WO2010027003A1 - 細胞検出方法及び該方法に用いるマイクロアレイチップ - Google Patents

細胞検出方法及び該方法に用いるマイクロアレイチップ Download PDF

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WO2010027003A1
WO2010027003A1 PCT/JP2009/065370 JP2009065370W WO2010027003A1 WO 2010027003 A1 WO2010027003 A1 WO 2010027003A1 JP 2009065370 W JP2009065370 W JP 2009065370W WO 2010027003 A1 WO2010027003 A1 WO 2010027003A1
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cells
microarray chip
microchamber
cell
specific
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PCT/JP2009/065370
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山村　昌平
聖基 八代
正俊 片岡
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独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa

Definitions

  • the present invention relates to a detection method for detecting a specific cell contained in a sample from a sample containing a plurality of cells.
  • the present invention also relates to a detection kit for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells.
  • the present invention also relates to a microarray chip that includes a plurality of microchambers and that can store a plurality of cells per microchamber.
  • the present invention relates to a method for screening drug candidate substances using a microarray chip having a plurality of microchambers.
  • Detecting only specific cells from a sample containing a plurality of cells of various types is required over a very wide range of fields.
  • a specific cell for example, a cell having or producing a specific substance, a cell infected with a pathogen, a cancer cell, etc. ) Is very important for the progress of experiments and diagnosis of diseases.
  • infectious diseases there is a malaria parasite infection caused by infection of red blood cells with a malaria parasite.
  • methods for detecting and diagnosing the infectious disease include the following.
  • PCR method As another method, there is a method of examining and diagnosing the presence / absence or degree of infection by malaria parasite using PCR method.
  • the method has a relatively high detection sensitivity, unlike the observation under the microscope described above.
  • the PCR method requires about 5 hours until results are obtained, and the operation is complicated and requires advanced techniques.
  • the PCR method alone is not suitable for infection diagnosis.
  • the conventional detection / diagnostic methods have drawbacks such as a long time required for detection, advanced techniques, and low detection sensitivity. Therefore, there is a need for a new method for detecting infectious diseases that is quick, simple, and has high detection sensitivity.
  • Patent Document 1 reports a system in which micro chambers are integrated and connected to a heater or the like to perform a biochemical reaction of a biological sample with high throughput.
  • the system is not sensitive enough to be detected at the cellular level, and it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a huge number of cells with high sensitivity.
  • Patent Document 2 reports a technique for observing the action of a substance on cells by patterning a polymer on a substrate, immobilizing a substance on the substrate, and causing cells to act on the immobilized substance. Has been. However, in this technique, it is difficult to fix a fixed number of cells in each pattern, and it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a vast number of cells with high sensitivity.
  • Patent Document 3 reports an array chip in which a large number of microwells designed to store one lymphocyte are integrated. However, since only one cell can be introduced into the microwell, it is difficult to screen more than the number of microwells integrated on the array chip. Therefore, even with the array chip, it is difficult to detect a small number of target cells mixed in a huge number (1 to 10 million) of cells with high sensitivity. Furthermore, it is considered extremely difficult to further culture or PCR the introduced cells in the microwells of the array chip.
  • a microarray chip having a plurality of microchambers which can store a plurality of cells per microchamber.
  • specific cells targeted can be detected quickly, simply and with high sensitivity.
  • the present inventors can not only store a plurality of cells in each microchamber provided in the microarray chip, but also store the cells in each microchamber by changing the size and the like of the microchamber. It was found that the number of cells can be controlled to an arbitrary constant.
  • the present inventors use a microarray chip that includes a plurality of microchambers, can store a plurality of cells per microchamber, and has a water contact angle of 10 ° or less on the surface.
  • the target cells can be stored in a constant number and evenly in each microchamber, and a large number of target cells can be held on a single microarray chip. It was found that can be detected quickly, conveniently and with high sensitivity.
  • the present invention has been completed as a result of further studies based on the above findings, and includes, for example, the inventions described in the following sections.
  • Detection method ⁇ 1>.
  • a detection method for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells (1) a step of holding a cell in the sample in a microarray chip having a plurality of microchambers, the microarray chip capable of storing a plurality of cells per one microchamber, and (2) A detection method comprising a step of confirming the presence or absence of a specific cell in cells held on a microarray chip.
  • Item 2. The detection method according to Item 1, wherein the ratio of (inner diameter: depth) of the microchamber is (1: 0.35 to 1).
  • the detection method according to Item 2 wherein the microchamber has an inner diameter of 20 to 500 ⁇ m and a depth of 20 ⁇ m or more.
  • Item 4. Item 4. The detection method according to any one of Items 1 to 3, wherein the specific cell is a cell infected with an infectious disease-causing pathogen.
  • Item 5. Item 5. The detection method according to Item 4, wherein the infectious disease-causing pathogen is a malaria parasite.
  • Item 6. Item 6. The detection method according to any one of Items 1 to 5, wherein the sample containing a plurality of cells is a sample containing a plurality of blood cells.
  • Item 7. Item 7. The detection method according to any one of Items 1 to 6, wherein the microarray chip can store at least 10 cells per one microchamber.
  • Item 8 The detection method according to any one of Items 1 to 7, wherein the microarray chip includes at least 1000 microchambers.
  • Item 9. Item 9. The detection method according to any one of Items 1 to 8, wherein a water contact angle on the surface of the microarray chip is 10 ° or less.
  • Detection kit Item 10 A microarray chip having a plurality of microchambers, the microarray chip capable of storing a plurality of cells per one microchamber, and a specific cell contained in the sample from a sample containing a plurality of cells Detection kit for detection.
  • Item 11. Item 11. The detection kit according to Item 10, wherein the sample containing a plurality of cells is a sample containing a plurality of blood cells, and the specific cells are blood cells infected with an infectious disease-causing pathogen.
  • Microarray chip A microarray chip comprising a plurality of microchambers, capable of storing a plurality of cells per microchamber, and having a surface water contact angle of 10 ° or less. Item 13. Item 13. The microarray chip according to Item 12, wherein the ratio of (inner diameter: depth) of the microchamber is (1: 0.35 to 1). Item 14. Item 14. The microarray chip according to Item 13, wherein the microchamber has an inner diameter of 20 to 500 ⁇ m and a depth of 20 ⁇ m or more. Item 15. Item 15.
  • microarray chip according to any one of Items 12 to 14, wherein the microchambers are arranged in a lattice pattern, and the shortest distance between the microchambers is 10 to 300 ⁇ m. Item 16. Item 16. The microarray chip according to any one of Items 12 to 15, wherein cells are held in the microchamber.
  • Item 17 Method for screening drug candidate substance A method for screening a drug candidate substance using a microarray chip comprising a plurality of microchambers and cells held in the microchambers, (1) adding a drug candidate substance to the microchamber in which the cells are held; (2) measuring the influence of the drug candidate substance on the cells, and selecting a substance exhibiting a desired activity; A method for screening drug candidate substances.
  • Item 18. Item 18. The method for screening a drug candidate substance according to Item 17, wherein after the step (1), cells are cultured in the microchamber and subjected to the step (2).
  • Item 19 Item 19. The method for screening a drug candidate substance according to Item 17 or 18, wherein the ratio of (inner diameter: depth) of the microchamber is (1: 0.35 to 1). Item 20.
  • Item 20. The method for screening a drug candidate substance according to Item 19, wherein the microchamber has an inner diameter of 20 to 500 ⁇ m and a depth of 20 ⁇ m or more.
  • a specific cell contained in a sample can be detected quickly, simply and with high sensitivity from a sample containing a plurality of cells, as compared with the conventional detection method.
  • a specific target cell can be rapidly, highly sensitively and easily detected from a sample containing a plurality of cells.
  • Microarray chip According to the microarray chip of the present invention, a specific target cell can be rapidly, highly sensitively and easily detected from a sample containing a plurality of cells.
  • the influence of various drug candidate substances on cells can be measured easily and rapidly, and substances exhibiting desired activity can be selected efficiently.
  • a large number of cells are held on one microarray chip, and specific cells serving as detection targets are detected from these cells.
  • specific cells for example, even a large number of cells of about 1 million can be held on one microarray chip, and even if only one specific cell to be targeted exists, Can be detected.
  • a specific cell as a detection target and a large number of cells (that is, a cell group) including the specific cell are not particularly limited.
  • a cell expressing a specific gene or a cell in which biological substances such as nucleic acids, proteins, lipids, and sugars are excessive or deficient than usual is detected as a specific cell from various cell groups.
  • Such specific cells may be cells that exist in nature or may be cells that have been subjected to artificial treatment.
  • the cells existing in the natural world are not particularly limited, and examples thereof include pathogenic cells, diseased cells, cells infected with pathogenic bacteria or pathogenic organisms, mutated cells, unknown cells having specific properties, and the like.
  • the artificial treatment is not particularly limited, and examples thereof include physical treatment (eg, electromagnetic wave irradiation), chemical treatment (eg: drug treatment), genetic engineering treatment (eg: gene recombination treatment), and the like. .
  • a treatment that has a known effect on cells can be applied to the cell group, and a cell that does not show the effect or a cell that shows the effect more strongly can be detected as a specific cell.
  • a cell that does not show the effect or a cell that shows the effect more strongly can be detected as a specific cell.
  • cells exhibiting resistance or high sensitivity to drug treatment can be detected as specific cells.
  • the cell group is not particularly limited. It may be a group of cells derived from a multicellular organism as well as a group of unicellular organisms. Examples of cells derived from multicellular organisms include cells obtained from normal tissues or pathological tissues of organisms, and cultured cells derived from these cells. Moreover, the organism from which these cells are obtained is not particularly limited. For example, it may be an animal-derived cell or a plant-derived cell, and more specific examples include, but are not limited to, vertebrate (particularly mammals and birds) -derived cells, insect-derived cells, plant cultured cells, and the like. Moreover, even if it is the group of the same cell, the group in which multiple types of cells are mixed may be sufficient.
  • More specific examples of detecting specific cells using the detection method of the present invention include, for example, detecting malaria parasite-infected erythrocytes from blood cells of malaria parasite infection patients.
  • detecting malaria parasite-infected erythrocytes from blood cells of malaria parasite infection patients In the case of a Plasmodium infection, even if there is only one infected blood cell in a large number of blood cells of about 1 million, this infected blood cell can be detected.
  • it can be preferably used in searching for cancer stem cells present in a cancer cell group.
  • cells that have a specific property by the treatment can be selected from the group of artificially treated cells. It is also possible to select cells that are particularly strong and have the specific properties.
  • cells that produce the substance can be detected particularly efficiently from a plurality of cells transformed to produce a particular substance by genetic recombination treatment.
  • cells that have lost a specific function due to electromagnetic wave irradiation treatment or drug treatment can be detected.
  • cells having resistance or high sensitivity to these treatments can be detected.
  • the specific cells as described above can be detected quickly, simply and with high sensitivity, and therefore, it is suitably used not only in a laboratory but also in a clinical site, for example. be able to.
  • detection and thus screening of cells having specific properties (eg drug resistance, drug sensitivity, expression of specific genes, over- or under-specific biological substances, etc.) and further detection of detected cells It can be used for analysis and the like.
  • the analysis after detecting specific cells is not particularly limited, and for example, dye or fluorescent staining, PCR analysis, culture, and the like can be performed in a microchamber.
  • the cells can be collected from the microchamber and cultured, and further subjected to various analyses.
  • the various cells can be cultured inside and outside the microchamber to examine their properties in more detail. More specifically, for example, at the bedside or the like, the presence / absence / degree of infected cells can be quickly grasped by a patient who may be infected with an infectious disease.
  • cancer eg, blood cancer
  • tissue collected by surgical operation can be used to examine the proportion of cancer cells that are resistant or sensitive to anticancer agents and can be used for treatment. .
  • the detection method of the present invention after storing (holding) a plurality of cells (cell groups) in each microchamber provided in the microarray chip, specific cells that are detection targets are specifically selected from the stored cells.
  • a detectable label can be applied.
  • a sample containing a plurality of cells (cell group) it is possible to label specific cells as detection targets in advance. It is preferable to label specific cells in advance because the labeling efficiency tends to be uniform.
  • the labeling method is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the properties of the specific cell that is the detection target. However, in view of the simplicity of detection and toxicity, a fluorescent label is particularly preferable. is there.
  • the specific cells can be detected based on the presence or absence of the label (for example, the presence or absence of a fluorescent label). Further, based on the number of labels to be detected (for example, the number of fluorescent labels), the cells in the sample can be detected. It is also possible to perform a quantitative analysis as to how many specific cells are present. Furthermore, based on the intensity of the label (for example, the fluorescence intensity of the fluorescent label), the intensity of the property of the detected specific cell can be analyzed. Specifically, for example, when a specific target cell is a cell infected with an infectious disease pathogen, the quantitative data and the intensity of labeling of each cell (for example, fluorescence intensity in the case of a fluorescent label) By paying attention, it is also possible to analyze the severity and stage of infection.
  • a specific cell to be targeted is a cell given a specific property by artificial processing
  • the ratio that can be given the specific property by the specific artificial processing or the specific property of each cell Expression intensity can be determined. Therefore, it is possible to examine how efficiently the nature of the cell can be changed by what kind of artificial processing, and how the nature can be changed.
  • the detection method of the present application cells are stored in the microchamber provided in the microarray chip. For this reason, in the detection method of the present application, at the time of detection, it is easy to know in which part of the microarray chip the target specific cell exists. From this, after the detection, the specific cells can be easily collected and further analyzed by the PCR method.
  • cells can be uniformly and efficiently stored in each microchamber provided in the microarray chip. That is, in the detection method of the present application, substantially the same number of cells can be stored in each microchamber provided in the microarray chip.
  • the cells are uniformly formed as a single layer (single layer) on the bottom of the microchamber. Can be retained. That is, the cells can be held at the bottom of each microchamber with little overlap. For this reason, cells overlap in the microchamber, and specific cells that are detection targets are located under other cells, so that problems such as difficulty in detection hardly occur.
  • the single layer enables easy focusing when observing with a microscope. Even in the observation with a confocal laser microscope, the background can be suppressed and observation with high sensitivity becomes possible.
  • the microarray chip used in the detection method of the present invention is preferably the microarray chip of the present invention described below.
  • the sample including a plurality of cells to which the detection method of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it may include a cell group in which specific cells serving as detection targets are present. Specific examples of such cell groups and specific cells that are detection targets are given below, but are not limited thereto.
  • Infected blood cells in infectious diseases Infected blood cells in infectious diseases can be detected by the detection method of the present invention.
  • infectious diseases include protozoan infections represented by malaria parasites, viral infections represented by human immunodeficiency virus (HIV), bacterial infections represented by Mycobacterium tuberculosis, and the like.
  • malaria parasites infect red blood cells.
  • the specific cells to be detected in the detection method of the present invention are blood cells infected with malaria parasites, that is, erythrocytes infected with malaria parasites.
  • the malaria parasites are exemplified by four types of Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum and oval malaria parasites.
  • HIV infects certain lymphocytes (T cells).
  • the specific cells to be detected in the detection method of the present invention are blood cells infected with HIV, that is, certain lymphocytes (T cells) infected with HIV.
  • T cells certain lymphocytes
  • examples of HIV include two types, HIV-1 and HIV-2.
  • certain types of white blood cells are infected with M. tuberculosis.
  • the specific cells to be detected in the detection method of the present invention are blood cells infected with M. tuberculosis, that is, certain white blood cells (monocytes) infected with M. tuberculosis.
  • the detection method of the present invention also detects infected blood cells in other infectious diseases.
  • blood cells are not limited as long as they are cells contained in blood.
  • blood cells include red blood cells, platelets, and white blood cells (lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils).
  • red blood cells platelets
  • white blood cells lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils.
  • a sample containing a plurality of these blood cells can be used as a sample containing a plurality of cells for use in the detection method of the present invention.
