JP2006101708A - マラリア感染赤血球の測定方法、測定装置、測定用試薬、及びマラリア原虫の測定方法、測定装置、測定用試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 マラリア感染赤血球を正確かつ簡便に検出する。
【解決手段】 本発明は、血液検体に、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を添加して測定用試料を調製し、前記調製した測定用試料中から光学的情報を検出し、検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア感染赤血球を検出する、マラリア感染赤血球測定方法を提供する。
【選択図】 図１１

Description

この発明は、マラリア感染赤血球またはマラリア原虫の測定方法、測定装置及び測定用試薬に関し、特に迅速、簡便、且つ精度よくマラリア感染赤血球またはマラリア原虫を検出する方法、装置及び試薬に関する。

マラリアは熱帯、亜熱帯に広く分布する寄生虫感染症であり、ハマダラカと呼ばれる蚊によって媒介される。マラリア原虫を持つハマダラカに吸血されると、ハマダラカの唾液とともに原虫が人の血液中に注入される。原虫は肝細胞内に進入し、そこで増殖し、再び血液中に放出される。このときの原虫の形態をメロゾイト（分裂小体:merozoite）とよぶ。メロゾイトは血液中に放出されると直ちに赤血球内に侵入し、その形態を変化させながら発育していく。この形態変化を生活環と呼び、生活環の各段階（ステージ）はリングフォーム（輪状体:ring form）、トロポゾイト（栄養体:tropozoite）、シゾント（分裂体:schizonte）と呼ばれる。シゾントまで発育した原虫は赤血球を破壊し、再びメロゾイトとなって血液中に放出される。放出されたメロゾイトは赤血球に侵入し、再び生活環を繰り返して増殖を繰り返す。マラリア原虫はこのサイクルを繰り返すことによって増殖し、血液中の赤血球を破壊し続ける。

従来からマラリア診断のために最も多用されている検査法は、目視による顕微鏡検査である。血液塗抹標本をギムザ染色し、顕微鏡で目視観察することによりマラリア原虫に感染している赤血球を検出して計数する。しかしこの方法は、塗抹標本の作成のために、血液検体の塗抹、固定、染色など煩雑な工程を要する。また正確な検査結果を得るためには、長時間かけて多数の赤血球を顕微鏡観察する必要があり、多数の試料を迅速に処理することが困難である。

一方、フローサイトメトリ法を応用し、蛍光染色したマラリア感染赤血球を自動的に検出する方法が研究されている。このような方法においては、検体中の網状赤血球が蛍光染色され、マラリア感染赤血球との判別が困難になるという問題点があったが、特許文献１には、第一の蛍光色素として低濃度のオーラミンＯを用いてマラリア感染赤血球のみを染色し、更に第二の蛍光色素として3,3'-ジエチル-2,2'-オキサカルボシアニンアイオダイドを用いることにより、網状赤血球の影響を低減させたマラリア感染赤血球の検出方法が記載されている。一方、血液中のマラリア原虫を測定する方法として、界面活性剤により試料中の赤血球を溶解してマラリア原虫を遊離させ、遊離したマラリア原虫に蛍光染色を施し、フローサイトメータに導入してマラリアの検出を行う方法が特許文献２に記載されている。同文献にはマラリア原虫を蛍光染色するために使用可能な核酸染色性色素が記載されている。

特許第３４２１１１１号公報 特開平１１−７５８９２号公報

本発明の解決課題は、従来とは異なる蛍光色素を用いることにより、測定用試料の調製を簡便なものとし、且つ網状赤血球の影響を低減させた、新規なマラリア感染赤血球の測定方法、測定装置及び測定用試薬を提供することである。また本発明の別の解決課題は、従来とは異なる蛍光色素を用いることによりマラリア原虫を検出可能な、新規なマラリア原虫の測定方法、測定装置及び測定用試薬を提供することである。

上記の課題に鑑み、本発明者らは鋭意研究の結果、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系の蛍光色素が、マラリア感染赤血球やマラリア原虫の測定に大変有用であることを見出した。すなわち本発明は、血液検体に、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を添加して測定用試料を調製し、前記調製した測定用試料から光学的情報を検出し、検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア感染赤血球を検出する、マラリア感染赤血球測定方法を提供するものである。

また本発明は、血液検体を収容する検体容器と、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む試薬を収容する試薬容器と、前記血液検体と前記試薬を混合するための混合容器を有し、前記検体容器内の血液検体及び前記試薬容器内の試薬を前記混合容器に供給して測定用試料を調製する試料調製部、前記試料調製部が調製した測定用試料から光学的情報を検出する検出部、前記検出部が検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア原虫を検出する制御部、を有するマラリア感染赤血球測定装置を提供するものである。

また本発明は、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む、マラリア感染赤血球測定用試薬を提供するものである。

また本発明は、血液検体に、溶血剤とＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を添加して測定用試料を調製し、前記調製した測定用試料から光学的情報を検出し、検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア原虫を検出する、マラリア原虫測定方法を提供するものである。

