JP2022544588A - クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 - Google Patents
クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022544588A JP2022544588A JP2022509592A JP2022509592A JP2022544588A JP 2022544588 A JP2022544588 A JP 2022544588A JP 2022509592 A JP2022509592 A JP 2022509592A JP 2022509592 A JP2022509592 A JP 2022509592A JP 2022544588 A JP2022544588 A JP 2022544588A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- medium
- clostridium
- growth
- certain embodiments
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/44—Staphylococcus
- C12R2001/45—Staphylococcus epidermidis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、細菌を培養するための培地組成に関する。特に、本発明は、クロストリジウム属細菌の培養及び/又は発酵のための培地に関する。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2019年8月16日に出願された米国特許仮出願第62/887,790号に対する優先権を主張する。前述の出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年8月16日に出願された米国特許仮出願第62/887,790号に対する優先権を主張する。前述の出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(電子的に提出された配列表の参照)
本出願は、2020年7月16日付で作成された、「JBI6144WOPCT1Sequencelisting.txt」というファイル名のASCII形式の配列表としてEFS-Webを介して電子的に提出された、43KBのサイズを有する配列表を含む。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年7月16日付で作成された、「JBI6144WOPCT1Sequencelisting.txt」というファイル名のASCII形式の配列表としてEFS-Webを介して電子的に提出された、43KBのサイズを有する配列表を含む。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(発明の分野)
本明細書に提供される開示は、クロストリジウム属に属する細菌を増殖させるのに有用な細菌培養培地と、前述の培地を製造及び使用する方法とに関する。
本明細書に提供される開示は、クロストリジウム属に属する細菌を増殖させるのに有用な細菌培養培地と、前述の培地を製造及び使用する方法とに関する。
最近の研究により、クロストリジウム属の細菌は、哺乳動物の腸における粘膜免疫系で宿主の免疫細胞の分化を制御することが示されている(国際公開第2013080561号、同第2011151941号)。したがって、生物の免疫系を調節するために、クロストリジウム属の特定の細菌を生物に導入することが有益であり得る。
ヒトが使用するのに有益な免疫機能を有する、これらの細菌を含む薬物、栄養補助食品、プロバイオティクス、又は食品を開発するために、それらの細菌が従来の工業的発酵プロセスによって生産され、次に医薬又は食品製剤に組み込まれ得るように、それらを培養する方法を開発する必要がある。クロストリジウム属細菌の生産は高コストなプロセスであり、これらの細菌を高収率で生産するために使用される増殖培地を改善するために継続的な研究が行われている。クロストリジウム属細菌のいくつかの株を組み合わせて使用する場合、更なる困難が生じる。いくつかのクロストリジウム株の各々を異なる培地で増殖させることは、コスト効率が悪く、時間がかかる場合がある。
したがって、クロストリジウム属細菌のいくつかの株を高収率で培養するために最適化された新規培地を開発することが望ましい。
本発明は、細菌細胞を培養するための最適化された培地組成及びプロセスを提供することによって、上記に示した問題を解決する。
一実施形態では、培地は、(a)5~15g/kgのプロテオースペプトン、(b)5~15g/kgのフィトンペプトン、(c)15~25g/kgの酵母エキス、(d)9~14g/kgのM9塩、(e)5~15g/kgのグルコースを含み、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものである。
別の実施形態では、培地は、(a)10g/kgのプロテオースペプトン、(b)10g/kgのフィトンペプトン、(c)20g/kgの酵母エキス、(d)11.4g/kgのM9塩、(e)10g/kgのグルコースを含む。
別の実施形態では、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものであり、クロストリジウム属に属する細菌株は、クロストリジウムクラスタIV又はXIVaに属する細菌株である。
別の実施形態では、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものであり、クロストリジウム属に属する細菌株は、表1に列挙された株からなる群から選択される。
別の実施形態では、培地は、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものであり、クロストリジウム属に属する細菌株は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される配列を含む。
別の実施形態では、培地は、嫌気性条件で維持される。
別の実施形態では、培地は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17の群から選択される16S rDNA配列を含む少なくとも1つの細菌を更に含む。
一実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、a)バイオリアクタを提供することと、b)培養される細胞を培地と混合することと、c)得られた混合物をインキュベートすることとを含む。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、クロストリジウム属に属する細菌株が、クロストリジウムクラスタIV又はXIVaに属する細菌株である、プロセスである。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、クロストリジウム属に属する細菌株が、表1に列挙された株からなる群から選択される、プロセスである。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、クロストリジウム属に属する細菌株が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される配列を含む、プロセスである。
別の実施形態では、細菌細胞を培養するためのプロセスは、培地が嫌気性条件で維持される、プロセスである。
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む(但しそれらに限定されない)全ての刊行物は、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