  • blood or body fluid containing a plurality of blood cells can be used as the sample.
  • (A) -1-2 Marker-expressing cells in cultured cells
  • specific cells in cultured cells can be detected.
  • the cultured cells are not particularly limited, and preferred examples include mammalian or insect-derived cell lines (eg, HEK293 cells, Hela cells, 3T3 cells, COS-7 cells, CHO cells, Jurkat cells, Sf9 cells) and yeast.
  • the detection method of the present invention can be used even if the target specific cells are present in a very small amount in the sample (for example, even if the sample is present in the cells at 0.0001%). Since it is possible to sufficiently detect a specific cell, it is particularly advantageous when a sample having a very small ratio of the specific cell to be detected is used.
  • cancer stem cells present in a cancer cell group can be mentioned. Cancer stem cells are self-replicating and proliferating, are present in very few malignant tumors (cancer), and express the same markers as stem cells (eg CD34, CD133, CD117, Sca-1 etc.) According to the detection method of the present invention, it can be preferably detected.
  • a cell expressing a specific gene or protein is also a detection target of the detection method of the present invention.
  • microarray Chip In the detection method of the present invention, a microarray chip that includes a plurality of microchambers and that can store a plurality of cells per microchamber can be used. If it is such a microarray chip, it will not be limited.
  • the substrate of the microarray chip is not limited, and polymers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polycarbonate, polydimethylsiloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA), and cyclic olefin copolymer (COC), metals such as silicon, glass, Examples thereof include quartz glass, and a combination of a plurality of materials such as a polymer and glass or metal laminated together (for example, PDMS and glass). Preferred are polystyrene, PMMA, glass, silicon and the like.
  • the size of the microarray chip is not limited and is appropriately selected according to a device for detecting and measuring a specific cell as a detection target.
  • the microarray chip is formed with a microchamber.
  • the microchamber may be produced by directly processing the substrate, or may be produced by attaching a film in which microthrough holes or microchambers are formed to these substrates.
  • the microchamber is produced by directly processing these substrates.
  • the microchamber is not only manufactured by a lithography method (optical lithography, electron beam lithography, etc.), which is a microfabrication technology in the field of semiconductor research, but also excavation processing technology for drilling holes using a microdrill, laser processing It can be produced by a technique for making any minute hole. For example, a LIGA (Lithographie Galvanoformung Abformung) process is exemplified.
  • the microarray chip can be subjected to surface treatment as necessary.
  • the surface treatment method is not limited, and examples thereof include plasma treatment and corona discharge treatment.
  • plasma treatment Preferable is plasma treatment, and oxygen plasma treatment is exemplified.
  • the substrate of the microarray chip is a hydrophobic material (polymer such as polystyrene or PMMA), it is preferable to perform a hydrophilic treatment such as an oxygen plasma treatment.
  • a hydrophilic treatment such as an oxygen plasma treatment.
  • the substrate of the microarray chip is made of a hydrophilic material (silicon, glass, etc.), it is not necessary to perform such treatment. Further, it may be prepared by coating with protein, lipid or the like and performing surface treatment.
  • the shape of the microchamber is not particularly limited.
  • the shape of the microchamber is cylindrical, inverted hemispherical, inverted conical, inverted pyramid (inverted triangular pyramid, inverted quadrangular pyramid, inverted pentagonal pyramid, inverted hexagonal pyramid, inverted polygonal pyramid with a heptagon or more)
  • a shape such as a rectangular parallelepiped or a combination of two or more of these shapes is exemplified.
  • the bottom of the microchamber is usually flat, but may be curved, convex, or concave.
  • the bottom surface is the opening of the microchamber, but the shape of the inverted cone or inverted pyramid cut out from the top (the bottom of the microchamber is flat) is also available. It can be illustrated. Furthermore, in the case of a shape obtained by cutting a part from the top of an inverted cone or inverted pyramid, the bottom of the microchamber can be a curved surface or the like as described above.
  • the shape of the microchamber is preferably cylindrical, inverted hemispherical, inverted conical, or inverted pyramid, more preferably cylindrical, inverted hemispherical, and most preferably cylindrical. Further, the microchamber preferably has one type of shape in one microarray chip.
  • the number of cells stored in the microchamber depends on the concentration of all cells contained in the sample, the proportion of specific cells that are detection targets in all the cells contained in the sample, the size and number of microchambers described below, etc. To be determined as appropriate. In addition, as the number of cells held in the microarray chip increases, specific cells that are detection targets can be detected with high sensitivity.
  • Cell retention in the microarray chip means that cells are stored in the microchamber provided in the microarray chip. Therefore, as the number of microchambers increases, the number of cells that can be stored in one microchamber increases.
  • the microarray chip can hold many cells.
  • one microarray chip can hold 1 million or more cells. More preferably, 2 million to 10 million cells, more preferably 3 million to 10 million cells can be carried. In this case, it is particularly preferable to provide 10,000 or more microchambers on one microarray chip.
  • the number of cells stored in each microchamber is not limited as long as the cells can be held in the microarray chip and two or more cells can be stored in each microchamber. Similar to the above, 10 or more cells are stored in each microchamber from the viewpoint that the greater the number of cells held in the microarray chip, the more sensitive the specific cells that are detection targets can be detected. It is preferable to be able to store 50-500 cells, more preferably 100-300 cells.
  • microarray chip when 100,000 microchambers are provided in one microarray chip, and about 10 cells are stored in each microchamber, about 1 million cells are held per microarray chip. It will be.
  • the dimensions of each microchamber are not limited.
  • the dimensions of the microchambers are preferably determined so that the same number of cells are stored in each microchamber. For this reason, it is more preferable that the dimensions of each microchamber are the same.
  • the “inner diameter” means the diameter of the opening of the microchamber on the surface of the microarray chip.
  • the “inner diameter” means the length of one side of the opening of the microchamber.
  • “Depth” means the distance between the opening of the microchamber and the deepest location of the microchamber.
  • the inner diameter and depth of the microchamber have a certain ratio.
  • the ratio of (inner diameter: depth) is preferably (1: 0.35 to 1), more preferably (1: 0.35 to 0.85), and (1: 0) .4 to 0.85), more preferably (1: 0.45 to 0.8).
  • the inner diameter of the microchamber is preferably 20 to 500 ⁇ m, more preferably 20 to 400 ⁇ m, still more preferably 20 to 300 ⁇ m, still more preferably 30 to 250 ⁇ m, and particularly preferably 30 to 200 ⁇ m.
  • the depth is preferably 20 to 200 ⁇ m, more preferably 20 to 100 ⁇ m, still more preferably 20 to 80 ⁇ m, still more preferably 20 to 70 ⁇ m, and particularly preferably 30 to 70 ⁇ m, although depending on the value of the inner diameter. is there.
  • the preferable value of the inner diameter is determined by the preferable ratio (inner diameter: depth) described above, the preferable value of the depth of the microchamber can be determined.
  • the microchamber preferably has a depth of 20 ⁇ m or more in order to store cells. That is, it is particularly preferable that the microchamber has an inner diameter and a depth having the above-described ratio, the inner diameter has the above-described value, and the depth is 20 ⁇ m or more.
  • microchamber With such a microchamber, cells can be stored in the microchamber as a single layer more uniformly and efficiently.
  • the number of micro chambers is not particularly limited. As described above, as the number of cells held in the microarray chip increases, infected blood cells can be detected with high sensitivity. From this viewpoint, the number of micro chambers is 1000 or more per one microarray chip, more preferably 2,000 to 50,000, still more preferably 2,000 to 20,000.
  • the distance between each microchamber is not particularly limited. As shown in FIG. 1, when the micro chambers are arranged in a lattice shape, the shortest distance between the micro chambers, that is, the distance of (i) in FIG. 1, is 10 to 300 ⁇ m, preferably 50 to 300 ⁇ m, more preferably 100 to 200 ⁇ m. Is exemplified.
  • the distance (i) can be set to 100 to 200 ⁇ m.
  • the shape, number, dimensions, and distance between the microchambers of the microchambers are the ratio of specific cells that are detection targets in the total cells contained in the sample, the number of cells to be stored in the microchambers, and the microarray chip. It is determined appropriately by those skilled in the art depending on the number of cells desired.
  • the surface state of the microarray chip is not limited as long as the cells can be held on the microarray chip.
  • the surface of the microarray chip is preferably hydrophilic. Specifically, when the water contact angle on the surface of the microarray chip is preferably 10 ° or less, it is more efficient, and the same number of cells can be uniformly stored as a single layer in each microchamber. From this viewpoint, the water contact angle on the surface of the microarray chip is more preferably 8 ° or less, and further preferably 5 ° or less.
  • the “surface of the microarray chip” is meant to include the inner surface of the microchamber.
  • the water contact angle on the substrate surface of the microarray chip is within the above-mentioned preferred range, no further treatment is required, and those not within the above-mentioned preferred range are within the preferred range.
  • the surface should just be processed so that it may become.
  • a person skilled in the art can perform a surface treatment on the microarray chip so as to obtain an optimum water contact angle while examining the degree of cell adhesion and the like.
  • the water contact angle may be adjusted by performing oxygen plasma treatment or the like on the surface.
  • the water contact angle is measured as follows.
  • the water contact angle is measured using a known method ⁇ / 2.
  • the ⁇ / 2 method is a method for obtaining the contact angle from the angle of the straight line connecting the left and right end points and the vertex of the droplet with respect to the solid surface. For example, when determining the water contact angle on the surface of the microarray chip, distilled water is dropped at a plurality of different locations on the surface, and the contact angle of each dropped liquid droplet is determined. The value obtained by this can be called a water contact angle.
  • a cylindrical micro chamber is formed in a lattice shape so that the distance (i) is 100 to 200 ⁇ m, and the water contact angle of the surface is set to 10 ° or less.
  • each microchamber has an inner diameter of 100 ⁇ m and a depth of 50 to 100 ⁇ m, and about 100 cells are stored per microchamber.
  • cells can be stored in each microchamber as a single layer more uniformly and efficiently.
  • Method for Producing Microarray Chip The aforementioned microarray chip is appropriately produced by a conventionally known method in this field.
  • the fabrication of a microarray chip is exemplified by a method of fabricating a chip mold using lithography and etching, and molding the chip from the mold.
  • the above-described microarray chip was produced by this method. Specifically, a polymer (plastic) material chip is used as the substrate of the microarray chip, and in accordance with the LIGA process, which is produced using X-ray lithography, electroforming (plating), and forming techniques, among electron beam lithography methods.
  • the above-described microarray chip can be manufactured.
  • the detection method of the present invention is a detection method for detecting specific cells contained in a sample from a sample containing a plurality of cells.
  • a plurality of microchambers A microarray chip comprising: a microarray chip capable of storing a plurality of cells per microchamber; and (2) a cell held in the microarray chip. And at least a step of confirming the presence or absence of specific cells.
  • Cell retention on the microarray chip is a procedure in which cells are brought into contact with the microarray chip, cells are spread on the microarray chip, cells are stored in each microchamber, and then excess cells are removed (washed) from the microarray chip. This is possible at least.
  • the method of contacting the cells with the microarray chip is not limited as long as the cells can be brought into contact with the microarray chip.
  • it may be performed by bringing cultured cells or cells themselves collected from a living body into contact with a microarray chip, mixing these with a solution such as a buffer solution or a culture solution, and bringing the obtained mixed solution into contact with the microarray chip. May be performed.
  • the blood cells may be contacted with the microarray chip by bringing the collected blood itself into contact with the microarray chip (addition, dropping, etc.), and the collected blood is mixed with a solution such as a buffer solution or a culture solution.
  • the obtained mixed solution may be brought into contact with a microarray chip.
  • the contact of blood cells with the microarray chip is performed by separating the blood cells from the collected blood, mixing it with a solution such as a buffer solution or a culture solution, and then bringing the mixture into contact with the microarray chip. You may go.
  • contact of cultured cells with the microarray chip may be performed by bringing the cultured cells into contact with the microarray chip together with the medium (addition, dropping, etc.). It is also possible to carry out by mixing the medium containing the solution with a solution such as a buffer solution or a culture solution, and bringing the obtained mixed solution into contact with the microarray chip. Alternatively, the cultured cells may be collected from the medium, mixed with a solution such as a buffer solution or a culture solution, and then contacted with the mixed solution to the microarray chip.
  • a solution such as a buffer solution or a culture solution
  • the method of expanding the cells on the microarray chip is not limited as long as the cells can be expanded on the microarray chip.
  • the cells may be developed on the microarray chip by bringing a plurality of cells (cell group) into contact with the microarray chip, or may be further developed using a developing solution after contacting.
  • the developing solution include a buffer solution, a culture solution, and a surfactant.
  • the blood cells may be spread on the microarray chip by bringing the blood cells into contact with the microarray chip as described above.
  • the blood cells may be further developed using a developing solution.
  • the cells to be developed are cultured cells, they can be developed on the microarray chip in the same manner as the blood cells. At least through such a procedure, cells (for example, blood cells and cultured cells) can be stored in each microchamber. If cells are difficult to spread on the chip (especially when air remains at the bottom of the chamber), insert the chip into a medium or buffer solution in advance and perform ultrasonic treatment, or use a brush or the like on the chip surface. There is no problem even if the cells are brought into contact with the microarray chip and developed after the solution is developed so that air does not enter the microchamber.
  • the concentration of the cell when the cell is spread on the microarray chip is not particularly limited, and may be 1 ⁇ 10 10 to 1 ⁇ 10 4 (cells / ml), for example, depending on the cell type. As described below, by removing excess cells after expanding the cells, it is possible to store the cells as a single layer almost uniformly in each microchamber. Further, the cell concentration to be appropriately developed may be adjusted according to the cell type and microarray chip to be used.
  • the method of removing (washing) excess cells from the microarray chip is not limited as long as excess cells can be removed from the microarray chip (that is, from inside and outside the microchamber).
  • the microarray chip may be lightly tilted and excess cells may be removed by flowing a washing solution such as a buffer solution, a culture solution, a surfactant, or an enzyme.
  • a washing solution such as a buffer solution, a culture solution, a surfactant, or an enzyme.
  • a device such as a cell scraper may be used.
  • the concentration of cells to be developed is reduced (for example, 1 ⁇ 10 6 cells / ml or less for red blood cells), thereby increasing the concentration of cells to be developed (for example, 1 ⁇ 10 8 cells / ml or more for red blood cells). ),
  • the number of cells stored in each microchamber after the removal operation can be reduced. Even in this case, the number of cells stored in each microchamber is approximately the same. Therefore, by setting the concentration of cells to be developed to be thin, it is possible to adjust so that one to several cells are uniformly stored as a single layer in each microchamber.
  • the concentration of cells to be expanded is increased, the number of cells that can be stored in the microchamber is not increased because the cells are uniformly stored as a single layer in the microchamber after the removal operation.
  • the number of cells stored is limited by the bottom area of the microchamber.
  • the removal (washing) of excess cells from the microarray chip is performed after the cells are brought into contact with and spread on the microarray chip and then adsorbed appropriately in the microchamber.
  • the time required for the adsorption is not limited and can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • the method is not limited as long as the specific cell can be detected.
  • a specific cell that is a detection target is a cell that undergoes a morphological change
  • bonds specifically with the said specific cell exists, it can detect by confirming the presence or absence of a coupling
  • examples of such substances include, but are not limited to, antibodies and aptamers.
  • a substance that specifically reacts with the specific cell exists it can be detected by confirming the presence or absence of the reaction using the substance.
  • the method for confirming the presence or absence of such binding or reaction is not particularly limited, but it is preferable to use fluorescence.
  • fluorescence For example, if a substance that specifically binds to specific cells is used after being fluorescently labeled, only specific cells in the sample can be labeled. Therefore, the presence or absence of the specific cell can be easily confirmed by the presence or absence of fluorescence.
  • a fluorescent label is applied so that only specific cells in the sample are labeled, and after the cells are held in the microchamber, the fluorescent label is detected to detect the specific cells. Can be confirmed. Alternatively, only specific cells may be fluorescently labeled after the cells are retained in the microchamber.
