JP7155021B2 - 単細胞全ゲノムライブラリおよびそれを作成する組み合わせインデックス付加方法 - Google Patents
単細胞全ゲノムライブラリおよびそれを作成する組み合わせインデックス付加方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、サイズが27キロバイトで、2017年7月18日に作成した、「1592SeqListing_ST25.txt」と題した、ASCIIテキストファイルとしてEFS-Webを介して米国特許商標庁に電子的に提出した配列表を含む。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本明細書で使用する場合、用語「生物」、「対象」は、区別なく使用され、動物および植物を指す。動物の例は、哺乳動物、例えばヒトなどである。
実施形態1.複数の単細胞に由来する核酸を含むシーケンシングライブラリを調製する方法であって:
(a)複数の細胞から単離核を提供するステップと;
(b)前記単離核の完全性を維持しながら、前記単離核を化学処理にかけてヌクレオソーム除去核を生成するステップと;
(c)前記ヌクレオソーム除去核のサブセットを、第1の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、各コンパートメントの前記トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと第1インデックス配列を含み、該第1インデックス配列はその他のコンパートメントの第1インデックス配列とは異なる、ステップと;
(d)前記ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第1インデックする配列を、前記核酸断片の少なくとも1つの鎖に組み込んで、インデックス付き核酸断片を含んだインデックス付き核を生成するステップであって、前記インデックス付き核酸断片は、トランスポザーゼに付着したままである、ステップと;
(e)前記インデックス付き核を組み合わせてプールされたインデックス付き核を生成するステップと;
(f)前記プールされたインデックス付き核のサブセットを、第2の複数のコンパートメントに分配するステップと;
(g)各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片に第2インデックス配列を組み込んで、二重インデックス断片を生成するステップであって、各コンパートメントの前記第2インデックス配列は、その他のコンパートメントの第2インデックス配列とは異なる、ステップと;
(h)前記二重インデックス断片を組み合わせることにより、前記複数の単細胞に由来する全ゲノム核酸を含むシーケンシングライブラリを生成するステップとを含む、方法。
複数の増幅部位を含む表面を提供するステップであって、前記増幅部位は、遊離3´末端を有する付着した一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも2つの集団を含む、ステップと;
増幅部位を含む前記表面を、個々の二重インデックス断片からのアンプリコンのクローン集団をそれぞれが含む複数の増幅部位を生成するのに適切な条件下で、前記二重インデックス断片と接触させるステップをさらに含む、実施形態1~42の何れかの方法。
組み合わせインデックス付加を伴う、数千個の単細胞ゲノムの生成およびシーケンシング
単細胞ゲノムのシーケンシングは、特に腫瘍進化の文脈において、体細胞変異を検出するのに有益であることが分かっている。現在の技法は、ライブラリ構築が高コストであるという欠点を持ち、これにより評価可能な細胞数が制限され、その結果、組織内の不均一性を測定する機能が制限されている。ここで、単細胞組み合わせインデックス付加シーケンシング(Single cell Combinatorial Indexed Sequencing、SCI-seq)を、体細胞コピー数多型を検出するための、数千個のローパス単細胞ライブラリを同時に生成する手段として提示する。16,698個の単細胞のライブラリを、培養細胞株、霊長類の前頭皮質組織、および膵臓腫瘍内のサブクローン性変異の詳細な評価を含む、2つのヒト腺がんの組み合わせより構築した。この実施例は、または、Vitak et al. (2017, Nature Methods, 14, 302-308, doi: 10.1038/nmeth. 4154)としても入手可能である。
サンプル調製および核の単離
組織培養細胞株を、接着性の場合は(HeLa S3、ATCC CCL-2.2;NIH/3T3、ATCC CRL-1658)、トリプシン処理してからペレット化し、懸濁液中で増殖させた場合は(GM12878、Coriell;OHSU Research Cytogenetics Laboratoryで核型分析済み)、ペレット化し、続いて、氷冷PBSで1回洗浄した。次いで、それらを架橋して(xSDS法の場合)または直接、ヌクレオソームを除去してまたは除去しないで、核単離緩衝液(NIB、10mM TrisHCl pH7.4、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.1% Igepal(登録商標)、1Xプロテアーゼ阻害剤(Roche,Cat.11873580001))を使用する核調製へ進めた。組織サンプル(RhesusFcx1,RhesusFcx2,PDAC,CRC)をNIB中でダウンスホモジナイズし、次に35μmの細胞ストレーナーに通してから、ヌクレオソームを除去した。アカゲザル凍結前頭皮質サンプルであるRhesusFcx1(4歳、メス)およびRhesusFcx2(9歳、メス)を、Oregon National Primate Research Centerより、加齢非ヒト霊長類リソースの一部として入手した。
QRP(quasi-random priming)とDOP(degenerate oligonucleotide primed PCR)を使用して構築した単細胞ライブラリを、ヌクレオソームを除去せずに単離核から調製し、NIBで1mLとし、5μLの5mg/mL DAPI(Thermo Fisher,Cat.D1306)で染色し、次に、単細胞モードのSony SH800でFANSソーティングした。1つの核を、それぞれのサンプル緩衝液を含む各単一ウェルに置いた。QRPライブラリは、PicoPlex DNA-seq Kit(Rubicon Genomics,Cat.R300381)を製造業者のプロトコルに従って使用し、キットで提供されたインデックス付きPCRプライマーを使用して、調製した。DOPライブラリは、SeqPlex DNA増幅キット(Sigma,Cat.SEQXE-50RXN)を製造業者のプロトコルに従って使用し、ただし、10bpインデックス配列を含むカスタムPCRインデックス付きプライマーを使用して、調製した。過剰増幅を避けるため、増幅をモニタリングし、指数関数的増殖の半ばまで到達した反応を除去する目的で、全てのQRPライブラリとDOPライブラリを、BioRad CFXサーモサイクラーにおいて、0.5μLの100X SYBR Green(FMC BioProducts,Cat.50513)を付加して増殖させた。