開示される内容は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。開示される内容は、本明細書に記載及び/又は表示の内容に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、請求項に記載の内容に限定することを意図しないことを理解されたい。
特別な記述がない限り、動作に関する可能なメカニズム又は形態、あるいは改善の理由についての説明は、説明のみを意図したものである。本開示の内容は、提案されている動作に関するメカニズム又は形態、あるいは改善の理由の是非によって制限されない。
値の範囲が表されている場合、別の実施形態においては、ある特定の値から、及び/又は他の特定の値までが含まれる。更に、範囲で記述される値に関する言及は、その範囲内のあらゆる値を含む。範囲はいずれも包括的であり、組み合わせであってもよい。値が、先行詞「約」を用いて近似値として表現される場合、その特定の値は、別の実施形態を形成することが理解される。特定の数値に関する言及は、文脈上その他に明記されない限り、少なくともその特定の値を含むものとする。
本明細書において、明確性のために、別々の実施形態の文脈において記載される、開示された内容の複数の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔のために単一の実施形態として記載された開示される内容の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の下位の組み合わせで提供されてもよい。
定義
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は複数を含むものとする。
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は複数を含むものとする。
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する種々の用語が使用される。特に指示がない限り、このような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
数値範囲、カットオフ、又は特定の値に言及するときに用いる場合、「約」という用語は、引用した値が、記載値から最大10%変動し得ることを示すために用いる。したがって、用語「約」とは、規定値からの±10%以下の変動、±5%以下の変動、±1%以下の変動、±0.5%以下の変動、又は±0.1%以下の変動を包含するために使用される。
「細菌増殖」は、二分裂と呼ばれるプロセス中で細菌細胞が2つの同一の娘細胞に分裂することと定義される。細菌集団の複製は、各細胞分裂において生じ、指数関数的に増殖する。培養物中の指数関数的細菌増殖は、とりわけ、細菌細胞の直接計数(すなわち、顕微鏡法、フローサイトメトリ)、バイオマス定量(ミリグラム、グラム、キロ、又はトン)、コロニー計数、光学密度(分光光度計で測定、約600nmの波長)、栄養消費などの周知の方法によってモニタすることができる。細菌増殖は、「遅滞期」、「指数増殖又は対数期」、「静止期」、及び「衰退又は死滅期」の4つの異なる期を特徴とすることができる。
「遅滞期」の間、細菌は増殖条件に順応中であり、まだ細胞分裂を行うことができないことが一般的に知られている。細胞が成熟状態に入る期間である。「指数増殖又は対数期」は、細菌集団の複製を特徴とする期間である。増殖が制限されない場合、細胞の複製は一定の割合で継続し、その結果、細胞数及び増殖率が共に各世代で複製される。増殖培地は栄養に限りがあり、かつ細胞分裂中に細菌細胞によって産生された代謝産物は多くの場合に毒性であるため、指数増殖期は無期限に持続しない。したがって、増殖率は減少する傾向があり、細菌増殖は「静止期」に入る。この期は、培養培地中の資源枯渇を特徴とする。「衰退又は死滅期」では、細菌は培養培地中の残りの栄養物を完全に枯渇させ、死滅する。
「前培養物」又は「前接種物」は、「培養物」又は「接種物」の製造に使用されるであろう保存培養物から得られる微生物の懸濁液として定義される。
「培養物」、「細胞培養物」、又は「接種物」という用語は、互換的に使用され、初期スケールよりも大規模(より大きな培養培地量)での増殖及び/又は発酵に使用される特定の濃度を有する微生物の懸濁液を定義する。
細胞培養は、ペトリ皿、コンタクトプレート、ボトル、チューブ、ウェル、ベッセル、バッグ、フラスコ、又はタンクなどの細胞の培養に好適な任意の容器で行うことができる。典型的には、容器は、使用前に滅菌される。インキュベーションは、典型的には、好適な温度、浸透圧、通気、撹拌などの好適な条件下で行われる。当業者は、細胞の増殖/培養を支持又は維持するための好適なインキュベーション条件を認識している。
本発明による「細胞培養培地」(同義的に使用される「培養培地」)は、細胞のインビトロ増殖を維持及び/若しくは支持する、並びに/又は特定の生理学的状態を支持する、成分の任意の混合物である。それは合成培地である。細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持及び/若しくは支持するために必要な全成分を含むか、又は別個に添加される更なる成分と組み合わせて選択成分を添加するために使用され得る。好ましくは、細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持及び/又は支持するために必要な全成分を含む。
「嫌気性条件」及び「嫌気生活」は、実質的に無酸素の培養条件を維持することとして定義される。
「新鮮な培養培地」は、培養培地がその成分の全てを完全に含有するとき、以前に使用されていない微生物増殖又は発酵のための任意の培養培地を指す。
「保存又は貯蔵培養物」は、所定の期間貯蔵された凍結培地中の微生物の画分を指す。
「操作的分類単位(OTU、複数形OTUs)」は、系統樹における末端葉を指し、特定の遺伝子配列及びこの配列と種のレベルで配列同一性を共有する全ての配列によって定義される。細菌の1つの「種類」又は複数の「種類」は、1つのOTU又は複数の異なるOTUを含み、細菌の株、種、属、科、又は目も包含する。特定の遺伝子配列は、16S配列若しくは16S配列の一部であってもよく、又は真正細菌界にわたって広く見られる機能的に保存されたハウスキーピング遺伝子であってもよい。OTUは、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を共有する。OTUは、しばしば生物間の配列を比較することによって定義される。95%未満の配列同一性を有する配列は、同じOTUの部分を形成するとは見なされない。
微生物学において、「16S配列決定」又は「16S rRNA」又は「16S-rRNA」又は「16S」は、16SリボソームRNA遺伝子(複数可)を含むヌクレオチドを特徴付けることによって誘導される配列を指す。細菌16S rDNAは、約1500ヌクレオチド長であり、系統学的アプローチを使用してある細菌分離株の進化的関係及び配列類似性を他に対して再生する際に使用される。16S配列は、一般に高度に保存されているため、系統学的再生に使用されるが、ほとんどの細菌並びに真菌の属及び種を区別するのに十分なヌクレオチド多様性を有する特異的な超可変領域を含有する。
16S rRNAの「V1~V9領域」は、細菌試料の遺伝子型決定に使用される16S rRNA遺伝子の第1~第9の超可変領域を指す。これらの細菌の領域は、大腸菌系の命名法に基づく番号付けを使用して、それぞれヌクレオチド69~99、137~242、433~497、576~682、822~879、986~1043、1117~1173、1243~1294、及び1435~1465によって定義される。Brosius et al.,Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli,PNAS 75(10):4801-4805(1978)。いくつかの実施形態では、OTUを特徴付けるために、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、及びV9領域のうちの少なくとも1つを使用する。一実施形態では、OTUを特徴付けるために、V1、V2、及びV3領域を使用する。別の実施形態では、OTUを特徴付けるために、V3、V4、及びV5領域を使用する。別の実施形態では、OTUを特徴付けるために、V4領域を使用する。当業者は、当該候補配列を参照の配列と比較して、参照の超可変領域との類似性に基づいて超可変領域を特定することにより、(配列番号1~1,4において)候補16S rRNAの特異的な超可変領域を特定することができる。
