JP2003210198A - 数値染色体異常を有する細胞の検出方法 - Google Patents
数値染色体異常を有する細胞の検出方法Info
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- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、数値染色体異常を有する有糸分裂
細胞および細胞中で数値染色体異常を誘発する薬品を検
出する方法を提供する。 【解決手段】 好ましい実施形態においてこの方法は、
有糸分裂中の細胞を検出する有糸分裂マーカーと、有糸
分裂細胞中のDNAの量を表示する定量用DNA着色剤を含
む。着色された細胞は、好ましくはフローサイトメトリ
ーによって分析される。
細胞および細胞中で数値染色体異常を誘発する薬品を検
出する方法を提供する。 【解決手段】 好ましい実施形態においてこの方法は、
有糸分裂中の細胞を検出する有糸分裂マーカーと、有糸
分裂細胞中のDNAの量を表示する定量用DNA着色剤を含
む。着色された細胞は、好ましくはフローサイトメトリ
ーによって分析される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有糸分裂マーカー
および定量用DNA着色剤を用いた細胞中の数値染色体異
常の検出に関する。異数性および倍数性などの数値染色
体異常は、細胞毒性および新生物形成の潜在性の判断基
準であることができる。
および定量用DNA着色剤を用いた細胞中の数値染色体異
常の検出に関する。異数性および倍数性などの数値染色
体異常は、細胞毒性および新生物形成の潜在性の判断基
準であることができる。
【０００２】
【従来の技術】異数性および倍数性などの数値染色体異
常は、先天性欠損、妊娠による消耗、および癌を含む数
多くの疾病と関連している。疾病の例には、ダウン症候
群、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、三倍
X症候群、四倍X症候群、五倍X症候群、XYY症候群、単一
染色体性、または７、１０、１１、１３、１８、２１、
X、およびYを含む任意の染色体の多染色体性がある。加
えて、倍数性および異数性などの数値染色体異常は、ヒ
トの自然流産にしばしば見出される。
常は、先天性欠損、妊娠による消耗、および癌を含む数
多くの疾病と関連している。疾病の例には、ダウン症候
群、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、三倍
X症候群、四倍X症候群、五倍X症候群、XYY症候群、単一
染色体性、または７、１０、１１、１３、１８、２１、
X、およびYを含む任意の染色体の多染色体性がある。加
えて、倍数性および異数性などの数値染色体異常は、ヒ
トの自然流産にしばしば見出される。
【０００３】数値染色体異常と関連する新生物の例に
は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性非リンパ
性白血病（ＡＮＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、
および慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）などの白血病、な
らびに膀胱癌、結腸癌、大腸癌、悪性黒色腫、および子
宮癌などの充実性腫瘍がある。加えて、げっ歯類動物の
発癌の多段階過程における異数性の役割は、幾つかの腫
瘍発生モデルに示されている。
は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性非リンパ
性白血病（ＡＮＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、
および慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）などの白血病、な
らびに膀胱癌、結腸癌、大腸癌、悪性黒色腫、および子
宮癌などの充実性腫瘍がある。加えて、げっ歯類動物の
発癌の多段階過程における異数性の役割は、幾つかの腫
瘍発生モデルに示されている。
【０００４】加えて、ベノミル、ジアゼパム、およびグ
ルセオフルビンなどの数多くの化合物が、数値染色体異
常を引き起こすことが報告されている。
ルセオフルビンなどの数多くの化合物が、数値染色体異
常を引き起こすことが報告されている。
【０００５】数値染色体異常を検出するための大部分の
既存の方法は、染色体を数える方法に依拠しており、こ
の方法は中期の細胞をギムザなどのDNA特異的な着色剤
で着色し、個々の染色体を数える。この方法は、数千個
の細胞を手作業で数えることが必要であるため非常に骨
の折れる仕事である。別法では、小核小体の誘発を用い
て化学的クラストゲンを検出する。しかしながらこの方
法は、クラストゲンとアノイゲン（aneugen）を見分け
るのが難しく、染色体の非分離に敏感でない。さらに別
の手法には、アニールして染色体上の相補的配列にする
ことができる、したがって特異的マーカーの役割を果た
すことができる染色体特異的なDNAプローブを用いた蛍
光in situハイブリッド形成法（FISH）がある。これら
のDNAプローブには、特定の染色体の長さ全体にわたっ
て一様な、またはほぼ一様な一連の蛍光シグナルをもた
らす領域特異的または全染色体プローブがある。
既存の方法は、染色体を数える方法に依拠しており、こ
の方法は中期の細胞をギムザなどのDNA特異的な着色剤
で着色し、個々の染色体を数える。この方法は、数千個
の細胞を手作業で数えることが必要であるため非常に骨
の折れる仕事である。別法では、小核小体の誘発を用い
て化学的クラストゲンを検出する。しかしながらこの方
法は、クラストゲンとアノイゲン（aneugen）を見分け
るのが難しく、染色体の非分離に敏感でない。さらに別
の手法には、アニールして染色体上の相補的配列にする
ことができる、したがって特異的マーカーの役割を果た
すことができる染色体特異的なDNAプローブを用いた蛍
光in situハイブリッド形成法（FISH）がある。これら
のDNAプローブには、特定の染色体の長さ全体にわたっ
て一様な、またはほぼ一様な一連の蛍光シグナルをもた
らす領域特異的または全染色体プローブがある。
【０００６】しかしながら、これらの手法はすべて、骨
の折れる仕事で時間がかかる可能性がある。したがっ
て、数値染色体異常を識別するための迅速で、費用がか
さまず、信頼性の高い方法が必要である。このような方
法は、生物学的試料中の数値染色体異常を検出するため
に、また数値染色体異常を誘発する化合物を特定するた
めに用いることができる。
の折れる仕事で時間がかかる可能性がある。したがっ
て、数値染色体異常を識別するための迅速で、費用がか
さまず、信頼性の高い方法が必要である。このような方
法は、生物学的試料中の数値染色体異常を検出するため
に、また数値染色体異常を誘発する化合物を特定するた
めに用いることができる。
【０００７】本出願を通じて引用される文献資料、発行
済み特許、および公開特許出願を、その全体として本明
細書中に援用する。
済み特許、および公開特許出願を、その全体として本明
細書中に援用する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、細胞中の１ま
たは複数の数値染色体異常を検出するための方法を提供
する。数値染色体異常は、倍数性または異数性などの異
常な倍数性であってもよい。好ましい実施形態において
その方法は、有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着色剤
を用いて細胞を標識し、それによって有糸分裂時の細胞
中のDNA量を定量し、有糸分裂細胞中の１または複数の
数値染色体異常の存在を検出することを含む。有糸分裂
マーカーは、有糸分裂細胞の特性、例えば有糸分裂時の
クロマチン凝縮と相関関係のあるヒストンのリン酸化、
例えばセリン１０上のヒストンH3のリン酸化を検出する
薬品であってもよい。この薬品は、6G3単クローン抗体
などの抗体であってもよい。任意の定量用DNA着色剤
を、例えば挿入色素、副溝バインダ、またはシアニン色
素からなる群から選択することができる。好ましい定量
用DNA着色剤は、ヨウ化プロピジウムである。好ましく
はこの方法には、有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着
色剤で着色した細胞を、着色細胞の分析のためにフロー
サイトメトリーにかけることが含まれる。
たは複数の数値染色体異常を検出するための方法を提供
する。数値染色体異常は、倍数性または異数性などの異
常な倍数性であってもよい。好ましい実施形態において
その方法は、有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着色剤
を用いて細胞を標識し、それによって有糸分裂時の細胞
中のDNA量を定量し、有糸分裂細胞中の１または複数の
数値染色体異常の存在を検出することを含む。有糸分裂
マーカーは、有糸分裂細胞の特性、例えば有糸分裂時の
クロマチン凝縮と相関関係のあるヒストンのリン酸化、
例えばセリン１０上のヒストンH3のリン酸化を検出する
薬品であってもよい。この薬品は、6G3単クローン抗体
などの抗体であってもよい。任意の定量用DNA着色剤
を、例えば挿入色素、副溝バインダ、またはシアニン色
素からなる群から選択することができる。好ましい定量
用DNA着色剤は、ヨウ化プロピジウムである。好ましく
はこの方法には、有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着
色剤で着色した細胞を、着色細胞の分析のためにフロー
サイトメトリーにかけることが含まれる。
【０００９】本発明はまた、有糸分裂マーカーおよび定
量用DNA着色マーカーで細胞の集団を着色し、それによ
って有糸分裂時に細胞中のDNAの量を定量化し、１また
は複数の細胞中の１または複数の数値染色体異常の存在
を決定することを含む、細胞の集団中の１または複数の
細胞中の１または複数の数値染色体異常を検出するため
の方法を提供する。
量用DNA着色マーカーで細胞の集団を着色し、それによ
って有糸分裂時に細胞中のDNAの量を定量化し、１また
は複数の細胞中の１または複数の数値染色体異常の存在
を決定することを含む、細胞の集団中の１または複数の