  • the nuclei of pathogenic microorganisms in the infected blood cells are fluorescently stained before contacting the blood cells with the microarray chip.
  • Infected blood cells can be detected based on the fluorescence using an apparatus such as a scanner.
  • the nuclei of pathogenic microorganisms in the blood cells may be fluorescently stained to similarly detect the infected blood cells.
  • a specific protein specifically amino acid sequence
  • a fluorescently labeled antibody or specified by using a fluorescently labeled probe.
  • an antibody specific for the marker and fluorescently labeled is allowed to act on the cultured cells in advance and held in the microchamber. Thereafter, the specific cells can be detected based on the fluorescence using an apparatus such as a fluorescence microscope or an array scanner.
  • an apparatus such as a fluorescence microscope or an array scanner.
  • cells expressing a specific marker in the cultured cells are labeled with a fluorescently labeled antibody, and the cells are detected based on the fluorescence. May be.
  • the infected erythrocytes are labeled by fluorescent staining so that the nuclei of infectious microorganisms such as protozoa are stained. Label with a fluorescent substance.
  • the erythrocyte cell suspension containing the labeled infected erythrocytes is spread on a microarray chip, excess blood cells are removed and washed, and then fluorescence is detected by a fluorescence microscope, a microarray scanner, or the like.
  • fluorescence intensity, the number of labeled cells, etc. it is possible to analyze not only the presence or absence of infectious disease but also the degree and type.
  • microchambers are arranged on the microarray chip so as to be 50 vertically and 200 horizontally, and 100 blood cells are stored in each microchamber. You can also When one infected blood cell is detected per one microchamber, the infection rate can be determined to be 1%.
  • a microarray chip can hold a total of 1 million blood cells, and even if one of the blood cells is infected, the infected blood cell can be detected. In this case, according to the detection method of the present invention, it can be said that detection is possible even when only 0.0001% of infected blood cells are present in the sample.
  • the detection kit of the present invention is a kit for detecting a specific cell from a sample containing a plurality of cells, comprising a plurality of microchambers, and a plurality of microchambers per one microchamber.
  • a microarray chip capable of storing a plurality of cells.
  • the detection kit can detect a specific target cell quickly, with high sensitivity and more easily from a sample containing a plurality of cells. For example, the presence or absence and degree of infected blood cells in an infectious disease can be detected quickly, simply and with high sensitivity.
  • cancer stem cells can be rapidly detected from a group of cancer cells.
  • cells expressing the specific gene can be screened from a group of cells containing cells expressing the specific gene (for example, cultured cells, yeast group, etc.).
  • the detection kit of the present invention may further contain a buffer solution, a culture solution, and the like that can be used when cells are brought into contact with the microarray chip.
  • the detection kit of the present invention may further contain a buffer solution, a culture solution, a surfactant and the like that can be used when cells are developed on the microarray chip.
  • the detection kit of the present invention may further contain a washing solution such as a buffer solution, a culture solution, a surfactant, and an enzyme that can be used when excess cells are removed (washed) from the microarray chip.
  • a washing solution such as a buffer solution, a culture solution, a surfactant, and an enzyme that can be used when excess cells are removed (washed) from the microarray chip.
  • the detection kit of the present invention may further contain a pipetteman or the like that can be used when cells are brought into contact with a microarray chip, developed, and further removed from the microarray chip.
  • the detection kit of the present invention may further contain a device such as a cell scraper that can be used for removing and washing excess cells adsorbed to portions other than the microchamber.
  • a device such as a cell scraper that can be used for removing and washing excess cells adsorbed to portions other than the microchamber.
  • the detection kit of the present invention may further contain a device for detecting specific cells that are detection targets.
  • a device for detecting specific cells that are detection targets examples include a fluorescence microscope and a microarray scanner.
  • the detection kit of the present invention includes a fluorescent staining agent (for example, a fluorescent dye) for staining the specific cell.
  • a fluorescent staining agent for example, a fluorescent dye
  • Fluorescently labeled antibodies, etc. may be contained.
  • the detection kit of the present invention may further contain a manual for using the detection kit.
  • the microarray chip of the present invention includes a plurality of microchambers, can store a plurality of cells per microchamber, and has at least a feature that a water contact angle on the surface is 10 ° or less. As long as it is described as above.
  • the microarray chip of the present invention Since the microarray chip of the present invention has the above characteristics, it is possible to uniformly store a certain number of cells in each microchamber. From the viewpoint of storing a certain number of cells uniformly in each microchamber more efficiently, the water contact angle of the microarray chip is preferably 10 ° or less, more preferably 8 ° or less, and even more preferably 5 ° or less. . The water contact angle can be adjusted as described above.
  • the inner diameter and the depth of the microchamber have a certain ratio.
  • the ratio of (inner diameter: depth) is preferably (1: 0.35 to 1), more preferably (1: 0.35 to 0.85), and (1: 0) .4 to 0.85), more preferably (1: 0.45 to 0.8).
  • the inner diameter of the microchamber is preferably 20 to 500 ⁇ m, more preferably 20 to 400 ⁇ m, still more preferably 20 to 300 ⁇ m, still more preferably 30 to 250 ⁇ m, and particularly preferably 30 to 200 ⁇ m.
  • the depth is preferably 20 to 200 ⁇ m, more preferably 20 to 100 ⁇ m, still more preferably 20 to 80 ⁇ m, still more preferably 20 to 70 ⁇ m, and particularly preferably 30 to 70 ⁇ m, although depending on the value of the inner diameter. is there.
  • the preferable value of the depth of the microchamber can be determined.
  • the microchamber preferably has a depth of 20 ⁇ m or more in order to store cells. That is, it is particularly preferable that the microchamber provided in the microarray chip of the present invention has an inner diameter and a depth having the above-described ratio, the inner diameter has the above-described value, and the depth is 20 ⁇ m or more.
  • microchamber With such a microchamber, cells can be stored in the microchamber as a single layer more uniformly and efficiently.
  • a microarray chip having such a microchamber is suitable for, for example, infected blood cells in infectious diseases, and particularly blood cells infected with malaria parasites. It is also suitable for various cultured cells (particularly mammalian or insect-derived cells and yeast).
  • the cells as described above can be uniformly stored in the microchamber. That is, approximately the same number of cells can be stored in each microchamber. For this reason, if the number of microchambers provided in the microarray chip and the number of cells stored in one microchamber are grasped, the number of cells held by the microarray chip can be estimated. Therefore, if the number of detected specific cells is known, it is possible to easily calculate how much the specific cells are present in a plurality of cells in the sample.
  • the method for counting the number of cells stored in the microchamber is not particularly limited. For example, the number of stored cells can be counted by observing the microchamber with a microscope.
  • the microarray chip of the present invention can also be preferably used for screening of drug candidate substances described below. Since almost the same number of cells are stored in each microchamber, the state of the cells in each microchamber is uniform, and when different drug candidate substances are added to each microchamber, what effect each drug candidate substance has This is because it is easy to compare and evaluate whether to give to cells.
  • cells can be stored in the microchamber as a single layer. That is, cells can be stored with little overlap on the bottom of each microchamber. For this reason, cells overlap in the microchamber, and specific cells that are detection targets are located under other cells, so that problems such as difficulty in detection hardly occur.
  • the single layer enables easy focusing when observing with a microscope. Even in the observation with a confocal laser microscope, the background can be suppressed and observation with high sensitivity becomes possible.
  • another type of cell can be placed on a cell stored in a single layer, and the interaction between the cells can be studied simply and efficiently. It is also possible to carry out culture by placing other types of cells and to examine the interaction of each cell in more detail.
  • cells can be cultured in a microchamber for at least several days.
  • cultured cells are often killed even if an appropriate culture environment is provided when the culture space is narrow or the number of cells at the start of the culture is small.
  • the cultured cells can be stored and then cultured for at least several days.
  • the specific cell after detecting a specific cell as a detection target by the microarray chip of the present invention, the specific cell can be cultured in the microchamber. Thereby, time-dependent examination can be performed on the specific cells in the microchamber.
  • the response to the stimulus can be examined by culturing the specific cell with the stimulus.
  • the stimulation include, but are not limited to, the addition of drugs such as growth factors and vitamins, changes in culture temperature, no addition of essential nutrients, and the like.
  • differentiation is induced in the specific cell by the stimulation, it is preferable that the specific cell can be detected and induced in the microchamber.
  • PC12 cells (Rat adrenal pheochromocytoma cell line) are detected in a microchamber, and nerve growth factor (NGF) is added to this and cultured for several days to differentiate into neuronal cells.
  • NGF nerve growth factor
  • the microarray chip of the present invention can be preferably used for screening drug candidate substances.
  • various cells can be used as detection targets.
  • it is possible to target cultured cells such as blood cells, human-derived cells and animal cells, yeast cells, microbial cell stem cells, and cancer cells exemplified above.
  • the microarray chip of the present invention it is possible to detect, measure, analyze, etc. only specific target cells quickly, simply and with high sensitivity from among the cells present in the sample.
  • a microarray chip having a plurality of microchambers and holding cells in the microchambers is used.
  • a drug candidate substance is added to the microchamber holding the cells.
  • the same drug candidate substance may be added to all the microchambers provided in the microarray chip, or the drug candidate substance to be added may be changed depending on the microchamber.
  • the influence of the drug candidate substance on the cells held in the microchamber is measured.
  • the method for measuring the influence may be appropriately set according to the drug candidate substance to be used, the cell to be used, and the desired activity.
  • a substance exhibiting a desired activity may be selected from drug candidate substances used in the experiment. For example, in the example of screening a substance that acts as the above-described anticancer agent, a substance that has an effect of killing cancer cells with high efficiency may be selected.
  • the microarray chip used in the screening method for drug candidate substances of the present invention is not particularly limited, but is preferably the above-described microarray chip of the present invention.
  • the microarray chip of the present invention cells can be stored in a microchamber as a single layer more uniformly and efficiently.
  • cells can be cultured in a microchamber for at least several days. For this reason, if the drug candidate substance screening method of the present invention is carried out using the microarray chip of the present invention, after adding the drug candidate substance, the cells are cultured and maintained for several days or more, and then the substance gives the cells The impact can be measured.
  • the state of the cells in each microchamber can be made uniform. Therefore, if the drug candidate substance screening method of the present invention is carried out using the microarray chip of the present invention, when different drug candidate substances are added to each microchamber, what effect each drug candidate substance has on the cell It is easy to compare and evaluate what to give.
  • FIG. 1 shows the distance (i) when the microchambers are arranged in a lattice pattern.
  • FIG. 2 shows a microarray chip in which microchambers are arranged to be 50 vertically and 200 horizontally, and 100 blood cells are stored in each microchamber, and one infected blood cell per microchamber. An example of detection is shown.
  • FIG. 3 shows an example of the microarray chip used in the first embodiment. The microchamber provided in the microarray chip has an inner diameter of 100 ⁇ m and a depth of 100 ⁇ m. The shortest distance between the microchambers is 200 ⁇ m. The total number of microchambers is 10752.
  • FIG. 4 shows the experimental results of Example 1.
  • FIG. 4 shows the experimental results of Example 1.
  • FIG. 5 shows red blood cells infected with Plasmodium detected by Giemsa staining in a microchamber provided in the microarray chip.
  • FIG. 6 shows the difference in cell expansion rate depending on the water contact angle.
  • the water contact angle on the surface of the microarray chip shown on the left is 80 degrees, and cells hardly enter the chamber (cell expansion rate is 10% or less).
  • the water contact angle on the surface of the microarray chip shown in the center is 25 degrees, and there are some chambers that do not contain cells (cell expansion rate of about 40%).
  • the water contact angle on the surface of the microarray chip shown on the right is 10 degrees, and a certain amount of cells are present in most chambers (cell expansion rate of 90% or more).
  • FIG. 7 shows a state in which red blood cells are stored in the microchamber in three types of microarray chips having microchambers having different inner diameters and depths.
  • FIG. 8 shows HEK-293 cells held in a microchamber provided in the microarray chip.
  • FIG. 9 shows the yeast held in the microchamber provided in the microarray chip.
  • FIG. 10 shows HEK-293 cells cultured in a microchamber provided in the microarray chip.
  • Example 1 Microarray chip used in Example 1 In Example 1, the following microarray chip was used.
  • Microarray chip substrate Polystyrene microarray chip surface treatment: Oxygen plasma treatment
  • Microchamber formation LIGA process Number of cells stored per microchamber: Approximately 100
  • Microchamber shape Cylindrical microchamber dimensions: Inner diameter 100 ⁇ m, Depth 100 ⁇ m Number of microchambers per microarray chip: 10,752 Distance between microchambers: distance 200 ⁇ m corresponding to (i) in FIG. Water contact angle on the surface of the microarray chip: 10 °
  • the microarray chip is shown in FIG.
  • Example 1 a microarray chip manufactured by Starlight Industry Co., Ltd. produced by the LIGA process was used. Specifically, the microarray chip is patterned on a PMMA substrate by an X-ray lithography method, and a PMMA mold is formed by etching. Then, electroforming (plating) is performed, and polystyrene is poured into the produced nickel mold. It was molded with
  • the surface of the microarray chip is subjected to oxygen plasma treatment with a reactive ion etching (RIE: Reactive Ion Etching) apparatus (manufactured by Samco Co., Ltd.) with an output of 200 W and a treatment time of about 20 seconds, thereby making the chip substrate surface hydrophilic. Turned into.
  • RIE reactive ion etching
  • the water contact angle on the surface of the microarray chip thus made hydrophilic was measured by the ⁇ / 2 method as follows. Specifically, 1 to 2 ⁇ l of distilled water is dropped onto a plurality of different points (more than 5 points) on the surface of the obtained microarray chip, and the temperature is adjusted to room temperature using a contact angle meter (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.). The water contact angle was measured. The water contact angle was determined by determining the average of the obtained values.
  • ultrasonic treatment was performed in advance on the hydrophilic microarray chip in order to prevent air from entering the microchamber.
  • the ultrasonic treatment was performed for about 5 minutes by immersing the surface-treated microarray chip in a beaker containing a medium (RPMI1640) using a commonly used ultrasonic cleaning apparatus.
  • Example 3 Detection procedure of Plasmodium-infected erythrocytes (fluorescence labeling method)
  • a malaria parasite infection was targeted as an infectious disease, and an object was to detect red blood cells infected with the infectious disease.
  • the detection procedure by the fluorescent labeling method is as follows. 1) Plasmodium is cultivated by malaria continuous culture method (W. Trager, JB Jensen, Science (1976) 673-675) (37 ° C., 5% CO 2 /5% O 2 , 3% human erythrocytes and 10% human) Cultured under serum-containing RPMI 1640 medium conditions), malaria-infected erythrocytes were obtained.
  • erythrocytes were those obtained by collecting blood from a human and centrifuging (4 ° C., 1500 g, 30 min). As a result of counting the cells under a microscope, the infection rate of erythrocytes of the malaria parasite at this time was 0.5%.
  • the results are shown in FIG.
  • the photograph on the left of FIG. 4 is a bright-field image and shows an entity image near the hole bottom of the microarray chip.
  • the middle photo in FIG. 4 shows all red blood cells on the microarray chip, with Dil staining the cell membrane.
  • the right photograph of FIG. 4 shows only erythrocytes infected with malaria parasites that are stained with SYTO59 among all cells (exactly, the nucleus of protozoa infected with erythrocytes is fluorescently stained, Fluorescence emitted from the nucleus is shown).
  • the detection method of the present invention can be sufficiently detected and diagnosed even if only about 0.0001% of all cells are infected.
  • the entire microarray chip is immersed in distilled water and washed three times. Using the vacuum pump and dryer, the water in the microchamber is rapidly removed at a temperature that does not rupture the cells (room temperature to 60 ° C). Was removed and dried. Then, it observed with the optical microscope.