リチウム補助ヌクレオソーム除去(LAND):調製した核をペレット化し、氷上で、5分間、200μLの12.5mMのリチウム3,5-ジヨードサリチル酸(本文では、ジヨードサリチル酸リチウムともいう、Sigma,Cat.D3635)を追加したNIBに再懸濁してから、800μLのNIBを加え、次いで、フローソーティングに直接かけた。
核を、5μLの5mg/mlのDAPI(Thermo Fisher,Cat.D1306)で染色し、35μmの細胞ストレーナーに通した。Nextera(登録商標)DNAサンプル調製キット(Illumina,Cat.FC-121-1031)の1x Nextera(登録商標)タグメントDNA(TD)緩衝液10μLを各ウェルにおいてNIBで希釈して、96ウェルプレートを準備した。Sony SH800フローソーターを使用して、迅速ソートモードで、2000個の単一核を96ウェルタグメンテーションプレートの各ウェルにソートした。次に、ユニークにインデックス付けした2.5μMトランスポザーゼ-アダプター複合体(トランスポソーム)1μLを、各ウェルに加えた。これらの複合体および関連する配列は、Amini et. al. (Amini, S. et al. Nat. Genet. 46,1343-9, 2014)に記載されている。反応物を55℃で15分間インキュベートした。室温まで冷却した後、全てのウェルをプールして、前記のようにDAPIで染色した。8.5μLの0.058%SDS、8.9nMのBSA溶液、および2.5μLの10μMの2つのユニークにバーコード化されたプライマー含む各ウェルを有する、第2の96ウェルプレートまたは96ウェルプレートのセットを準備した。次に、96個の反応のプールから、22個のタグメンテーション後の核を、同じ機器上で、ただし単細胞ソートモードで第2プレートの各ウェルにフローソートし、次に、55℃で5分間SDS溶液中でインキュベートして、核骨格を壊し、トランスポザーゼ酵素を解離させた。68℃で1時間インキュベートすることにより架橋を逆転させた(xSDS)。次に、Nextera(登録商標)PCR Master mix(Illumina,Cat.FC-121-1031)7.5μLならびに100x SYBR Green(FMC BioProducts,Cat.50513)0.5μLおよび水4μLを加えることにより、SDSを希釈した。次に、まず反応物を72℃で5分間、次に98℃で3分間インキュベートし、[98℃で20秒、63℃で15秒、および72℃で25秒]を15-20サイクル行うことにより、リアルタイムPCRをBioRad CFXサーモサイクラー上で実行した。反応をモニタリングし、指数関数的増幅がウェルの大部分で観察されたら、反応を止めた。次に、各ウェルの5μLをプールし、Qiaquick PCR精製カラム(Qiagen,Cat.28104)を使用して精製し、30μLのEBで溶出した。
ライブラリを、200bpおよび1kbpの範囲の間で、High Sensitivity Bioanalyzer kit(Agilent,Cat.5067-4626)において定量化した。ライブラリを、0.8pMをロードしたIllumina NextSeq(登録商標)500において、カスタムシーケンシングケミストリープロトコル(リード1:50イメージ化サイクル;インデックスリード1:8イメージ化サイクル、27ダークサイクル、10イメージ化サイクル;インデックスリード2:8イメージ化サイクル、21ダークサイクル、10イメージ化サイクル;リード2:50イメージ化サイクル)を用い、Amini et. al. (Amini, S. et al. Nat. Genet. 46,1343-9, 2014)に記載されるカスタムシーケンシングプライマーを使用して、シーケンシングした。QRPおよびDOPライブラリを、二重インデックス付加を伴うhigh-capacity 75サイクルキットを使用して、NextSeq(登録商標)500において、標準的なプライマーを使用して、シーケンシングした。QRPでは、リードの最初の15bpを「G」塩基について高度に濃縮するという追加の課題があるが、これは、NextSeq(登録商標)2色化学作用では蛍光性ではなく、そのため、機器におけるクラスタの特定はできない。そのため、この領域をスキップするカスタムシーケンシングプロトコルを使用して、ライブラリをシーケンシングした(リード1:15ダークサイクル、50イメージ化サイクル;インデックスリード1:10イメージ化サイクル;インデックスリード2:10イメージ化サイクル)。
SCI-seqの生のリードを処理するソフトウェアは、World Wide Web上のsci-seq. sourceforge. netで入手可能である。シーケンスランを、--create-fastq-for-index-readsオプションと--with-failed-readsオプションを有するbcl2fastq(Illumina Inc.、バージョン2.15.0)を使用し処理して、fastqファイルを生成した。インデックスリードを連結し(全部で36bp)、末端に付加されたユニークリード番号を用いてリード名として使用した。次に、これらのインデックスを、対応するインデックス参照セットとマッチングさせ、4つのインデックス成分(i7-トランスポザーゼ(8bp)、i7-PCR(10bp)、i5-トランスポザーゼ(8bp)、およびi5-PCR(10bp))のそれぞれについてハミング距離2を許容し、次に、四重インデックス組み合わせにマッチングしたリードを正確なインデックスに名称を変え(かつ、ユニークなリードナンバーは保持し)、これを、続いて、細胞識別子として使用した。次に、リードをアダプタートリミングし、次いで対にし、対になっていないリードをBowtie2により参照ゲノムに整列させ、混合した。ヒト調製物をGRCh37に整列させ、アカゲザル調製物をRheMac8に整列させ、ヒト/マウス混合調製物を組み合わせたヒト(GRCh37)およびマウス(mm10)参照の組み合わせに整列させた。整列させたbamファイルは、Bowtie2により報告されるように、10未満の整列スコアのリードと共に、各バーコードを基準に同一の整列座標を有するリードを取り除くカスタムスクリプトを使用する、PCR duplicate除去にかけた。