細胞中の１または複数の数値染色体異常を検出するため
の方法を提供する。
【００１０】本発明はまた、有糸分裂マーカーおよび定
量用DNA着色剤で細胞の集団を着色すること、その細胞
をフローサイトメトリーにかけ、それによって細胞のDN
A内容を視覚化し、それによって１または複数の染色体
異常を有する細胞を識別すること、および細胞の集団か
ら１または複数の染色体異常を有する１または複数の細
胞を分離することを含む、細胞の集団中の１または複数
の数値染色体異常を有する１または複数の細胞を単離す
る方法を提供する。分析および分離の好ましい方法に
は、フローサイトメトリーがある。この方法は、少なく
とも２つの異なる細胞の分集団を互いに、また細胞の集
団から分離することを含むことができる。本発明の方法
は、有糸分裂を受ける任意の型の細胞、またはマイトジ
ェンにより刺激されて有糸分裂を受けることができる細
胞、例えば真核細胞に適用することができる。細胞の例
には、ヒトの細胞などの哺乳類の細胞がある。好ましい
細胞には、体細胞および生殖細胞がある。これらの細胞
は生物学的試料、例えば生検から得るか、または培養細
胞、例えば細胞株から得られる細胞であることができ
る。
量用DNA着色剤で細胞の集団を着色すること、その細胞
をフローサイトメトリーにかけ、それによって細胞のDN
A内容を視覚化し、それによって１または複数の染色体
異常を有する細胞を識別すること、および細胞の集団か
ら１または複数の染色体異常を有する１または複数の細
胞を分離することを含む、細胞の集団中の１または複数
の数値染色体異常を有する１または複数の細胞を単離す
る方法を提供する。分析および分離の好ましい方法に
は、フローサイトメトリーがある。この方法は、少なく
とも２つの異なる細胞の分集団を互いに、また細胞の集
団から分離することを含むことができる。本発明の方法
は、有糸分裂を受ける任意の型の細胞、またはマイトジ
ェンにより刺激されて有糸分裂を受けることができる細
胞、例えば真核細胞に適用することができる。細胞の例
には、ヒトの細胞などの哺乳類の細胞がある。好ましい
細胞には、体細胞および生殖細胞がある。これらの細胞
は生物学的試料、例えば生検から得るか、または培養細
胞、例えば細胞株から得られる細胞であることができ
る。
【００１１】本発明はさらに、細胞中で数値染色体異常
を誘発する化合物を特定するための検定法を提供する。
好ましい実施形態において検定法は、任意の潜在的な数
値染色体異常を娘細胞中に誘発させるのに十分な時間、
細胞の集団を供試化合物と接触させること、この細胞を
本発明の方法にかけること、および供試化合物と接触し
た細胞の集団中に染色体異常を有する細胞の数が供試化
合物と接触しなかった類似の細胞の集団と比べてより多
いならば、その供試化合物は細胞中に数値染色体異常を
誘発することを示すようにして細胞中の染色体異常の存
在を決定することを含む。任意の真核細胞、例えば哺乳
類、例えばヒトの細胞をこの検定に用いることができ
る。
を誘発する化合物を特定するための検定法を提供する。
好ましい実施形態において検定法は、任意の潜在的な数
値染色体異常を娘細胞中に誘発させるのに十分な時間、
細胞の集団を供試化合物と接触させること、この細胞を
本発明の方法にかけること、および供試化合物と接触し
た細胞の集団中に染色体異常を有する細胞の数が供試化
合物と接触しなかった類似の細胞の集団と比べてより多
いならば、その供試化合物は細胞中に数値染色体異常を
誘発することを示すようにして細胞中の染色体異常の存
在を決定することを含む。任意の真核細胞、例えば哺乳
類、例えばヒトの細胞をこの検定に用いることができ
る。
【００１２】別の実施形態において本発明は、ヒトの被
検者または動物から得た細胞の集団中の１または複数の
染色体異常を含有する細胞の存在を決定する方法を提供
する。この方法は好ましくは、ヒトの被検者または動物
から細胞試料を入手すること、その細胞試料を本発明の
方法にかけ、それによってヒトの被検者または動物中の
１または複数の数値染色体異常を含有する細胞の存在を
決定することを含む。疾病の例には、さまざまな種類の
癌、生殖細胞の異常染色体性、ならびに三染色体性およ
び一染色体性などの遺伝病がある。
検者または動物から得た細胞の集団中の１または複数の
染色体異常を含有する細胞の存在を決定する方法を提供
する。この方法は好ましくは、ヒトの被検者または動物
から細胞試料を入手すること、その細胞試料を本発明の
方法にかけ、それによってヒトの被検者または動物中の
１または複数の数値染色体異常を含有する細胞の存在を
決定することを含む。疾病の例には、さまざまな種類の
癌、生殖細胞の異常染色体性、ならびに三染色体性およ
び一染色体性などの遺伝病がある。
【００１３】本発明はさらに、細胞中の数値染色体異常
を検出するためのキットを提供する。このキットは、細
胞毒である化合物を特定するための、または試料中の数
値染色体異常を識別するためのキットであることができ
る。キットは、有糸分裂マーカーまたは定量用DNA着色
剤などの１つのマーカーを含んでもよい。好ましい実施
形態においてキットは、有糸分裂マーカーと定量用DNA
着色剤の両方を含む。キットが含むことができる他の構
成要素には、補助のマーカー、検出試薬、緩衝剤、負ま
たは正の対照標準、および生物学的試料を得るための装
置がある。キットはまた、取扱説明書を含むことができ
る。
を検出するためのキットを提供する。このキットは、細
胞毒である化合物を特定するための、または試料中の数
値染色体異常を識別するためのキットであることができ
る。キットは、有糸分裂マーカーまたは定量用DNA着色
剤などの１つのマーカーを含んでもよい。好ましい実施
形態においてキットは、有糸分裂マーカーと定量用DNA
着色剤の両方を含む。キットが含むことができる他の構
成要素には、補助のマーカー、検出試薬、緩衝剤、負ま
たは正の対照標準、および生物学的試料を得るための装
置がある。キットはまた、取扱説明書を含むことができ
る。
【００１４】本発明は、少なくとも細胞中の数値染色体
異常の分析速度の劇的な向上、データ変動の低減、統計
的検出力の増加、および有糸分裂集団中の数値染色体異
常の判定の総合的改善をもたらす利点を提供する。
異常の分析速度の劇的な向上、データ変動の低減、統計
的検出力の増加、および有糸分裂集団中の数値染色体異
常の判定の総合的改善をもたらす利点を提供する。
【００１５】
［発明の詳細な説明］本発明の少なくとも一部は、有糸
分裂のマーカーで分裂している細胞の集団を標識し、そ
してDNA含量の染色及びフローサイトメトリーを介する
着色した細胞の視覚化が細胞の集団中の数値染色体異常
を有する細胞を検出する単純明快な方法を可能にすると
いう発見に基づいている。その結果は、余分または欠落
した染色体あるいは余分の染色体の倍数を有する有糸分
裂細胞の数を示す。
分裂のマーカーで分裂している細胞の集団を標識し、そ
してDNA含量の染色及びフローサイトメトリーを介する
着色した細胞の視覚化が細胞の集団中の数値染色体異常
を有する細胞を検出する単純明快な方法を可能にすると
いう発見に基づいている。その結果は、余分または欠落
した染色体あるいは余分の染色体の倍数を有する有糸分
裂細胞の数を示す。
【００１６】本発明の検出法、識別法、単離法、および
検定法においては、細胞をまず有糸分裂マーカー、次い
で定量用DNA着色剤で処理してもよく、あるいはこの逆
の順序であってもよい。別法では、細胞をまず定量用DN
A着色剤で処理し、続いてDNAの定量化を行ってもよい。
次いで、数値染色体異常を示すこれらの細胞を有糸分裂
マーカーで処理すると有糸分裂であるか非有糸分裂であ
るかを見分けることができる。別の選択肢として、まず
細胞が有糸分裂であるか非有糸分裂であるかを見分け、
次いで定量用DNA着色剤で処理して数値染色体異常を見
分けることもできる。前述の選択肢はすべて本発明の範
囲内にある。
検定法においては、細胞をまず有糸分裂マーカー、次い
で定量用DNA着色剤で処理してもよく、あるいはこの逆
の順序であってもよい。別法では、細胞をまず定量用DN
A着色剤で処理し、続いてDNAの定量化を行ってもよい。
次いで、数値染色体異常を示すこれらの細胞を有糸分裂
マーカーで処理すると有糸分裂であるか非有糸分裂であ
るかを見分けることができる。別の選択肢として、まず
細胞が有糸分裂であるか非有糸分裂であるかを見分け、
次いで定量用DNA着色剤で処理して数値染色体異常を見
分けることもできる。前述の選択肢はすべて本発明の範
囲内にある。
【００１７】本明細書で用いる用語は、当業界の通常の
意味を持つが、本発明をさらにはっきりさせるために便
宜上、この明細書、実施例、および添付の特許請求の範
囲の中で採用する特定の用語および表現を下記に示す。
意味を持つが、本発明をさらにはっきりさせるために便
宜上、この明細書、実施例、および添付の特許請求の範
囲の中で採用する特定の用語および表現を下記に示す。
【００１８】「アノイゲン」は、異数性を引き起こす化
学薬品などの薬品である。「非アノイゲン」は、異数性
を引き起こさない薬品である。
学薬品などの薬品である。「非アノイゲン」は、異数性
を引き起こさない薬品である。
【００１９】「異数性」および「倍数性」は、細胞が通
常の半数体の数（「ｎ」）または二倍体の数（「２
ｎ」）とは異なる染色体の数を有する状態である。ヒト
の場合、染色体の正常な半数体の数は２３であり、二倍
体の数は４６である。正常な細胞ならば４６染色体の二
倍体染色体の内容を有するはずである。異数体細胞は、
正常な半数体の数の全倍数と等しくない染色体の数を有
する。例えば異数体細胞は、三染色体性を有する細胞、
すなわち１つの染色体の３つのコピーを有する細胞、ま
たは一染色体性、すなわち１つの染色体の単一のコピー
を有する細胞であることができる。異数性は、有糸分裂
の間に染色体の非分離の結果生ずる。倍数体細胞は、通
常の二倍体の数すなわち２ｎよりも大きい正常な半数体
の数の数倍の染色体の数を有する細胞である。例えば倍
数体細胞は、三倍体細胞（ｎ＝６９）または四倍体細胞
（ｎ＝９２）であることができる。
常の半数体の数（「ｎ」）または二倍体の数（「２
ｎ」）とは異なる染色体の数を有する状態である。ヒト
の場合、染色体の正常な半数体の数は２３であり、二倍
体の数は４６である。正常な細胞ならば４６染色体の二
倍体染色体の内容を有するはずである。異数体細胞は、
正常な半数体の数の全倍数と等しくない染色体の数を有