発明の説明
本発明による細胞培養培地は、クロストリジウム属に属する1つ以上の細菌株を増殖するか又はその増殖を維持/支持するのに好適であるように設計される。本発明による培地によって増殖が維持/支持されるクロストリジウム株の例は、表1及び表10に列挙された1つ以上の株である。
本発明による細胞培養培地は、クロストリジウム属に属する1つ以上の細菌株を増殖するか又はその増殖を維持/支持するのに好適であるように設計される。本発明による培地によって増殖が維持/支持されるクロストリジウム株の例は、表1及び表10に列挙された1つ以上の株である。
例えば、以下のように、「クロストリジウム属に属する細菌」のクラスタを特定し得ることに留意されたい。具体的には、クロストリジウム属に属する細菌は、配列番号18及び19からなるプライマセット(クラスタXIVaに属するクロストリジウム種用)又は配列番号20及び21からなるプライマセット(クラスタIVに属するクロストリジウム種用)を使用してPCRによって分類される。更に、クロストリジウム属に属する細菌は、配列番号22及び23からなるプライマセットを使用して増幅された16S rRNA遺伝子の配列決定によって分類される。
配列番号18-AAATGACGGTACCTGACTAA
配列番号19-CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA
配列番号20-GCACAAGCAGTGGAGT
配列番号21-CTTCCTCCGTTTTGTCAA
配列番号22-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
配列番号23-ATTACCGCGGCKGCTG
配列番号18-AAATGACGGTACCTGACTAA
配列番号19-CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA
配列番号20-GCACAAGCAGTGGAGT
配列番号21-CTTCCTCCGTTTTGTCAA
配列番号22-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
配列番号23-ATTACCGCGGCKGCTG
本発明による細胞培養培地、特に完全培地は、典型的には、少なくとも1つ以上の糖成分、任意選択で1つ以上のアミノ酸、任意選択で1つ以上のビタミン又はビタミン前駆体、1つ以上の塩、任意選択で1つ以上の緩衝成分、任意選択で1つ以上の補助因子、及び任意選択で1つ以上の核酸成分を含む。
培地はまた、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、脂肪酸及び/又は脂肪酸誘導体、及び/又はプルロニック酸、及び/又は化学的に調製された非イオン性界面活性剤のような界面活性成分を含み得る。
糖成分は、グルコース、ガラクトース、リボース、若しくはフルクトース(単糖類の例)、又はスクロース、ラクトース、若しくはマルトース(二糖類の例)のような全ての単糖類又は二糖類である。
本発明によるアミノ酸の例は、チロシン、タンパク質原性アミノ酸、特に必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、及びバリン、並びにD-アミノ酸のような非タンパク質原性アミノ酸である。
ビタミンの例は、ビタミンA(レチノール、レチナール、様々なレチノイド、及び4つのカロチノイド)、ビタミンB1(チアミン)、ビタミンB2(リボフラビン)、ビタミンB3(ナイアシン、ナイアシンアミド)、ビタミンB5(パントテン酸)、ビタミンB6(ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール)、ビタミンB7(ビオチン)、ビタミンB9(葉酸、フォリン酸)、ビタミンB12(シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン)、ビタミンC(アスコルビン酸)、ビタミンD(エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール)、ビタミンE(トコフェロール、トコトリエノール)、及びビタミンK(フィロキノン、メナキノン)である。ビタミン前駆体も含まれる。
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸塩、カリウム、及びナトリウムなどの無機イオン、又はCo、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V、及びZnなどの微量元素を含む成分である。例としては、硫酸銅(II)五水和物(CuSO4.5H2O)、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カルシウム(CaCl2.2H2O)、塩化カリウム(KCl)、硫酸鉄(II)、塩基性リン酸ナトリウム無水物(NaH2PO4)、硫酸マグネシウム無水物(MgSO4)、二塩基性リン酸ナトリウム無水物(Na2HPO4)、塩化マグネシウム六水和物(MgCl2.6H2O)、硫酸亜鉛七水和物である。
緩衝剤の例は、CO2/HCO3(炭酸塩)、リン酸塩、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS、及びTRISである。
補助因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンC、NAD/NADP、コバラミン、フラビンモノヌクレオチド及び誘導体、グルタチオン、リン酸ヘムヌクレオチド及び誘導体である。
細胞は、例えば、灌流バイオリアクタ、細胞バッグ、培養プレート、フラスコ、及び当業者に周知の他の容器を含む様々な容器で培養され得る。温度及び空気組成などの細胞培養に適した周囲条件もまた、当業者に周知である。細胞を培養するための方法もまた、当業者に周知である。
一態様では、本発明は、以下の量で以下の成分を含む組成を提供する:
6.5~40g/kgのプロテオースペプトン(植物性)、
1~50g/kgの酵母エキス、
5~15g/kgの二塩基性リン酸ナトリウム(Na2HPO4)、
1~50g/kgの糖、並びに任意選択で
チオグリコール酸ナトリウム、L-システイン、及びアスコルビン酸からなる群から選択される、0.3~10g/kgの還元剤。
6.5~40g/kgのプロテオースペプトン(植物性)、
1~50g/kgの酵母エキス、
5~15g/kgの二塩基性リン酸ナトリウム(Na2HPO4)、
1~50g/kgの糖、並びに任意選択で
チオグリコール酸ナトリウム、L-システイン、及びアスコルビン酸からなる群から選択される、0.3~10g/kgの還元剤。