各PCRプレートについて、全部で9,216個のユニークなインデックスの組み合わせが可能であるが(12個のi7-トランスポザーゼインデックス×8個のi5-トランスポザーゼインデックス×12個のi7-PCRインデックス×8個のi5-PCRインデックス)、これについては、インデックス組み合わせの大部分が存在しないはずである―つまり、核のトランスポザーゼインデックス組み合わせが所与のPCRウェルにソートされなかった―ことから、少数だけが実質的なリードカウントを有するはずである。これらの「空の」インデックスが含むリードは、典型的には非常に少なく(ランの1-3%)、リードの大部分は真の単細胞インデックス組み合わせに分類される(ランの97-99%)。結果として生じる、インデックス組み合わせについてのlog10ユニークリードカウントのヒストグラム(図6)は、2つの正規分布:ノイズ成分と単細胞成分の混合を生成する。次に、Rパッケージ「mixtool」を使用し、混合モデルにフィットさせて(normalmixEM)、各成分の比率(λ)、平均(μ)、および標準偏差(σ)を特定した。単細胞ライブラリとして認定するためのリードカウント閾値は、log10領域の単細胞成分の平均を1標準偏差下回る値か、ノイズ成分の平均の100倍大きい値(log10領域では+2)の大きい方であるように設定し、最小値は1,000ユニークリードでなければならなかった。
i)細胞段階(HumMus.LAND1およびHumMus.LAND2)で混合するか、またはii)核段階(HumMus.LAND3,HumMus.LAND4、およびHumMus.xSDS)で混合する2つのアプローチのうち一方を、ヒト(GM12878またはHeLa S3)とマウス(3T3)細胞の混合物に対し利用した。後者を利用して、ダブレットを生じさせる可能性がある核の架橋または凝集を制御した。2つの別個のDAPI陽性集団がフローソート時に観察されるようなライブラリを本明細書に記載するように構築し、該ライブラリは、比率が歪まないように、同じゲートの集団を両方含んだ。リードは他の実験のように処理したが、ただし、リードは、GRCh37(hg19)およびmm10を含む参照配列に整列させた。マッピングクオリティ10フィルタにより、両ゲノムの保存領域に整列したリードを効率的に除去し、次に、特定された単細胞それぞれについて、各種に対するリードを記録し、これを使用して衝突頻度を推定した。初期のLAND調製物では、25個のインデックス付き核をPCRウェル毎にソートし、28.1%および10.4%という総衝突率(つまり、ヒト-マウス衝突率の2倍)を得た。第2の2つのLAND調製物では、PCRウェル毎に22個の核をソートしたが、これは、一方の調製物では4.3%の総衝突率を生成し、もう一方では、検出可能な衝突はなかった。xSDS調製物で2つのFANSソート条件もテストしたが、一方は寛大で、より広い範囲のDAPI蛍光を許容し、もう一方はより制限的とし、同じPCRプレートの別の部位で両方を調製した。許容的なゲーティングでは、23.6%の総衝突率を観察したが、より制限的なゲーティングでは実質的に減少し、8.1%だった。これらの結果に基づき、より制限的なFANSを使用して、PCRウェル毎に22個の核のソートを続けることにした。
ライブラリプールをより深い深度までシーケンシングする場合、またはシーケンシングする際のライブラリプールの性能を評価するため、ランダムなリードを、各SCI-seq調製物から、非整列リードおよび総生リードの1%毎に置換を含まない低質リードを含む全ての組み合わせインデックスにわたって、漸増的にサンプリングした。各点で、各単細胞インデックスに割り当てられた高品質(MQ≧10)な整列リードの総数と、ユニークなPCR複製物ではないリードの割合、および、対応する、そのインデックスに割り当てられたサンプリング総リードの割合を特定した。これらの点を使用して、非線形モデルとヘインズ-ウルフ変換モデルの両方をフィットさせて、プール内の各個別の単細胞ライブラリについてさらなるシーケンシングを予測し、5%という、細胞でのユニークリードパーセンテージの中央値まで予想した。モデルの正確性を測るため、細胞毎のユニークリードパーセンテージの中央値が90%である点に到達すると考えられる、ダウンサンプリングした各ライブラリの生リードの数を求めたが、これは、低カバレッジでシーケンシングしたライブラリで到達されたものよりも幾分低い。次に、30回の反復のために所定の数のリードをサブサンプリングし、各反復で各細胞について新しいモデルを構築し、次に、達成された真のシーケンシング深度までの、各細胞のユニークリードカウントを予測した。次に、全細胞の全ての反復にわたる真のリードカウントの標準偏差を計算した。
ゲノムウィンドウを、カスタムツールを使用して、各ライブラリベースで決定した。各染色体について、全染色体のサイズを標的ウィンドウサイズにより分割して、染色体毎のウィンドウ数を生成した。全単細胞(完全コピー数が決定された全ヒトサンプルおよび平均コピー数と比較して増幅または欠失が確認されたプールされた各サンプルとして、GM12878)のプール全体で要約した染色体の総リードカウントを、次に、ウィンドウカウントにより分割して、ウィンドウごとの平均リードカウントを求めた。次に、染色体を移動させ、プールからの配列リードを符号させ、ウィンドウごとの標的リードカウントが達成されたらウィンドウブレイクを作成した。染色体の境界でのウィンドウは、それが、その染色体について、ウィンドウ限界ごとに75%超の平均リードを含む場合にのみ含めた。動的ウィンドウを使用することにより、高度反復領域、動原体、および、固定サイズビン22の場合にリードドロップアウトを引き起こし得る他の複合領域などのバイアスを説明した。
リードを可変サイズのビンに置き、動的ウィンドウのGC含量ではなく、個々のリードのGC含量に基づいてGCを修正した。単細胞解析に必要な大きいビンは、より小規模のGC含量変化を平均するものと仮定する。さらに、SCI-seqは、ゲノムの大きい領域が増幅されるプレ増幅を伴わないため、GCバイアスはPCRによってのみ生じ、アンプリコン特異的である。リードの修正量を計算するため、所与のGCを有する全リードの割合を、同じGC割合で平均挿入サイズを有するシミュレートした総リードの割合と比較した。次に、この量をリードカウントの代わりに使用し、所与のウィンドウにおける前リードにわたって合計した。DACブラックリスト化領域に存在する全領域は、ヒトサンプル解析のための解析からは除外した(http: //genome. ucsc. edu/cgi-bin/hgFileUi?db=hg19&g=wgEncodeMapability)19。GC修正後、全てのリードを、ゲノムにわたって、ビン毎に平均リード数により正規化した。最後に、各ウィンドウで、各細胞の正規化リードカウントをとり、それを、プールしたサンプルベースラインにより割って、比率スコアを生成した。