する。例えば異数体細胞は、三染色体性を有する細胞、
すなわち１つの染色体の３つのコピーを有する細胞、ま
たは一染色体性、すなわち１つの染色体の単一のコピー
を有する細胞であることができる。異数性は、有糸分裂
の間に染色体の非分離の結果生ずる。倍数体細胞は、通
常の二倍体の数すなわち２ｎよりも大きい正常な半数体
の数の数倍の染色体の数を有する細胞である。例えば倍
数体細胞は、三倍体細胞（ｎ＝６９）または四倍体細胞
（ｎ＝９２）であることができる。
【００２０】用語「生物学的試料」とは、生物または生
物の構成部分（例えば細胞）から得られる試料を意味す
る。試料は任意の生物の組織または体液であることがで
きる。試料は、患者から取り出された試料である「臨床
試料」のこともしばしばあるはずである。このような試
料には、喀痰、血液、血液細胞（例えば白色細胞）、組
織または穿針生検試料、尿、腹膜液、および胸膜液、あ
るいはそれらから取り出された細胞があるが、これらに
は限定されない。生物学的試料にはまた、組織学的目的
で採取された凍結切片などの組織の切片が含まれる。
物の構成部分（例えば細胞）から得られる試料を意味す
る。試料は任意の生物の組織または体液であることがで
きる。試料は、患者から取り出された試料である「臨床
試料」のこともしばしばあるはずである。このような試
料には、喀痰、血液、血液細胞（例えば白色細胞）、組
織または穿針生検試料、尿、腹膜液、および胸膜液、あ
るいはそれらから取り出された細胞があるが、これらに
は限定されない。生物学的試料にはまた、組織学的目的
で採取された凍結切片などの組織の切片が含まれる。
【００２１】細胞中の「数値染色体異常」とは、細胞中
に正常の細胞と比べて余分の染色体またはその部分がよ
り多量に存在すること、あるいは染色体またはその部分
がより多量に欠落していることを意味する。
に正常の細胞と比べて余分の染色体またはその部分がよ
り多量に存在すること、あるいは染色体またはその部分
がより多量に欠落していることを意味する。
【００２２】細胞の「染色体含量」とは、染色体または
その部分の数を意味する。二倍体細胞の正常な染色体の
内容は２ｎであり、半数体細胞のそれはｎである。有糸
分裂中の二倍体細胞の正常な染色体の内容は４ｎであ
る。
その部分の数を意味する。二倍体細胞の正常な染色体の
内容は２ｎであり、半数体細胞のそれはｎである。有糸
分裂中の二倍体細胞の正常な染色体の内容は４ｎであ
る。
【００２３】「定量用DNA着色剤」とは、細胞のDNAの検
出および定量化を可能にする薬品を意味する。好ましい
定量用DNA着色剤は、DNAを着色する薬品、例えば挿入剤
である。定量用DNA着色剤の例はヨウ化プロピジウムで
ある。
出および定量化を可能にする薬品を意味する。好ましい
定量用DNA着色剤は、DNAを着色する薬品、例えば挿入剤
である。定量用DNA着色剤の例はヨウ化プロピジウムで
ある。
【００２４】「二倍体欠損」細胞は、同一種の正常な二
倍体細胞よりも少ない染色体DNAを有する細胞である。
「二倍体過剰」細胞は、同一種の正常な二倍体細胞より
も多い染色体DNAを有する細胞である。
倍体細胞よりも少ない染色体DNAを有する細胞である。
「二倍体過剰」細胞は、同一種の正常な二倍体細胞より
も多い染色体DNAを有する細胞である。
【００２５】「標識」および「検出可能な標識」とは、
これには限定されないが放射性同位元素、蛍光団、化学
発光部分、酵素、酵素基質、酵素共同因子、酵素阻害
剤、色素、金属イオン、リガンド（例えば、ビオチンま
たはハプテン）などを含む検出能力のある分子を意味す
る。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲で蛍光を示す
能力のある物質またはその部分を意味する。本発明で使
用することができる標識の例には、フルオレセイン、ロ
ーダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、TexasRed、ル
ミノール、NADPH、αまたはβ−ガラクトシダーゼ、お
よびワサビダイコンペルオキシダーゼがある。
これには限定されないが放射性同位元素、蛍光団、化学
発光部分、酵素、酵素基質、酵素共同因子、酵素阻害
剤、色素、金属イオン、リガンド（例えば、ビオチンま
たはハプテン）などを含む検出能力のある分子を意味す
る。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲で蛍光を示す
能力のある物質またはその部分を意味する。本発明で使
用することができる標識の例には、フルオレセイン、ロ
ーダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、TexasRed、ル
ミノール、NADPH、αまたはβ−ガラクトシダーゼ、お
よびワサビダイコンペルオキシダーゼがある。
【００２６】「マーカー」は、細胞の幾つかの特性、例
えば細胞周期の段階あるいは細胞の構成部分、例えばDN
Aの存在および／または量に印を付ける薬品であること
ができる。
えば細胞周期の段階あるいは細胞の構成部分、例えばDN
Aの存在および／または量に印を付ける薬品であること
ができる。
【００２７】「有糸分裂マーカー」は、有糸分裂中に存
在する細胞に印を付ける薬品である。好ましい有糸分裂
マーカーは、セリン１０部位でヒストンH3のリン酸化を
検出する薬品である。
在する細胞に印を付ける薬品である。好ましい有糸分裂
マーカーは、セリン１０部位でヒストンH3のリン酸化を
検出する薬品である。
【００２８】「倍数性」とは、染色体の正常な数の反復
の程度を意味する。「倍数性」を有する細胞は、同一種
の正常な細胞とは異なる染色体の数を有する細胞であ
り、例えば異数体細胞または倍数体細胞であることがで
きる。細胞の「倍数性の測定」とは、細胞中の染色体の
数の決定を意味する。
の程度を意味する。「倍数性」を有する細胞は、同一種
の正常な細胞とは異なる染色体の数を有する細胞であ
り、例えば異数体細胞または倍数体細胞であることがで
きる。細胞の「倍数性の測定」とは、細胞中の染色体の
数の決定を意味する。
【００２９】本明細書で用いられる「小分子」とは、分
子量が約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の組
成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチ
ド、擬似ペプチド、炭水化物、脂質、またはその他の有
機（炭素含有）もしくは無機分子であってもよい。多く
の医薬会社は、化学的および／または生物学的混合物、
多くの場合真菌、細菌、または藻類抽出物の広範なライ
ブラリーを所有しており、それらは本発明の検定法のい
ずれかでスクリーニングして数値染色体異常を引き起こ
す化合物をつきとめることができる。
子量が約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の組
成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチ
ド、擬似ペプチド、炭水化物、脂質、またはその他の有
機（炭素含有）もしくは無機分子であってもよい。多く
の医薬会社は、化学的および／または生物学的混合物、
多くの場合真菌、細菌、または藻類抽出物の広範なライ
ブラリーを所有しており、それらは本発明の検定法のい
ずれかでスクリーニングして数値染色体異常を引き起こ
す化合物をつきとめることができる。
【００３０】「着色剤」とは、標的を検出することがで
きる任意の薬品、例えばDNA色素を意味する。
きる任意の薬品、例えばDNA色素を意味する。
【００３１】一実施形態において本発明は、有糸分裂マ
ーカーで細胞を標識すること、およびDNA内容を着色
し、それによって有糸分裂時に細胞のDNAの量を定量
し、またそれによって細胞の染色体内容を決定すること
を含む、細胞の染色体内容、例えば倍数性を決定する方
法を提供する。有糸分裂マーカーで得られる標識の存在
は、細胞が有糸分裂を受けつつあることの現われであ
る。定量用DNA着色剤で得られる着色量は細胞中のDNA
量、例えば細胞中の染色体またはその部分の数と相関性
がある。有糸分裂マーカーの使用により、DNA内容の分
析を有糸分裂細胞に限定することが可能になる。細胞の
染色体内容を決定することには、異数性または倍数性の
存在、あるいは細胞中の染色体の一部の存在または不在
を決定することが含まれる。したがって、有糸分裂性で
あり４ｎ以外のDNA内容を有する細胞は、数値染色体異
常を持つと判定される。もしDNA内容が８ｎなど、４ｎ
よりも大きい正常な半数体の数の数倍ならば、細胞は倍
数体と考えられる。もしDNA内容が実質的に４ｎと等し
くなく、かつ４ｎよりも大きいｎの整数倍でないなら
ば、細胞は異数体と考えられる。さまざまな手法を用い
て着色剤を検出および／または定量することができる。
好ましい方法はフローサイトメトリーである。
ーカーで細胞を標識すること、およびDNA内容を着色
し、それによって有糸分裂時に細胞のDNAの量を定量
し、またそれによって細胞の染色体内容を決定すること
を含む、細胞の染色体内容、例えば倍数性を決定する方
法を提供する。有糸分裂マーカーで得られる標識の存在
は、細胞が有糸分裂を受けつつあることの現われであ
る。定量用DNA着色剤で得られる着色量は細胞中のDNA
量、例えば細胞中の染色体またはその部分の数と相関性
がある。有糸分裂マーカーの使用により、DNA内容の分
析を有糸分裂細胞に限定することが可能になる。細胞の
染色体内容を決定することには、異数性または倍数性の
存在、あるいは細胞中の染色体の一部の存在または不在
を決定することが含まれる。したがって、有糸分裂性で
あり４ｎ以外のDNA内容を有する細胞は、数値染色体異
常を持つと判定される。もしDNA内容が８ｎなど、４ｎ
よりも大きい正常な半数体の数の数倍ならば、細胞は倍
数体と考えられる。もしDNA内容が実質的に４ｎと等し
くなく、かつ４ｎよりも大きいｎの整数倍でないなら
ば、細胞は異数体と考えられる。さまざまな手法を用い
て着色剤を検出および／または定量することができる。
好ましい方法はフローサイトメトリーである。
【００３２】また細胞中の数値染色体異常、例えば異数
性および倍数性の存在は、有糸分裂の状態にかかわりな
く単に細胞のDNA内容を測定することによって推定する
こともできる。しかしながら、有糸分裂中の細胞を選択