また本発明は、血液検体を収容する検体容器と、溶血剤を含む第一試薬を収容する第一試薬容器と、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む第二試薬を収容する第二試薬容器と、前記血液検体、前記第一試薬及び前記第二試薬を混合するための混合容器を有し、前記検体容器内の血液検体、前記第一試薬容器内の第一試薬及び前記第二試薬容器内の第二試薬を前記混合容器に供給して測定用試料を調製する試料調製部、前記試料調製部が調製した測定用試料から光学的情報を検出する検出部、前記検出部が検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア原虫を検出する制御部、を有するマラリア原虫測定装置を提供するものである。

また本発明は、溶血剤を含む第一試薬と、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む第二試薬と、を含むマラリア感染赤血球測定用試薬を提供するものである。

この発明によれば、マラリア感染赤血球内のマラリア原虫が有するＤＮＡを特異的に染色し、迅速かつ正確なマラリア感染赤血球の検出が可能となる。またこの発明によれば、溶血した赤血球から遊離したマラリア原虫が有するＤＮＡを特異的に染色し、迅速かつ正確なマラリア原虫の検出が可能となる。

本発明では、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系の蛍光色素を用いて血液検体に蛍光染色を施す。蛍光色素としては、例えば以下の式

（但し、この式において、Ｒ₁およびＲ₂のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ₃Ｒ₄であり、ＡがＣ_2-8アルキレン基であって、Ｒ₃とＲ₄が互いに独立に、水素、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_2-4ヒドロキシアルキル、およびＣ_2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ₃とＲ₄が一緒に、Ｒ₃およびＲ₄が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ_2-6アルキレン基を形成する化合物である。）で表される物質を使用できる。特に好適には、上記式中、Ｒ_１及びＲ_２がいずれもNH(CH₂)₂N(CH₃)₂である物質が用いられる。

蛍光染色処理は、血液検体中の赤血球を溶血させてマラリア原虫を遊離させ、遊離したマラリア原虫を染色する方法（溶血法）を用いてもよい。或いは、血液検体中の赤血球を溶血させずにマラリア感染赤血球中のマラリア原虫を染色する方法（非溶血法）を用いてもよい。従来、非溶血法にて核酸染色色素を用いる場合、網状赤血球がその細胞内に有するＲＮＡも蛍光染色され、マラリア感染赤血球と同程度の蛍光を発し、両者の判別が困難になることがあった。しかし、上記化学式の蛍光色素は、ＤＮＡと特異的に結合し、ＲＮＡとは実質的に結合しない性質を有しているため、マラリア原虫のＤＮＡは染色されるが、その一方で細胞内にＲＮＡを含有するがＤＮＡは含有しない網状赤血球は実質的に染色されない。よって検体中に網状赤血球が含まれていても、マラリア感染赤血球の検出に影響を与えることはない。

図１は、ＤＮＡ及びＲＮＡを共に染色する従来の核酸染色色素をマラリア未感染の血液に添加して試料液を調製し、その試料液からフローサイトメータにより前方散乱光及び蛍光を得て作成した二次元スキャッタグラムである。図２は、前記化学式で表されるアントラキノン系の蛍光色素であって前記式中のＲ_１及びＲ_２がいずれもNH(CH₂)₂N(CH₃)₂である物質を、図１と同じマラリア未感染の血液に添加して試料液を調製し、その試料液からフローサイトメータにより前方散乱光及び蛍光を得て作成した二次元スキャッタグラムである。これらの二次元スキャッタグラムはいずれも縦軸に前方散乱光強度を、横軸に蛍光強度をとっている。

図１においては、前方散乱光強度の小さい領域に、赤血球に対応するドットの集団が出現している。また、その集団の左側、すなわち通常の赤血球よりも蛍光強度の大きい領域に、網状赤血球に対応するドットが出現している。網状赤血球は細胞内にＲＮＡを有するため、核酸染色色素により染色され、ＲＮＡを有さない通常の赤血球よりも蛍光強度が大きくなる。ここで、もし検体中にマラリア感染赤血球が存在すると、マラリア原虫の有するＤＮＡが核酸染色色素により染色され、検出される蛍光強度の大きさが網状赤血球から検出される蛍光の強度と重なる場合がある。つまり、網状赤血球とマラリア感染赤血球との判別が困難となる場合がある。

一方、図２では、図１と同様に、前方散乱光強度の小さい領域に、赤血球に対応するドットの集団が出現しているが、通常の赤血球よりも蛍光強度の大きい領域に、網状赤血球に対応するドットは出現していない。これは、用いている蛍光色素が、ＤＮＡは染色するがＲＮＡは染色しない性質を有するため、ＤＮＡは有さずＲＮＡを有する網状赤血球を染色していない結果である。以上に示した図１及び図２より、前記化学式で表したアントラキノン系の蛍光色素をマラリア感染赤血球の検出に用いれば、網状赤血球の影響を受けずに精度よい測定を行うことが可能であるとわかる。

以下、本発明の一実施形態にかかるマラリア感染赤血球測定装置を用いた検体の測定について説明する。ここでは、フローサイトメトリ法を用い、非溶血法にてマラリア感染赤血球を計数するマラリア感染赤血球測定装置を用いる。検体としては、ヒトの血液を用いる。