データの質を測定するため、カバレッジのばらつきについての2つの異なる測定値:中央絶対偏差(MAD)、中央絶対対差(median absolute pairwise difference、MAPD)を計算した。各スコアについて、細胞内の平均ビンカウントにより正規化された近傍のビンの間の全ての対の差の絶対値の中央値を計算した(MAPDスコアについてはlog2-正規化比率)。これらのスコアは、頻度の低い2,22、コピー数状態の変化ではなく、技術的なノイズに起因する正規化ビンリードのばらつきを測定するものである。
CNVコールを、2つの異なるセグメント化戦略を利用する2つの利用可能なRパッケージ:隠れマルコフモデルアプローチ(HMMcopy,バージョン3.3.0,Ha, G. et al., Genome Res. 22, 1995-2007, 2012)およびCircular Binary Segmentation(DNAcopy,バージョン1.44.0,Olshen et al. Biostatistics5, 557-572, 2004)を用いて、ウィンドウ化し、GCを修正し、バルクサンプルを正規化したリードにおいて実行した。値は、インプットについて変換したLog2(CBSに対し2*log2)であり、コピー数コールは、Knouse et al. 2016, Knouse et al., Genome Res. gr. 198937.115, 2016, doi: 10.1101/gr. 198937.115)からの最適化パラメータに基づいて行った。サイズ≧5Mbのコピー数コールを検出するための最適な感度および特異性のため、セグメント伸長(E)の確率をHMMでは0.995に設定し、CBSでは、コピー数変化(α)を認める有意水準が0.0001であるように選択した。損失および獲得をコールするLog2カットオフは、HMMでは0.4および-0.35とし、CBSでは1.32および0.6とした。CNVコールのための追加のツールとして、データ正規化のために別の方法を使用するGinkgo22を使用した。各細胞に対するベッドファイルと、Picard Tools(ダウンサンプル確率0.1を使用)を用いて作成した量を減らしてサンプリングしたベッドファイルをアップロードした。解析には、ダウンサンプリングしたバルクベッドファイルで単細胞を分割することを選択し、サンプルについて倍数性が既知である場合は、FACSファイルを作成して、Ginkgoにその倍数性を正規化させた。3つの方法でのコールを、各ウィンドウを基準に交差させるか、または、全長が染色体腕の≧80%であるコールのみを含むようにフィルタリングし、次に、異数性解析のために交差させた。
孤発型の異数性の評価とは異なり、腫瘍構造多型は、染色体内に切断点の大部分を有し、はるかに複雑である。さらに、腫瘍の任意の所与のサブクローン内の孤発型の異数性も、存在する亜集団の正確なプロファイルほどの妥当性はない。そのため、HMMおよびCBSにより分割した比率スコアマトリックスを使用して、細胞中の分割領域の境界を一致させることにより、切断点を特定した。次に、結果として生じた、ゲノム中で共有される染色体切断点の分布を使用して、コールが作成された特異的なウィンドウの可変性を説明する極大値を特定し、次に、細胞の少なくとも5%に存在するものを保持した。次に、各切断点の全長内の全てのウィンドウを合わせ、正倍数性集団の平均値を超える、各異数体細胞の新しいlog2比を計算した。次に、主な成分の解析を実行してから、シルエット解析で求めたk値を用いてk-meansクラスタリングを行った。仮想単細胞の~10%を占め得るダブレットの影響を最小化し、また、低パフォーマンス細胞を除外するため、それぞれの重心に近いもののみを保持した。次に、各クラスタ内の全細胞の配列リードを合わせ、次に、HMM戦略を使用して高分解能CNV解析(標的ウィンドサイズ100kbp)を実行し、その後、完全なコピー数状態の特定と、スライディングウィンドウ外れ値戦略20を使用した極限的増幅および欠失の特定を行った。腫瘍内のクローン関係は、構造的な変化は、細胞に対しより影響力の強いDNAの切断を伴うという仮定に基づくセグメントのコピー数のずれとは対照的に、共有された切断点により最も正確に捕捉される。したがって、高分解能(100kbp)CNV解析を使用して特定された、セグメント総数の少なくとも90%で重複する(コピー数変化としてコールされた、正確なウィンドウのノイズを説明する)、切断点間のセグメント比率を評価することにより、細胞を比較した。
均一なゲノムカバレッジのためのヌクレオソーム除去
均一に分配された配列リードを生成するために組み合わせインデックス付加を適応させることに対するハードルは、核の完全性を損なうことなくゲノムDNAへのヌクレオソーム結合を除去することである。sciATAC-seq方法を天然のクロマチン上で実行することにより、DNAを、オープンクロマチン(ゲノムの1-4%)の領域内でのみ、ライブラリ分子に変換することが可能になる18。この制限は、エピジェネティックな特徴付けのために望ましいが;CNV検出では、それは、生物学的なバイアスと、著しく制限されたリードカウント(細胞毎に~3000個)を生じさせる17。したがって、我々は、SCI-seqライブラリ構築のために核の完全性を維持しながら、ヌクレオソームをゲノムDNAから解放する、2つの戦略を開発した。第1のリチウム補助ヌクレオソーム除去(LAND)は、カオトロピック剤であるジヨードサリチル酸リチウムを利用して、細胞におけるDNA-タンパク質の相互作用を阻害し、その結果、DNAをヒストンから放出させる。第2のSDSを用いた架橋(xSDS)は、界面活性剤SDSを使用して、ヒストンタンパク質を変性し、ヒストンタンパク質がDNAに結合できないようにする。しかしながら、SDSは、核の完全性に対し破壊的な作用を有し、そのため、インタクトな核を維持するために、変性前に架橋ステップを必要とする。
