JP2007526743A - クロマチン分析を利用して細胞の侵襲可能性を評価するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/476,580号(2003年6月6日出願);同第60/511,543号(2003年10月14日出願);同第60/526,792号(2003年12月4日出願);および出願番号不明(2004年5月26日出願)に基づく優先権を主張する。これらの全体は本明細書中に参考として援用される。
(I.発明の分野)
本発明は、侵襲性哺乳動物細胞の検出および上記細胞の侵襲性の程度間で区別するための方法についての方法に関連する。特に、本発明は、特定のクロマチン調節因子(例えば、エンドヌクレアーゼALUおよび/またはプロテアーゼ プロテイナーゼKの分解作用)に対するクロマチンの感受性を決定するための方法に関連し、ここでそのような因子に対するクロマチンの感受性は、細胞の癌性状態および/または細胞の侵襲可能性の指標である。
癌の検出について、多くの方法が考案されてきた。それらの範囲は、X線および光学技術による腫瘍塊の画像化から、生検を介して得られた組織試料中の細胞の評価を経る、癌性細胞の表面上に発現されるか、または癌性細胞によって体液(例えば、血液および尿)中に放出されるタンパク質および他の分子種の検出にわたる。一旦、癌細胞が検出され、そして限局された場合、型について上記癌を分類し、そして上記癌の特徴を決定して、適切な予後診断および処置計画に至ることが、必要である。上記癌細胞の侵襲性の推定は、この特徴付けの重要な局面である。
上記で議論した理由により、一般的に広い範囲の癌型に適用可能であり、そして臨床的に有用な結論に達するために必要な解釈が最小限である、癌細胞の検出のための客観的でありかつ明白な方法の必要性が存在する。本発明は、哺乳動物細胞の、形態学的特徴および免疫学的特徴の両方の基礎をなす全ての哺乳動物細胞の基本的な特徴に注目して、この必要性に取り組んだ。
クロマチン構造は、遺伝子の転写、複製および組み換えを含む細胞調節および細胞機能の多くの局面における重要な要素である。要求されるクロマチン高次構造および細胞周期間におけるその変化を制御する詳細な機構はまだ十分に理解されていないが、クロマチン構造の全局面は、細胞の状態と相関し得、正常細胞と癌細胞との間の形態学的区別における主要な要素として広く使用される。さらに、クロマチンを含む遺伝子の発現は、この目的のために使用される免疫学的特徴および他の形態学的特徴の発生を生じる。クロマチン構造、遺伝子発現、ならびに形態学的特徴および免疫学的特徴の間の上記関係は、積極的に研究されている領域である。
本発明の実施形態は、1つ以上の細胞の、前癌性(pre−cancerous)、癌性および/または侵襲特性を評価するために使用され得る。本方法に使用される適切な試料としては、培養細胞ならびに被験体または患者由来の腫瘍生検、他の組織、器官および細胞を含む体液から得られた細胞が挙げられるが、これに限られない。
クロマチン安定性の判定は、正常細胞および/または癌性細胞から単離されるクロマチンを使用して行われ得る。細胞の全ゲノムを含むクロマチンは、細胞から顕微手術的に除去され得、そして公知技術に従って、単一のクロマチン鎖として外部から操作され得る。クロマチンが顕微手術的に除去されるべき細胞は、固体基材上にコンフルエンスに接近するように細胞を増殖することによって、最も都合よく調製される。このプロセスは、上記基材に強力な付着物を形成する細胞を生じ、そして細胞が、顕微手術手順の間に上記細胞に加わる機械的な力によって移動するのを防ぐ。この固体基材に対する細胞の固着は、操作上の便宜のためだけであり、そして本発明の実施のために必須なものではない。クロマチンの顕微手術抽出に適する付着細胞は、実施例1:材料および方法(後述)に記載されるような方法によって調製され得る。実施例1に記載される上記特定の方法は主に、内皮細胞、メラノーマ細胞、および内皮細胞に由来する他の細胞型に適用され得る。本方法は、当業者にとって公知の様式で増殖培地の組成および関連するパラメータを調節することによって、他の細胞型に適合され得る。
本発明の方法は、完全な細胞ならびに単離されたクロマチン鎖に適用され得る。例として、対象となる完全な細胞は、吸着した血清タンパク質でコートされた固体基材(例えば、カバーガラス片)上に位置決めされ得るか、配置決めされ得るか、または増殖し得、そして界面活性剤(例えば、Triton X−100)を用いる処理によって透過処理され得、残留する界面活性剤を除去するために洗浄され得、そして適切なクロマチン改変剤によって処理され得る。本発明の実施形態は、支持基材および培地中に懸濁されている生存しかつ保存された細胞に付着する、生存しかつ保存された細胞を使用して実施され得る。特定の実施形態において、上記対象となる細胞の核は、クロマチン安定性アッセイが行われる前に、単離され得る。定量的クロマチン安定性アッセイは、特定のエンドヌクレアーゼ、特定のヌクレアーゼおよび特定のプロテアーゼによる消化に対するクロマチンの感受性に基づき、ここでこの感受性は、上記クロマチンを含むかまたは提供する上記細胞の侵襲性の程度を反映する。