  • Example 2 The water contact angle and cell deployment efficiency were compared as follows.
  • microarray chip Preparation of microarray chip
  • three types of microarray chips water contact angles of 80 °, 25 °, and 10 °
  • These microarray chips are fabricated in the same manner as in Example 1 described above, but three types of microarray chips having different water contact angles were fabricated by changing the oxygen plasma treatment conditions. Specifically, oxygen plasma treatment was performed under the following conditions. Using a microarray chip having a water contact angle of 80 °: RIE apparatus (manufactured by Samco Co., Ltd.), surface treatment was performed with an output of 200 W and a treatment time of 3 seconds.
  • RIE apparatus manufactured by Samco Co., Ltd.
  • a microarray chip having a water contact angle of 25 °: surface treatment was performed using an RIE apparatus with an output of 200 W and a treatment time of 5 seconds.
  • a microarray chip having a water contact angle of 10 °: surface treatment was performed using an RIE apparatus with an output of 200 W and a treatment time of 20 seconds.
  • Red blood cell detection procedure In Example 2, red blood cells that were not infected with Plasmodium were used. Specifically, cell development efficiency was compared by detecting red blood cells as follows.
  • red blood cells obtained by collecting blood from a human and centrifuging in the same manner as in Example 1 above, and suspending it in a culture medium (RPMI 1640), the human-derived red blood cell suspension (red blood cells in suspension) A concentration of 1 ⁇ 10 8 cells / ml) was obtained.
  • RPMI 1640 a culture medium
  • red blood cells obtained by collecting blood from a human and centrifuging in the same manner as in Example 1 above, and suspending it in a culture medium (RPMI 1640), the human-derived red blood cell suspension (red blood cells in suspension)
  • red blood cells in suspension A concentration of 1 ⁇ 10 8 cells / ml
  • the red blood cells were brought into contact with and spread on the microarray chip, and the number of microchambers storing red blood cells under the microscope was determined. confirmed. Since red blood cells are light red under a microscope, whether or not red blood cells are stored in the microchamber can be determined by the color in the microchamber (the color of red blood cells).
  • the cell deployment efficiency means the ratio of the number of microchambers in which cells are stored to the total number of microchambers provided in the microarray chip.
  • Example 3 Production of Microarray Chip In the same manner as in Example 2, each microarray chip having a water contact angle of 80 ° or more or 10 ° or less was produced.
  • Example 4 Examination of red blood cell retention ability by each microchamber When the inner diameter and depth of the microchamber provided in the microarray chip were changed, it was examined whether a difference was observed in the cells stored in the microchamber.
  • ⁇ Manufacture of microarray chip> Three types of microarray chips (microarray chips A to C) having cylindrical microchambers with the following inner diameter and depth were manufactured. For microarray chips A to C, all conditions except for the inner diameter and depth, the distance between each microchamber, and the number of stored cells are all except for the distance between each microchamber (the distance corresponding to (i) in FIG. 1). It was the same as the microarray chip manufactured in Example 1, and was manufactured in the same manner as the method described in Example 1.
  • the distance between each microchamber is as follows.
  • erythrocytes obtained by collecting blood and centrifuging from a human were suspended in a medium (RPMI1640), thereby suspending a human-derived erythrocyte cell suspension (red blood cell concentration in suspension 5). 0.0 ⁇ 10 7 cells / ml).
  • RPMI1640 a medium
  • red blood cell concentration in suspension 5 0.0 ⁇ 10 7 cells / ml
  • Results are shown in FIG. As shown in FIG. 7, it was confirmed that the microarray chips A and C were stored in the microchambers without overlapping under the microscope. Moreover, the number of cells was counted under a microscope, and it was confirmed that almost the same number of cells were stored in each microchamber. Therefore, it was found that the red blood cells were uniformly held in the monolayer at the bottom of each microchamber. On the other hand, in the microchip B, depending on the microchamber, many portions of the bottom surface where the red blood cells were not adhered were observed. This was thought to be because, even when the microarray chip was washed, even the erythrocytes adhered to the bottom of the microchamber were washed away by washing.
  • the (inner diameter: depth) ratio of the microchamber is (1: 0.35 to 1). The degree was considered preferable.
  • Example 5 Development of various cells on a microarray chip Using the microarray chip A and the microarray chip C produced in Example 4, HEK-293 cells (hereinafter abbreviated as “HEK cells”) in the microchamber of the chip and We examined whether yeast can be retained.
  • HEK cells HEK-293 cells
  • a micropipette By adding 200 ⁇ l of the suspension onto the microarray chip C using a micropipette, HEK cells were brought into contact with the microarray chip C and developed.
  • both HEK cells and yeast were stored in each microchamber without overlapping. From this, it was found that both HEK cells and yeast are uniformly held as a monolayer in each microchamber. From the results, it was found that various cells can be held uniformly and in a single layer in the microchamber provided in the microarray chip of the present invention.
  • Example 6 Culture of cells in microchamber In order to examine whether cells can be cultured in the microchamber, HEK cells were cultured using the microarray chip C produced in Example 4.
  • the culture was performed as follows. HEK cells (1 ⁇ 10 6 cells / ml) were developed on the microarray chip C and washed in the same manner as described in Example 5. Next, the entire microarray chip C was immersed in a culture medium for culture (DMEM / 10% FBS medium) and cultured in a CO 2 incubator (CO 2 concentration 5%, 37 ° C.). In the culture in the CO 2 incubator, the medium on which the microarray chip was immersed was replaced with a new medium every 24 hours. When exchanging, the chip surface was washed with a new medium so that the medium was also exchanged in the microchamber.
  • DMEM / 10% FBS medium a culture medium for culture
  • CO 2 incubator CO 2 concentration 5%, 37 ° C.

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Abstract

本発明は、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法を提供することを課題とする。複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、（１）複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、該試料中の細胞を保持させる工程、及び（２）該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を確認する工程、を含有する検出方法により、当該課題を解決することができる。

Description

細胞検出方法及び該方法に用いるマイクロアレイチップ
　本発明は、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法に関する。また、本発明は、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出用キットに関する。また、本発明は、複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数個の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに関する。さらにまた、本発明は、複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップを用いて薬剤候補物質をスクリーニングする方法に関する。
　様々な種類の複数の細胞が含まれる試料から特定の細胞のみを検出することは、非常に幅広い分野にわたって必要とされている。特に医学、薬学に関連するバイオテクノロジーの研究開発及び臨床現場においては、多数の細胞中において、特定の細胞（例えば、特定の物質を有する又は産出する細胞、あるいは病原菌に感染した細胞や癌細胞等）の有無を確認することは、実験の進行や病気の診断のために非常に重要である。
　しかしながら、特に特定の細胞の存在割合が低い場合、多くの細胞が存在する試料中から当該特定の細胞を検出することは困難である。
　例えば、感染症の一つとして、マラリア原虫が赤血球細胞に感染することにより生じるマラリア原虫感染症があるが、該感染症の検出・診断方法としては次のものが例示される。
　例えば、血液細胞をスライドガラスに塗抹、乾燥し、ギムザ染色した後に顕微鏡下でマラリア原虫による感染の有無・程度を観察する方法がある。該方法は染色操作を行うだけで顕微鏡による観察が可能であり、簡便という利点を有する。しかしながら、該方法による検出・診断には時間と高度な観察技術を必要とし、さらに検出感度は非常に低い。例えば、該方法の所要時間は４０分と長く、全血液細胞のうち少なくとも０．０１％程度の細胞が感染している場合にかろうじて検出できる程度であり、検出感度（検出限界）は高くない。
　別の例としては、イムノクロマトグラフィー法を利用してマラリア原虫による感染の有無・程度を検査・診断する方法がある。該方法も広く知られており、検査が簡便に実施できるように検査キットも販売されている。このため、このような検査キットを使用した場合には、さらに簡単な操作で感染の有無・程度を観察できる。イムノクロマトグラフィー法の所要時間は２０分程度と短時間ではあるが、その検出感度は顕微鏡下での観察と同程度であり高くない。また、イムノクロマトグラフィー法は擬陽性も出やすいことから前述の顕微鏡下での観察との併用が常である。
　別の方法としては、ＰＣＲ法を利用してマラリア原虫による感染の有無・程度を検査・診断する方法がある。該方法は、前述の顕微鏡下での観察等とは異なり比較的高い検出感度を有する。しかしながら、ＰＣＲ法では結果を得るまでに５時間程度を要し、また操作が煩雑で高度な技術を要する。また、試料の状態やプライマーによっては反応条件設定が難しく検出できない場合もある。従ってＰＣＲ法単独では感染診断には向いていない。
　このように、例えばマラリア原虫感染症において、従来の検出・診断方法には検出までに長時間を要する、高度な技術を要する、検出感度が低い等の欠点がある。このため、迅速、簡便かつ検出感度が高い新しい感染症の検出方法が求められている。
　一方、これまでに種々のマイクロアレイチップが報告されており、細胞の検出等に応用されている。例えば、特許文献１には、マイクロチャンバーを集積化し、ヒーター等と連結し、ハイスループットに生体試料の生化学反応等を行うシステムが報告されている。しかしながら、該システムは細胞レベルで検出できるほど感度が高いとはいえず、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。