当社の単細胞組み合わせインデックス付加ワークフローを用いた、ヌクレオソーム除去の性能を評価するため、まず、深く測定した、正倍数性リンパ芽球様細胞株GM12878に焦点を当てた14,15,19。PCRインデックス付加段階での単一96ウェルプレートをそれぞれ使用した、種々のLAND条件の全部で6個のSCI-seqライブラリと、3×96ウェルPCRプレートを用いる単一xSDSライブラリを生成した。既存の方法との比較として機能させるため、準ランダムプライミング(QRP、40個がQCを通過)を使用した42個の単細胞ライブラリと、変性オリゴヌクレオチドprimed PCR(DOP、45個がQCを通過)を使用した51を調製した。最後に、50個の細胞の核型を決定して、異数性測定の非シーケンシング手段として機能させた(表2)。
任意の単細胞ゲノムシーケンシング研究では、真の異数体細胞を除去することなく、如何に不良ライブラリをフィルタにかけ除去するかを決定することは、著しい難題である。他の方法と直接比較するため、最初に、どのフィルタリングもなしに、当社のSCI-seq調製物において、CNVコールを進めた。全ての調製物について、CNVコールのために、可変サイズのゲノムウィンドウ(標的中央値は250万bp)を用いて、最低で50,000個のユニークで高品質な整列リードを有する細胞を使用し(全LANDライブラリで868個、xSDSライブラリでは1,056個)、Ginkgo22、Circular Binary Segmentation(CBS)24、およびHidden Markov Model(HMM)25を適用し(図12)、3つの方法全ての交差を保存的に維持した。核型を決定した細胞を用いる当社のシーケンシングに基づくコールと比較するために、染色体腕レベルの事象に焦点を当てた(図7e、f)。カバレッジ均一性の差と一致して、当社のLAND SCI-seq調製物は、高い異数性比率(61.9%)を生成し、これは、カバレッジ均一性の欠如による偽陽性の存在を示唆する(図7e、g)。しかしながら、SCI-seqを用いたxSDSヌクレオソーム除去戦略は、22.6%の異数性頻度をもたらし、これは、核型決定結果(図7e、h)ならびにDOPおよびQRP(それぞれ、15.0%および13.5%)にはるかに近かった(図13)。
哺乳類の脳における異数性および大規模なCNV頻度の推定値は、<5%~33%と広く変動する1-4。この不確実性は、主に、定量測定に十分な数の単細胞を測定ことが不可能であることから生じる。ヒトサンプルが入手困難で、生涯の環境曝露における高い可変性により混同されることから、アカゲザルが、脳の異数性の存在を定量化するのに理想的なモデルである。さらに、アカゲザルの脳は、げっ歯類よりも、系統的、構造的、および生理学的によりヒトに似ている26。
単細胞ゲノムのシーケンシングの主な適用の一つは、腫瘍の不均一性の測定およびがんにおけるクローン進化を理解することである。これは、それが、治療耐性に関連するためである5-8。約250mm3の新たに取得したステージIIIの膵管腺がん(PDAC)サンプルにおいて、単一xSDS SCI-seq調製を行い、これにより、1,715個の単細胞のライブラリを生成し、細胞毎のユニークリードカウント中央値が49,272とシーケンシングされた(M50は71,378;ライブラリがシーケンシングされた深度で846細胞≧50,000ユニークリード;図24a)。まず、比較のための正倍数体基線として当社のGM12878ライブラリを使用し、CNVコールを実施して、信頼度の高い正倍数体細胞のセット(298、35.2%)を特定し、これを次に、個体および調製物に対し特異的な新たな基線として使用した(図23、25、26)。サブ染色体コピー数の変化(ゲノムの不安定性により引き起こされる)は、全染色体異数性(細胞分裂時のエラーに起因する)よりもサブクローン集団を特定するのにより有益であると仮定して、新しいウィンドウ境界として使用する低分解能での仮想コピー数切断点を特定する戦略を開発し(方法、図27)、その後、主成分解析(PCA)およびk-meansクラスタリングにより層別化した。最初にこの方法を当社のHeLaライブラリ(全部で2,361単細胞)に適用し、明確な不均一性がないことを明らかにし、さらに、HeLa細胞株の安定性を支持し20(図28-31)、次に、当社の主要なPDACサンプルにおいて、シルエット分析により、最適なクラスタカウント4を明らかにした(図24b、c)。
当社は、組み合わせインデックス付加ワークフローにおいて核の除去を利用して数千個の単細胞ゲノムシーケンシングライブラリを生成する方法である、SCI-seqを開発した。SCI-seqを使用して、単細胞ゲノムリサーチの2つの主要な領域である:体細胞異数性とがんを代表する、一次組織単離物を含む無数のサンプルから、16,698個の単細胞ライブラリ(このうち5,395個は、CNVコールに十分な深度までシーケンシングした)を生成した。スループットの利点に加え、プラットフォームは、特別なマイクロフルイディクス機器も液滴乳化技法も必要としない。当社のより均一なヌクレオソーム除去戦略であるxSDSを使用して、250kbpの桁での分解能を達成することができたが、別の架橋剤などのさらなる最適化により、分解能の改善に十分な深度が提供され得ると思われる。また、当社は、増殖、転位に影響を与え得る、または他の分子サブタイプを駆動する可能性がある34、サブクローン特異性CNVを明らかにしたこの戦略の膵管腺がんへの適用により、凝集し得るクローン集団を特定して高分解能のCNVコールを容易にすることが可能であることを実証する。
NCBI BioProject ID:PRJNA326698
HeLa dbGaPアクセッション:phs000640
GM12878およびアカゲザルの配列データは、NCBI Sequence Read Archive(SRA)を介して、無制限アクセス用のBioProject ID:PRJNA326698の下で、アクセス可能である。HeLa配列データは、Genotypes and Phenotypes(dbGaP)のデータベースを介して、アクセッション番号phs000640の下、調査の一部として、アクセス可能である。ヒト腫瘍サンプルはdbGaPへ提出され、studyアクセッションの割り当てを待っている。このプロジェクトに対し特異的に開発されたソフトウェアは、World Wide Web上のsci-seq. sourceforge. net.で利用可能である。
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実施例2で使用した試薬
・リン酸緩衝生理食塩水(PBS,Thermo Fisher,Cat.10010023)
・0.25%トリプシン(Thermo Fisher,Cat.15050057)
・トリス(Fisher,Cat.T1503)
・HCl(Fisher,Cat.A144)