的に評価することにより数値染色体異常の検出が向上す
る。これは、有糸分裂細胞が細胞の周期性集団から選択
され、そのすべてがDNA内容の測定によって数値染色体
異常のように見える可能性のある死んだ細胞、プログラ
ムされた細胞死（アポトーシスとして知られる）を受け
る細胞、および細胞の断片または残屑を含む背景誤差の
幾つかの源泉をかなり除去するために起こる。
性および倍数性の存在は、有糸分裂の状態にかかわりな
く単に細胞のDNA内容を測定することによって推定する
こともできる。しかしながら、有糸分裂中の細胞を選択
的に評価することにより数値染色体異常の検出が向上す
る。これは、有糸分裂細胞が細胞の周期性集団から選択
され、そのすべてがDNA内容の測定によって数値染色体
異常のように見える可能性のある死んだ細胞、プログラ
ムされた細胞死（アポトーシスとして知られる）を受け
る細胞、および細胞の断片または残屑を含む背景誤差の
幾つかの源泉をかなり除去するために起こる。
【００３３】この細胞は、細胞の集団内の細胞であって
もよい。したがって本発明は、有糸分裂マーカーおよび
定量用DNA着色剤で細胞の集団を着色し、それによって
有糸分裂時の細胞のDNAの量を定量化することを含む、
細胞の集団中の１または複数の細胞の数値染色体異常の
存在を決定する方法を提供する。本発明は、細胞の集団
中の１または複数の数値染色体異常を有する細胞の数を
定量する方法を提供する。例えばこの方法は、４ｎとは
異なる染色体数を有する有糸分裂細胞を数えることを含
んでもよい。
もよい。したがって本発明は、有糸分裂マーカーおよび
定量用DNA着色剤で細胞の集団を着色し、それによって
有糸分裂時の細胞のDNAの量を定量化することを含む、
細胞の集団中の１または複数の細胞の数値染色体異常の
存在を決定する方法を提供する。本発明は、細胞の集団
中の１または複数の数値染色体異常を有する細胞の数を
定量する方法を提供する。例えばこの方法は、４ｎとは
異なる染色体数を有する有糸分裂細胞を数えることを含
んでもよい。
【００３４】本発明の方法は、細胞株ならびに一次細胞
の培養細胞および動物から得た生物学的試料、例えば生
検試料に適用可能である。有糸分裂を受ける任意の細胞
を使用することができる。好ましい細胞には真核細胞が
ある。この細胞は、脊椎動物細胞、例えば哺乳類の細
胞、例えばヒト；ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネ
コなど非ヒト霊長類；マウス；またはラットの細胞であ
ってもよい。この細胞は、真核生物の任意の器官または
組織、例えば血液細胞、上皮細胞、骨髄細胞、肺細胞、
腎臓細胞、または羊水細胞から得られるものであること
ができる。本発明の方法はまた、酵母菌細胞、Drosophi
la細胞、Xenopus細胞、C. elegans、または染色体を有
する任意の他の細胞に適用することができる。
の培養細胞および動物から得た生物学的試料、例えば生
検試料に適用可能である。有糸分裂を受ける任意の細胞
を使用することができる。好ましい細胞には真核細胞が
ある。この細胞は、脊椎動物細胞、例えば哺乳類の細
胞、例えばヒト；ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネ
コなど非ヒト霊長類；マウス；またはラットの細胞であ
ってもよい。この細胞は、真核生物の任意の器官または
組織、例えば血液細胞、上皮細胞、骨髄細胞、肺細胞、
腎臓細胞、または羊水細胞から得られるものであること
ができる。本発明の方法はまた、酵母菌細胞、Drosophi
la細胞、Xenopus細胞、C. elegans、または染色体を有
する任意の他の細胞に適用することができる。
【００３５】使用される細胞株、例えば数値染色体異常
を引き起こす薬品を見分けるのに使用される細胞株は、
例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC) 1080
1 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209から入
手することができる。
を引き起こす薬品を見分けるのに使用される細胞株は、
例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC) 1080
1 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209から入
手することができる。
【００３６】細胞の生物学的試料は、「侵襲性」または
「非侵襲性」のいずれかのサンプリング手段を用いて個
体から得ることができる。サンプリング手段は、もし動
物の皮膚または器官内からの細胞の採集を含むならば
「侵襲性」であると言われる。侵襲性の方法の例には、
血液採集、精液採集、針生検、胸膜吸引、臍帯生検、羊
水生検などがある。このような方法の例は、Kim, C. H.
等の論文（J. Virol. 66:3879-3882 (1992)）、Biswas,
B等の論文（Annals NY Acad. Sci. 590:582-583(199
0)）、およびBiswas, B等の論文（J. Clin. Microbiol.
29:2228-2233 (1991)）で論じられている。
「非侵襲性」のいずれかのサンプリング手段を用いて個
体から得ることができる。サンプリング手段は、もし動
物の皮膚または器官内からの細胞の採集を含むならば
「侵襲性」であると言われる。侵襲性の方法の例には、
血液採集、精液採集、針生検、胸膜吸引、臍帯生検、羊
水生検などがある。このような方法の例は、Kim, C. H.
等の論文（J. Virol. 66:3879-3882 (1992)）、Biswas,
B等の論文（Annals NY Acad. Sci. 590:582-583(199
0)）、およびBiswas, B等の論文（J. Clin. Microbiol.
29:2228-2233 (1991)）で論じられている。
【００３７】これとは対照的に「非侵襲性」サンプリン
グ手段は、細胞が動物の内面または外面から集められる
ものである。このような「非侵襲性」サンプリング手段
の例には「スワビング」、すなわち涙、唾液、尿、糞材
料、汗または蒸散、毛などの採集がある。このような採
集は、鼻、口、直腸、膣、または耳の穴をスワビングす
ることにより、皮膚または涙管に触れることにより、毛
包を集めることによるなどにより達成することができ
る。本明細書で用いられる「スワビング」は、細胞を集
めるのに十分なやり方で吸着材を含有または具備する塗
布具／採集具（「綿棒」）を表面に接触させることを指
す。
グ手段は、細胞が動物の内面または外面から集められる
ものである。このような「非侵襲性」サンプリング手段
の例には「スワビング」、すなわち涙、唾液、尿、糞材
料、汗または蒸散、毛などの採集がある。このような採
集は、鼻、口、直腸、膣、または耳の穴をスワビングす
ることにより、皮膚または涙管に触れることにより、毛
包を集めることによるなどにより達成することができ
る。本明細書で用いられる「スワビング」は、細胞を集
めるのに十分なやり方で吸着材を含有または具備する塗
布具／採集具（「綿棒」）を表面に接触させることを指
す。
【００３８】細胞の集団は、細胞、例えば細胞株から得
られる細胞の純集団、または細胞の多様な集団であって
もよい。一実施形態において細胞は、末梢血液単核細胞
（PBMC）である。さまざまな型の細胞からなる集団はさ
らに、１または複数の特殊型に濃縮することができる。
例えばリンパ球をPBMCから単離することができる。細胞
の分集団の単離は、アフィニティー精製または細胞表面
マーカーと特異的に反応する抗体を用いたパンニング法
などのさまざまな方法により行うことができる。
られる細胞の純集団、または細胞の多様な集団であって
もよい。一実施形態において細胞は、末梢血液単核細胞
（PBMC）である。さまざまな型の細胞からなる集団はさ
らに、１または複数の特殊型に濃縮することができる。
例えばリンパ球をPBMCから単離することができる。細胞
の分集団の単離は、アフィニティー精製または細胞表面
マーカーと特異的に反応する抗体を用いたパンニング法
などのさまざまな方法により行うことができる。
【００３９】本発明の方法は単細胞に用いることができ
る。好ましくは本発明の方法は、少なくとも１０、好ま
しくは少なくとも１０2、１０3、１０4、１０5、１
０6、１０7、または１０8細胞の集団に用いられる。
る。好ましくは本発明の方法は、少なくとも１０、好ま
しくは少なくとも１０2、１０3、１０4、１０5、１
０6、１０7、または１０8細胞の集団に用いられる。
【００４０】一実施形態において細胞は、紡錘体遮断薬
（例えば、コルセミド(登録商標)またはコルヒチン（GI
BCO, BLR）およびTN16（Wako Pure chemical））と共に
インキュベートされる。例えば、固定する前に細胞をコ
ルセミド（約0.1μg/ml、GIBCO）に１〜３時間さらすこ
とができる。「紡錘体遮断薬」は、有糸分裂時に細胞を
蓄積させる薬品である。
（例えば、コルセミド(登録商標)またはコルヒチン（GI
BCO, BLR）およびTN16（Wako Pure chemical））と共に
インキュベートされる。例えば、固定する前に細胞をコ
ルセミド（約0.1μg/ml、GIBCO）に１〜３時間さらすこ
とができる。「紡錘体遮断薬」は、有糸分裂時に細胞を
蓄積させる薬品である。
【００４１】着色する前または後に、任意選択で細胞を
溶媒で処理して細胞膜を固定し、また任意選択で細胞膜
の透過性をあげる。複数の固定液および固定条件がこの
目的に適している。有用な固定液には、ホルムアルデヒ
ド、例えば２％パラホルムアルデヒド；冷メタノール；
冷エタノール、例えば７０％エタノールがあるがこれに
は限定されない。細胞の固定はまた、パラホルムアルデ
ヒドの３．７％溶液中で約１５〜３０分インキュベート
することによって達成することができる。
溶媒で処理して細胞膜を固定し、また任意選択で細胞膜
の透過性をあげる。複数の固定液および固定条件がこの
目的に適している。有用な固定液には、ホルムアルデヒ
ド、例えば２％パラホルムアルデヒド；冷メタノール；
冷エタノール、例えば７０％エタノールがあるがこれに
は限定されない。細胞の固定はまた、パラホルムアルデ
ヒドの３．７％溶液中で約１５〜３０分インキュベート