試薬
マラリア感染赤血球測定装置において測定用試料を調製するために用いる試薬として、以下に説明する染色液と希釈液を用いる。

染色液
染色液としては、Biostatus社製DRAQ5を用いる。この染色液は、以下の式で表されるアントラキノン系の蛍光色素を含有している。

（但し、上記式中、Ｒ１及びＲ２はいずれもNH(CH₂)₂N(CH₃)₂である。）

上記蛍光色素は波長６３３ｎｍ前後のレーザ光により蛍光が励起される性質を有する。

希釈液
希釈液は、検体に蛍光染色を施すための環境を整えるために検体に添加する試薬である。ここではシスメックス株式会社製レットサーチ（II）を用いる。これは自動血球計数装置用に市販されている希釈液であり、赤血球が溶血しない浸透圧及びｐＨの範囲に緩衝能を有する。

マラリア感染赤血球測定装置
図３は、マラリア感染赤血球測定装置１００の外観を示したものである。装置の前面には、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１０１、後述する試料調製部２００を覆うカバー１０２、スタートスイッチ１０３を備えている。図４はマラリア感染赤血球測定装置１００の内部構成を示したものである。装置の右側のスペースには、装置の動作や解析処理を司る制御部４００が備えられている。装置の左下のスペースには、試料液から信号を検出するための検出部３００が備えられている。また残りのスペースに、試料液を調製するための試料調製部２００が備えられている。

以下、試料調製部２００、検出部３００、制御部４００の各部について説明する。

試料調製部２００の構成
図５は試料調製部２００を示す説明図である。試料調製部２００は、手前右側に検体セット部２２１、手前左側に試薬セット部２２２、奥側にインキュベータ２２３を備えている。また分注装置２２４を備えている。操作者が前記図３のカバー１０２を開けることにより、図５に示した試料調製部２００が現れる。試料調製部２００において、検体セット部２２１には、検体の入った検体容器２２５をセットするよう構成されている。インキュベータ２２３には、反応容器２２６をセットするよう構成されている。また試薬セット部２２２には、染色液の入った試薬容器２２７、希釈液が入った試薬容器２３１をセットするよう構成されている。インキュベータ２２３は、セットされた反応容器２２６の中の液体を、所定の温度に保ちながら振盪撹拌するよう構成されている。分注装置２２４は、その先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示しない駆動装置によって前後・上下・左右に移動可能に構成されている。試料容器２３３は、後述する検出部３００のフローセル３０１と接続されている。

検出部３００の構成
図６は検出部３００の構成を示す説明図である。検出部３００は、試料液を流すためのフローセル３０１を有する。フローセル３０１は、レーザ光が照射される部分であり内部流路が細く絞られているオリフィス部３０２、試料液をオリフィス部に向かって上方へ噴射するノズル３０３、シース液供給口３０４、排液口３０５を有する。また検出部３００は、レーザ光を照射するためのレーザ光源３０６を有する。レーザ光源３０６は、波長６３３ｎｍのレーザ光を出射する赤色半導体レーザ光源である。半導体レーザ光源は、アルゴンイオンレーザ光源に代表される従来の気体レーザ光源に比べ小型であり、また発振寿命も長いという利点を有する。検出部３００はさらに、レーザ光源３０６から照射されたレーザ光をフローセル３０１へ集光するコンデンサレンズ３０７、レーザ光を照射された試料液から発せられた前方散乱光を受光して電気信号に変換するフォトダイオード３０８、フォトダイオード３０８へ前方散乱光を集光するためのコレクタレンズ３０９とピンホール３１０、レーザ光を照射された試料液から発せられた蛍光を受光して電気信号に変換するフォトマルチプライヤチューブ３１１、フォトマルチプライヤチューブ３１１へ蛍光を集光するためのコレクタレンズ３１２、フィルタ３１３、ピンホール３１４、フォトダイオード３０８やフォトマルチプライヤチューブ３１１から出力された電気信号を増幅し、前方散乱光信号及び蛍光信号として制御部４００へ出力するアンプ３１５、３１６を有する。

制御部４００の構成
図７は制御部４００の構成、及び制御部４００と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部４００は、メモリ４０１、中央演算処理装置（ＣＰＵ）４０２、検出部３００から送られた信号を処理する信号処理回路４０３、マラリア感染赤血球検出装置１００の装置各部の動作を制御するための動作制御回路４０４を有する。メモリ４０１は、試料中に含まれる血球等の粒子から得た信号の解析に関する解析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを記憶している。また、信号処理回路４０３により処理されたデータや、解析プログラムによる処理結果を記憶する。ＣＰＵ４０２は、メモリ４０１から読み出された解析プログラムや制御プログラムを実行し、検出部３００において試料液から検出された信号を処理・解析したり、装置各部の動作を制御するための信号を動作制御回路４０４に送ったりする。解析プログラムによる解析結果は、液晶タッチパネル１０１に出力される。