特定の実施形態では、糖は、単糖類であり得る。特定の実施形態では、単糖類は、グルコース又はフルクトースであり得る。特定の実施形態では、糖は、二糖類であり得る。特定の実施形態では、二糖類は、スクロースであり得る。特定の実施形態では、糖は、三糖類であり得る。特定の実施形態では、三糖類は、ラフィノースであり得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約6.5~約8、約7.5~約9、約8~約10、約9~約11、約10~約12、約11~約13、約12~約14、約13~約15、約14~約16、約15~約17、約16~約18、約17~約19、約18~約20、約19~約21、約20~約22、約21~約23、約22~約24、約23~約25、約24~約26、約25~約27、約26~約28、約27~約29、約28~約30、約29~約31、約30~約32、約31~約33、約32~約34、約33~約35、約34~約36、約35~約37、約36~約38、約37~約39、約38~約40、約39~約41、約40~約42g/kgのプロテオースペプトン(植物性)を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約0.3~約1、約0.5~約1.5、約1~約2、約1.5~約2.5、約2~約3、約2.5~約3.5、約3~約4、約3.5~約4.5、約4~約5、約4.5~約5.5、約5~約6、約5.5~約6.5、約6~約7、約0.5~約2、約0.8~約1.3g/kgの還元剤を含み得る。特定の実施形態では、還元剤は、チオグリコール酸ナトリウムである。特定の実施形態では、還元剤は、L-システインである。特定の実施形態では、還元剤は、アスコルビン酸である。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約4、約2~約5、約3~約6、約4~約7、約5~約8、約6~約9、約7~約10、約8~約11、約8~約12、約8~約13、約8~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40g/kgの酵母エキスを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約5~約10、約6~約11、約7~約12、約8~約13、約9~約14、約10~約15g/kgの二塩基性リン酸ナトリウムを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55g/kgのグルコースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55g/kgのスクロースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55g/kgのラフィノースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55g/kgのフルクトースを含み得る。
一態様では、本発明は、以下の量で以下の成分を含む組成を提供する:
5~15g/kgのプロテオースペプトン、
5~15g/kgのフィトンペプトン、
15~25g/kgの酵母エキス、
9~14g/kgのM9塩、
5~15g/kgの糖、
任意選択で2~6g/kgの脂肪酸、及び
任意選択で2~6g/kgのポリソルベート20。
5~15g/kgのプロテオースペプトン、
5~15g/kgのフィトンペプトン、
15~25g/kgの酵母エキス、
9~14g/kgのM9塩、
5~15g/kgの糖、
任意選択で2~6g/kgの脂肪酸、及び
任意選択で2~6g/kgのポリソルベート20。
特定の実施形態では、糖は、単糖類であり得る。特定の実施形態では、単糖類は、グルコース又はフルクトースであり得る。特定の実施形態では、糖は、二糖類であり得る。特定の実施形態では、二糖類は、スクロースであり得る。特定の実施形態では、糖は、三糖類であり得る。特定の実施形態では、三糖類は、ラフィノースであり得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約5~約10、約6~約10、約8~約10、約9~約11、約10~約12、約10~約13、約10~約14、約10~約15、約10~約16、約10~約17、約10~約18、約10~約19、約10~約20、約8~約12、約8~約13、約7~約12g/kgのプロテオースペプトンを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約5~約10、約6~約10、約8~約10、約9~約11、約10~約12、約10~約13、約10~約14、約10~約15、約10~約16、約10~約17、約10~約18、約10~約19、約10~約20、約8~約12、約8~約13、約7~約12g/kgのフィトンペプトンを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約15~約20、約16~約20、約17~約20、約18~約20、約18~約21、約18~約22、約18~約23、約18~約24、約18~約25、約19~約20、約19~約21、約19~約22、約19~約23、約19~約24、約19~約25、約20~約25、約20~約26、約20~約27、約20~約28、約20~約29、約20~約30g/kgの酵母エキスを含み得る。
M9塩は、細菌増殖培地で使用される、当該技術分野において周知の塩の組成である(Sambrook,Fritsch and Maniatis.1989.Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。本発明のM9塩は、以下を含有する:
33.9g/LのNa2HPO4
15g/LのKH2PO4
5g/LのNH4Cl
2.5g/LのNaCl。
33.9g/LのNa2HPO4
15g/LのKH2PO4
5g/LのNH4Cl
2.5g/LのNaCl。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約9~約11.5、約9.5~約11.5、約10~約11.5、約10.5~約11.5、約11~約11.5、約11~約12、約11~約12.5、約11~約13、約11~約13.5、約11~約12、約11~約12.5、約11~約13、約11~約13.5、約11~約14g/kgのM9塩を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのグルコースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのフルクトースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのラフィノースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのスクロースを含み得る。
本明細書で使用する場合、「脂肪酸」という用語は、当該技術分野で認識されており、長鎖炭化水素系カルボン酸を含む。脂肪酸は、グリセリドを含む多くの脂質の成分である。最も一般的な天然に存在する脂肪酸は、偶数の炭素原子(16又は18個)を有するモノカルボン酸であり、これは飽和又は不飽和であり得る。「不飽和」脂肪酸は、炭素原子間にシス二重結合を含む。「多価不飽和」脂肪酸は、2つ以上の二重結合を含み、二重結合は、メチレン中断系に配置されている(-CH=CH-CH2-CH=CH-)。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約2~約4、約2.5~約4、約3~約4、約2~約5、約2.5~約5、約3~約5、約3.5~約5、約3~約6、約3.5~約6、約4~約6、約4~約5g/kgの脂肪酸を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約2~約4、約2.5~約4、約3~約4、約2~約5、約2.5~約5、約3~約5、約3.5~約5、約3~約6、約3.5~約6、約4~約6、約4~約5g/kgのポリソルベート20を含み得る。
一態様では、本発明は、以下の量で以下の成分を含む組成を提供する:
45~55g/kgのHY-ペプトン、
15~25g/kgの酵母エキス、
9~14g/kgのM9塩、
5~15g/kgの糖、及び
任意選択で2~6g/kgの脂肪酸。
45~55g/kgのHY-ペプトン、
15~25g/kgの酵母エキス、
9~14g/kgのM9塩、
5~15g/kgの糖、及び
任意選択で2~6g/kgの脂肪酸。