することによって達成することができる。
【００４２】固定の前に、細胞は小型ボアピペットを通
してピペットで移され、単細胞の懸濁を確実にする。細
胞はまたこの目的で、例えば35μmストレーナキャップ
（Becton Dickinson、Franklin Lakes, N. J.）を通し
て濾過することもできる。
してピペットで移され、単細胞の懸濁を確実にする。細
胞はまたこの目的で、例えば35μmストレーナキャップ
（Becton Dickinson、Franklin Lakes, N. J.）を通し
て濾過することもできる。
【００４３】一般には細胞は、使用する特定の方法、例
えばフローサイトメトリーにとって十分な時間、特定の
試薬中で固定化される。特定の細胞型に適した固定方法
は、当業界で周知の方法に従って、例えばその特定の方
法に使用するのにどの固定方法が細胞の適切な着色を可
能にするかを決めるためにさまざまな固定方法で検定を
行うことによって決定することができる。
えばフローサイトメトリーにとって十分な時間、特定の
試薬中で固定化される。特定の細胞型に適した固定方法
は、当業界で周知の方法に従って、例えばその特定の方
法に使用するのにどの固定方法が細胞の適切な着色を可
能にするかを決めるためにさまざまな固定方法で検定を
行うことによって決定することができる。
【００４４】使用する有糸分裂マーカーおよび／または
定量用DNA着色剤によっては、有糸分裂マーカーで標識
する前に細胞の透過性をあげることが必要であるかも知
れない。例えば、好ましくは細胞の抗体標識の前に細胞
の透過性をあげる。易透化は、粗大なマーカーが普通な
ら細胞膜に関して不浸透性であるはずの細胞空間に入る
のを可能にするのに役立つ。易透化は、アセトン、エタ
ノール、DMSO、またはさまざまな界面活性剤、例えばト
ゥイーン80またはトリトンX-100などの試薬中で細胞を
インキュベートすることによって達成することができ
る。例えば細胞は、もしあれば細胞の固定中または固定
後に約０．０５〜１．０％トリトンX-100中でインキュ
ベートすることによって透過性をあげることができる。
定量用DNA着色剤によっては、有糸分裂マーカーで標識
する前に細胞の透過性をあげることが必要であるかも知
れない。例えば、好ましくは細胞の抗体標識の前に細胞
の透過性をあげる。易透化は、粗大なマーカーが普通な
ら細胞膜に関して不浸透性であるはずの細胞空間に入る
のを可能にするのに役立つ。易透化は、アセトン、エタ
ノール、DMSO、またはさまざまな界面活性剤、例えばト
ゥイーン80またはトリトンX-100などの試薬中で細胞を
インキュベートすることによって達成することができ
る。例えば細胞は、もしあれば細胞の固定中または固定
後に約０．０５〜１．０％トリトンX-100中でインキュ
ベートすることによって透過性をあげることができる。
【００４５】細胞の透過性をあげる場合一般には、使用
する特定の着色剤、マーカー、および／または検出剤が
細胞上または細胞中のそれらの標的に到達するのに十分
な時間、試薬により細胞の透過性をあげる。特定の細胞
にとって適切な易透化の方法およびその方法に用いられ
る試薬は、当業界で周知の方法に従って、例えばどの易
透化の方法が細胞の適切な着色を可能にするかを決定す
るために、例えば幾つかの異なる易透化の方法で検定を
行うことによって決めることができる。
する特定の着色剤、マーカー、および／または検出剤が
細胞上または細胞中のそれらの標的に到達するのに十分
な時間、試薬により細胞の透過性をあげる。特定の細胞
にとって適切な易透化の方法およびその方法に用いられ
る試薬は、当業界で周知の方法に従って、例えばどの易
透化の方法が細胞の適切な着色を可能にするかを決定す
るために、例えば幾つかの異なる易透化の方法で検定を
行うことによって決めることができる。
【００４６】さまざまな固定液、固定条件、および易透
化剤が当業界で知られており、本発明の着色剤に関連し
て試料細胞を固定または透過性をあげる他の方法は普通
の当業技術者には明らかなはずである。
化剤が当業界で知られており、本発明の着色剤に関連し
て試料細胞を固定または透過性をあげる他の方法は普通
の当業技術者には明らかなはずである。
【００４７】好ましい定量用DNA着色剤は、ヨウ化プロ
ピジウム（PI；Molecular Probes製品番号P-3566、Calb
iochem, La Jolla, Calif.）である。他の有用な定量用
DNA着色剤は、蛍光核酸着色剤である。これには限定さ
れないがチアゾールオレンジ、エチジウムホモダイマ
ー、臭化エチジウム、HOECHST 33258、およびDAPIを含
む、さまざまな適切な核酸着色剤が当業界で知られてい
る。核酸着色剤は、フェナントリジンおよびアクリジン
などの挿入色素、例えば臭化エチジウムおよびヨウ化プ
ロピジウム；DAPIおよびHOECHST色素などの副溝バイン
ダ；またはこれら二つのカテゴリーのどちらにも属さな
いアクリジンオレンジ、7-AAD、およびヒドロキシスチ
ルバミジンなどであってもよい。シアニン色素は、その
高いモル吸光係数、きわめて低い内在蛍光、核酸と結合
した場合の大きな蛍光増大機能、他の生体高分子をほと
んどまたは全く着色させずに核酸に対するその並みない
しきわめて高い親和力に基づいて選択される色素であ
る。幾つかの核酸着色剤は細胞に不浸透性であり、別の
着色剤は細胞浸透性着色剤である。細胞浸透性着色剤
は、着色の前の細胞の易透化を必要としない。細胞浸透
性色素の例には、シアニン色素（SYTO核酸着色剤）；ヨ
ウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、およびエチジ
ウムホモダイマーがある。
ピジウム（PI；Molecular Probes製品番号P-3566、Calb
iochem, La Jolla, Calif.）である。他の有用な定量用
DNA着色剤は、蛍光核酸着色剤である。これには限定さ
れないがチアゾールオレンジ、エチジウムホモダイマ
ー、臭化エチジウム、HOECHST 33258、およびDAPIを含
む、さまざまな適切な核酸着色剤が当業界で知られてい
る。核酸着色剤は、フェナントリジンおよびアクリジン
などの挿入色素、例えば臭化エチジウムおよびヨウ化プ
ロピジウム；DAPIおよびHOECHST色素などの副溝バイン
ダ；またはこれら二つのカテゴリーのどちらにも属さな
いアクリジンオレンジ、7-AAD、およびヒドロキシスチ
ルバミジンなどであってもよい。シアニン色素は、その
高いモル吸光係数、きわめて低い内在蛍光、核酸と結合
した場合の大きな蛍光増大機能、他の生体高分子をほと
んどまたは全く着色させずに核酸に対するその並みない
しきわめて高い親和力に基づいて選択される色素であ
る。幾つかの核酸着色剤は細胞に不浸透性であり、別の
着色剤は細胞浸透性着色剤である。細胞浸透性着色剤
は、着色の前の細胞の易透化を必要としない。細胞浸透
性色素の例には、シアニン色素（SYTO核酸着色剤）；ヨ
ウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、およびエチジ
ウムホモダイマーがある。
【００４８】利用できるその他の色素には、挿入剤の７
−アミノアクチノマイシンＤおよびアクチノマイシン
Ｄ、多色ヒドロキシスチルバミジン、Long-Wavelength
LDS751、およびNeurtrace Fluorescent Nissl Stain類
がある。別の定量用DNA着色剤は、塩基類似体５−ブロ
モ−２′−デオキシウリジン（BrdU、Sigma Chemical C
o.から入手できる）である。その他の有用な核酸着色剤
が、国際公開第WO93/06482号（公開日1993年4月1日）、
第WO94/24213号（公開日1994年10月27日）；Yue他の米
国特許第5,321,130号（1994年）、Yue他の第5,410,030
号（1995年）、Haugland他の第5,436,134号（1995
年）、およびHaugland他の第5,437,980号（1995年）に
記載されている。本発明の有糸分裂マーカーと関連して
適切な核酸着色剤の使用は、有糸分裂細胞およびDNA内
容の同時または逐次観察を可能にするように選択するこ
とができる。
−アミノアクチノマイシンＤおよびアクチノマイシン
Ｄ、多色ヒドロキシスチルバミジン、Long-Wavelength
LDS751、およびNeurtrace Fluorescent Nissl Stain類
がある。別の定量用DNA着色剤は、塩基類似体５−ブロ
モ−２′−デオキシウリジン（BrdU、Sigma Chemical C
o.から入手できる）である。その他の有用な核酸着色剤
が、国際公開第WO93/06482号（公開日1993年4月1日）、
第WO94/24213号（公開日1994年10月27日）；Yue他の米
国特許第5,321,130号（1994年）、Yue他の第5,410,030
号（1995年）、Haugland他の第5,436,134号（1995
年）、およびHaugland他の第5,437,980号（1995年）に
記載されている。本発明の有糸分裂マーカーと関連して
適切な核酸着色剤の使用は、有糸分裂細胞およびDNA内
容の同時または逐次観察を可能にするように選択するこ
とができる。
【００４９】ヨウ化プロピジウム（PI；Calbiochem, La
Jolla, Calif.）は、少なくとも約0.1μg/ml〜約100μ
g/ml、好ましくは少なくとも約0.1μg/ml〜約10μg/m
l、最も好ましくは少なくとも約1μg/ml〜約5μg/mlの
濃度で細胞の集団に加えることができる。この細胞は、
室温で約１分〜約２時間、好ましくは約１０分〜約１時
間、最も好ましくは約１５分〜約３０分、また任意選択
で暗所でインキュベートすることができる。インキュベ
ーションはまた、氷上で少なくとも約1分間、好ましく
は少なくとも約５分間、最も好ましくは少なくとも約１
５分間行ってもよい。
Jolla, Calif.）は、少なくとも約0.1μg/ml〜約100μ
g/ml、好ましくは少なくとも約0.1μg/ml〜約10μg/m
l、最も好ましくは少なくとも約1μg/ml〜約5μg/mlの
濃度で細胞の集団に加えることができる。この細胞は、
室温で約１分〜約２時間、好ましくは約１０分〜約１時
間、最も好ましくは約１５分〜約３０分、また任意選択
で暗所でインキュベートすることができる。インキュベ