以下、マラリア感染赤血球測定装置１００の動作の詳細につき説明する。図８は、制御プログラムによるマラリア感染赤血球測定装置１００の全体制御を示すフローチャートである。操作者がスタートスイッチ１０３を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＳ１（測定用試料の調製）、ステップＳ２（粒子信号の検出）、ステップＳ３（粒子信号の解析）が順次実行される。これにより、試料調製部２００、検出部３００、制御部４００の各部が制御され、マラリア感染赤血球測定装置１００の一連の動作が自動的に実行される。上記ステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３における装置各部の動作を以下に説明する。

ステップＳ１（測定用試料の調製）
ステップＳ１では、試料調製部２００が制御され、測定用試料の調製が実行される。ステップＳ１における試料調製部２００の動作を、図５を用いて説明する。まず分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から希釈液を１０００μＬ吸引し、次に検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体（ヒトの血液）を５μＬ吸引する。そして吸引した希釈液と検体を、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は、試薬セット部２２２の試薬容器２２７から２μＬの染色液を吸引し、反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、検体・希釈液・染色液が入った反応容器２２６内の液温を４０℃に保ったまま３１秒間撹拌し、希釈された検体に染色を施す。このようにして調製した測定用試料（試料液）を分注装置２２４が吸引し、試料容器２３３に供給する。試料容器２３３に供給された試料液は、検出部３００のフローセル３０１に流される。

ステップＳ２（粒子信号の検出）
ステップＳ２では、検出部３００が制御され、試料液中の粒子から、各粒子の特徴を反映する信号が検出される。ステップＳ２における検出部３００の動作を、図６を用いて説明する。前記の通り試料容器２３３に試料液が供給されると、図示しないポンプやバルブの動作により試料液がノズル３０３へ導かれる。そして試料液がノズル３０３からフローセル３０１に吐出される。それと同時にシース液が、図示しないシース液容器からシース液供給口３０４を介してフローセル３０１に供給される。これによって試料液は、フローセル３０１内でシース液に包まれ、更にオリフィス部３０２で細く絞られて流れる。試料液の流れを細く絞り込むことにより、試料液に含まれる血球等の粒子を一列に整列させてオリフィス部３０２に流すことができる。オリフィス部３０２を流れる試料液に対し、レーザ光源３０６から出射されたレーザ光がコンデンサレンズ３０７で絞られて照射される。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた前方散乱光はコレクタレンズ３０９により集光される。そしてピンホール３１０を通過した前方散乱光は、フォトダイオード３０８で受光、光電変換されてパルス状の前方散乱光信号となる。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた蛍光は、コレクタレンズ３１２により集光される。そしてフィルタ３１３、ピンホール３１４を通過した蛍光は、フォトマルチプライヤチューブ３１１で受光、光電変換されてパルス状の蛍光信号となる。前方散乱光信号及び蛍光信号は、それぞれアンプ３１５・３１６で増幅され、制御部４００へ送られる。

ステップＳ３（粒子信号の解析）
ステップＳ２で検出部３００により検出された前方散乱光信号及び蛍光信号は、制御部４００において図９に示すフロー（ステップＳ３１〜Ｓ３４）に従って解析される。

ステップＳ３１：まず検出部３００により検出された前方散乱光信号及び蛍光信号を信号処理回路４０３に入力する。この信号処理回路４０３は、前方散乱光信号及び蛍光信号それぞれにつき、一連の信号波形において所定の信号強度を超える部分を、粒子を検出した信号とみなす。そして粒子毎に信号強度のピーク値を抽出する。前方散乱光信号のピーク値を前方散乱光強度、蛍光信号のピーク値を蛍光強度とする。

ステップＳ３２：前記ステップＳ３１で得られた前方散乱光強度と蛍光強度は、粒子毎のデータとしてメモリ４０１に記憶される。

ステップＳ３３：メモリ４０１に記憶された粒子毎の前方散乱光強度及び蛍光強度のデータを、メモリ４０１に予め記憶されている解析プログラムにより解析する。ＣＰＵ４０２に読み出されて実行される解析プログラムの各ステップにつき、図１０のフローチャートを用いて説明する。

ステップＳ３３１：メモリ４０１から、試料液中の各粒子に対応した前方散乱光強度及び蛍光強度のデータを取得する。

ステップＳ３３２：前方散乱光強度及び蛍光強度のデータを二次元座標空間に展開し、前方散乱光強度及び蛍光強度をパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成する。

ステップＳ３３３：ステップＳ３３２で作成した二次元スキャッタグラム上に、マラリア感染赤血球に対応するドットが出現する領域Ｍ、及びマラリアに感染していない赤血球（以下、「非感染赤血球」という。これには、通常の成熟赤血球及び網状赤血球が含まれる）が出現する領域Ｒを設定する。領域Ｍ、領域Ｒの座標データはそれぞれメモリ４０１に予め記憶されており、本ステップにおいて解析プログラムによって読み出され、二次元スキャッタグラム上に適用される。なお領域Ｍ、領域Ｒの位置は、予め顕微鏡検査等によりマラリア感染赤血球、或いは非感染赤血球であると確認された血球から得た前方散乱光強度及び蛍光強度に基づき定めたものである。