・NaCl(Fisher,Cat.M-11624)
・MgCl2(Sigma,Cat.M8226)
・Igepal(登録商標)CA-630(Sigma,I8896)
・プロテアーゼ阻害剤(Roche,Cat.11873580001)
・3,5-ジヨードサリチル酸リチウム(Sigma,Cat.D3635)-LANDのみ
・ホルムアルデヒド(Sigma,Cat.F8775)-xSDSのみ
・グリシン(Sigma,Cat.G8898)-xSDSのみ
・HEPES(Fisher,Cat.BP310)-xSDSのみ
・NEBuffer2.1(NEB,Cat.B7202)-xSDSのみ
・SDS(Sigma,Cat.L3771)-xSDSのみ
・Triton(商標)-X100(Sigma,Cat.9002-93-1)-xSDSのみ
・DAPI(Thermo Fisher,Cat.D1306)
・Nextera(登録商標)キットのTD緩衝液およびNPM(Illumina,Cat.FC-121-1031)
・96インデックス付きトランスポソーム(公開済みの方法を使用して組み立てまたはIlluminaより入手、表4に示すオリゴ)
・インデックス付きi5およびi7 PCRプライマー(表5)
・SYBR Green(FMC BioProducts,Cat.50513)
・Qiaquick(登録商標)PCR精製キット(Qiagen,Cat.28104)
・dsDNA高感度qubit(登録商標)(Thermo Fisher,Cat.Q32851)
・高感度バイオアナライザキット(Agilent,Cat.5067-4626)
・NextSeqシーケンシングキット(HighまたはMid 150サイクル)
・シーケンシングプライマー(表6)
・ダウンス型ホモジナイザー
・35μMの細胞ストレーナー(BD Biosciences,Cat.352235)
・Sony SH800セルソータ―(Sony Biotechnology,Cat.SH800)またはDAPIをベースにした単一核ソートが可能なFACS機器
・CFX Connect RTサーマルサイクラー(Bio-Rad,Cat.1855200)または他のリアルタイムサーモサイクラー
・Qubit(登録商標)2.0フルオロメーター(Thermo Fisher,Cat.Q32866)
・2100バイオアナライザ(Agilent,Cat.G2939A)
・NextSeq(登録商標)500(Illumina,Cat.SY-415-1001)
A.核調製および核除去のLAND法
細胞が細胞培養懸濁液中にある場合、培養物をそっと砕いて細胞凝集塊を破壊し、4℃で5分間、500xgで回転することにより細胞をペレット化し、500μLの氷冷PBSで洗浄した。
細胞が細胞培養懸濁液中にある場合、培地をそっと砕いて細胞凝集塊を破壊した。培地中の細胞10mLに、37%ホルムアルデヒド406μLを加え、室温で10分間、軽く振とうしながらインキュベートした。800マイクロリットルの2.5Mグリシンを細胞に加え、氷上で5分間インキュベートし、次に、4℃で8分間、550xgで遠心分離した。10mLの氷冷PBSで洗浄した後、細胞を5mLの氷冷NIB(10mM TrisHCl pH7.4,10mM NaCl,3mM MgCl2,0.1%Igepal(登録商標),1x プロテアーゼ阻害剤)に再懸濁し、氷上で20分間、静かに混ぜながらインキュベートした。
タグメンテーションプレートを、10μLの1X TD緩衝液を用いて準備し(1プレートに対し:500μLのNIB緩衝液+500μLのTD緩衝液)、2000個の単一核をタグメンテーションプレートの核ウェルにソートした。このステップでは、ウェル毎の核の数は、ウェル毎の核の数が全プレートで変わらない限り、多少変化してよい。また、トランスポザーゼインデックスが保存されることから、異なるサンプルをプレートの異なるウェルに多重化することも可能である。細胞を図33に従いゲート化した。プレートを回転した後、2.5nMのユニークにインデックス付加したトランスポソーム1μLを、各ウェルに加えた。封止した後、プレートを、55℃で15分間、軽く振とうしながらインキュベートした。次に、プレートを室温に戻し、次に氷上に置いた。全てのウェルをプールし、5μLのDAPI(5mg/mL)を加え、次に、細胞を35μMの細胞ストレーナーに通した。
各ウェルに対し、20mg/mLのBSA0.25μL、1%SDS0.5μL、およびH2O7.75μLを用いてマスターミックスを調製した。マスターミックス(8.5μL)と、それぞれ(i5およびi7)10μMのプライマー2.5μLを、96ウェルプレートの各ウェルに加えた。単一核(15-22個)を、最もストリンジェントなソート設定を使用して、各ウェルにソートした。次に、プレートを沈降させた。LAND法を使用して調製した核を、55℃で5分間インキュベートして、トランスポザーゼを変性させた。xSDS法を使用して調製した核を68℃で45分間インキュベートして、トランスポザーゼを変性させ、架橋を逆転させた。
PCRプレートの5μLの各ウェルを使用して、ライブラリをプールし、次に、Qiaquick(登録商標)PCR精製カラムを使用して精製し、10mMのTris-Cl,pH8.5(EB)30μLに溶出した。2マイクロリットルを使用して、dsDNA High Sensitivity Qubit(登録商標)2.0フルオロメーターを製造業者のプロトコルに従って用いて、DNAの濃度を定量化した。Qubit(登録商標)の読み取りを使用して、ライブラリを~4ng/uLまで希釈し、1μLを、製造業者のプロトコルに従って、High Sensitivity Bioanalyser 2100の上を走らせた。次に、ライブラリを、200bp-1kbpの範囲で定量化して、プールを、Illuminaシーケンシングのために1nMに希釈した。
NextSeq(登録商標)500を、以下の変更を除いて、1nMのサンプル用の製造業者の指示通りにラン用にセットした ライブラリプールを濃度0.8pM、総体積1.5mLで充填し、カートリッジポジション10に置き;100μMのストックシーケンシングプライマー1の9μLを、全部で1.5mLのHT1緩衝液に希釈し、カートリッジポジション7に入れることにより、カスタムプライマーをセットし;100μMのストックシーケンシングプライマー2の9μLを、全部で1.5mLのHT1緩衝液に希釈し、カートリッジポジション8に入れることにより、シーケンシングプライマーをセットし;100μMのストック濃度の各カスタムインデックスシーケンシングプライマーの18μLを、全部で3mLのHT1緩衝液に希釈し、カートリッジポジション9に入れることにより、カスタムインデックスシーケンシングプライマーをセットした(表7参照)。NextSeq(登録商標)500を、スタンドアロンモードで操作し;SCIseqカスタム化学処方(Amini et al., 2014, Nat. Genet. 46, 1343-1349)を選択し;二重インデックスを選択し;適切な数のリードサイクルを入力し(50推奨)、各インデックスにつき18サイクル;全リードとインデックスに対しカスタムチェックボックスを選択した。