　また、特許文献２には、ポリマーを基板上にパターニングして、これに何らかの物質を固定させ、固定された該物質に細胞を作用させることにより、該物質の細胞に対する作用を観察する技術が報告されている。しかしながら、該技術においては各パターンに一定数の細胞を固定化することは困難であり、また膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。
　また、特許文献３には、１つのリンパ球が格納されるように設計されたマイクロウェルを多数集積化したアレイチップが報告されている。しかしながら、該マイクロウェルには一細胞しか導入できないため、アレイチップ上に集積化されたマイクロウェル数以上の細胞をスクリーニングすることは困難である。従って、当該アレイチップにおいても、膨大な数（１００～１０００万個）の細胞中に混在する少数の標的細胞を高感度に検出することは困難である。またさらに、当該アレイチップのマイクロウェルでは、導入された細胞をさらに培養やPCRすることは極めて困難であると考えられる。
　このように、従来のマイクロアレイチップを用いる方法であっても、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出することは困難である。
　このことから、例えば前述のマラリア原虫感染症をはじめとする種々の感染症に感染した細胞、また、これ以外の種々の標的細胞（特定の細胞）を迅速、簡便かつ高感度に検出可能な新しい検出手段が求められている。また、ベッドサイド等でも容易に使用可能な新しい検出手段が求められている。しかしながら、このような検出手段はこれまでに報告されていない。
特表２００４－５０２９２９号公報 特開２００４－１２５７８１号公報 特開２００４－１８７６７６号公報
　本発明は、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出できる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出を可能とする検出キットを提供することを目的とする。また、本発明は、膨大な数の細胞中に混在する少数の標的細胞（特定の細胞）を高感度に検出できるマイクロアレイチップを提供することを目的とする。
　本発明者らが上記課題に鑑み鋭意検討を行ったところ、複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数個の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップを使用することにより、標的とする特定の細胞を迅速、簡便かつ高感度に検出できることを見出した。また、本発明者らは、該マイクロアレイチップに備えられた各マイクロチャンバーに、複数個の細胞を格納できるだけでなく、該マイクロチャンバーの大きさ等を変更することにより、各マイクロチャンバーに格納される細胞数を任意の一定数に制御できることを見出した。また、本発明者らは、複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数個の細胞を格納可能であり、かつ表面の水接触角が１０°以下であるマイクロアレイチップを用いた場合には、標的とする細胞を各マイクロチャンバーに一定数かつ均一に格納させることができ、また標的とする細胞を一枚のマイクロアレイチップに多数保持させることができ、これにより標的とする細胞を迅速、簡便かつ高感度に検出できることを見出した。
本発明は上記知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、例えば以下の項に記載の発明を包含する。
検出方法
項１．
複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、
（１）複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、該試料中の細胞を保持させる工程、及び
（２）該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を確認する工程
を含有する検出方法。
項２．
前記マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５～１）である、項１に記載の検出方法。
項３．
前記マイクロチャンバーが、内径が２０～５００μｍ、深さが２０μｍ以上である、項２に記載の検出方法。
項４．
前記特定の細胞が感染症原因病原体の感染した細胞である、項１～３のいずれかに記載の検出方法。
項５．
前記感染症原因病原体がマラリア原虫類である、項４に記載の検出方法。
項６．
前記複数の細胞を含む試料が複数の血液細胞を含む試料である、項１～５のいずれかに記載の検出方法。
項７．
前記マイクロアレイチップが、前記マイクロチャンバー１つあたりに少なくとも１０個以上の細胞を格納可能である、項１～６のいずれかに記載の検出方法。
項８．
前記マイクロアレイチップが、少なくとも１０００個以上の前記マイクロチャンバーを備えている、項１～７のいずれかに記載の検出方法。
項９．
　前記マイクロアレイチップの表面の水接触角が１０°以下である、項１～８のいずれかに記載の検出方法。
検出用キット
項１０．
　複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップを含有する、複数の細胞を含む試料から該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出用キット。
項１１．
前記複数の細胞を含む試料が複数の血液細胞を含む試料であり、前記特定の細胞が感染症原因病原体の感染した血液細胞である、項１０に記載の検出用キット。
マイクロアレイチップ
項１２．
　複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であり、かつ表面の水接触角が１０°以下であるマイクロアレイチップ。
項１３．
前記マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５～１）である、項１２に記載のマイクロアレイチップ。
項１４．
前記マイクロチャンバーが、内径が２０～５００μｍ、深さが２０μｍ以上である、項１３に記載のマイクロアレイチップ。
項１５．
　前記マイクロチャンバーが格子状に配置されており、各該マイクロチャンバーの最短距離が１０～３００μｍである、項１２～１４のいずれかに記載のマイクロアレイチップ。
項１６．
前記マイクロチャンバー内に細胞が保持された、項１２～１５のいずれかに記載のマイクロアレイチップ。
薬剤候補物質のスクリーニング方法
項１７．
複数のマイクロチャンバーを備え、該マイクロチャンバー中には細胞が保持されているマイクロアレイチップを用いて、薬剤候補物質をスクリーニングする方法であって、
（１）該細胞が保持されたマイクロチャンバーに薬剤候補物質を添加する工程、
（２）該薬剤候補物質が該細胞に与える影響を測定し、所望の活性を示す物質を選択する工程、
を含む、薬剤候補物質のスクリーニング方法。
項１８．
前記工程（１）の後、前記マイクロチャンバー中で細胞を培養し、前記工程（２）に供することを特徴とする、項１７に記載の薬剤候補物質のスクリーニング方法。
項１９．
前記マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５～１）である、項１７又は１８に記載の薬剤候補物質のスクリーニング方法。
項２０．
前記マイクロチャンバーが、内径が２０～５００μｍ、深さが２０μｍ以上である、項１９に記載の薬剤候補物質のスクリーニング方法。
検出方法
　本発明の検出方法によれば、従来の検出方法と比較して、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を迅速、簡便かつ高感度に検出することができる。
検出用キット
　本発明の検出用キットによれば、複数の細胞を含む試料から、標的とする特定の細胞を迅速、高感度かつより簡便に検出することができる。
マイクロアレイチップ
　本発明のマイクロアレイチップによれば、複数の細胞を含む試料から、標的とする特定の細胞を迅速、高感度かつより簡便に検出することができる。
薬剤候補物質のスクリーニング方法
　本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法により、種々の薬剤候補物質が細胞に与える影響を簡便かつ迅速に測定し、所望の活性を示す物質を効率よく選択することができる。
（ａ）検出方法
　以下、本発明の検出方法について説明する。
　本発明の検出方法では、１つのマイクロアレイチップに、多数の細胞を保持させ、この中から検出標的となる特定の細胞を検出する。例えば１００万個程度という多数の細胞であっても１つのマイクロアレイチップに保持させることができ、そしてこのうち標的とする特定の細胞が一つしか存在しない場合であっても、この特定の細胞を検出することができる。この場合、本発明の検出方法によれば細胞が試料中に０．０００１％しか存在していなくとも、特定の細胞を検出することが可能であるといえる。
　本発明の検出方法において、検出標的となる特定の細胞、及びこれを含む多数の細胞（すなわち、細胞群）は特に限定されない。
　例えば、特定の遺伝子を発現している細胞や、核酸、タンパク質、脂質、糖等の生体物質が通常より過剰である、又は不足している細胞を、特定の細胞として種々の細胞群から検出することができる。このような特定の細胞は自然界に存在する細胞であってもよいし、人為的処理が施された細胞であってもよい。当該自然界に存在する細胞としては、特に限定されないが、例えば病原細胞、病変細胞、病原菌又は病原生物に感染された細胞、突然変異した細胞、特定の性質を有する未知の細胞等が挙げられる。また、当該人為的処理は特に限定されないが、例えば物理的処理（例：電磁波照射）、化学的処理（例：薬剤処理）、遺伝子工学的処理（例：遺伝子組み換え処理）等を挙げることができる。
　また、このような人為的処理のうち、細胞に与える影響が既知である処理を細胞群に施し、当該影響が表れない細胞又は当該影響がより強く表れる細胞を特定の細胞として検出することもできる。例えば、薬剤処理へ耐性又は高感受性を示す細胞を特定の細胞として検出することができる。
　また、当該細胞群も特に限定はされない。単細胞生物の群はもちろん、多細胞生物由来の細胞の群であってもよい。多細胞生物由来の細胞としては、例えば生物の正常組織又は病態組織から得られた細胞、及びこれらの細胞に由来する培養細胞等が挙げられる。また、これらの細胞を得る生物は特に限定されない。例えば動物由来細胞又は植物由来細胞であってよく、より具体的には例えば脊椎動物（特に哺乳類及び鳥類）由来細胞、昆虫由来細胞、植物培養細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、同一の細胞の群であっても、複数種の細胞が混在する群であってもよい。
　本発明の検出方法を用いて特定の細胞を検出する、より具体的な例としては、例えば、マラリア原虫感染症患者の血液細胞中から、マラリア原虫感染赤血球を検出する例が挙げられる。マラリア原虫感染症であれば、１００万個程度という多数の血液細胞中感染した血液細胞が一つしか存在しない場合であっても、この感染した血液細胞を検出することができる。また、例えば、癌細胞群中に存在する癌幹細胞を探索するにあたっても、好ましく用いることができる。さらに、例えば、人為的処理された細胞の群のなかから、当該処理により特定の性質を有するようになった細胞を選択することができる。また、特に強く当該特定の性質を有する細胞を選択することもできる。より具体的には、例えば、遺伝子組み換え処理により特定の物質を生産するよう形質転換させた複数の細胞の中から、特に効率よく当該物質を生産する細胞を検出することもできる。あるいは、例えば、電磁波照射処理若しくは薬剤処理により特定の機能を失った細胞を検出することができる。また、これらの処理に対し耐性又は高感受性を有する細胞を検出することができる。
　また、本発明の検出方法によれば、迅速、簡便かつ高感度に、例えば上述のような特定の細胞を検出することができるので、研究室のみならず、例えば臨床現場等においても好適に用いることができる。
　研究室においては、例えば、特定の性質（例えば薬剤耐性、薬剤感受性、特定遺伝子の発現、特定生体物質の過剰含有又は不足、等）を有する細胞の検出（ひいてはスクリーニング）、及び検出した細胞のさらなる解析等に用いることができる。特定の細胞を検出した後の解析としては、特に限定されないが、例えば、マイクロチャンバー内で色素又は蛍光染色やＰＣＲ解析、培養等を行うことができる。また、マイクロチャンバーから当該細胞を回収して培養し、さらに種々の解析に供することもできる。
　臨床現場においては、例えば、病気の診断（特に細胞診）に好適に用いることができる。病気が疑われる人間の組織を回収し、当該組織の細胞群中に病原細胞、病変細胞、病原菌又は病原生物に感染された細胞等が存在しないかを検出し、診断に役立てることができる。またさらに、このようにして検出された該各種細胞の薬剤耐性や感受性の調査、ＰＣＲやＦＩＳＨ等による遺伝子解析等をマイクロチャンバー内で行うこともできる。また、マイクロチャンバー内外において、当該各種細胞を培養してその性質をさらに詳細に検討することもできる。より具体的には、例えばベッドサイド等において、感染症に感染したおそれのある患者のそばで感染細胞の有無・程度を迅速に把握することができる。また、外科的手術により採取された癌（例えば血液癌）組織を用いて、抗ガン剤に耐性又は感受性を有する癌細胞がどの程度の割合で存在するのかを検討し、治療に役立てることもできる。
　また、本発明の検出方法では、複数の細胞（細胞群）をマイクロアレイチップが備える各マイクロチャンバーに格納（保持）させた後、この格納された細胞中、検出標的である特定の細胞を特異的に検出し得る標識を施すことができる。また、複数の細胞（細胞群）を含む試料において、検出標的とする特定の細胞をあらかじめ標識しておくことも可能である。特定の細胞を予め標識しておく方が、標識効率が均一になりやすいため、好ましい。このような標識の方法としては特に限定されず、検出標的である特定の細胞の性質に応じて適宜選択することができるが、検出の簡便性及び毒性等を考慮すると、特に蛍光標識が好適である。そして、該標識の有無（例えば蛍光標識の有無）に基づき当該特定の細胞を検出することができ、さらに、検出される標識の数（例えば蛍光標識の数）に基づけば、試料中の細胞のうち特定の細胞がどの程度存在しているのかについて定量的な分析を行うこともできる。またさらに、該標識の強度（例えば蛍光標識の蛍光強度）に基づき、検出した特定の細胞が有する性質の強度を分析することもできる。具体的には例えば、標的とする特定の細胞が感染症病原体に感染された細胞である場合は、当該定量的データや個々の細胞の標識の強さ（例えば蛍光標識の場合は蛍光強度）に着目することにより、感染症の重傷度やステージを分析することもできる。また、標的とする特定の細胞が人為的処理により特定の性質を与えられた細胞である場合は、その特定の人為的処理により当該特定の性質を与えることのできる割合や各細胞の有する当該性質の発現強度を求めることができる。よって、どのような人為的処理によりどの程度の効率で細胞の性質を変化させることができるか、またどのように性質を変化させることができるかを検討することができる。
　また、本願の検出方法によれば、マイクロアレイチップに備えられたマイクロチャンバー内に細胞が格納される。このため、本願の検出方法においては、検出時、標的とする特定の細胞がマイクロアレイチップのどの部分に存在しているのかが分かり易い。このことから、検出後、当該特定の細胞の回収やＰＣＲ法による更なる分析等を容易に行うことができる。
　また、本願の検出方法においては、マイクロアレイチップに備えられた各マイクロチャンバー内に細胞を均一かつ効率よく格納させることが可能である。すなわち、本願の検出方法においては、マイクロアレイチップに備えられた各マイクロチャンバーには、ほぼ同数の細胞を格納させることができる。
　なお、特に限定されないが、備えるマイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が例えば（１：０．３５～１）である場合、該マイクロチャンバーの底に細胞を均一に一層（単層）として保持させることができる。すなわち、各マイクロチャンバーの底辺に、ほとんど重複することなく細胞を保持することができる。このため、マイクロチャンバー内で細胞が重なり、検出標的である特定の細胞が他の細胞の下に位置することになって、検出が困難になるなどの問題が起きにくい。また、単層であることにより、顕微鏡で観察する際に焦点を容易に合わせることができる。共焦点レーザー顕微鏡による観察においても、バックグラウンドを抑制でき、高感度での観察が可能となる。
また、特に限定されないが、本発明の検出方法に用いるマイクロアレイチップは、下述する本発明のマイクロアレイチップであることが好ましい。
　本発明の検出方法を適用できる、複数の細胞を含む試料は特に限定されず、検出標的となる特定の細胞が存在する細胞群を含む可能性のある試料であればよい。このような細胞群及び検出標的となる特定の細胞として以下に具体的な例を挙げるが、これらに限定されるわけではない。
（ａ）－１.検出標的となる特定の細胞例
（ａ）－１－１．感染症における感染血液細胞
　本発明の検出方法により感染症における感染血液細胞を検出することができる。感染症としては、マラリア原虫類に代表される原虫感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に代表されるウイルス感染症、結核菌に代表される細菌感染症等が例示される。
　これらの感染症のうち、例えばマラリア原虫類による感染症では、マラリア原虫類が赤血球に感染する。この場合、本発明の検出方法における検出対象である特定の細胞はマラリア原虫類に感染した血液細胞、すなわちマラリア原虫類に感染した赤血球である。マラリア原虫類は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の４種類が例示される。
　また、例えばＨＩＶ感染症では、ＨＩＶがある種のリンパ球（Ｔ細胞）に感染する。この場合、本発明の検出方法における検出対象である特定の細胞は、ＨＩＶに感染した血液細胞、すなわちＨＩＶに感染したある種のリンパ球（Ｔ細胞）である。ＨＩＶには、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２の2種類が例示される。
　また、例えば結核では、結核菌がある種の白血球細胞（単球）に感染する。この場合、本発明の検出方法における検出対象である特定の細胞は、結核菌に感染した血液細胞、すなわち結核菌に感染したある種の白血球細胞（単球）である。
　本発明の検出方法は当然にこのほかの感染症における感染血液細胞も検出の対象とする。
　また、血液細胞としては血液に含まれる細胞であれば限定されない。血液細胞として赤血球、血小板、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）が例示される。例えば、これら血液細胞を複数含む試料を、本発明の検出方法へ供する、複数の細胞を含む試料として用いることができる。例えば、複数の血液細胞を含む血液や体液を当該試料として用いることができる。
（ａ）－１－２．培養細胞中のマーカー発現細胞