上記ステップＳ３３３で作成された二次元スキャッタグラムの一例を、図１１に示す。この二次元スキャッタグラムは、縦軸に前方散乱光強度を、横軸に蛍光強度をとっている。マラリア感染赤血球に対応するドットが出現する領域Ｍ、非感染赤血球が出現する領域Ｒが設定されている。マラリア感染赤血球は、赤血球細胞内に寄生しているマラリア原虫の有するＤＮＡが蛍光染色されており、発する蛍光の強度が大きい。そのため、領域Ｍは領域Ｒに比べ蛍光強度の大きい位置に設定されている。マラリアに感染していない通常の成熟赤血球は、細胞内にＤＮＡを有しないため、マラリア感染赤血球に比べ、発する蛍光の強度が小さい。また網状赤血球は、細胞内にＲＮＡを有するがＤＮＡは有さないため、本例で用いられている蛍光色素によってはほとんど染色されず、非感染赤血球として捉えられる。

ステップＳ３３４：領域Ｍ、領域Ｒそれぞれにつき、各領域内に出現しているドット数を計数する。領域Ｍ内に出現したドットの数は、試料液中のマラリア感染赤血球の数を反映している。また領域Ｒ内に出現したドットの数は、非感染赤血球の数を反映している。

ステップＳ３３５：ステップＳ３３４で求めたマラリア感染赤血球数と非感染赤血球の数の合計（全赤血球数）で、マラリア感染赤血球数を除することにより、赤血球のマラリア感染率を求める（マラリア感染率＝マラリア感染赤血球数／（マラリア感染赤血球数＋非感染赤血球数））。

ステップＳ３３６：解析結果として前記作成した二次元スキャッタグラムとマラリア感染率を液晶タッチパネル１０１に出力するためのデータを作成し、作成したデータをメモリ４０１に記憶する。以上がステップＳ３３において解析プログラムにより実行されるステップである。続いて、図９に示したフローのステップＳ３４へ進む。

ステップＳ３４：前記ステップＳ３３６でメモリ４０１に記憶された解析結果のデータを液晶タッチパネル１０１に出力する。図１２は、前記データが液晶タッチパネル１０１に出力された様子を示す模式図である。液晶タッチパネル１０１には、二次元スキャッタグラムとマラリア感染率が解析結果として表示される。

測定結果の例
前記図１１は、上記に説明してきたマラリア感染赤血球測定装置１００を用いて、マラリア感染患者から採取した血液検体を測定して得られた二次元スキャッタグラムである。図１１の二次元スキャッタグラムにおいては、領域Ｍに、マラリア感染赤血球に対応するドットが出現している。また領域Ｒに、非感染赤血球に対応するドットが多数出現している。この検体に関し、マラリア感染赤血球測定装置１００による解析の結果得られたマラリア感染率は０．１２％（マラリア感染赤血球数は６９個×１０^４／μＬ、非感染赤血球数は５８００１個×１０^４／μＬ）、同検体に対し顕微鏡を用いた目視検査の結果得られたマラリア感染率は０．１４％（非感染赤血球９９００個に対し、マラリア感染赤血球数１４個）であり、上記マラリア感染赤血球測定装置１００による測定結果は目視検査の結果との相関が良いと言える。

ところで、上記実施形態のマラリア感染赤血球測定装置１００により検体を測定して得たマラリア感染率が、目視により得られた感染率と強い相関はあるものの、目視より低値になる場合があった。そのような検体を測定した例を以下に示す。ここでは、マラリア非感染の血液に培養したマラリア感染赤血球を添加してマラリア感染率の異なる複数の検体を用意し、これらを前記マラリア感染赤血球測定装置１００にて測定して、マラリア感染率を得た。また前記用意した複数の検体に対し顕微鏡を用いた目視検査を行ってマラリア感染率を得た。図１３のグラフ中、回帰直線１は前記マラリア感染赤血球測定装置１００にて得たマラリア感染率と目視検査にて得たマラリア感染率の相関を示すものである。ここでマラリア感染率の数値については、前記マラリア感染赤血球測定装置１００にて得たマラリア感染率の方が目視検査と比べやや低値となっている。しかし、相関係数Ｒの二乗は０．９９６７であり、両者の相関は良い。そこで、前記マラリア感染赤血球測定装置１００によるマラリア感染率に定数としてＫ＝２．１を乗じて値を補正することで、図１３のグラフにおける回帰直線２（y=0.9866x+0.0006）が得られる。この補正により、目視検査による値と非常に近い値が得られる。この補正を自動的に行うことも可能であり、その場合は、前記のマラリア感染赤血球測定装置１００の動作におけるステップＳ３３（解析プログラム実行）のフローに、補正のステップを追加すればよい。そのフローの一例を図１４のフローチャートに示す。このフローチャートは、図７のフローチャートと比較し、ステップＳ３３５’を有する点でのみ異なる。本フローチャートにおいて、ステップＳ３３５で感染率が算出されると、続いてステップＳ３３５’において、前記算出された感染率に定数Ｋ（ここではＫ＝２．１）を乗じて感染率の値を補正する。そしてステップＳ３３６において補正後の値を感染率として出力するデータを作成する。