細胞は、当業者にとって公知な方法(概説について、Freshney,(1987)を参照のこと)による腫瘍生検のような組織から単離され得る。そのような方法は概して、肝臓由来の細胞外マトリックスタンパク質の単離についてのそれらの記載に類似するが、但し、上記組織がタンパク質分解酵素(例えば、細胞間相互作用を分断するトリプシン)を含む培地とともにインキュベートされ得るか、またはこの培地中でホモジナイズされ得ること、および上記所望の細胞が、上記上清中ではなく上記細胞ペレット中に見られることを除く。
対象となる細胞における核酸染色は、視覚的にモニターされ得るか、かつ/または当業者にとって周知である顕微鏡画像化手段(一般的な方法としては、Current Protocols in Cell Biology (2001);またはMurphy, Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging(2001)を参照のこと)によって、その後の定量的分析のために、電子的画像として獲得され得る。視覚的画像化および電子的画像獲得についての1つの適切な顕微鏡プラットフォームは、20倍、40倍、および63倍の拡大率における、透過光、位相差、微分干渉ならびにエピ蛍光視覚的画像および電子的画像に対応したLeica DM IRB倒立顕微鏡(Leica,Wetzlar,Germany Microsystems Inc.,Bannockburn,IL)からなる。この顕微鏡プラットフォームはまた、長期間にわたる反応の時間経過のモニタリングを容易にするための、任意に所望される温度(最も一般的には約25℃または約37℃)において画像化される上記標本を維持する手段を備え得る。Leica model LSまたはLeica model LB(Leica Microsystems Inc.,Bannockburn,IL)のような同等の仕様の正立顕微鏡もまた、利用され得る。
本発明の実施形態は、癌性細胞(特に、侵襲性表現型を伴う癌性細胞)のクロマチンに対する非侵襲性細胞(正常細胞)のクロマチンを、差次的に改変しまたはこのクロマチンに作用する特定のクロマチン改変剤を利用する。
エンドヌクレアーゼは、特定の部位でのDNA鎖の開裂をその主な機能とする広い酵素の分類を含む。いくつかのエンドヌクレアーゼは、核酸配列およびDNAコンホメーションに対する非常に特異的な組み合わせによって決められた部位においてのみDNA鎖を開裂するが、他のエンドヌクレアーゼは、開裂するDNAの部位の特徴についてより厳しくない。しかし、いくつかの事例において、上記DNAは、開裂が起こるためには、上記エンドヌクレアーゼに接近可能であるべきである。クロマチンのDNA成分が外部因子にさらされるクロマチン鎖に沿った位置の数および同一性は、クロマチンが得られた細胞の状態によって判断される。エンドヌクレアーゼによるクロマチンの開裂は、それらの位置においてのみ起こり、この位置において、露出されたDNAのセグメントの、核酸配列および物理的コンホメーションは、上記エンドヌクレアーゼの特異性に対応する。従って、クロマチン鎖が、いくつかの特定のエンドヌクレアーゼによって処理された場合に得られるDNA鎖開裂のパターンは、特定のクロマチン鎖の構造の代用となる。このパターンは、ゲル電気泳動のような公知の方法によって明確に評価され得るか、または本発明の方法によって絶対的に評価され得る。
ヒストンH1のようなタンパク質は、クロマチン組織において重要な役割を果たすことが知られている。例えば、プロテイナーゼK(50μg/ml)またはヘパリン(5mg/ml)(両者ともクロマチンからタンパク質を除去することが知られている)のような物質による正常細胞由来クロマチンの処理は、拡散したDNA群への、迅速なクロマチンの脱濃縮を生じることが知られている。この脱濃縮は、周囲の培地における、イオン強度の増加または減少、あるいはMg2+濃度の増加または減少によっては反転され得ないが、ヒストンH1の添加による元のクロマチン形態の再編成によって、本質的かつ完全に反転する。この再編成はまた、イオン強度およびMg2+濃度の変化に応じて濃縮および/または再濃縮するクロマチンの能力を回復する。