　本発明の検出方法により、培養細胞中の特定の細胞を検出することができる。培養細胞は特に限定されないが、哺乳類又は昆虫由来の細胞株（例えばＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｓｆ９細胞等）や酵母が好ましく例示できる。
　特に限定されないが、本発明の検出方法は標的とする特定の細胞が試料中に極微量しか存在していなくとも（例えば試料の細胞中の存在割合が０．０００１％であっても）、該特定の細胞を十分に検出することが可能であるため、検出標的となる特定の細胞の存在割合が非常に小さい試料を用いるときに特に有利である。このような例としては、例えば癌細胞群中に存在する癌幹細胞を挙げることができる。癌幹細胞は、自己複製能と増殖能を有し、悪性腫瘍（癌）にごくわずか存在しており、幹細胞と同様のマーカー（例えばCD34、CD133、CD117、Sca-1等）を発現していると言われており、本発明の検出方法によれば、好ましく検出することができると考えられる。
　またあるいは、特定の遺伝子やタンパク質を発現している細胞も、本発明の検出方法の検出対象である。
（ａ）－２．マイクロアレイチップ
　本発明の検出方法においては、複数のマイクロチャンバーを備えており、かつ該マイクロチャンバー１つあたりに複数個の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップを使用することができる。このようなマイクロアレイチップであれば限定されない。
　マイクロアレイチップの基板は限定されず、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等のポリマー、シリコン等の金属、ガラス、石英ガラス、またポリマーとガラスや金属等を張り合わせたような複数の素材を組み合わせたもの（例えばＰＤＭＳとガラス）等が例示される。好ましくは、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ガラス、シリコン等である。
　マイクロアレイチップの大きさは限定されず、検出標的である特定の細胞を検出・測定する装置に応じて適宜選択される。
　該マイクロアレイチップにはマイクロチャンバーが形成されている。マイクロチャンバーは基板に直接加工を施すことにより作製してもよく、マイクロ貫通孔もしくはマイクロチャンバーが形成されたフィルムをこれらの基板に貼り付けることにより作製してもよい。好ましくは、マイクロチャンバーはこれらの基板に直接加工を施すことにより作製される。この場合、マイクロチャンバーは半導体研究分野における微細加工技術であるリソグラフィー法（光リソグラフィー、電子線リソグラフィー等）によって作製することはもちろんのこと、マイクロドリル等を用いて穴をあける掘削加工技術、レーザー加工等あらゆる微小穴をあける技術によって作製することができる。例えば、ＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）プロセス等が例示される。
　該マイクロアレイチップには、必要に応じて表面処理を施すことができる。表面処理方法は限定されず、プラズマ処理、コロナ放電処理等が例示される。好ましくは、プラズマ処理であり、酸素プラズマ処理等が例示される。例えば、マイクロアレイチップの基板が疎水性の材料（ポリスチレン、ＰＭＭＡ等のポリマー）である場合には、酸素プラズマ処理等の親水化処理を行うことが好ましい。また、マイクロアレイチップの基板が親水性の材料（シリコンやガラス等）である場合には、このような処理をする必要はない。さらに、タンパク質や脂質等でコーティングして表面処理をして調整しても良い。
　マイクロチャンバーの形状は特に限定されない。マイクロチャンバーの形状としては円筒形、逆半球形、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）、直方体等、さらにこれらの形状の二つ以上を組み合わせた形状が例示される。前記円筒形や直方体の場合はマイクロチャンバーの底部は通常平坦であるが、曲面、凸面、凹面とすることもできる。また、前記逆円錐形や逆角錐形の場合は底面がマイクロチャンバーの開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状（マイクロチャンバーの底部は平坦な形状）も例示できる。さらに、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合は、前述と同様に、マイクロチャンバーの底部を曲面等とすることもできる。マイクロチャンバーの形状は好ましくは円筒形、逆半球形、逆円錐形、逆角錐形であり、より好ましくは円筒形、逆半球形であり、最も好ましくは円筒形である。また、マイクロチャンバーは、一枚のマイクロアレイチップにおいて、好ましくは一種類の形状からなる。
　マイクロチャンバーに格納される細胞数は、試料中に含まれる全細胞の濃度、試料中に含まれる全細胞に占める検出標的である特定の細胞の割合、後述するマイクロチャンバーの寸法及び数等に応じて適宜決定される。また、マイクロアレイチップに保持される細胞数が多ければ多いほど、検出標的である特定の細胞を高感度に検出することができる。
　この観点から、一枚のマイクロアレイチップにできるだけ多数の細胞を保持できることが好ましい。マイクロアレイチップに細胞が保持されるとは、マイクロアレイチップに備えられたマイクロチャンバーに細胞が格納されることであり、従ってマイクロチャンバーの数が多いほど、また１つのマイクロチャンバーに格納できる細胞数が多いほど、マイクロアレイチップは多くの細胞を保持できる。
　特に限定されるわけではないが、一枚のマイクロアレイチップに１万個以上の細胞を保持できるようにすることが好ましい。また、１０万個以上がより好ましく、１００万個以上がさらに好ましく、１０００万個以上がよりさらに好ましい。
　例えば、１００万個に１個の割合で存在し得る標的細胞を検出する場合、一枚のマイクロアレイチップに１００万個以上の細胞を保持できるようにすることが好ましい。より好ましくは２００万～１０００万個、さらに好ましくは３００万～１０００万個の細胞を担持できるようにする。この場合、一枚のマイクロアレイチップに１万個以上のマイクロチャンバーを設けることが特に好ましい。
　このようにマイクロアレイチップに細胞を保持させることができ、かつ各マイクロチャンバーに２個以上の細胞を格納できる限り、各マイクロチャンバーに格納される細胞の数は限定されない。前述と同様に、マイクロアレイチップに保持される細胞数が多ければ多いほど、検出標的である特定の細胞を高感度に検出することができるという観点から、各マイクロチャンバーに１０個以上の細胞を格納できるようにすることが好ましく、より好ましくは５０～５００個、さらに好ましくは１００～３００個の細胞を格納できるようにする。
　例えば、一枚のマイクロアレイチップに１０万個のマイクロチャンバーを設け、各マイクロチャンバーに約１０個ずつ細胞を格納させた場合には、マイクロアレイチップ一枚あたり約１００万個の細胞が保持されていることとなる。
　このように各マイクロチャンバーに細胞を格納できる限り、各マイクロチャンバーの寸法は限定されない。マイクロチャンバーの寸法は、好ましくは各マイクロチャンバーに同数程度の細胞を格納されるように決定される。このため、各マイクロチャンバーの寸法は同一であることがさらに好ましい。なお、マイクロチャンバーの開口部が円形である場合には、「内径」とはマイクロアレイチップ表面におけるマイクロチャンバーの開口部の直径を意味する。マイクロチャンバーの開口部が円形でない場合には、「内径」とはマイクロチャンバーの開口部の一辺の長さを意味する。また、「深さ」とは、マイクロチャンバーの開口部と、マイクロチャンバーの最も深い場所の距離を意味する。
　特に、マイクロチャンバーの内径と深さは、一定の比の関係にあることが好ましい。具体的には（内径：深さ）の比が（１：０．３５～１）であることが好ましく、（１：０．３５～０．８５）であることがより好ましく、（１：０．４～０．８５）であることがさらに好ましく、（１：０．４５～０．８）であることがよりさらに好ましい。
　また、マイクロチャンバーの内径は好ましくは２０～５００μｍ、より好ましくは２０～４００μｍ、さらに好ましくは２０～３００μｍ、よりさらに好ましくは３０～２５０μｍ、特に好ましくは３０～２００μｍである。また、その深さは、内径の値にもよるが、好ましくは２０～２００μｍ、より好ましくは２０～１００μｍ、さらに好ましくは２０～８０μｍ、よりさらに好ましくは２０～７０μｍ、特に好ましくは３０～７０μｍである。
　なお、上述の好ましい（内径：深さ）の比により、内径の値が決まれば、マイクロチャンバーの深さの好ましい値を決めることができる。ただし、マイクロチャンバーは細胞を格納するため、２０μｍ以上の深さを有することが好ましい。すなわち、マイクロチャンバーは、内径及び深さが上述の比の関係を有し、内径が上述の値を有し、かつ深さが２０μｍ以上であるものが特に好ましい。
　このようなマイクロチャンバーであれば、細胞をより均一かつ効率よく、単層として、マイクロチャンバーに格納させることができる。
　マイクロチャンバーの数も特に限定されない。前述のように、マイクロアレイチップに保持される細胞数が多ければ多いほど、感染した血液細胞を高感度に検出することができる。この観点から、マイクロチャンバーの数は、一枚のマイクロアレイチップあたり１０００個以上、より好ましくは２，０００～５０，０００個、さらに好ましくは２，０００～２０，０００個である。
　各マイクロチャンバーの距離も特に限定されない。図１に示すように、マイクロチャンバーを格子状に配置させる場合、各マイクロチャンバーの最短距離、すなわち図１の（ｉ）の距離は１０～３００μｍ、好ましくは５０～３００μｍ、より好ましくは１００～２００μｍが例示される。
　例えば、１つのマイクロチャンバーが約１００個の細胞を格納し、各マイクロチャンバーの内径が１００μｍ、深さ５０～１００μｍの場合、（ｉ）の距離は１００～２００μｍとすることができる。
　マイクロチャンバーの形状、数、寸法及びマイクロチャンバー間の距離等は、試料中に含まれる全細胞に占める検出標的である特定の細胞の割合、マイクロチャンバー内に格納させたい細胞数、マイクロアレイチップに保持させたい細胞数等に応じて、当業者により適宜決定される。
　また、前述するようにマイクロアレイチップ上に細胞を保持できる限りマイクロアレイチップの表面の状態も限定されない。また、マイクロアレイチップに保持させる細胞の種類にもよるが、マイクロアレイチップの表面は親水性であることが好ましい。具体的には、マイクロアレイチップの表面の水接触角を好ましくは１０°以下にすると一層効率よく、また各マイクロチャンバーに同数程度の細胞を均一に単層として格納することができる。この観点から、マイクロアレイチップの表面の水接触角は、より好ましくは８°以下、さらに好ましくは５°以下である。なお、“マイクロアレイチップの表面”とはマイクロチャンバーの内部表面も含む意味である。
　このため、前述のマイクロアレイチップの基板表面の水接触角が前述する好適な範囲にあるものであれば更に処理を施さなくてもよく、前述する好適な範囲にないものは、当該好適な範囲になるよう、その表面が処理されればよい。当業者であれば、細胞の接着の程度等を検討しつつ、最適な水接触角となるようマイクロアレイチップに表面処理を施すことができる。例えばマイクロアレイチップの基板としてポリマー素材のものを使用する場合には、その表面を酸素プラズマ処理等を行うことにより水接触角を調整すればよい。
　なお、水接触角は次のように測定される。水接触角は公知の方法であるθ/２法を用いて測定される。θ/２法とは液滴の左右端点と頂点を結ぶ直線の、固体表面に対する角度から接触角を求める方法である。例えば、マイクロアレイチップの表面において水接触角を求める場合、蒸留水を該表面の異なる複数の場所に滴下し、それぞれ滴下した液滴の接触角を求める。これにより得られる値を水接触角ということができる。例えば、上記方法に従い、接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて、蒸留水１～２μlをマイクロアレイチップ基板の異なる複数の地点（５点以上）に滴下して水接触角を測定することができる。
　例えば、マイクロアレイチップに、前記（ｉ）の距離が１００～２００μｍとなるよう格子状に円筒形のマイクロチャンバーを形成させ、該表面の水接触角を１０°以下とする。この際、各マイクロチャンバーの内径を１００μｍ、深さを５０～１００μｍとし、１つのマイクロチャンバーあたり約１００個の細胞を格納させる。このようなマイクロアレイチップとした場合には、細胞をより均一かつ効率よく、単層として、各マイクロチャンバーに格納させることができる。
（ａ）－３．マイクロアレイチップの作製方法
　前述のマイクロアレイチップは、当該分野で従来公知の方法により適宜作製される。例えば、マイクロアレイチップの作製は、リソグラフィーとエッチングという手法を用いてチップの鋳型を作製し、その鋳型からチップを成型する方法が例示される。本発明においては、当該方法により前述のマイクロアレイチップを作製した。具体的には、マイクロアレイチップの基板としてポリマー（プラスチック）素材のチップを使用し、電子線リソグラフィー法の中でも、Ｘ線リソグラフィーと、電鋳（メッキ）、形成の技術を用いて作製するＬＩＧＡプロセスに従い、前述のマイクロアレイチップを作製することができる。
（ａ）－４．本発明の検出方法に含有される工程
　本発明の検出方法は、複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって
（１）複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、試料中の細胞を保持させる工程、及び
（２）該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を確認する工程
を少なくとも含有する。
　マイクロアレイチップへの細胞の保持は、細胞をマイクロアレイチップに接触させ、細胞をマイクロアレイチップ上に展開し、細胞を各マイクロチャンバーに格納したのち、過剰な細胞をマイクロアレイチップから除去（洗浄）する手順を少なくとも経ることにより可能となる。
　ここで、細胞のマイクロアレイチップへの接触は、細胞をマイクロアレイチップに接触させられる限り、その方法は限定されない。
　例えば、培養細胞や生体から採取した細胞そのものをマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよく、これらを緩衝液や培養液等の溶液と混合させ、得られた混合液をマイクロアレイチップに接触させることによりおこなってもよい。
　例えば、血液細胞のマイクロアレイチップへの接触は、採取した血液そのものをマイクロアレイチップに接触（添加、滴下等）させることにより行ってもよく、採取した血液を緩衝液や培養液等の溶液と混合させ、得られた混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。また、血液細胞のマイクロアレイチップへの接触は、採取した血液から血液細胞を分取し、これを緩衝液や培養液等の溶液と混合させた後に、該混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。
　また、培養細胞（例えば哺乳類又は昆虫由来細胞、及び酵母等）のマイクロアレイチップへの接触は、培養した細胞を培地ごとマイクロアレイチップに接触（添加、滴下等）させることにより行ってもよく、培養細胞をふくむ培地を緩衝液や培養液等の溶液と混合させ、得られた混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。また、培養細胞を培地から回収し、これを緩衝液や培養液等の溶液と混合させた後に、該混合液をマイクロアレイチップに接触させることにより行ってもよい。
　また、細胞のマイクロアレイチップ上への展開も、細胞をマイクロアレイチップ上に展開できる限り、その方法は限定されない。複数の細胞（細胞群）そのものをマイクロアレイチップに接触させることにより細胞をマイクロアレイチップ上に展開させてもよく、接触させた後さらに展開液を用いて展開させてもよい。展開液としては、緩衝液、培養液、界面活性剤等が例示される。
　例えば、マイクロアレイチップ上への展開させる細胞が血液細胞の場合、前述のように血液細胞をマイクロアレイチップに接触させることにより血液細胞をマイクロアレイチップ上に展開させてもよく、また前述のように接触させた血液細胞を、さらに展開液を用いて展開させてもよい。また例えば、展開させる細胞が培養細胞の場合であっても、血液細胞と同様にしてマイクロアレイチップ上に展開させることができる。少なくともこのような手順を経ることにより、細胞（例えば血液細胞や培養細胞）を各マイクロチャンバーに格納することができる。また、細胞がチップに展開しにくい場合（特にチャンバーの底に空気が残るような場合）、予め培地や緩衝液等の溶液中にチップを入れて超音波処理を行ったり、ブラシ等でチップ表面を擦る等して、マイクロチャンバー内に空気が入らないように溶液を展開してから細胞をマイクロアレイチップに接触、展開しても問題ない。
　マイクロアレイチップ上に細胞を展開する際の細胞の濃度は特に制限されず、細胞種にもよるが、例えば１×１０１０～１×１０４（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）が例示できる。下述するように、細胞を展開後、過剰な細胞の除去を行うことで、各マイクロチャンバー内にほぼ均一に単層として細胞を格納することができる。また、用いる細胞種やマイクロアレイチップに応じて適宜展開させる細胞濃度を調整してもよい。
　過剰な細胞のマイクロアレイチップからの除去（洗浄）も、マイクロアレイチップから（すなわちマイクロチャンバー内及びマイクロチャンバー外から）過剰な細胞を除去できる限り、その方法は限定されない。
　例えば、ピペットマン等を用いて、マイクロアレイチップを軽く傾けて緩衝液、培養液、界面活性剤、酵素等の洗浄液を流すことにより過剰な細胞を除去してよい。また、マイクロチャンバー以外の部分に吸着した余分な細胞を除去、洗浄する際には、セルスクレイパー等の器具を使用しても良い。
　なお、展開する細胞の濃度を薄め（例えば赤血球細胞の場合１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下）にすることにより、展開する細胞の濃度を濃いめ（例えば赤血球細胞の場合１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上）にした場合に比べ、除去操作後に各マイクロチャンバーに格納される細胞数を少なくすることができる。この場合でも、各マイクロチャンバーに格納される細胞数はほぼ同数となる。よって、展開する細胞の濃度を薄めに設定することにより、各マイクロチャンバーに１～数個の細胞が均一に単層として格納されるよう調整することも可能である。逆に、展開する細胞の濃度を濃くしても、除去操作後にはマイクロチャンバーに均一に単層として格納されることから、マイクロチャンバーに格納できる細胞数が増えるわけではない。格納される細胞数はマイクロチャンバーの底面積によって制限される。
　また、過剰な細胞のマイクロアレイチップからの除去（洗浄）は、マイクロアレイチップに細胞を接触、展開させた後、マイクロチャンバーに細胞を適度に吸着させた後に実施することが好ましい。該吸着に要する時間は限定されず、当業者により適宜調整される。
　検出標的である特定の細胞の有無を確認するにあたっては、当該特定の細胞を検出できる限り、その方法は限定されない。