上記の実施形態では、検体中の赤血球を溶血させずに蛍光染色を行う非溶血法により、マラリア感染赤血球の検出を行った。なお、溶血剤を含む試薬により血液検体中の赤血球や網状赤血球を溶血させ、赤血球から遊離したマラリア原虫を核酸染色性色素により蛍光染色して検出する方法（溶血法）を用いると、赤血球や網状赤血球を溶血させるため、網状赤血球の影響をより低減させてマラリア原虫の存在を検出できるというメリットがある。しかし溶血法によって計数されるマラリア原虫の数と、目視検査により計数されるマラリア原虫感染赤血球数との間には乖離が生じる場合があった。目視検査の場合、一つの赤血球細胞中に複数のマラリア原虫が存在していてもそれを一つのマラリア感染赤血球として計数し、赤血球数に対するマラリア感染赤血球数の割合を「感染率」として求めていたのに対し、上記のような溶血法では、赤血球を溶血させ、遊離させたマラリア原虫を計数するため、一つの赤血球細胞中に複数のマラリア原虫が存在していた場合は、マラリア原虫の数がマラリア感染赤血球の数よりも多くなるからである。

一方、上記に説明してきた本発明の実施形態では、マラリア感染赤血球を溶血することなく計数しているので、従来の目視検査と良好な相関が得られ、かつ簡便・迅速なマラリア感染赤血球の計数、並びに感染率の算出が可能である。但し、測定の目的に応じて、本発明の方法を上記のような溶血法に適用しても良いことは言うまでもない。

以下、前記実施形態と同様の蛍光色素を用い、溶血法によりマラリア原虫の測定を行った例につき説明する。

検体は、前記の実施形態と同じくヒトの血液を用いた。試薬としては、染色液、溶血剤を含む希釈液を用いた。染色液は前記の実施形態にて用いたものと同じ（Biostatus社製DRAQ5）である。希釈液としては、シスメックス株式会社製ストマトライザーＷＨを、同じくシスメックス株式会社製セルパックで９倍に希釈したものを用いた。ストマトライザーＷＨは、自動血球計数装置用に市販されている溶血試薬であり、赤血球を溶血させる効果のある物質として四級アンモニウム塩を含有している。セルパックは自動血球計数装置用に市販されている希釈液である。

マラリア原虫測定装置
測定に用いたマラリア原虫測定装置のハードウェア構成は、前記実施形態のマラリア感染赤血球測定装置１００と同じである。よってマラリア原虫測定装置の動作については、マラリア感染赤血球測定装置１００の説明に用いた図を用いて説明する。

検体セット部２２１に検体が入った検体容器を、試薬セット部２２２に、染色液の入った試薬容器２２７及び希釈液が入った試薬容器２３１をセットした状態でマラリア原虫測定装置の動作をスタートさせると、試料調製部２００において、まず分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から希釈液を１０００μＬ吸引し、次に検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体（ヒトの血液）を２０μＬ吸引する。そして吸引した希釈液と検体を、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は、試薬セット部２２２の試薬容器２２７から２μＬの染色液を吸引し、反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、反応容器２２６内の液温を２５℃に保ったまま１０秒間撹拌し、検体に溶血処理及び染色処理を施す。このようにして、血液中の赤血球を溶血させ、赤血球内のマラリア原虫が液中に遊離した状態で蛍光染色処理が施された測定用試料（試料液）が調製される。試料液中の赤血球は、溶血処理により細胞が破裂して破片状となる。調製された試料液は分注装置２２４により吸引され、試料容器２３３に供給される。

以降の動作は、前記マラリア感染赤血球測定装置１００と同様であり、試料容器２３３に供給された試料液は、検出部のフローセルに流され、試料液から前方散乱光及び蛍光が検出され、それらに基づき二次元スキャッタグラムが作成される。

図１５は、マラリア原虫測定装置を用いて、マラリア感染患者から採取した血液検体を測定して得られた二次元スキャッタグラムである。この二次元スキャッタグラムは、縦軸に前方散乱光強度を、横軸に蛍光強度をとっている。マラリア原虫に対応するドットが出現する領域Ｍ、及び赤血球の破片に対応するドットが出現する領域Ｇが設定されている。赤血球の破片に対応するドットは、前方散乱光強度・蛍光強度共に低値の領域に出現する。一方マラリア原虫に対応するドットは、前方散乱光強度及び蛍光強度の違いから、赤血球の破片と異なる位置に出現する。この二次元スキャッタグラムから、本実施形態で用いたアントラキノン系のＤＮＡ染色色素によりマラリア原虫が強く染色され、赤血球の破片と分別できることがわかる。領域Ｍ内に出現したドットを計数することにより、検体中のマラリア原虫の数を求めることが出来る。