特定の実施形態では、糖は、単糖類であり得る。特定の実施形態では、単糖類は、グルコース又はフルクトースであり得る。特定の実施形態では、糖は、二糖類であり得る。特定の実施形態では、二糖類は、スクロースであり得る。特定の実施形態では、糖は、三糖類であり得る。特定の実施形態では、三糖類は、ラフィノースであり得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約45~約50、約46~約50、約47~約50、約47~約51、約47~約52、約47~約53、約47~約54、約47~約55、約48~約55、約49~約55、約50~約55g/kgのHY-ペプトンを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約15~約20、約16~約20、約17~約20、約18~約20、約18~約21、約18~約22、約18~約23、約18~約24、約18~約25、約19~約20、約19~約21、約19~約22、約19~約23、約19~約24、約19~約25、約20~約25、約20~約26、約20~約27、約20~約28、約20~約29、約20~約30g/kgの酵母エキスを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約9~約11.5、約9.5~約11.5、約10~約11.5、約10.5~約11.5、約11~約11.5、約11~約12、約11~約12.5、約11~約13、約11~約13.5、約11~約12、約11~約12.5、約11~約13、約11~約13.5、約11~約14g/kgのM9塩を含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのグルコースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのフルクトースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのラフィノースを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約1~約8、約2~約9、約3~約10、約4~約11、約5~約12、約6~約13、約7~約14、約8~約15、約8~約16、約8~約17、約8~約18、約8~約19、約8~約20、約8~約21、約8~約22、約8~約23、約8~約24、約8~約25、約8~約30、約8~約35、約8~約40、約8~約45、約8~約50、約8~約55、約9~約11、約9~約12、約9~約13g/kgのスクロースを含み得る。
本明細書で使用する場合、「脂肪酸」という用語は、当該技術分野で認識されており、長鎖炭化水素系カルボン酸を含む。脂肪酸は、グリセリドを含む多くの脂質の成分である。最も一般的な天然に存在する脂肪酸は、偶数の炭素原子(16又は18個)を有するモノカルボン酸であり、これは飽和又は不飽和であり得る。「不飽和」脂肪酸は、炭素原子間にシス二重結合を含む。「多価不飽和」脂肪酸は、2つ以上の二重結合を含み、二重結合は、メチレン中断系に配置されている(-CH=CH-CH2-CH=CH-)。
特定の実施形態では、本発明の組成は、約2~約4、約2.5~約4、約3~約4、約2~約5、約2.5~約5、約3~約5、約3.5~約5、約3~約6、約3.5~約6、約4~約6、約4~約5g/kgの1つ以上の脂肪酸を含み得る。
以下の例は、本発明を例示する。これらの例は本発明の範囲を制限するとして解釈されてはならない。例は図示の目的のために含まれ、本発明は請求項によってのみ限定される。
実施例1.クロストリジウム株の初期増殖条件。
この研究は、少なくとも1.0×109細胞/mLの最終濃度に達することを目標として、クロストリジウム属の細菌を増殖させるための増殖培地の最適化を検討した。
以下のクロストリジウム株を試験に使用した(表1)。
培養培地(培地A)は、Duncan Strong(DS)Medium(Duncan and Strong,Appl.Microbiol.,Vol.16,1968)の部分変更に基づいて、以下の成分を使用して調製した。
培地A:
プロテオースペプトン(植物性)(Fluka、カタログ番号29185)-7.5g/kg
植物抽出物(Sigma、カタログ番号49869-500G-F)-7.5g/kg
酵母エキス(BD、カタログ番号212750)-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム(Sigma、カタログ番号T0632)-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム(Na2HPO4、Sigma、カタログ番号S5136-500)-10g/kg
D-(+)-ラフィノース五水和物(Sigma、カタログ番号83400-100g)-4g/kg
ジャガイモ由来デンプン、可溶性(Sigma、カタログ番号S9765)-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
培地A:
プロテオースペプトン(植物性)(Fluka、カタログ番号29185)-7.5g/kg
植物抽出物(Sigma、カタログ番号49869-500G-F)-7.5g/kg
酵母エキス(BD、カタログ番号212750)-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム(Sigma、カタログ番号T0632)-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム(Na2HPO4、Sigma、カタログ番号S5136-500)-10g/kg
D-(+)-ラフィノース五水和物(Sigma、カタログ番号83400-100g)-4g/kg
ジャガイモ由来デンプン、可溶性(Sigma、カタログ番号S9765)-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
培地は、オートクレーブ処理(121℃、15分間)又は0.22μmフィルタを使用した滅菌濾過によって滅菌した。培地を使用前に嫌気キャビネットに約16時間配置した。
クロストリジウム株(表1)の凍結保存培養物を嫌気チャンバ内で解凍した。400μLの各株を、25mLの培地Aを有する別個のフラスコに接種し、嫌気性条件下で37℃で15時間インキュベートした。600nmでの光学密度(OD600nm)をモニタし、Tryptic Soy寒天プレートを使用して、最大OD600nmにおいてコロニー形成単位(CFU)をカウントした(表2)。
増殖収率を増加させる目的で、Microbioreactor System(BIOLECTOR(登録商標)、m2plabs)を使用して、増殖培地の最適化に関する試験を行った。BIOLECTOR(登録商標)では、規定の波長の光をマルチウェルプレートの各ウェルに送ることによって細菌増殖を連続的にモニタし、その一方で後方散乱光(バイオマスのインジケータ)を検出及び分析する。
実施例2.クロストリジウム株の増殖における炭素源の影響。
培地Aの本来の配合は、主炭素源としてラフィノースを含む。最良の増殖条件を見出すために、培地A中のラフィノースを同じ濃度のスクロース(Sigma、カタログ番号84100)又はグルコース(Sigma、カタログ番号G5767)のいずれかと置き換え、したがって以下の組成のうちの1つを使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
D-(+)-ラフィノース五水和物、又はD-(+)-グルコース、又はD-スクロース-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
培地Aの本来の配合は、主炭素源としてラフィノースを含む。最良の増殖条件を見出すために、培地A中のラフィノースを同じ濃度のスクロース(Sigma、カタログ番号84100)又はグルコース(Sigma、カタログ番号G5767)のいずれかと置き換え、したがって以下の組成のうちの1つを使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
D-(+)-ラフィノース五水和物、又はD-(+)-グルコース、又はD-スクロース-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