ーションはまた、氷上で少なくとも約1分間、好ましく
は少なくとも約５分間、最も好ましくは少なくとも約１
５分間行ってもよい。
【００５０】一般には細胞は、細胞中のDNAの検出およ
び定量を可能にするのに十分な量および時間、定量用DN
A着色剤で着色される。特定の細胞型にとって適切な着
色手順および検出方法は、当業界で知られている方法に
従って、例えばどの条件が細胞の適切な着色を可能にす
るかを決めるために、例えば幾つかのDNA着色剤、濃
度、およびインキュベーション回数を用いた誘導検定に
よって決定することができる。
び定量を可能にするのに十分な量および時間、定量用DN
A着色剤で着色される。特定の細胞型にとって適切な着
色手順および検出方法は、当業界で知られている方法に
従って、例えばどの条件が細胞の適切な着色を可能にす
るかを決めるために、例えば幾つかのDNA着色剤、濃
度、およびインキュベーション回数を用いた誘導検定に
よって決定することができる。
【００５１】DNA内容のための細胞の着色は、染色体DNA
でない、例えばRNAの核酸の着色を妨げる薬品で細胞を
処理することを伴ってもよい。例示の実施形態において
細胞は、RNAを分解する薬品、例えばＲＮアーゼで処理
される。例えば、ＲＮアーゼＡ（BD Clontech、Palo Al
to, California）を約100〜500μg/ml加えることができ
る。
でない、例えばRNAの核酸の着色を妨げる薬品で細胞を
処理することを伴ってもよい。例示の実施形態において
細胞は、RNAを分解する薬品、例えばＲＮアーゼで処理
される。例えば、ＲＮアーゼＡ（BD Clontech、Palo Al
to, California）を約100〜500μg/ml加えることができ
る。
【００５２】一般には細胞は、染色体DNAではない核酸
の着色を妨げる薬品と一緒に、もう一方の核酸の着色と
比べて染色体DNAの支配的な着色を可能にするのに十分
な濃度と時間でインキュベートされる。適切な条件は、
当業界の方法に従って、例えば使用する方法にとって適
切な条件を決めるために、例えばさまざまな条件でさま
ざまな薬品を用いて検定を行うことによって決定するこ
とができる。
の着色を妨げる薬品と一緒に、もう一方の核酸の着色と
比べて染色体DNAの支配的な着色を可能にするのに十分
な濃度と時間でインキュベートされる。適切な条件は、
当業界の方法に従って、例えば使用する方法にとって適
切な条件を決めるために、例えばさまざまな条件でさま
ざまな薬品を用いて検定を行うことによって決定するこ
とができる。
【００５３】好ましい有糸分裂マーカーは、非有糸分裂
細胞中には本質的に存在しないか、または非有糸分裂細
胞では検出されない有糸分裂細胞（Ｍ）の特性を検出す
ることによって有糸分裂細胞を特異的に検出する薬品で
ある。好ましい実施形態において有糸分裂マーカーは、
間期中ではなく（すなわちＧ0、Ｇ1、Ｓ、またはＧ2中
ではない）有糸分裂時に起こるクロマチンの凝縮を検出
するマーカーである。さらに一層好ましい有糸分裂マー
カーは、セリン10上のヒストンH3（抗H3-P抗体）のリン
酸化を検出する薬品（Juan等の論文、Cytometry 32:71
(1998)）である。この薬品は、単クローン抗体などの抗
体であってもよい。好ましい抗体は、Cell Signaling T
echnology (Berverly, MA) から市販されている抗H3-P
抗体6G3（Juan等の論文、上記）である。この抗体は、
リン酸化されていない形態ではなく、セリン10残基のリ
ン酸化された形態を特異的に検出する。前期から終期ま
での有糸分裂細胞が、抗H3-P抗体によって検出される。
これとは対照的に、抗体と間期細胞（すなわちＧ０、Ｇ
１、Ｓ、およびＧ２）のクロマチンとの結合は数倍弱
い。したがって、この抗体と結合する唯一の細胞は有糸
分裂中の細胞である。
細胞中には本質的に存在しないか、または非有糸分裂細
胞では検出されない有糸分裂細胞（Ｍ）の特性を検出す
ることによって有糸分裂細胞を特異的に検出する薬品で
ある。好ましい実施形態において有糸分裂マーカーは、
間期中ではなく（すなわちＧ0、Ｇ1、Ｓ、またはＧ2中
ではない）有糸分裂時に起こるクロマチンの凝縮を検出
するマーカーである。さらに一層好ましい有糸分裂マー
カーは、セリン10上のヒストンH3（抗H3-P抗体）のリン
酸化を検出する薬品（Juan等の論文、Cytometry 32:71
(1998)）である。この薬品は、単クローン抗体などの抗
体であってもよい。好ましい抗体は、Cell Signaling T
echnology (Berverly, MA) から市販されている抗H3-P
抗体6G3（Juan等の論文、上記）である。この抗体は、
リン酸化されていない形態ではなく、セリン10残基のリ
ン酸化された形態を特異的に検出する。前期から終期ま
での有糸分裂細胞が、抗H3-P抗体によって検出される。
これとは対照的に、抗体と間期細胞（すなわちＧ０、Ｇ
１、Ｓ、およびＧ２）のクロマチンとの結合は数倍弱
い。したがって、この抗体と結合する唯一の細胞は有糸
分裂中の細胞である。
【００５４】使用することができる別の有糸分裂マーカ
ーには、TG-3単クローン抗体がある（Andersonの論文、
Experimental Cell Res. 238, 498-502 (1998)）。
ーには、TG-3単クローン抗体がある（Andersonの論文、
Experimental Cell Res. 238, 498-502 (1998)）。
【００５５】一般には細胞は、使用する特定の方法、例
えばフローサイトメトリーにより有糸分裂細胞の検出を
可能にするのに十分な濃度と時間、有糸分裂マーカーで
標識される。適切な条件は、当業界で周知の方法、例え
ば適切な条件を割り出すために有糸分裂マーカーと一緒
にさまざまな条件で細胞をインキュベートすることによ
り決めることができる。
えばフローサイトメトリーにより有糸分裂細胞の検出を
可能にするのに十分な濃度と時間、有糸分裂マーカーで
標識される。適切な条件は、当業界で周知の方法、例え
ば適切な条件を割り出すために有糸分裂マーカーと一緒
にさまざまな条件で細胞をインキュベートすることによ
り決めることができる。
【００５６】幾つかの実施形態において細胞は、１また
は複数の追加のマーカーで着色することができる。例え
ば第三のマーカーは、他の２つのマーカーで得られる結
果を立証するための別の有糸分裂マーカーまたはDNAマ
ーカーであることができる。別法では別のマーカーは、
細胞または細胞オルガネラの大きさまたは粒状度を検出
するマーカーであってもよい。
は複数の追加のマーカーで着色することができる。例え
ば第三のマーカーは、他の２つのマーカーで得られる結
果を立証するための別の有糸分裂マーカーまたはDNAマ
ーカーであることができる。別法では別のマーカーは、
細胞または細胞オルガネラの大きさまたは粒状度を検出
するマーカーであってもよい。
【００５７】例えば追加のマーカーは、細胞膜、核、ゴ
ルジ装置、小胞体、リソソームなどの細胞オルガネラを
選択的に着色するか、あるいはローダミン123などの第
二のミトコンドリア着色剤またはHaugland他の米国特許
第5,459,268号（1995年）に記載の定着性ミトコンドリ
ア着色剤である、任意のプローブまたは着色剤であるこ
とができる。追加のマーカーの特異な例には、LYSOTRAC
KER (Molecular Probes, Eugene, Oreg.) などの酸性オ
ルガネラ用着色剤および米国特許第6,291,203号に記載
のリソソーム用の他の着色剤がある。本発明の着色剤と
組み合わせてリソソームに対して選択的な着色剤を使用
することにより、有糸分裂細胞、DNA内容、および、例
えば細胞中のミトコンドリアと酸性オルガネラの多色視
覚化が可能になる。
ルジ装置、小胞体、リソソームなどの細胞オルガネラを
選択的に着色するか、あるいはローダミン123などの第
二のミトコンドリア着色剤またはHaugland他の米国特許
第5,459,268号（1995年）に記載の定着性ミトコンドリ
ア着色剤である、任意のプローブまたは着色剤であるこ
とができる。追加のマーカーの特異な例には、LYSOTRAC
KER (Molecular Probes, Eugene, Oreg.) などの酸性オ
ルガネラ用着色剤および米国特許第6,291,203号に記載
のリソソーム用の他の着色剤がある。本発明の着色剤と
組み合わせてリソソームに対して選択的な着色剤を使用
することにより、有糸分裂細胞、DNA内容、および、例
えば細胞中のミトコンドリアと酸性オルガネラの多色視
覚化が可能になる。
【００５８】有糸分裂マーカーおよび／または定量用DN
A着色剤は、それ自体検出可能ではないが二次的な試薬
または「検出試薬」によって検出することができる薬品
であってもよい。例えばマーカーは抗体であってもよ
い。抗体は直接、例えば下記に述べる標識で標識するこ
とができる。別法では抗体は、その抗体を識別する二次
（または第二）試薬と反応してもよい。さまざまな二次
試薬が当業界、例えばFITCで知られている。また、抗体
はビオチンと結合してもよく、二次試薬はアビジンまた
はストレプトアビジンと結合してもよい。一般に二次試
薬は標識を運ぶことになる。標識を運ぶ試薬は「検出試
薬」と呼ばれる。
A着色剤は、それ自体検出可能ではないが二次的な試薬
または「検出試薬」によって検出することができる薬品
であってもよい。例えばマーカーは抗体であってもよ
い。抗体は直接、例えば下記に述べる標識で標識するこ
とができる。別法では抗体は、その抗体を識別する二次
（または第二）試薬と反応してもよい。さまざまな二次
試薬が当業界、例えばFITCで知られている。また、抗体
はビオチンと結合してもよく、二次試薬はアビジンまた
はストレプトアビジンと結合してもよい。一般に二次試
薬は標識を運ぶことになる。標識を運ぶ試薬は「検出試
薬」と呼ばれる。
【００５９】一般に検出試薬は、検出可能な応答を生じ
る手段を内臓する。検出可能な応答は、直接観察するか
計器のいずれかで感知できる、また細胞試料中の特定の
結合ペアの特に標的されたメンバーの存在の関数である
試験システムのパラメータの変化または発生を意味す
る。このような検出可能な応答には、色、蛍光、反射
率、ｐＨ、化学ルミネセンス、または赤外放出の変化も
しくは発生がある。検出可能な応答をもたらす適切な標
識には、可視または蛍光色素、酵素作用に基づいて可視