上記の各実施形態では、レーザ光源３０６として赤色半導体レーザ光源を用いているが、必ずしもこれに限る必要はない。レーザ光源は、測定に用いる蛍光色素の励起波長に応じて適宜選択される。

また上記の各実施形態では、染色液としてBiostatus社製DRAQ5を用いたが、使用可能な蛍光色素は前記染色液に含まれるものに限られない。マラリア原虫が有するＤＮＡと特異的に結合し、網状赤血球が有するＲＮＡと実質的に結合しないアントラキノン系の蛍光色素を用いることができる。なお、色素によって蛍光の励起波長が異なるため、使用する色素の励起波長及び蛍光波長に応じて適切なレーザ光源や受光素子を適宜選択することが好ましい。

上記各実施形態におけるマラリア感染赤血球測定装置では、染色液及び希釈液は別々の容器に入れられ、別々にセットされている。つまり、装置にセットする前は別々の容器に収められた状態であり、それらをまとめて試薬キットとしている。しかし染色液と希釈液は必ずしも別液とする必要は無く、両者を一液としてもよい。また上記実施形態におけるマラリア原虫測定装置では、染色液と希釈液は必ずしも二液とする必要は無く、上記のように一液としてもよいし、或いは希釈液とは別に溶血剤を含有する試薬を用い、染色液・希釈液・溶血剤含有液の三液からなる試薬キットとしてもよい。

上記の実施形態では検体に溶液中で染色を施し、液体試料を測定対象としたが、検体中の血球を固定する方法を用いてもよい。その場合、ガラス等の平板上に検体を薄く塗布した塗抹標本を作製し、その標本をそのままもしくはメタノール等で固定し、蛍光染色する。溶液中での染色と同様に、染色の定量性を確保するために、ｐＨ、色素濃度等の染色条件は一定に保つことが好ましい。蛍光染色を施した塗抹標本からは、光学情報を検出し、検出した光学的情報に基づきマラリア感染赤血球を検出する。光学的情報の検出及びマラリア感染赤血球の検出には、画像解析もしくはスキャニングサイトメトリと呼ばれる方法を用いることができる。画像解析を行う場合は、塗抹標本の全領域に光を照射し、測定領域をCCDカメラで撮像し、得られた画像を解析して、マラリア感染赤血球内に存在するマラリア原虫のＤＮＡに結合した蛍光色素を測定する。スキャニングサイトメトリを用いる場合は、レンズで絞った光を照射することにより塗抹標本上の測定領域をスキャンし、それによって得られる信号を経時的に測定して、その結果からマラリア感染赤血球内に存在するマラリア原虫のＤＮＡに結合した蛍光色素を測定する。

ＤＮＡ及びＲＮＡを共に染色する核酸染色色素を用いて調製した試料液からフローサイトメータにより前方散乱光及び蛍光を得て作成した二次元スキャッタグラムである。 本発明の一実施形態で用いる蛍光色素を用いて調製した試料液からフローサイトメータにより前方散乱光及び蛍光を得て作成した二次元スキャッタグラムである。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の外観を説明する図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の内部構成を説明する図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の試料調製部を説明する図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の検出部を説明する図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の制御部を説明する図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の全体制御を説明するフローチャートである。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の粒子信号解析の動作を説明するフローチャートである この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置により実行される解析プログラムの各ステップを説明するフローチャートである。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置により作成された二次元スキャッタグラムの一例を示す図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置の液晶タッチパネルに、解析の結果が表示された様子を示す図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置により得られたマラリア感染率と、目視検査により得られたマラリア感染率の相関を示す図である。 この発明の一実施形態であるマラリア感染赤血球測定装置により実行される解析プログラムの変形例の各ステップを説明するフローチャートである。 この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により作成された二次元スキャッタグラムの一例を示す図である。

符号の説明

１００ マラリア感染赤血球測定装置
２００ 試料調製部
２２１ 検体セット部
２２２ 試薬セット部
２２３ インキュベータ
２２４ 分注装置
２２５ 検体容器
２２６ 反応容器
２２７ 試薬容器
２３１ 試薬容器
３００ 検出部
３０１ フローセル
３０６ レーザ光源
３０８ フォトダイオード
３１１ フォトマルチプライヤチューブ
４００ 制御部
４０１ メモリ
４０２ ＣＰＵ
４０３ 信号処理回路
４０４ 動作制御回路

Claims (24)

1. 血液検体に、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を添加して測定用試料を調製し、
   前記調製した測定用試料中から光学的情報を検出し、
   検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア感染赤血球を検出する、マラリア感染赤血球測定方法。
2. 前記アントラキノン系蛍光色素は、以下の化学式
   

   