最初に、各クロストリジウム株の凍結保存培養物(300μL)を解凍し、次いで、4g/Lのラフィノース、スクロース、グルコース、又はフルクトースのいずれかを含有する3mLの培地Aに接種し、嫌気チャンバ内で37℃で20時間インキュベートした(前培養物と称される)。次に、分光光度計を使用して前培養物のOD600nmを測定し、培養物に接種される前培養物の体積(X)を以下の式に従って計算した。
前培養物の体積X=目標OD600nm(0.05)*目標体積(1.4mL)/前培養物のOD600nm
前培養物の体積X=目標OD600nm(0.05)*目標体積(1.4mL)/前培養物のOD600nm
次に、計算された体積の前培養物を、4g/Lのラフィノース、スクロース、グルコース、又はフルクトースのいずれかを含有する合計1.4mLの培地Aに再び接種し(培養物と称される)、BIOLECTOR(登録商標)を使用して嫌気性条件下で600rpmで撹拌しながら37℃で48時間維持した。
嫌気性条件は、以下の体積による気体の混合物を使用することによって達成した:10%のH2、10%のCO2、及び80%のN2。あるいは、以下の混合物を使用することができる:5%のH2、10%のCO2、及び85%のN2。
結果は、各炭素源の選好が株依存性であることを示した(表3)。
表3.使用した炭素源に応じてより速い増殖を示すクロストリジウム株。20時間培養後のBiolectorの散乱光読み取り値(ゲイン40)によって、異なる株の増殖をスコア化した。++-散乱光読み取り値>100、+-20時間の散乱光読み取り値>50、o-散乱光読み取り値<50、nd-検出不可能。
実施例3.クロストリジウム株の増殖における植物抽出物、ペプトン、酵母エキス、及び炭素源の様々な濃度の影響。
次に、植物抽出物、ペプトン、酵母エキス、及び/又は炭素源の濃度を増加させることによって、培地Aを更に最適化した(表4参照)。
次に、植物抽出物、ペプトン、酵母エキス、及び/又は炭素源の濃度を増加させることによって、培地Aを更に最適化した(表4参照)。
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。結果は、培地A1、A2、又はA3を使用した場合に細菌増殖が向上することを示唆した。培地A4を使用した場合、有益性は観察されなかった。
実施例4.クロストリジウム株の増殖におけるデンプン及び植物抽出物の影響。
次に、実施例1の配合表からデンプンを除去することによって培地Aを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物#2-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
次に、実施例1の配合表からデンプンを除去することによって培地Aを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物#2-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。結果は、デンプンの除去が増殖曲線に有意な影響を及ぼさないことを示唆した。
次に、実施例1の配合表から植物抽出物を除去することによって培地Aを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。植物抽出物の除去は、増殖曲線に有意な影響を及ぼさなかった。
実施例5.クロストリジウム株の増殖におけるチオグリコール酸ナトリウムの影響。
次に、実施例1の配合表からチオグリコール酸ナトリウムを除去することによって培地Aを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
次に、実施例1の配合表からチオグリコール酸ナトリウムを除去することによって培地Aを更に最適化し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。チオグリコール酸ナトリウムの除去は、株1、4、6、7、9、18、26、27、及び28に有意な増殖抑制の影響を及ぼした。
実施例6.クロストリジウム株の増殖におけるpHの影響。
次に、100mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用してpHを5.8、6.3、又は7のいずれかに調整することによって、炭素源としてラフィノースを含有する培地Aを更に最適化した。
次に、100mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用してpHを5.8、6.3、又は7のいずれかに調整することによって、炭素源としてラフィノースを含有する培地Aを更に最適化した。
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。結果は、より低いpHが増殖率に悪影響を及ぼすことを示唆した(表5)。
表5.異なるpHにおける20時間後のクロストリジウム株の増殖。
20時間培養後のBiolectorの散乱光読み取り値(ゲイン40)によって、異なる株の増殖をスコア化した。++-散乱光読み取り値>100、+-20時間の散乱光読み取り値>50、o-散乱光読み取り値<50。
実施例7.クロストリジウム株の増殖における消泡剤の影響。
細菌増殖の指数増殖期中の泡の形成を防止するために、消泡剤204(100μL/L、Sigma)を培地に添加し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
細菌増殖の指数増殖期中の泡の形成を防止するために、消泡剤204(100μL/L、Sigma)を培地に添加し、したがって以下の組成を使用した。
プロテオースペプトン(植物性)-7.5g/kg
植物抽出物-7.5g/kg
酵母エキス-4g/kg
チオグリコール酸ナトリウム-1g/kg
二塩基性リン酸ナトリウム-10g/kg
炭素源(株依存性、表3参照)-4g/kg
デンプン-0.5g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。結果は、消泡剤の添加が細菌増殖率に悪影響を及ぼさないことを示唆した。
実施例8.クロストリジウム株の増殖における基本培地の影響。
最終培地は、上記の全ての変更を含み、基本培地(BM、表6)と名付けられた。培地中の添加糖は株依存性であるため、最終培地は、ラフィノースを含む場合は「BMR」、スクロースを含む場合は「BMS」、又はグルコースを含む場合は「BMG」と称された。
最終培地は、上記の全ての変更を含み、基本培地(BM、表6)と名付けられた。培地中の添加糖は株依存性であるため、最終培地は、ラフィノースを含む場合は「BMR」、スクロースを含む場合は「BMS」、又はグルコースを含む場合は「BMG」と称された。
クロストリジウム株に対して培地AとBMとの比較を行った(表7)。
表7.培地A及びBM培地におけるクロストリジウム株の増殖。
20時間培養後のBiolectorの散乱光読み取り値(ゲイン40)によって、異なる株の増殖をスコア化した。++-散乱光読み取り値>100、+-20時間の散乱光読み取り値>50、o-散乱光読み取り値<50、nd-検出不可能。
実施例9.クロストリジウム株の増殖における高純度ペプトンの影響。
表5による培地組成中の本来のプロテオースペプトンの代わりに、高純度ペプトン(VEGETABLE PEPTONE No1、OXOID、VG0100)を30g/kgの濃度で試験した。表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。結果は、このペプトンが株番号1、4、6、9、18、及び29の細菌の増殖に悪影響を及ぼすことを示唆した。
表5による培地組成中の本来のプロテオースペプトンの代わりに、高純度ペプトン(VEGETABLE PEPTONE No1、OXOID、VG0100)を30g/kgの濃度で試験した。表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例2に記載したようにBIOLECTOR(登録商標)を使用して分析した。結果は、このペプトンが株番号1、4、6、9、18、及び29の細菌の増殖に悪影響を及ぼすことを示唆した。
実施例10.M1培地を使用したクロストリジウム株の増殖。