本発明に基づくアッセイは、侵襲性細胞と非侵襲性細胞を区別するため;細胞の侵襲性を修飾し得るか、または他に変更し得る物質を、検出および評価するため;およびクロマチンを、クロマチンが得られた細胞の侵襲性に依存する様式に従って差次的に分解し得る物質を、検出および評価するために使用され得る。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の本実施例中に開示された技術は、本発明の実施において良好に機能することが、本発明者によって見出された技術を表し、そしてそれ故、その実施についての好ましい形態を構成すると考えられ得ることが、当業者によって十分理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの改変がされ得、そしてなお、本発明の精神および本発明の範囲から外れることなく、同様の結果または類似の結果を得ることを十分理解するべきである。
本発明の特定の実施形態において、標本として利用される単離されたクロマチン鎖を、上述した一般的な方法および以下のような特定の方法によって調製し得る。
図1Aは、上述のようにガラス基材に付着し、位相差において画像化された、OCM−1aメラノーマ細胞株、M619メラノーマ細胞株、およびMUM−2Bメラノーマ細胞株から単離されたクロマチン鎖を示す。OCM−1a、M619およびMUM−2Bは、それぞれ、非侵襲性メラノーマ細胞株、侵襲性(原発性)、および高侵襲性(転移性)メラノーマ細胞株であることが独立した手段により知られている。図1Bは、5単位のエンドヌクレアーゼAULを、上記クロマチン鎖を取り囲む液体培地に添加した後30分の位相差において表示される同一クロマチン鎖を示し、一方、図1Cは、ALUの添加およびその後のエチジウムブロマイドによるクロマチンの染色後60分における、これらの同一クロマチン鎖の蛍光画像を示す。エチジウムブロマイドは、DNAに特異的に結合し、そして結合したDNAを、濃縮および沈殿させる蛍光色素である。非侵襲性OCM−1aメラノーマ細胞株から得られたクロマチンは、ALUを用いた処理によって、本質的に完全に分解される一方で、侵襲性M619細胞株由来および高侵襲性MUM−2B細胞株由来のクロマチンは、この処理によってはほとんど影響を受けない。
非侵襲性細胞型および侵襲性細胞型から単離されるクロマチンにおけるプロテイナーゼKの効果を、図2に例示する。参照の目的で示される、図2A、図2Bおよび図2Cは、上述の様式における、正常ヒト微小血管内皮細胞由来および侵襲性HT1080線維肉腫細胞由来のクロマチン鎖のALUを用いる処理の効果を例示する。正常内皮細胞由来のクロマチンは、広範に分解される一方で、線維肉腫由来のクロマチンは、概ね完全な状態を維持する。
実施例2の方法は、癌細胞の侵襲性挙動を抑制または遮蔽する工程におけるポリアミン11158およびポリアミン11172のような抗癌剤の有効性を評価するために使用され得る。この有効性を、上記薬物を用いて癌細胞を処理する工程;前述のように細胞からクロマチンを除去する工程;DMEM中で5単位のALUまたは5単位のDNAaseで30〜60分間処理する工程;可視化を促進するために、エチジウムブロマイドまたは他のDNA結合色素を用いてサンプルを染色する工程;そして、クロマチン分解の程度を、薬物によって処理されていない癌細胞から単離されたクロマチンおよび同型の非癌性細胞から単離されたクロマチンの処理などによって得られたクロマチン分解の程度とを比較する工程によって評価し得る。侵襲性癌細胞のクロマチンは大部分は、この処理によって影響されないが、正常細胞のクロマチンおよび非侵襲性細胞のクロマチンは大部分分解される。薬物効果は、薬物で処理していない他の同一の細胞由来のクロマチンの分解に対する薬物処理された細胞由来のクロマチンの分解の増加によって証明される。同じ型の正常細胞由来のクロマチンは、本方法において対照の役目をする。
本発明の方法は、正常細胞のクロマチンに対して癌性細胞のクロマチンを差次的に分解する薬物および他の化学物質ならびに生物学的存在を検出しおよび同定するために使用され得る。例として、そのような物質としては、ALUおよびDNAase以外のヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ、カスパーゼ、触媒RNA、ならびに他の物質が挙げられるが、これらに限定されない。同じ型の、正常細胞由来のクロマチン鎖および癌性細胞由来のクロマチン鎖を、事前に選択した期間、同一条件下で、評価される物質に露出し;可視化を促進するためにエチジウムブロマイドまたは他のDNA結合色素を用いて染色し;癌性細胞由来のクロマチンまたは正常細胞由来のクロマチンが優先的に分解されるか否かを決定するために比較した。