   （但し、この式において、Ｒ₁およびＲ₂のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ₃Ｒ₄であり、ＡがＣ_2-8アルキレン基であって、Ｒ₃とＲ₄が互いに独立に、水素、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_2-4ヒドロキシアルキル、およびＣ_2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ₃とＲ₄が一緒に、Ｒ₃およびＲ₄が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ_2-6アルキレン基を形成する化合物である。）で表される、請求項１に記載のマラリア感染赤血球測定方法。
3. 前記アントラキノン系蛍光色素は、Ｒ_１及びＲ_２がいずれもNH(CH₂)₂N(CH₃)₂である、請求項２に記載のマラリア感染赤血球測定方法。
4. 前記光学的情報は、測定用試料にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定用試料中の細胞から発せられた蛍光の強度である、請求項１記載のマラリア感染赤血球測定方法。
5. 前記レーザ光は、半導体レーザ光源を用いて照射する、請求項４記載のマラリア感染赤血球測定方法。
6. 前記半導体レーザ光源は、赤色半導体レーザ光源である、請求項５記載のマラリア感染赤血球測定方法。
7. 前記検出した光学的情報に基づき、更にマラリア感染赤血球を計数する、請求項１に記載のマラリア感染赤血球測定方法。
8. 前記検出した光学的情報に基づき、更にマラリア未感染赤血球を計数する、請求項７に記載のマラリア感染赤血球測定方法。
9. マラリア感染赤血球の計数結果及びマラリア未感染赤血球の計数結果に基づき、マラリア感染率を算出する、請求項８に記載のマラリア感染赤血球測定方法。
10. 血液検体を収容する検体容器と、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む試薬を収容する試薬容器と、前記血液検体と前記試薬を混合するための混合容器を有し、前記検体容器内の血液検体及び前記試薬容器内の試薬を前記混合容器に供給して測定用試料を調製する試料調製部、
    前記試料調製部が調製した測定用試料から光学的情報を検出する検出部、
    前記検出部が検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア感染赤血球を検出する制御部、を有するマラリア感染赤血球測定装置。
11. 前記アントラキノン系蛍光色素は、以下の化学式
    

    

    （但し、この式において、Ｒ₁およびＲ₂のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ₃Ｒ₄であり、ＡがＣ_2-8アルキレン基であって、Ｒ₃とＲ₄が互いに独立に、水素、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_2-4ヒドロキシアルキル、およびＣ_2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ₃とＲ₄が一緒に、Ｒ₃およびＲ₄が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ_2-6アルキレン基を形成する化合物である。）で表される、請求項１０に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
12. 前記アントラキノン系蛍光色素は、Ｒ_１及びＲ_２がいずれもNH(CH₂)₂N(CH₃)₂である、請求項１１に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
13. 前記検出部は、測定用試料にレーザ光を照射するためのレーザ光源と、レーザ光を照射された測定用試料中の細胞から発せられた蛍光を検出する受光素子を有する、請求項１０に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
14. 前記検出部は、更にレーザ光を照射された測定用試料中の細胞から発せられた散乱光を検出する受光素子を有する、請求項１３に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
15. 前記レーザ光源は、半導体レーザ光源である、請求項１３又は１４に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
16. 前記制御部は、前記検出した光学的情報に基づき、更にマラリア感染赤血球を計数する、請求項１０に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
17. 前記制御部は、前記検出した光学的情報に基づき、更にマラリア未感染赤血球を計数する、請求項１６に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
18. 前記制御部は、マラリア感染赤血球の計数結果とマラリア未感染赤血球の計数結果に基づき、マラリア感染率を算出する、請求項１７に記載のマラリア感染赤血球測定装置。
19. ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む、マラリア感染赤血球測定用試薬。
20. 前記アントラキノン系蛍光色素は、以下の化学式
    

    

    （但し、この式において、Ｒ₁およびＲ₂のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ₃Ｒ₄であり、ＡがＣ_2-8アルキレン基であって、Ｒ₃とＲ₄が互いに独立に、水素、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_2-4ヒドロキシアルキル、およびＣ_2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ₃とＲ₄が一緒に、Ｒ₃およびＲ₄が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ_2-6アルキレン基を形成する化合物である。）で表される、請求項１９記載のマラリア感染赤血球測定用試薬。
21. 前記アントラキノン系蛍光色素は、Ｒ_１及びＲ_２がいずれもNH(CH₂)₂N(CH₃)₂である、請求項２０に記載のマラリア感染赤血球測定用試薬。
22. 血液検体に、溶血剤とＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を添加して測定用試料を調製し、
    前記調製した測定用試料から光学的情報を検出し、
    検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア原虫を検出する、マラリア原虫測定方法。
23. 血液検体を収容する検体容器と、溶血剤を含む第一試薬を収容する第一試薬容器と、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む第二試薬を収容する第二試薬容器と、前記血液検体、前記第一試薬及び前記第二試薬を混合するための混合容器を有し、前記検体容器内の血液検体、前記第一試薬容器内の第一試薬及び前記第二試薬容器内の第二試薬を前記混合容器に供給して測定用試料を調製する試料調製部、
    前記試料調製部が調製した測定用試料中から光学的情報を検出する検出部、
    前記検出部が検出した光学的情報に基づき検体中のマラリア原虫を検出する制御部、を有するマラリア原虫測定装置。
24. 溶血剤を含む第一試薬と、ＤＮＡを特異的に染色するアントラキノン系蛍光色素を含む第二試薬と、を含むマラリア原虫測定用試薬。
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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