単一の培地を開発して17種のクロストリジウム株を約109細胞/mLのCFUまで増殖させること、並びに株3及び株8の増殖を改善することを目標として、新規の培地組成を試験してきた。
M1培地:
プロテオースペプトン(Fluka、カタログ番号29185-500F)-10g/kg
フィトンペプトン(BD、カタログ番号211906)-10g/kg
酵母エキス(BD、カタログ番号212730)-10g/kg
M9塩(33.9g/LのNa2HPO4、15g/LのKH2PO4、5g/LのNH4Cl、2.5g/LのNaCl、BD、カタログ番号248510)-11.4g/kg
D-(+)-グルコース(Sigma、カタログ番号G5767)-10g/kg
微量元素金属混合カクテル粉末(Sigma SAFC、87148CP)-0.1g/kg
脂肪酸(Sigma SAFC、カタログ番号F7050)-4g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
単一の培地を開発して17種のクロストリジウム株を約109細胞/mLのCFUまで増殖させること、並びに株3及び株8の増殖を改善することを目標として、新規の培地組成を試験してきた。
M1培地:
プロテオースペプトン(Fluka、カタログ番号29185-500F)-10g/kg
フィトンペプトン(BD、カタログ番号211906)-10g/kg
酵母エキス(BD、カタログ番号212730)-10g/kg
M9塩(33.9g/LのNa2HPO4、15g/LのKH2PO4、5g/LのNH4Cl、2.5g/LのNaCl、BD、カタログ番号248510)-11.4g/kg
D-(+)-グルコース(Sigma、カタログ番号G5767)-10g/kg
微量元素金属混合カクテル粉末(Sigma SAFC、87148CP)-0.1g/kg
脂肪酸(Sigma SAFC、カタログ番号F7050)-4g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例1に記載したように分析した。結果は、全てのクロストリジウム株がM1培地で良好に増殖していることを示唆した(表8)。株3及び株27を除く全ての株が、109細胞/mLの所望のCFUに達することが観察された(表8)。
M1培地を更に最適化するために、追加の試験を行った。上記のM1培地の組成から微量元素金属混合物及び脂肪酸を除去し、細菌細胞の増殖を試験した。結果は、細菌の増殖に有意な影響を及ぼさないことを示唆した。
実施例11.M81培地を使用したクロストリジウム株の増殖。
単一の培地を開発して17種のクロストリジウム株を約109細胞/mLのCFUまで増殖させること、並びに株3の増殖を改善することを目標として、M1培地を下記のように変更し、新しい培地をM81と称した。
M81培地:
HYペプトン(Kerry Biosciences、カタログ番号5X01111)50g/kg
酵母エキス(BD、カタログ番号212730)-10g/kg
M9塩(33.9g/LのNa2HPO4、15g/LのKH2PO4、5g/LのNH4Cl、2.5g/LのNaCl、BD、カタログ番号248510)-11.4g/kg
D-(+)-グルコース(Sigma、カタログ番号G5767)-10g/kg
微量元素金属混合カクテル粉末(Sigma SAFC、87148CP)-0.1g/kg
脂肪酸(Sigma SAFC、カタログ番号F7050)-4g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
単一の培地を開発して17種のクロストリジウム株を約109細胞/mLのCFUまで増殖させること、並びに株3の増殖を改善することを目標として、M1培地を下記のように変更し、新しい培地をM81と称した。
M81培地:
HYペプトン(Kerry Biosciences、カタログ番号5X01111)50g/kg
酵母エキス(BD、カタログ番号212730)-10g/kg
M9塩(33.9g/LのNa2HPO4、15g/LのKH2PO4、5g/LのNH4Cl、2.5g/LのNaCl、BD、カタログ番号248510)-11.4g/kg
D-(+)-グルコース(Sigma、カタログ番号G5767)-10g/kg
微量元素金属混合カクテル粉末(Sigma SAFC、87148CP)-0.1g/kg
脂肪酸(Sigma SAFC、カタログ番号F7050)-4g/kg
水(MILLI-Q(登録商標)システムを使用して精製)-1L
表1のクロストリジウム株の増殖曲線を、実施例1に記載したように分析した。結果は、少なくともクロストリジウム株番号1、3、8、18、27、及び29がM81培地で良好に増殖していることを示唆した(表7)。少なくとも株番号3及び18が、109細胞/mLの所望のCFUに達することが観察された(表9)。
M81培地を更に最適化するために、追加の試験を行った。上記のM81培地の組成から微量元素金属混合物及び脂肪酸を除去し、細菌細胞の増殖を試験した。結果は、細菌の増殖に有意な影響を及ぼさないことを示唆した。
Claims (12)
- (a)5~15g/kgのプロテオースペプトンと、
(b)5~15g/kgのフィトンペプトンと、
(c)15~25g/kgの酵母エキスと、
(d)9~14g/kgのM9塩と、
(e)5~15g/kgのグルコースと
を含む、培地であって、
前記培地が、クロストリジウム属に属する細菌株を培養するためのものである、
前記培地。 - 前記培地が、
(a)10g/kgのプロテオースペプトンと、
(b)10g/kgのフィトンペプトンと、
(c)20g/kgの酵母エキスと、
(d)11.4g/kgのM9塩と、
(e)10g/kgのグルコースと
を含む、請求項2に記載の培地。 - 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、クロストリジウムクラスタIV又はXIVaに属する細菌株である、請求項1又は2に記載の培地。
- 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、表1に列挙された株からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の培地。
- 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される配列を含む、請求項1又は2に記載の培地。
- 前記培地が、嫌気性条件で維持される、請求項1又は2に記載の培地。
- 前記培地が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17の群から選択される16S rDNA配列を含む少なくとも1つの細菌を更に含む、請求項1又は2に記載の培地。
- 細菌細胞を培養するためのプロセスであって、前記プロセスが、
a)バイオリアクタを提供することと、
b)培養される前記細胞を請求項1又は2に記載の培地と混合することと、
c)得られた混合物をインキュベートすることと
を含む、前記プロセス。 - 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、クロストリジウムクラスタIV又はXIVaに属する細菌株である、請求項8に記載のプロセス。
- 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、表1に列挙された株からなる群から選択される、請求項8に記載のプロセス。
- 前記クロストリジウム属に属する細菌株が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される配列を含む、請求項8に記載のプロセス。
- 前記培地が、嫌気性条件で維持される、請求項8に記載のプロセス。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962887790P | 2019-08-16 | 2019-08-16 | |
US62/887,790 | 2019-08-16 | ||