上記実施形態の方法は、インタクトな細胞ならびに単離されたクロマチン鎖に適用され得る。例として、上述したゼラチンコートされたカバーガラス上で増殖したインタクトなメラノーマ細胞を、DMEM中の0.5%界面活性剤Triton X−100溶液で2分間処理することにより透過処理し;残りの界面活性剤を除去するためにDMEMで洗浄し;そして、DMEM中において100単位のALUで1〜3時間処理し得る。この実施形態は、支持基材ならびに培地中に懸濁した生きた細胞および保存された細胞に付着した生きた細胞または保存された細胞、を使用して実施し得る。
細胞は、上述のように調製した直径12mmのカバーガラスに付着する。細胞が付着したカバーガラスを、10mg/mlサイトカラシンBを正常増殖培地中に5cc含有する50cc円錐形遠心チューブ内に、細胞側を下にして配置し、その結果、カバーガラスの端は、チューブの円錐形の壁に対しておさまり(seat)、そしてカバーガラスの平面は、チューブの長軸に対して垂直になる。遠心分離は、結果として細胞核が細胞膜を通過して移動し、そして遠心チューブの底にペレットとして回収される核を生じる。除核された細胞は、カバーガラスへの付着したままである。
(方法)
ヒト線維芽細胞、低侵襲性ヒトメラノーマ細胞(OCM−1)、および高侵襲性ヒトメラノーマ細胞(MUM−2B)を、それらのクロマチン構造がEGTAによってか、またはそれらのグリコカリスがトリプシンによって破壊されるのを避けるために、ラバーポリスマンを用いてプラスチック細胞培養フラスコの底から擦り取った。各細胞スラリーの25μL滴を、スライドガラス上に配置し、そして細胞を含む液滴が完全に乾燥するまで、30分〜1時間インキュベートした。その後、0.5μLのMSP Iを、DMEMの25μL滴またはPBSの25μL滴に添加し、そしてその25μL滴を乾燥した細胞ブロット(blot)上に滴下し、次いでそのスライドガラスを37℃のインキュベーターの密封加湿チャンバー内に24時間配置した。消化後、MSP Iを除去し、そしてエチジウムブロマイドで置換し、エピ蛍光顕微鏡下で視覚化し、そしてそのブロットを撮影した。
MSP I中で、1時間、2時間、4時間、5時間、6時間、および24時間インキュベートしようが、MSP Iによる消化からの隔離は、侵襲性細胞挙動が増加すると共に増加するようであった。正常間質細胞(例えば、線維芽細胞)は、低侵襲性細胞または高侵襲性細胞と比較して、より多く消化された。細胞は代表的に、機械的に得られる。なぜならトリプシン−EGAT溶液における細胞のトリプシン処理は、酵素に対して、非特異的感受性および時として完全な非感受性を生じるからである。例えば、トリプシンEGTAを利用した場合、細胞クロマチン(細胞型に関係なく)は、機械的に単離された細胞と比較して、あらゆる制限酵素による消化に対してよりいっそう安定であった。ほとんどの場合、細胞は、最も感受性である正常細胞、感受性が減少した低侵襲性細胞、そしてMSP Iならびに他の制限酵素による消化に対して完全に非感受性ではないとしても、最も非感受性である高侵襲性細胞をともなう感受性の漸次的変化を示した(図4A〜図4C)。
本発明の上記実施例に記載された侵襲性細胞の検出のための方法は、クロマチン分解剤による細胞の処理の前に、細胞が基材(代表的には、吸着されたタンパク質の層)と接触することを必要とする。この工程は、臨床設定において不都合であり得る。血液学的な癌の細胞は代表的に、液体培地(例えば、血液またはリンパ液)において、細胞の懸濁液として収集される。同様に、固形腫瘍からの標本の初期収集のために一般に臨床使用される特定の方法(例えば、微細針吸引(FNA))は、液体培地において、収集された細胞の懸濁液の形成を生じる。さらに、液体培地中への細胞の分散は、顕微鏡スライド上に単層調製物を調製するプロセス、ならびに組織培養および類似の方法による、評価のための標本調製において本質的な要素である。この理由により、細胞を最初に固体基材(例えば、カバーガラス)に移動させることを求めるのではなく、懸濁液中の標本細胞を直接利用する様式で本発明を実施し得ることは好都合である。この方法に直接的に類似する様式での本発明の実施における懸濁された細胞の利用は、上で記載した。
直径12mmのカバーガラスに付着した細胞を、本明細書中に記載されるように調製した。細胞が付着したカバーガラスを、標準的な増殖培地中の10mg/mlサイトカラシンB(5cc)を含む50ccの円錐形遠心チューブ内に、カバーガラスの端が、チューブの円錐形の壁におさまり(seat)、そしてカバーガラスの平面が、チューブの長軸に対して垂直になるように細胞を下にして置いた。1400RPMで5分間の遠心分離は、細胞膜を通過して移動し、そして遠心チューブの底にペレットとして集まる細胞核を生じる。
以下の参考文献は、それらが提供する模範的手順または本明細書中に示される他の補足的な詳説の範囲で、本明細書中に参考として具体的に援用される。
Claims (67)