または蛍光沈殿物を生成する酵素基質（例えば、ジアミ
ノベンジジンに対するワサビダイコンペルオキシダーゼ
の作用）、酵素変換に基づいて蛍光または可視色を生ず
る酵素基質、可視または蛍光標識したラテックス微粒
子、または試薬に対する光の作用により放出されるシグ
ナル（例えば、光分解またはジアミノベンジジンに対す
る光の作用により活性化されるケージ発蛍光団）がある
が、これには限定されない。
る手段を内臓する。検出可能な応答は、直接観察するか
計器のいずれかで感知できる、また細胞試料中の特定の
結合ペアの特に標的されたメンバーの存在の関数である
試験システムのパラメータの変化または発生を意味す
る。このような検出可能な応答には、色、蛍光、反射
率、ｐＨ、化学ルミネセンス、または赤外放出の変化も
しくは発生がある。検出可能な応答をもたらす適切な標
識には、可視または蛍光色素、酵素作用に基づいて可視
または蛍光沈殿物を生成する酵素基質（例えば、ジアミ
ノベンジジンに対するワサビダイコンペルオキシダーゼ
の作用）、酵素変換に基づいて蛍光または可視色を生ず
る酵素基質、可視または蛍光標識したラテックス微粒
子、または試薬に対する光の作用により放出されるシグ
ナル（例えば、光分解またはジアミノベンジジンに対す
る光の作用により活性化されるケージ発蛍光団）がある
が、これには限定されない。
【００６０】興味深い蛍光部分または標識には、クマリ
ンとその誘導体、例えば７−アミノ−４−メチルクマリ
ン、アミノクマリン；Bodipy FL、カスケードブルーな
どのボディピー色素；フルオレセインとその誘導体、例
えばフルオレセインイソチオシアナート；オレゴングリ
ーン；ローダミン色素、例えばTexas Red、テトラメチ
ルローダミン、エオシン、およびエリトロシン；シアニ
ン色素、例えばCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；Fl
uor X；ランタニドイオンの大環状キレート化合物、例
えばQuantum dye(商標)；チアゾールオレンジ−エチジ
ウムヘテロダイマー、TOTAB、ダンシルなどの蛍光性エ
ネルギー転移色素などがある。検出試薬と結合するため
の官能基を有する、またはそのような官能基を組み込む
ように変性することができる個々の蛍光化合物には、例
えば塩化ダンシル；３，６−ジリドロキシ−９−フェニ
ルキサンチドロールなどのフルオレセイン；ローダミン
イソチオシアナート；Ｎ−フェニル−１−アミノ−８−
スルホナートナフタレン；Ｎ−フェニル−２−アミノ−
６−スルホナートナフタレン；４−アセトアミド−４−
イソチオシアナート−スチベン−２，２′−ジスルホン
酸；ピレン―３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレ
ン−６−スルホナート；Ｎ−フェニル−Ｎ−メチル−２
−アミノナフタレン−６−スルホナート；臭化エチジウ
ム；ステブリン；オーロミン−０，２−（９′−アント
ロイル）パルミタート；ダンシルホスファチジルエタノ
ールアミン；Ｎ，Ｎ′−ジオクトアデシルオキサカルボ
シアニン；Ｎ，Ｎ′−ジヘキシルオキサカルボシアニ
ン；メロシアニン；４−（３′−ピレニル）ステアラー
ト；ｄ−３−アミノデスオキシ−エキレニン；１２−
（９′−アントロイル）ステアラート；２−メチルアン
トラセン；９−ビニルアントラセン；２，２′−（ビニ
レン−ｐ−フェニレン）ビスベンズオキサゾール；ｐ−
ビス（２−メチル−５−フェニル−オキサゾリル）ベン
ゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジ
ン；レチノール；二ヨウ化ビス（３′−アミノピリジニ
ウム）１，１０−デカンジイル；ヘリブリエニンのスル
ホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ−
（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−
クロメニル）マレイミド；Ｎ−（ｐ−（２−ベンズイミ
ダゾリル）−フェニル）マレイミド；Ｎ−（４−フルオ
ランチル）マレイミド；ビス（ホモバリニン酸）；レサ
ザリン；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾ
オキサジアゾール；メロシアニン５４０；レソルフィ
ン；ローズベンガル；および２，４−ジフェニル−３
（２Ｈ）−フラノンがある（例えば、Kricka著、Non-is
otoPIc DNA Probe Techniques, Academic Press San Di
ego, Calif. (1992)を参照されたい）。多くの蛍光標識
が、Sigma chemical company (Saint Louis, Mo.)、Ame
rsham、Molecular Probes、R&D systems (Minneapolis,
Minn.)、Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway,
N.J.)、CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Cal
f.)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company (M
ilwaukee, Wis.)、Glen Research, Inc.、GIBCO BRL Li
fe Technologies, Inc. (Gaithersberg, Md.)、Fluka C
hemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buch
s, Switzerland)、Applied Biosystems (Foster City,
Calf.)、ならびに当業技術者には周知の他の市場供給先
により市販されている。
ンとその誘導体、例えば７−アミノ−４−メチルクマリ
ン、アミノクマリン；Bodipy FL、カスケードブルーな
どのボディピー色素；フルオレセインとその誘導体、例
えばフルオレセインイソチオシアナート；オレゴングリ
ーン；ローダミン色素、例えばTexas Red、テトラメチ
ルローダミン、エオシン、およびエリトロシン；シアニ
ン色素、例えばCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；Fl
uor X；ランタニドイオンの大環状キレート化合物、例
えばQuantum dye(商標)；チアゾールオレンジ−エチジ
ウムヘテロダイマー、TOTAB、ダンシルなどの蛍光性エ
ネルギー転移色素などがある。検出試薬と結合するため
の官能基を有する、またはそのような官能基を組み込む
ように変性することができる個々の蛍光化合物には、例
えば塩化ダンシル；３，６−ジリドロキシ−９−フェニ
ルキサンチドロールなどのフルオレセイン；ローダミン
イソチオシアナート；Ｎ−フェニル−１−アミノ−８−
スルホナートナフタレン；Ｎ−フェニル−２−アミノ−
６−スルホナートナフタレン；４−アセトアミド−４−
イソチオシアナート−スチベン−２，２′−ジスルホン
酸；ピレン―３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレ
ン−６−スルホナート；Ｎ−フェニル−Ｎ−メチル−２
−アミノナフタレン−６−スルホナート；臭化エチジウ
ム；ステブリン；オーロミン−０，２−（９′−アント
ロイル）パルミタート；ダンシルホスファチジルエタノ
ールアミン；Ｎ，Ｎ′−ジオクトアデシルオキサカルボ
シアニン；Ｎ，Ｎ′−ジヘキシルオキサカルボシアニ
ン；メロシアニン；４−（３′−ピレニル）ステアラー
ト；ｄ−３−アミノデスオキシ−エキレニン；１２−
（９′−アントロイル）ステアラート；２−メチルアン
トラセン；９−ビニルアントラセン；２，２′−（ビニ
レン−ｐ−フェニレン）ビスベンズオキサゾール；ｐ−
ビス（２−メチル−５−フェニル−オキサゾリル）ベン
ゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジ
ン；レチノール；二ヨウ化ビス（３′−アミノピリジニ
ウム）１，１０−デカンジイル；ヘリブリエニンのスル
ホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ−
（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−
クロメニル）マレイミド；Ｎ−（ｐ−（２−ベンズイミ
ダゾリル）−フェニル）マレイミド；Ｎ−（４−フルオ
ランチル）マレイミド；ビス（ホモバリニン酸）；レサ
ザリン；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾ
オキサジアゾール；メロシアニン５４０；レソルフィ
ン；ローズベンガル；および２，４−ジフェニル−３
（２Ｈ）−フラノンがある（例えば、Kricka著、Non-is
otoPIc DNA Probe Techniques, Academic Press San Di
ego, Calif. (1992)を参照されたい）。多くの蛍光標識
が、Sigma chemical company (Saint Louis, Mo.)、Ame
rsham、Molecular Probes、R&D systems (Minneapolis,
Minn.)、Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway,
N.J.)、CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Cal
f.)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company (M
ilwaukee, Wis.)、Glen Research, Inc.、GIBCO BRL Li
fe Technologies, Inc. (Gaithersberg, Md.)、Fluka C
hemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buch
s, Switzerland)、Applied Biosystems (Foster City,
Calf.)、ならびに当業技術者には周知の他の市場供給先
により市販されている。