PCT/IB2020/056846 WO2021033043A1 (en) | 2019-08-16 | 2020-07-21 | Optimized culture media for clostridia bacteria |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022544588A true JP2022544588A (ja) | 2022-10-19 |
Family
ID=72039624
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022509592A Pending JP2022544588A (ja) | 2019-08-16 | 2020-07-21 | クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4013852A1 (ja) |
JP (1) | JP2022544588A (ja) |
WO (1) | WO2021033043A1 (ja) |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06113823A (ja) * | 1991-09-18 | 1994-04-26 | Horinouchi Kanzume Kk | 生菌数検出用培地及び検出方法 |
KR20090120222A (ko) * | 2008-05-19 | 2009-11-24 | (주)메디톡스 | 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 |
WO2011151941A1 (ja) | 2010-06-04 | 2011-12-08 | 国立大学法人東京大学 | 制御性t細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物 |
EP2785828B1 (en) | 2011-12-01 | 2020-04-08 | The University of Tokyo | Human-derived bacteria that induce proliferation or accumulation of regulatory t cells |
CN108342434B (zh) * | 2018-02-06 | 2021-08-31 | 中国兽医药品监察所 | 一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基 |
-
2020
- 2020-07-21 WO PCT/IB2020/056846 patent/WO2021033043A1/en unknown
- 2020-07-21 EP EP20754026.1A patent/EP4013852A1/en not_active Withdrawn
- 2020-07-21 JP JP2022509592A patent/JP2022544588A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021033043A1 (en) | 2021-02-25 |
EP4013852A1 (en) | 2022-06-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20240093141A1 (en) | Strains and processes for single cell protein or biomass production | |
Song et al. | Halapricum salinum gen. nov., sp. nov., an extremely halophilic archaeon isolated from non-purified solar salt | |
Trigui et al. | Characterization of Halorubrum sfaxense sp. nov., a new halophilic archaeon isolated from the solar saltern of Sfax in Tunisia | |
Finster et al. | Desulfospira joergensenii, gen. nov., sp. nov., a new sulfate-reducing bacterium isolated from marine surface sediment | |
CN102286606A (zh) | 克罗诺杆菌肉汤培养基及检测方法 | |
JP6923523B2 (ja) | 微生物の検出のための化学的に明らかな培地 | |
CN108467879B (zh) | 一种用于红霉素发酵的合成培养基 | |
RU2343192C2 (ru) | Среда для роста гетеротрофных водорослей или гетеротрофных бактерий, способ их культивирования и субстрат для их роста | |
JP2022544588A (ja) | クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 | |
JP2022544616A (ja) | クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 | |
JP2022544615A (ja) | クロストリジウム属細菌の最適化された培養培地 | |
KR101548640B1 (ko) | 엽산생성능이 우수한 신규한 락토바실러스 플랜타룸 ja71 균주 | |
RU2745093C1 (ru) | Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы | |
Kim et al. | Paralcaligenes ureilyticus gen. nov., sp. nov. isolated from soil of a Korean ginseng field | |
Stoyanova et al. | Isolation and identification of new nisin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis from milk | |
US11674165B2 (en) | Enrichment of Listeria | |
US11377633B2 (en) | Medium supplement for high-yield industrial culture of fastidious anaerobes and medium composition containing the same | |
Pennekamp et al. | Detection of Haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae from body fluids in blood culture bottles | |
JP2024515522A (ja) | タンパク質又はバイオマス生成のための変異体細菌株及び方法 | |
CN115335504A (zh) | 链球菌的无动物产物培养 | |
Iyer et al. | Analyses of growth kinetics and the development of simple media for the growth of Xanthomonas albilineans | |
Salih et al. | Maximization of growth and storage of locally isolated Lactobacillus salivarius subsp. Salivarius with high stability and functionality | |
CN107937330A (zh) | 吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用 |