　例えば、検出標的である特定の細胞が形態変化を起こす細胞である場合は、顕微鏡観察により細胞の形態を観察することにより、検出することができる。また、当該特定の細胞に特異的に結合する物質が存在する場合、当該物質を用いて結合の有無を確認することで検出することができる。このような物質としては、例えば抗体やアプタマー等を挙げることができるが、これらに限定されない。またあるいは、当該特定の細胞に特異的に反応する物質が存在する場合、当該物質を用いて反応の有無を確認することで検出することもできる。
　このような結合や反応の有無を確認する方法も特に限定されないが、蛍光を用いるのが好適である。例えば、特定の細胞に特異的に結合する物質に蛍光標識を施してから用いれば、試料中の特定の細胞のみを標識することができる。よって、蛍光の有無により該特定の細胞の有無を容易に確認できる。
　特に、マイクロアレイチップに試料を接触させる前に、該試料中の特定の細胞のみが標識されるよう蛍光標識を施し、細胞がマイクロチャンバー内に保持された後に当該蛍光標識を検出して特定の細胞の有無を確認することができる。また、細胞がマイクロチャンバー内に保持された後、特定の細胞のみを蛍光標識してもよい。
　例えば、血液細胞中から病原性微生物が感染した血液細胞を検出する場合、マイクロアレイチップに血液細胞を接触させる前に、感染した血液細胞中の病原性微生物の核を蛍光染色し、蛍光顕微鏡やアレイスキャナー等の装置を用いて、該蛍光に基づき感染した血液細胞を検出できる。あるいは、マイクロアレイチップに形成されたマイクロチャンバーに血液細胞を格納した後に、血液細胞中の病原性微生物の核を蛍光染色し、同様に感染した血液細胞を検出してもよい。例えばベッドサイド等において感染した血液細胞を検出しようとする場合には、マイクロアレイチップに血液細胞を接触、展開させる前に感染した血液細胞中の病原性微生物の核等を蛍光染色させたほうが、接触、展開後の処理が簡便になるため、一層簡単に感染した血液細胞を検出することができる。また、例えば、血液細胞中の病原性微生物の核に限定されず、例えば蛍光標識された抗体を用いることによって特定タンパク質（特定アミノ酸配列）を標的としたり、蛍光標識されたプローブを用いることによって特定の遺伝子配列を標的としてもよい。
　また、例えば、培養細胞中特定のマーカーを発現した細胞を検出したい場合は、当該マーカーに特異的であって蛍光標識された抗体を予め培養細胞に作用させておき、マイクロチャンバー内に保持された後、蛍光顕微鏡やアレイスキャナー等の装置を用いて該蛍光に基づき当該特定の細胞を検出できる。あるいは、マイクロアレイチップに形成されたマイクロチャンバーに培養細胞を格納した後に、培養細胞中の特定のマーカーを発現した細胞を蛍光標識された抗体を用いて標識し、該蛍光に基づき当該細胞を検出してもよい。
　具体的に一例を説明すると、まず、感染赤血球細胞を含む赤血球細胞懸濁液において、原虫等の感染微生物の核が染まるように蛍光染色して感染赤血球細胞を標識し、場合によっては赤血球細胞も蛍光物質等で標識を行う。この標識された感染赤血球細胞を含む赤血球細胞懸濁液をマイクロアレイチップ上に展開し、過剰な血液細胞を除去・洗浄した後、蛍光顕微鏡やマイクロアレイスキャナー等によって、蛍光検出を行う。これにより、蛍光強度や標識された細胞の数等を調べることによって、感染症の有無はもちろん、程度及び種類等についても解析することができる。
　このような本発明の検出方法では、例えば図２のように、マイクロアレイチップ上に縦５０個、横２００個になるようにマイクロチャンバーを配置させ、各マイクロチャンバーに１００個ずつ血液細胞を格納させることもできる。そして、１つのマイクロチャンバーあたり１つの感染した血液細胞が検出された場合には、その感染率は１％と判断することができる。
　また、本発明の検出方法では、例えばマイクロアレイチップに合計１００万個の血液細胞を保持させ、そのうち１つの血液細胞が感染した場合であっても、この感染した血液細胞を検出することができる。この場合、本発明の検出方法によれば感染した血液細胞が試料中に０．０００１％しか存在していなくとも、検出することが可能であるといえる。
（ｂ）検出用キット
　本発明の検出用キットは、複数の細胞を含む試料から特定の細胞を検出するためのキットであって、複数のマイクロチャンバーを備え、かつ該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップを含有することを特徴とする。
　当該検出キットにより、複数の細胞を含む試料から、標的とする特定の細胞を迅速、高感度かつより簡便に検出することができる。例えば感染症における感染血液細胞の有無、程度を迅速、簡便かつ高感度に検出することができる。あるいは、例えば癌細胞群の中から癌幹細胞を迅速に検出できる。またあるいは、例えば特定の遺伝子が発現している細胞を含む細胞群（例えば培養細胞や酵母の群等）から、当該特定の遺伝子が発現している細胞をスクリーニングすることができる。
（ｂ）－１．検出対象となる特定の細胞
　本発明の検出用キットが検出の対象とする特定の細胞は、前述と同様に説明される。
（ｂ）－２．検出用キットに含有されるマイクロアレイチップ
　本発明の検出用キットに含有されるマイクロアレイチップは、前述と同様に説明される。
（ｂ）－３．検出用キットに含有されるマイクロアレイチップの作製方法
　本発明の検出用キットに含有されるマイクロアレイチップの作製方法は、前述と同様に説明される。
（ｂ）－４．検出用キットに含有されるマイクロアレイチップ以外のもの
　本発明の検出用キットに含有されるマイクロアレイチップ以外のものとしては限定されないが、以下のものが例示される。
　本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップに細胞を接触させる際に使用され得る緩衝液、培養液等が含有されていてもよい。
　本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップに細胞を展開させる際に使用され得る緩衝液、培養液、界面活性剤等が含有されていてもよい。
　本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップから過剰な細胞を除去（洗浄）する際に使用され得る緩衝液、培養液、界面活性剤、酵素等の洗浄液等が含有されていてもよい。
　本発明の検出用キットにはさらに、マイクロアレイチップに細胞を接触、展開、さらにマイクロアレイチップから細胞を除去等させる際に使用され得るピペットマン等が含有されていてもよい。
　本発明の検出用キットにはさらに、マイクロチャンバー以外の部分に吸着した余分な細胞を除去、洗浄する際に使用され得るセルスクレイパー等の器具が含有されていてもよい。
　本発明の検出用キットにはさらに、検出標的である特定の細胞を検出するための装置が含有されていてもよい。装置としては、蛍光顕微鏡、マイクロアレイスキャナー等が例示される。
　また、例えば検出標的である特定の細胞が最終的に蛍光染色されることにより検出される場合、本発明の検出用キットには、該特定の細胞を染色するための蛍光染色剤（例えば蛍光色素、蛍光標識済み抗体等）が含有されていてもよい。
　本発明の検出用キットにはさらに、該検出用キットの使用マニュアルが含有されていてもよい。
　このような本発明の検出用キットを使用することにより、検出標的である特定の細胞が試料中に存在する割合が低くても（例えば０．０００１％しか存在していなくとも）、迅速かつ簡便に当該特定の細胞を検出することが可能である。
（ｃ）マイクロアレイチップ
　以下、本発明のマイクロアレイチップについて説明する。
　本発明のマイクロアレイチップは、複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数個の細胞を格納可能であり、かつ表面の水接触角が１０°以下という特徴を少なくとも備えている限り、前述と同様に説明される。
　本発明のマイクロアレイチップは、該特徴を有することにより、各マイクロチャンバーに一定数の細胞を均一に格納することが可能である。さらに効率よく各マイクロチャンバーに一定数の細胞を均一に格納するという観点からは、マイクロアレイチップの水接触角は、好ましくは１０°以下、より好ましくは８°以下、さらに好ましくは５°以下である。なお、水接触角は上述のようにして調整することができる。
　また、同様に、より効率よく各マイクロチャンバーに一定数の細胞を均一に格納するという観点から、マイクロチャンバーの内径と深さは、一定の比の関係にあることが好ましい。具体的には（内径：深さ）の比が（１：０．３５～１）であることが好ましく、（１：０．３５～０．８５）であることがより好ましく、（１：０．４～０．８５）であることがさらに好ましく、（１：０．４５～０．８）であることがよりさらに好ましい。
　また、マイクロチャンバーの内径は好ましくは２０～５００μｍ、より好ましくは２０～４００μｍ、さらに好ましくは２０～３００μｍ、よりさらに好ましくは３０～２５０μｍ、特に好ましくは３０～２００μｍである。また、その深さは、内径の値にもよるが、好ましくは２０～２００μｍ、より好ましくは２０～１００μｍ、さらに好ましくは２０～８０μｍ、よりさらに好ましくは２０～７０μｍ、特に好ましくは３０～７０μｍである。
　なお、上述の好ましい（内径：深さ）の比により、内径の値が決まれば、マイクロチャンバーの深さの好ましい値を決めることができる。ただし、マイクロチャンバーは細胞を格納するため、２０μｍ以上の深さを有することが好ましい。すなわち、本発明のマイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーは、内径及び深さが上述の比の関係を有し、内径が上述の値を有し、かつ深さが２０μｍ以上であるものが特に好ましい。
　このようなマイクロチャンバーであれば、細胞をより均一かつ効率よく、単層として、マイクロチャンバーに格納させることができる。
　このようなマイクロチャンバーを備えるマイクロアレイチップは、例えば、感染症における感染血液細胞、さらには特にマラリア原虫類に感染した血液細胞に好適である。また、各種培養細胞（特に哺乳類又は昆虫由来細胞、及び酵母等）にも好適である。
　本発明のマイクロアレイチップによれば、例えば上記のような細胞を均一にマイクロチャンバー内へ格納できる。すなわち、各マイクロチャンバーにほぼ同数の細胞を格納できる。このため、マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバー数及び１つのマイクロチャンバー内に格納される細胞数を把握すれば、該マイクロアレイチップが保持する細胞数を概算することができる。よって、検出された特定の細胞数がわかれば、当該特定の細胞が試料中の複数の細胞中にどの程度の割合で存在するのか容易に算出することができる。なお、マイクロチャンバー内に格納された細胞の数を数える方法は特に制限されない。例えば、顕微鏡でマイクロチャンバーを観察して格納された細胞数を数えることができる。
　また、本発明のマイクロアレイチップは、下述する薬剤候補物質のスクリーニングにも好ましく用いることができる。各マイクロチャンバーにほぼ同数の細胞が格納されるため各マイクロチャンバー内の細胞の状態が均一となり、異なる薬剤候補物質を各マイクロチャンバーへと添加した際、それぞれの薬剤候補物質がどのような影響を細胞へ与えるのかを比較評価しやすいからである。
　またさらに、上述のように、本発明のマイクロアレイチップによれば、細胞を単層としてマイクロチャンバー内へ格納できる。すなわち、各マイクロチャンバーの底辺に、ほとんど重なることなく細胞を格納することができる。このため、マイクロチャンバー内で細胞が重なり、検出標的である特定の細胞が他の細胞の下に位置することになって、検出が困難になるなどの問題が起きにくい。また、単層であることにより、顕微鏡で観察する際に焦点を容易に合わせることができる。共焦点レーザー顕微鏡による観察においても、バックグラウンドを抑制でき、高感度での観察が可能となる。また、単層に格納された細胞上に、別の種類の細胞をのせて、それぞれの細胞の相互作用を簡便かつ効率よく検討することもできる。また、別の種類の細胞をのせて培養を行い、さらに詳細にそれぞれの細胞の相互作用を検討することもできる。
　なお、マイクロチャンバーに細胞が単層に格納されているか否かは、当業者であれば、光学顕微鏡により観察し、細胞が重なっているか否かを観察することで容易に確認することができる。また、例えば、細胞膜を染色する色素（好ましくは蛍光色素）を用いて細胞を染色しておけば、細胞膜の重なりが存在するか否かを簡便に確認することができるため、マイクロチャンバーに細胞が重なり無く単層に格納されているか否かを簡便に確認することができる。
　またさらに、本発明のマイクロアレイチップによれば、細胞をマイクロチャンバー内で、少なくとも数日以上培養することが可能である。通常、培養細胞は培養スペースが狭い場合、又は培養スタート時点の細胞数が少ない場合等は、適切な培養環境を与えても死滅してしまうことが多い。しかし、本発明のマイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバー内であれば、培養細胞を格納させた後、少なくとも数日以上培養を行うことができる。
　よって、本発明のマイクロアレイチップにより検出標的である特定の細胞を検出した後、当該特定の細胞をマイクロチャンバー内で培養することも可能である。これにより、マイクロチャンバー内において、当該特定の細胞に対して経時的な検討を行うことができる。例えば、当該特定の細胞に刺激を与えて培養することで、当該刺激への応答を検討することができる。当該刺激としては、特に制限されないが成長因子やビタミン等の薬剤の添加、培養温度の変化、必須栄養源の無添加等が例示できる。さらに、当該刺激により当該特定の細胞に分化誘導が起こる場合には、マイクロチャンバー内で当該特定の細胞の検出及び分化誘導を行えることとなり、好ましい。マイクロチャンバー内で培養ができない場合は、一度培養シャーレ中で分化誘導刺激を与えて培養し、マイクロチャンバーへ戻すこととなり、手間であるからである。また、シャーレに細胞が接着する場合、当該接着を酵素等により剥がす操作が必要となり、当該操作により細胞を傷つけ、細胞の機能が損なわれるおそれがあるからである。
　具体的には、例えば、マイクロチャンバー内でＰＣ１２細胞（Rat adrenal pheochromocytoma cell line）を検出し、これに神経成長因子 (NGF) を添加して数日培養することで、神経細胞様に分化させシナプスネットワークを形成させることができる。
　さらにまた、下述する薬剤候補物質のスクリーニングにおいて、薬剤候補物質の中には、添加後すぐに（数分～数時間）細胞に与える影響が観察できる物質の他に、添加後数日間しなければ細胞に与える影響が観察できない物質も存在することが考えられる。よって、薬剤候補物質のスクリーニングを行うにあたり、薬剤候補物質を添加した後細胞を数日間培養して維持した後、細胞の状態を観察することが求められることがある。このため、本発明のマイクロアレイチップは薬剤候補物質のスクリーニングに好ましく用いることができる。
　本発明のマイクロアレイチップによれば、前述のように、種々の細胞を検出標的とすることができる。例えば、これまでにも例示した血液細胞、ヒト由来の細胞や動物細胞、酵母細胞、微生物細胞幹細胞、ガン細胞等の培養細胞も標的とすることが可能である。そして、本発明のマイクロアレイチップを使用することにより、試料中に存在する細胞の中から、標的とする特定の細胞のみを迅速、簡便かつ高感度に検出、測定、解析等できる。
（ｄ）薬剤候補物質のスクリーニング
　本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法により、種々の薬剤候補物質が細胞に与える影響を簡便かつ迅速に測定し、所望の活性を示す物質を効率よく選択することができる。
　本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法には、複数のマイクロチャンバーを備え、該マイクロチャンバー内には細胞が保持されているマイクロアレイチップを用いる。
　本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法では、まず、前記細胞が保持されたマイクロチャンバーに薬剤候補物質を添加する。マイクロアレイチップが備える全てのマイクロチャンバーに同一の薬剤候補物質を添加してもよいし、マイクロチャンバーによって添加する薬剤候補物質を変えてもよい。また、いくらかのマイクロチャンバーには薬剤候補物質を加えず、これらのマイクロチャンバーに保持された細胞をコントロールとして用いるのが好ましい。
　薬剤候補物質を添加した後、該薬剤候補物質がマイクロチャンバー内に保持される細胞に与える影響を測定する。当該影響の測定の方法は、用いる薬剤候補物質、用いる細胞、及び所望の活性に応じて適宜設定すればよい。
　例えば、抗ガン剤として作用する物質をスクリーニングしたい場合は、マイクロチャンバー内に癌細胞を保持し、薬剤候補物質を添加して、当該癌細胞がどの程度の割合及び時間で死滅するかを測定すればよい。
　そして、当該測定結果に基づいて、実験に供した薬剤候補物質の中から所望の活性を示す物質を選択すればよい。例えば、上記の抗ガン剤として作用する物質をスクリーニングする例であれば、癌細胞が高効率で死滅する作用を示した物質を選択すればよい。
　このようにすることで、多数の薬剤候補物質を簡便かつ迅速にスクリーニングすることができる。
　また、本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法に用いられるマイクロアレイチップは、特に制限されないが、上述の本発明のマイクロアレイチップであることが好ましい。本発明のマイクロアレイチップであれば、細胞をより均一かつ効率よく、単層として、マイクロチャンバーに格納させることができる。
　また、上述のように、本発明のマイクロアレイチップによれば、細胞をマイクロチャンバー内で少なくとも数日以上培養することができる。このため、本発明のマイクロアレイチップを用いて本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法を実施すれば、薬剤候補物質を添加した後細胞を数日以上培養して維持した後、当該物質が細胞に与える影響を測定することができる。
　またさらに、本発明のマイクロアレイチップでは、各マイクロチャンバーにほぼ同数の細胞が保持されるため、各マイクロチャンバー内の細胞の状態を均一とすることができる。よって、本発明のマイクロアレイチップを用いて本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法を実施すれば、異なる薬剤候補物質を各マイクロチャンバーへと添加した際、それぞれの薬剤候補物質がどのような影響を細胞へ与えるのかを比較評価しやすい。