単細胞組み合わせインデックス付加およびゲノムと染色体の立体配座
単離核の制限エンドヌクレアーゼ消化とその後のライゲーションを使用して、クロマチンフォールディング解析およびゲノム再編成検出など、核内の染色体構造についての情報を入手した。斯かるタイプの解析は、chromosome conformation capture(3C)および関連方法(4C、5C、およびHi-C)として、当技術分野で既知である。
Claims (47)
- 複数の単細胞に由来する核酸を含むシーケンシングライブラリを調製する方法であって:
(a)複数の細胞から単離核を提供するステップと;
(b)前記単離核の完全性を維持しながら、前記単離核を化学処理にかけてヌクレオソーム除去核を生成するステップであって、前記化学処理には、カオトロピック剤を用いた処理が含まれる、ステップと;
(c)前記ヌクレオソーム除去核のサブセットを、第1の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、各コンパートメントの前記トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと第1インデックス配列を含み、該第1インデックス配列はその他のコンパートメントの第1インデックス配列とは異なる、ステップと;
(d)前記ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第1インデックス配列を、前記核酸断片の少なくとも1つの鎖に組み込んで、インデックス付き核酸断片を含んだインデックス付き核を生成するステップであって、前記インデックス付き核酸断片は、トランスポザーゼに付着したままである、ステップと;
(e)前記インデックス付き核を組み合わせてプールされたインデックス付き核を生成するステップと;
(f)前記プールされたインデックス付き核のサブセットを、第2の複数のコンパートメントに分配するステップと;
(g)各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片に第2インデックス配列を組み込んで、二重インデックス断片を生成するステップであって、各コンパートメントの前記第2インデックス配列は、その他のコンパートメントの第2インデックス配列とは異なる、ステップと;
(h)前記二重インデックス断片を組み合わせることにより、前記複数の単細胞に由来する全ゲノム核酸を含むシーケンシングライブラリを生成するステップとを含む、方法。 - 複数の単細胞に由来する核酸を含むシーケンシングライブラリを調製する方法であって:
(a)複数の細胞から単離核を提供するステップと;
(b)前記単離核の完全性を維持しながら、前記単離核を化学処理にかけてヌクレオソーム除去核を生成するステップであって、前記化学処理には、界面活性剤を用いた処理が含まれる、ステップと;
(c)前記ヌクレオソーム除去核のサブセットを、第1の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、各コンパートメントの前記トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと第1インデックス配列を含み、該第1インデックス配列はその他のコンパートメントの第1インデックス配列とは異なる、ステップと;
(d)前記ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第1インデックス配列を、前記核酸断片の少なくとも1つの鎖に組み込んで、インデックス付き核酸断片を含んだインデックス付き核を生成するステップであって、前記インデックス付き核酸断片は、トランスポザーゼに付着したままである、ステップと;
(e)前記インデックス付き核を組み合わせてプールされたインデックス付き核を生成するステップと;
(f)前記プールされたインデックス付き核のサブセットを、第2の複数のコンパートメントに分配するステップと;
(g)各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片に第2インデックス配列を組み込んで、二重インデックス断片を生成するステップであって、各コンパートメントの前記第2インデックス配列は、その他のコンパートメントの第2インデックス配列とは異なる、ステップと;
(h)前記二重インデックス断片を組み合わせることにより、前記複数の単細胞に由来する全ゲノム核酸を含むシーケンシングライブラリを生成するステップとを含む、方法。 - 前記カオトロピック剤は、リチウム3,5-ジヨードサリチル酸を含む、請求項1の方法。
- 前記界面活性剤にはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が含まれる、請求項2の方法。
- 前記核は、ステップ(b)の前に架橋剤で処理される、請求項2の方法。
- 前記架橋剤はホルムアルデヒドである、請求項5の方法。
- 前記ホルムアルデヒドの濃度は、約0.2%~約2%の範囲である、請求項6の方法。
- 前記ホルムアルデヒドの濃度は約1.5%以下である、請求項6の方法。
- 前記ホルムアルデヒドによる架橋は、ステップ(f)の後とステップ(g)の前に逆転される、請求項6の方法。
- 前記架橋の逆転には、約55℃~約72℃でのインキュベートを含む、請求項9の方法。
- 前記トランスポザーゼは、前記架橋の逆転の前に前記インデックス付き核酸断片から解離される、請求項9または10の何れか一項の方法。
- 前記トランスポザーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を使用して前記インデックス付き核酸断片から解離される、請求項11の方法。
- 前記核はステップ(d)の前に制限酵素で処理される、請求項1または2の方法。
- 前記核は、前記制限酵素での処理の後、リガーゼで処理される、請求項13の方法。
- ステップ(c)および(f)における分配は、蛍光活性化核ソーティングにより実行される、請求項1または2の方法。
- 前記ヌクレオソーム除去核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含む、請求項1または2の方法。