- 細胞の侵襲可能性を評価するための方法であって、以下の工程:
a)細胞のクロマチンを1つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程;および
b)クロマチン分解を評価することによってクロマチン安定性を評価する工程
を包含する、方法。 - 前記クロマチンを1つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞から核を単離する工程をさらに包含、請求項1に記載の方法。
- クロマチンを1つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞および核膜が透過処理される、請求項1に記載の方法。
- 核膜が透過処理される、請求項2に記載の方法。
- 前記クロマチン改変剤がタンパク質分解酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素がプロテイナーゼKである、請求項6に記載の方法。
- クロマチンが、前記クロマチン改変剤との接触後に再凝集される、請求項6に記載の方法。
- 前記クロマチン安定性を評価する工程の前に、前記クロマチンを、DNA結合色素、ポリアミン、ヒストン、トポイソメラーゼ、またはグルタルアルデヒドとが接触する工程によって、クロマチン再凝集が開始される、請求項8に記載の方法。
- 前記クロマチン改変剤がヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがDNAaseである、請求項10に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項10に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ALUまたはMSP 1である、請求項12に記載の方法。
- 前記クロマチンの評価が、平面またはほぼ平面の表面上で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマチンの評価が、液体培地中の懸濁液において行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記評価がフローサイトメトリーによって行われる、請求項15に記載の方法。
- クロマチン分解が定性的に評価される、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマチン分解が定量的に評価される、請求項1に記載の方法。
- クロマチン分解が、視覚的な顕微鏡法、画像解析、またはフローサイトメトリーによって評価される、請求項1に記載の方法。
- クロマチンの光学的コントラストが、評価の前に、クロマチンとDNA結合色素と接触させることによって上昇する、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA結合色素がクロマチン色素を含有する、請求項20に記載の方法。
- 前記DNA結合色素が蛍光色素を含有する、請求項20に記載の方法。
- 前記蛍光色素が、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、TO−PRO、YO−YO、YO−PROまたはPO−PROである、請求項22に記載の方法。
- 候補治療薬の有効性を評価するための方法であって、以下の工程:
a)細胞を該候補治療薬と接触させる工程;
b)該細胞のクロマチンをクロマチン改変剤と接触させる工程;
c)クロマチン分解を評価することによって染色体の安定性を評価する工程;および
d)該候補治療薬を用いた該細胞の処置によって生じるクロマチン分解と、該治療薬を用いて処理してない細胞とを比較することによって該候補治療薬の有効性を評価する工程
を包含する、方法。 - クロマチンを前記クロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞が高増殖性細胞である、請求項24に記載の方法。
- 前記高増殖性細胞が癌細胞である、請求項26に記載の方法。
- クロマチンをクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞から核を単離する工程をさらに包含する、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞の前記核からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞および核膜が透過処理される、請求項24に記載の方法。
- 前記クロマチン改変剤がタンパク質分解酵素である、請求項24に記載の方法。