図１は、マイクロチャンバーを格子状に配置させる場合の距離（ｉ）を示す。 図２は、縦５０個、横２００個になるようにマイクロチャンバーを配置させ、各マイクロチャンバーに１００個ずつ血液細胞を格納させたマイクロアレイチップにおいて、１つのマイクロチャンバーあたり１つの感染した血液細胞が検出された例を示す。 図３は、実施例１において使用したマイクロアレイチップの例を示す。当該マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーは、内径１００μｍ、深さ１００μｍである。また、各マイクロチャンバー同士の最短距離は２００μｍである。また、マイクロチャンバーの総数は１０７５２個である。 図４は、実施例１の実験結果を示す。 図５は、マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバー内で、ギムザ染色により検出された、マラリア原虫が感染した赤血球細胞を示す。 図６は、水接触角による細胞展開率の差異を示す。左に示すマイクロアレイチップの表面の水接触角は８０度であり、チャンバーに細胞がほとんど入らない（細胞展開率１０％以下）。中央に示すマイクロアレイチップの表面の水接触角は２５度であり、細胞が入らないチャンバーがいくつか存在する（細胞展開率４０％程度）。右に示すマイクロアレイチップの表面の水接触角は１０度であり、ほとんどのチャンバーに一定量の細胞が存在する（細胞展開率９０％以上）。 図７は、内径及び深さの異なるマイクロチャンバーを備えた３種のマイクロアレイチップにおいて、マイクロチャンバーに赤血球細胞が格納された様子を示す。 図８は、マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーに保持されたＨＥＫ－２９３細胞をを示す。 図９は、マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーに保持された酵母をを示す。 図１０は、マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバー内で培養されたＨＥＫ－２９３細胞をを示す。
　以下、実施例を挙げて本発明について説明するが、本発明は該実施例に限定されない。
実施例１
１．実施例１で使用したマイクロアレイチップ
　実施例１では、次のマイクロアレイチップを使用した。
マイクロアレイチップの基板：ポリスチレン
マイクロアレイチップの表面処理：酸素プラズマ処理
マイクロチャンバーの形成：ＬＩＧＡプロセス
１つのマイクロチャンバーあたりの格納細胞数：約１００個
マイクロチャンバーの形状：円筒形
マイクロチャンバーの寸法：内径１００μｍ、深さ１００μｍ
１つのマイクロアレイチップあたりのマイクロチャンバーの数：１０，７５２個
マイクロチャンバー同士の距離：図１において（ｉ）に相当する距離２００μｍ
マイクロアレイチップの表面の水接触角：１０°
該マイクロアレイチップを図３に示す。
２．実施例１で使用したマイクロアレイチップの作製方法
　前述のマイクロアレイチップは次のようにして製造した。
　実施例１では、ＬＩＧＡプロセスによって作製されたスターライト工業株式会社製のマイクロアレイチップを使用した。具体的には、該マイクロアレイチップは、Ｘ線リソグラフィー法によって、ＰＭＭＡ基板にパターニングし、エッチングによってＰＭＭＡの鋳型を作り、そこで電鋳（メッキ）を行い、作製されたニッケルの金型にポリスチレンを流し込んで成型されたものである。
　該マイクロアレイチップの表面を、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ：Reactive Ion Etching）装置（サムコ株式会社製）によって２００Ｗの出力、２０秒程度の処理時間で酸素プラズマ処理を行うことにより、チップ基板表面を親水化した。
　このように親水化したマイクロアレイチップ表面の水接触角は次のようにθ/２法により測定した。具体的には、得られたマイクロアレイチップの表面の異なる複数の地点（５点以上）に蒸留水１～２μlを滴下して、接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて、室温にて水接触角を測定した。得られた値の平均値を求めることにより、水接触角を決定した。
　また、マイクロアレイチップ上に細胞懸濁液が展開しやすいように、マイクロチャンバー内に空気が入らないようにするため、親水化したマイクロアレイチップに対して事前に超音波処理を行った。超音波処理は、一般的に用いられる超音波洗浄装置を用いて、培地（ＲＰＭＩ１６４０）を入れたビーカーに表面処理を行ったマイクロアレイチップを浸して、約５分間処理を行った。
３．マラリア原虫感染赤血球の検出手順（蛍光標識法）
　実施例１では、感染症としてマラリア原虫感染症を対象とし、該感染症に感染した赤血球を検出することを目的とした。蛍光標識法による検出手順は次の通りである。
１）マラリア原虫をマラリア連続培養法（W. Trager, J.B. Jensen, Science (1976) 673-675）にて培養（３７℃、５％ＣＯ２／５％Ｏ２、３％ヒト赤血球および１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地条件下にて培養）し、マラリア感染赤血球を得た。次いで、これをマラリア感染赤血球１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう培養液（ＲＰＭＩ１６４０）で懸濁することにより、マラリア感染赤血球懸濁液を作製した。なお、前記ヒト赤血球は、ヒトから採血し、遠心分離（４℃、１５００ｇ、３０ｍｉｎ）することにより得たものを使用した。
　顕微鏡下で細胞をカウントした結果、このときのマラリア原虫の赤血球への感染率は０．５％であった。
２）マラリア感染赤血球を染色するため、作製したマラリア感染赤血球懸濁液に対し２種類の蛍光色素（Ｄｉｌ、ＳＹＴＯ５９）を市販推奨濃度を基準に同時に加えよく懸濁した後、３７℃にて５分間インキュベートすることにより蛍光染色した。
３）蛍光染色された赤血球懸濁液２００μｌを、マイクロピペットを用いて前記マイクロアレイチップ上に添加することにより、マイクロアレイチップに赤血球を接触、展開させた。
４）１０分、室温で放置することにより、赤血球をマイクロアレイチップに吸着させた。
５）前記マイクロアレイチップ表面を、マイクロピペットを用いて１ｍｌの培養液（ＲＰＭＩ１６４０）で洗浄した。
６）洗浄後、マイクロアレイチップを蛍光顕微鏡を用いて観察した。
　結果を図４に示す。図４の左の写真は、明視野像でありマイクロアレイチップの穴底付近の実体像を示している。図4真ん中の写真は、Ｄｉｌにて細胞の細胞膜を染色しておりマイクロアレイチップ上のすべての赤血球を示す。図４の右の写真は、すべての細胞のうちＳＹＴＯ５９にて核を染色しておりマラリア原虫に感染した赤血球のみを示す（正確には、赤血球に感染した原虫の核が蛍光染色されており、当該核から発せられた蛍光を示す）。
　直径１００μｍのマイクロチャンバー内に１００個程度の赤血球を導入することに成功した。さらに、マイクロチャンバーに格納された赤血球の中から、マラリア原虫に感染した赤血球を検出することができた。
　本結果から、本発明の検出方法によれば全細胞のうち少なくとも０．０００１％程度の細胞しか感染していなくとも十分に検出・診断できることが分かった。
４．マラリア原虫感染赤血球の検出手順（ギムザ染色法）
　ギムザ染色法によるマラリア原虫感染赤血球の検出手順は次の通りである。
　マラリア感染赤血球を蛍光染色する工程を省いた以外、上記３．に記載の方法に従い、マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーへ、マラリア原虫感染赤血球を含む一定数の赤血球細胞を保持させた。
　次に、スライドガラス及びセルスクレーパーを用いて細胞チップ表面に残った水分を除去した。さらに、真空ポンプ及びドライヤーを用いて、細胞が破裂しない程度の温度（室温～６０℃）で速やかにマイクロチャンバー内の水分を除去し、細胞を乾燥固定した。その後、マイクロアレイチップを丸ごと１００％メタノール中に浸積させ（室温、３０分間）、メタノール固定を行った。メタノール固定後、ギムザ染色液（メルク社）へマイクロアレイチップを丸ごと浸積させ（室温、３０分間）、染色を行った。
　染色後、マイクロアレイチップを丸ごと蒸留水に浸積させて洗浄する操作を３回繰り返し、真空ポンプ及びドライヤーを用いて、細胞が破裂しない程度の温度（室温～６０℃）で速やかマイクロチャンバー内の水分を除去し、乾燥させた。この後、光学顕微鏡にて観察を行った。
　結果を図５に示す。図５に示されるように、マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバー内で、マラリア原虫をギムザ染色し、検出することが可能であることが確認できた。
実施例２
　水接触角と細胞の展開効率について、以下のようにして比較した。
１．マイクロアレイチップの作製
　まず、水接触角の異なる３種のマイクロアレイチップ（水接触角８０°、２５°、１０°）を作製した。これらのマイクロアレイチップは前述の実施例１と同様に作製されるが、酸素プラズマ処理条件を変更することより、水接触角の異なる３種のマイクロアレイチップを作製した。具体的には、以下の条件下で酸素プラズマ処理を実施した。
水接触角８０°のマイクロアレイチップ：ＲＩＥ装置（サムコ株式会社製）を用いて、出力２００Ｗ、３秒の処理時間で表面処理を行った。
水接触角２５°のマイクロアレイチップ：ＲＩＥ装置を用いて、出力２００Ｗ、５秒の処理時間で表面処理を行った。
水接触角１０°のマイクロアレイチップ：ＲＩＥ装置を用いて、出力２００Ｗ、２０秒の処理時間で表面処理を行った。
２．赤血球の検出手順
　本実施例２では、マラリア原虫に感染していない赤血球を使用した。具体的には、次のようにして赤血球を検出することにより、細胞の展開効率を比較した。
　まず、前述の実施例１と同様にしてヒトから採血、遠心分離することにより得た赤血球を培地（ＲＰＭＩ１６４０）で懸濁することにより、ヒト由来の赤血球細胞懸濁液（懸濁液中の赤血球濃度１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を得た。得られた赤血球細胞懸濁液２００μｌを実施例１と同様にしてマイクロアレイチップ上に添加することにより、マイクロアレイチップに赤血球を接触、展開させ、顕微鏡下で赤血球が格納されているマイクロチャンバーの数を確認した。なお、赤血球は顕微鏡下で淡赤色であるため、マイクロチャンバーに赤血球が格納されているかどうかは、マイクロチャンバー内の色（赤血球の色）により判別できる。すなわち、マイクロチャンバー内が淡赤色となっていれば該マイクロチャンバーには赤血球が格納されており、淡赤色となっていなければ該マイクロチャンバーには赤血球が格納されていないと判断できる。このことから、本実施例２及び下記実施例４では、蛍光染色は行わなかった。
３．結果
　結果を図６に示す。ここで、細胞の展開効率とは、マイクロアレイチップに備えられた全マイクロチャンバー数に対する、細胞が格納されたマイクロチャンバー数の割合を意味する。
　前述のようにして得られたマイクロアレイチップにおいては、水接触角が８０°の場合は、マイクロチャンバーに殆ど細胞が入らなかった。これに対して、水接触角を２５°にした場合には、４０％程度のマイクロチャンバーに細胞を格納することができた。また、水接触角を１０°にした場合には、９０％以上のマイクロチャンバーに細胞を格納することができた。
実施例３
１．マイクロアレイチップの作製
　実施例２と同様にして、水接触角８０°以上または１０°以下のマイクロアレイチップをそれぞれ作製した。
２．赤血球の検出手順
　実施例２と同様にして、マラリア原虫に感染していない赤血球を使用して、各マイクロアレイチップにおける細胞の展開効率を比較した。
３．結果
　前述のようにして得られたマイクロアレイチップにおいては、水接触角が８０°以上の場合は、マイクロチャンバーに殆ど細胞が入らなかった。これに対して、水接触角を１０°以下にした場合には、９０％以上のマイクロチャンバーに細胞を格納することができた。例えば、水接触角を５°以下にした場合も、良好にマイクロチャンバーに細胞を格納することができた。
実施例４：各マイクロチャンバーによる赤血球細胞の保持能力の検討
　マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーの内径及び深さを変えたとき、マイクロチャンバー内に格納される細胞に違いが見られるかを検討した。
＜マイクロアレイチップの製造＞
　下記の内径及び深さの円筒形マイクロチャンバーを備えるマイクロアレイチップを３種（マイクロアレイチップＡ～Ｃ）製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
マイクロアレイチップＡ～Ｃは、内径及び深さ、各マイクロチャンバー間の距離、並びに格納細胞数以外の条件は、各マイクロチャンバー間の距離（図１の（i）に相当する距離）を除いて全て実施例１で製造したマイクロアレイチップと同じであり、実施例１に記載の方法と同様にして製造した。なお、各マイクロチャンバー間の距離は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
＜マイクロアレイチップへの赤血球細胞の展開＞
　前述の実施例１と同様にしてヒトから採血、遠心分離することにより得た赤血球を培地（ＲＰＭＩ１６４０）で懸濁することにより、ヒト由来の赤血球細胞懸濁液（懸濁液中の赤血球濃度５．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を得た。得られた赤血球細胞懸濁液２００μｌを実施例１と同様にしてマイクロアレイチップ上に添加することにより、マイクロアレイチップに赤血球を接触、展開させ、顕微鏡下で赤血球が格納されているマイクロチャンバーを確認した。
　結果を図７に示す。図７に示されるように、マイクロアレイチップＡ及びＣでは、顕微鏡下、各マイクロチャンバーに重なり無く格納されることが確認できた。また、顕微鏡下、細胞数を数え、各マイクロチャンバーにほぼ同数の細胞が格納されていることが確認できた。よって、各マイクロチャンバーの底に均一に、赤血球が単層に保持されていることがわかった。一方、マイクロチップＢでは、マイクロチャンバーによっては、底面のうち赤血球が接着していない部分が多く見られた。これは、マイクロアレイチップを洗浄した際に、マイクロチャンバーの底に接着していた赤血球までも洗浄により洗い流されてしまったためと考えられた。このことから、内径が５００μｍ程度の大きさのマイクロチャンバーでは、深さが１５０μｍ以下の場合、細胞を均一に単層にチャンバー内に保持するのが困難であると考えられた。また、マイクロアレイチップＡ及びＣでは各マイクロチャンバーの底に均一に、赤血球が単層に保持されていることから、マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比は（１：０．３５～１）程度が好ましいと考えられた。
実施例５：マイクロアレイチップへの各種細胞の展開
　実施例４にて製造したマイクロアレイチップＡ及びマイクロアレイチップＣを用い、当該チップのマイクロチャンバー内にＨＥＫ－２９３細胞（以下「ＨＥＫ細胞」と略す）及び酵母を保持させられるかを検討した。
＜ＨＥＫ細胞＞
　ＨＥＫ細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地で常法に従って培養し、これを回収して１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう当該培地に懸濁した。当該懸濁液２００μｌを、マイクロピペットを用いてマイクロアレイチップＣ上に添加することにより、マイクロアレイチップＣにＨＥＫ細胞を接触、展開させた。さらに該マイクロアレイチップＣ表面を、マイクロピペットを用いて１ｍｌの前記培養液で洗浄し、光学顕微鏡で明視野像を観察した。結果を図８に示す。
＜酵母＞
　培地（YPN（基本培地））に縣濁した酵母（細胞濃度３．６x１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をピペットマンでマイクロアレイチップＡ上に２００ｍＬ展開して静置した後、20分後、チップ表面を培地等で洗浄して、光学顕微鏡で明視野像を観察した。結果を図９に示す。
　図８及び図９に示されるように、ＨＥＫ細胞及び酵母とも、各マイクロチャンバーに重なり無く格納されることが確認できた。このことから、ＨＥＫ細胞及び酵母とも、各マイクロチャンバーに均一に単層として保持されることがわかった。当該結果から、本発明のマイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーには、種々の細胞を均一かつ単層に保持させ得ることがわかった。
実施例６：マイクロチャンバー内での細胞の培養
　マイクロチャンバー内で細胞を培養できるか調べるため、実施例４で製造したマイクロアレイチップＣを用いてＨＥＫ細胞の培養を試みた。
　具体的には次のように培養を行った。実施例５に記載の方法と同様にしてＨＥＫ細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をマイクロアレイチップＣに展開し、洗浄した。次に当該マイクロアレイチップＣを丸ごと培養用液体培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地）へ浸積させ、ＣＯ２インキュベーター内（ＣＯ２濃度５％、３７℃）で培養を行った。ＣＯ２インキュベーター内の培養では、２４時間毎にマイクロアレイチップを浸積させている培地を新しい培地へ交換した。交換する際には、当該チップ表面を新しい培地で洗浄し、マイクロチャンバー内も培地が交換されるようにした。
　結果を図１０に示す。細胞をマイクロアレイチップＣへ展開し、マイクロチャンバー内へ保持させた直後に比べ、培養４日目ではＨＥＫ細胞数が増え、形態が変化している細胞も存在することから、ＨＥＫ細胞を培養できたことが確認できた。

Claims (13)

  1. 複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、
    （１）複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、該試料中の細胞を保持させる工程、及び
    （２）該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を確認する工程
    を含有する検出方法。
  2. 前記マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５～１）である、請求項１に記載の検出方法。
  3. 前記マイクロチャンバーが、内径が２０～５００μｍ、深さが２０μｍ以上である、請求項２に記載の検出方法。
  4. 前記特定の細胞が感染症原因病原体の感染した細胞である、請求項１に記載の検出方法。
  5. 前記感染症原因病原体がマラリア原虫類である、請求項４に記載の検出方法。
  6. 前記複数の細胞を含む試料が複数の血液細胞を含む試料である、請求項１に記載の検出方法。
  7. 前記マイクロアレイチップの表面の水接触角が１０°以下である、請求項１に記載の検出方法。
  8. 複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップを含有する、複数の細胞を含む試料から該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出用キット。
  9. 前記複数の細胞を含む試料が複数の血液細胞を含む試料であり、前記特定の細胞が感染症原因病原体の感染した血液細胞である、請求項８に記載の検出用キット。
  10. 　複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー１つあたりに複数の細胞を格納可能であり、かつ表面の水接触角が１０°以下であるマイクロアレイチップ。
  11. 前記マイクロチャンバーの（内径：深さ）の比が（１：０．３５～１）である、請求項１０に記載のマイクロアレイチップ。
  12. 　前記マイクロチャンバーが、内径が２０～５００μｍ、深さが２０μｍ以上である、請求項１１に記載のマイクロアレイチップ。
  13. 前記マイクロチャンバー内に細胞が格納された、請求項１０に記載のマイクロアレイチップ。
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