- 前記ヌクレオソーム除去核のサブセットは、1~約2000個の核を含む、請求項16の方法。
- 前記第1の複数のコンパートメントはマルチウェルプレートである、請求項1または2の方法。
- 前記マルチウェルプレートは96ウェルプレートまたは384ウェルプレートである、請求項18の方法。
- 前記プールされたインデックス付き核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含む、請求項1または2の方法。
- 前記プールされたインデックス付き核のサブセットは、1~約25個の核を含む、請求項20の方法。
- 前記プールされたインデックス付き核のサブセットに含まれる核は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも10分の1である、請求項1または2の方法。
- 前記プールされたインデックス付き核のサブセットに含まれる核は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも100分の1である、請求項1または2の方法。
- 前記第2の複数のコンパートメントはマルチウェルプレートである、請求項1または2の方法。
- 前記マルチウェルプレートは96ウェルプレートまたは384ウェルプレートである、請求項24の方法。
- ステップ(c)は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットが分配された後、前記トランスポソーム複合体を前記コンパートメントに加えるステップを含む、請求項1または2の方法。
- 前記トランスポソーム複合体はそれぞれトランスポゾンを含み、前記トランスポゾンはそれぞれ転移鎖を含む、請求項1または2の方法。
- 前記転移鎖は、前記第1インデックス配列と、第1ユニバーサル配列を含む、請求項27の方法。
- ステップ(g)における第2インデックス配列の組み込みは、各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片を、第1ユニバーサルプライマーおよび第2ユニバーサルプライマーに接触させるステップであって、前記第1ユニバーサルプライマーおよび第2ユニバーサルプライマーはそれぞれインデックス配列を含み、それぞれ前記第1ユニバーサル配列の一部と同一または相補的な配列を含む、ステップと、指数関数的増幅反応を実施するステップとを含む、請求項28の方法。
- 前記第1ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、前記第2ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体である、請求項29の方法。
- 前記第1ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、前記第2ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体とは異なる、請求項29の方法。
- 前記第1ユニバーサルプライマーは、さらに、第1捕捉配列と、前記二重インデックス断片の3´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第1アンカー配列とを含む、請求項29の方法。
- 前記第1捕捉配列は、P5プライマー配列を含む、請求項32の方法。
- 前記第2ユニバーサルプライマーは、さらに、第2捕捉配列と、前記二重インデックス断片の5´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第2アンカー配列とを含む、請求項29の方法。
- 前記第2捕捉配列は、P7プライマー配列の逆相補体を含む、請求項34の方法。
- 前記指数関数的増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が含まれる、請求項29の方法。
- 前記PCRは15~30サイクルを含む、請求項36の方法。
- 前記二重インデックス断片に対し特異性を有する複数の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した、二重インデックス断片の濃縮をさらに含む、請求項1または2の方法。
- 前記捕捉オリゴヌクレオチドは、固体基板の表面に固定化される、請求項38の方法。
- 前記捕捉オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル結合対の第1メンバーを含み、前記結合対の第2メンバーは固体基板の表面に固定化される、請求項38~39の何れか一項の方法。
- 前記二重インデックス断片をシーケンシングして、前記複数の単細胞に由来する核酸のヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む、請求項1または2の方法。
- 複数の増幅部位を含む表面を提供するステップであって、前記増幅部位は、遊離3´末端を有する付着した一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも2つの集団を含む、ステップと;
増幅部位を含む前記表面を、個々の二重インデックス断片からのアンプリコンのクローン集団をそれぞれが含む複数の増幅部位を生成するのに適切な条件下で、前記二重インデックス断片と接触させるステップをさらに含む、請求項41の方法。 - 前記二重インデックス断片の数は、増幅部位の数を上回り、前記二重インデックス断片は前記増幅部位に流体アクセスし、前記増幅部位にはそれぞれ、前記シーケンシングライブラリ中のいくつかの二重インデックス断片のための容量がある、請求項42の方法。
- 前記接触ステップは、(i)前記二重インデックス断片を平均輸送速度で前記増幅部位に輸送するステップと、(ii)前記増幅部位にある二重インデックス断片を平均増幅速度で増幅させるステップとを同時に含み、前記平均増幅速度は前記平均輸送速度を上回る、請求項42~43の何れか一項の方法。
- 請求項1~44の何れか一項の方法により調整されるシーケンシングライブラリを含み、前記シーケンシングライブラリは、インデックス付き核酸断片を含む、組成物。
- 前記組成物は、オーバーハングを含む切断制限部位において終端するインデックス付き核酸断片を含む、請求項45の組成物。
- ウェルが請求項45または46の組成物を含む、マルチウェルプレート。
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