- 前記タンパク質分解酵素がプロテイナーゼKである、請求項31に記載の方法。
- クロマチン安定性を評価する工程の前に、クロマチンが再凝集される、請求項31に記載の方法。
- クロマチン安定性の評価の前に、クロマチンを、DNA結合色素、ポリアミン、ヒストン、トポイソメラーゼ、またはグルタルアルデヒドと接触させる工程によって、クロマチン再凝集が開始される、請求項33に記載の方法。
- 前記クロマチン改変剤がヌクレアーゼである、請求項24に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがDNAaseである、請求項35に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項35に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、ALUまたはMSP 1である、請求項37に記載の方法。
- クロマチン安定性の評価が、平面またはほぼ平面の表面上で行われる、請求項24に記載の方法。
- クロマチン安定性の評価が、液体培地中の細胞懸濁液として行われる、請求項24に記載の方法。
- 前記評価がフローサイトメトリーによって行われる、請求項40に記載の方法。
- 前記クロマチン分解が定性的に評価される、請求項24に記載の方法。
- 前記クロマチン分解が定量的に評価される、請求項24に記載の方法。
- クロマチン分解が、視覚的な顕微鏡法、画像解析、フローサイトメトリーによって評価される、請求項24に記載の方法。
- クロマチンの光学的コントラストが、評価の前に、クロマチンをDNA結合色素と接触させることによって上昇する、請求項24に記載の方法。
- 前記DNA結合色素がクロマチン色素を含有する、請求項45に記載の方法。
- 前記DNA結合色素が蛍光色素を含有する、請求項45に記載の方法。
- 前記蛍光色素が、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、TO−PRO、YO−YO、YO−PROまたはPO−PROである、請求項47に記載の方法。
- ヌクレアーゼによるクロマチン分解の程度を評価することによって、正常細胞と侵襲性癌細胞との間を区別する工程を包含する、方法。
- 前記ヌクレアーゼがDNAaseである、請求項49に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項49に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ALUまたはMSP 1である、請求項51に記載の方法。
- 前記クロマチンを1つ以上のクロマチン改変剤とが接触させる工程の前に、前記細胞から核を単離する工程をさらに包含する、請求項49に記載の方法。
- 前記クロマチンを1つ以上のクロマチン改変剤と接触させる工程の前に、前記細胞の前記核からクロマチンを単離する工程をさらに包含する、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞および核膜が透過処理される、請求項49に記載の方法。
- クロマチン分解を評価する工程の前に、クロマチンが再凝集される、請求項49に記載の方法。
- 前記クロマチン安定性を評価する工程の前に、クロマチンを、DNA結合色素、ポリアミン、ヒストン、トポイソメラーゼ、またはグルタルアルデヒドと接触する工程によって、クロマチン再凝集が開始される、請求項56に記載の方法。
- 前記クロマチンの評価が、平面またはほぼ平面の表面上で行われる、請求項49に記載の方法。
- 前記クロマチンの評価が、液体培地中の懸濁液として行われる、請求項49に記載の方法。
- 前記評価がフローサイトメトリーによって行われる、請求項59に記載の方法。
- クロマチン分解が定性的に評価される、請求項49に記載の方法
- 前記クロマチン分解が定量的に評価される、請求項49に記載の方法。
- クロマチン分解が、視覚的な顕微鏡法、画像解析、またはフローサイトメトリーによって評価される、請求項49に記載の方法。
- クロマチンの光学的コントラストが、評価の前に、クロマチンをDNA結合色素と接触させることによって上昇する、請求項49に記載の方法。
- 前記DNA結合色素がクロマチン色素を含有する、請求項64に記載の方法。
- 前記DNA結合色素が蛍光色素を含有する、請求項64に記載の方法。
- 前記蛍光色素が、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、TO−PRO、YO−YO、YO−PROまたはPO−PROである、請求項66に記載の方法。
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