【００６１】化学発光性の標識には、ルシフェリンおよ
び２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えばルミノ
ールがある。興味深い同位体部分または標識には、
32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、2Ｈ、14Ｃなどがある（Zhao
等の論文、Gene 156:207 (1995);PIetu等の論文、Genom
e Res. 6:492 (1996)を参照されたい）。
び２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えばルミノ
ールがある。興味深い同位体部分または標識には、
32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、2Ｈ、14Ｃなどがある（Zhao
等の論文、Gene 156:207 (1995);PIetu等の論文、Genom
e Res. 6:492 (1996)を参照されたい）。
【００６２】標識はまた、検出可能なシグナルを提供す
るように同じシステムの１または複数の補助メンバーと
協力して作用するシグナル発生システムのメンバーであ
ることもできる。このような標識の実例は、リガンドな
どの特異的に結合するペアのメンバー、例えばビオチ
ン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価カチ
オン類、キレート基などであり、このメンバーは直接的
または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを提供す
るシグナル発生システムの補助メンバー、例えば蛍光部
分、または基質を色原体生成物に転換することができる
酵素部分に接合した抗体、例えばアルカリ性ホスファタ
ーゼ複合抗体などと特異的に結合する。使用できる薬品
の対の例には、酵素と酵素基質、抗原と抗体、ビオチン
とアビジン（またはストレプトアビジン）、免疫グロブ
リンとタンパク質ＡまたはＣ、炭水化物とレクチンがあ
る。
るように同じシステムの１または複数の補助メンバーと
協力して作用するシグナル発生システムのメンバーであ
ることもできる。このような標識の実例は、リガンドな
どの特異的に結合するペアのメンバー、例えばビオチ
ン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価カチ
オン類、キレート基などであり、このメンバーは直接的
または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを提供す
るシグナル発生システムの補助メンバー、例えば蛍光部
分、または基質を色原体生成物に転換することができる
酵素部分に接合した抗体、例えばアルカリ性ホスファタ
ーゼ複合抗体などと特異的に結合する。使用できる薬品
の対の例には、酵素と酵素基質、抗原と抗体、ビオチン
とアビジン（またはストレプトアビジン）、免疫グロブ
リンとタンパク質ＡまたはＣ、炭水化物とレクチンがあ
る。
【００６３】適切な酵素の存在下で蛍光性沈殿物を生じ
る手段としての酵素基質はさらに、Haugland他の米国特
許第5,316,906号（1994年）およびHaugland他の米国特
許第5,443,986号（1995年）に記載されている。
る手段としての酵素基質はさらに、Haugland他の米国特
許第5,316,906号（1994年）およびHaugland他の米国特
許第5,443,986号（1995年）に記載されている。
【００６４】例えば6G3抗体と共に使用することができ
る、抗体の定常部を識別する標識抗体の例には、蛍光色
素、例えばAlexa Fluor 488（Molecular Probes, A-110
11）、フルオレセインイソチオシアナート（FITC）、フ
ィコエリトリン（PE）、Ｒ−フィコエリトリン（R-P
E）、Cy-Chrome(商標)、およびPerCP（BD PharMingen）
がある。抗体はまた、アロフィコシアニン（APC）およ
びTexas Red(商標)と接合することができる。このよう
な標識した二次的な抗体は当業界でよく知られており、
多数の市場の供給先から入手できる。
る、抗体の定常部を識別する標識抗体の例には、蛍光色
素、例えばAlexa Fluor 488（Molecular Probes, A-110
11）、フルオレセインイソチオシアナート（FITC）、フ
ィコエリトリン（PE）、Ｒ−フィコエリトリン（R-P
E）、Cy-Chrome(商標)、およびPerCP（BD PharMingen）
がある。抗体はまた、アロフィコシアニン（APC）およ
びTexas Red(商標)と接合することができる。このよう
な標識した二次的な抗体は当業界でよく知られており、
多数の市場の供給先から入手できる。
【００６５】その他の適切な補助検出試薬には、Kuhn他
の米国特許第5,453,517号（1995年）、Kuhn他の米国特
許第5,405,975号（1995年）、およびHauglandの上記HAN
DBOOK Sets 20-22 (1992)に記載されているものなど、
選ばれたｐＨまたは金属イオン指示薬がある。さらに別
の興味深い標識には、米国特許第5,563,037号、国際公
開第WO97/17471号、および国際公開第WO97/17076号に記
載されたものがある。
の米国特許第5,453,517号（1995年）、Kuhn他の米国特
許第5,405,975号（1995年）、およびHauglandの上記HAN
DBOOK Sets 20-22 (1992)に記載されているものなど、
選ばれたｐＨまたは金属イオン指示薬がある。さらに別
の興味深い標識には、米国特許第5,563,037号、国際公
開第WO97/17471号、および国際公開第WO97/17076号に記
載されたものがある。
【００６６】共に測定されることになるさまざまなマー
カーに使用される区別できる標識の例は当業界でよく知
られており、Cy3およびCy5のような２つ以上の異なる発
光波長の蛍光色素；フィコエリトリンとCy5のような蛍
光タンパク質と色素の組合せ；32Ｐと33Ｐのような異な
る発光エネルギーを有する２つ以上の同位体；異なる散
乱スペクトルを有する金または銀の粒子；温度、ｐＨ、
追加の化学薬品による処理などのような異なる処理条件
下でシグナルを発するか、または処理後のさまざまな時
点でシグナルを発する標識が含まれる。シグナル発生用
の１または複数の酵素を用いると、酵素の異なる基質特
異性（アルカリ性ホスファターゼ／ペルオキシダーゼ）
に基づいてさらにいろいろの区別できる標識の使用が可
能になる。
カーに使用される区別できる標識の例は当業界でよく知
られており、Cy3およびCy5のような２つ以上の異なる発
光波長の蛍光色素；フィコエリトリンとCy5のような蛍
光タンパク質と色素の組合せ；32Ｐと33Ｐのような異な
る発光エネルギーを有する２つ以上の同位体；異なる散
乱スペクトルを有する金または銀の粒子；温度、ｐＨ、
追加の化学薬品による処理などのような異なる処理条件
下でシグナルを発するか、または処理後のさまざまな時
点でシグナルを発する標識が含まれる。シグナル発生用
の１または複数の酵素を用いると、酵素の異なる基質特
異性（アルカリ性ホスファターゼ／ペルオキシダーゼ）
に基づいてさらにいろいろの区別できる標識の使用が可
能になる。
【００６７】本発明の好ましい方法は、溶液中で細胞の
固定に適した時間の間、細胞を固定することを含む。次
いで細胞は、その方法で用いられる着色剤に適した細胞
の易透化用試薬を含む溶液中でインキュベートされる。
好ましくは細胞は、特定の有糸分裂マーカーのために、
また任意選択で二次検出試薬のために細胞の透過性をあ
げるのに十分な時間、界面活性剤を含有する溶液中でイ
ンキュベートされる。易透化のステップは必須ではな
く、非細胞浸透性のマーカーまたは検出剤が使用される
場合にのみ必要である。次いで細胞は、第一マーカー、
例えば有糸分裂マーカーの存在下で、マーカーがその標
的分子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８
０％、最も好ましくは少なくとも約１００％と結合する
のに十分な量および時間、インキュベートすることがで
きる。第一マーカーでインキュベートした後、細胞は二
次検出剤と共に、その標的分子の少なくとも約７０％、
好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なく
とも約１００％と反応するのに十分な量および時間でイ
ンキュベートすることができる。細胞は定量用DNA着色
剤などの第二マーカーと共に、その標的分子の少なくと
も約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ま
しくは少なくとも約１００％と反応するのに十分な濃度
および時間でインキュベートすることができる。
固定に適した時間の間、細胞を固定することを含む。次
いで細胞は、その方法で用いられる着色剤に適した細胞
の易透化用試薬を含む溶液中でインキュベートされる。
好ましくは細胞は、特定の有糸分裂マーカーのために、
また任意選択で二次検出試薬のために細胞の透過性をあ
げるのに十分な時間、界面活性剤を含有する溶液中でイ
ンキュベートされる。易透化のステップは必須ではな
く、非細胞浸透性のマーカーまたは検出剤が使用される
場合にのみ必要である。次いで細胞は、第一マーカー、
例えば有糸分裂マーカーの存在下で、マーカーがその標
的分子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８
０％、最も好ましくは少なくとも約１００％と結合する
のに十分な量および時間、インキュベートすることがで
きる。第一マーカーでインキュベートした後、細胞は二
次検出剤と共に、その標的分子の少なくとも約７０％、
好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なく
とも約１００％と反応するのに十分な量および時間でイ
ンキュベートすることができる。細胞は定量用DNA着色
剤などの第二マーカーと共に、その標的分子の少なくと
も約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ま
しくは少なくとも約１００％と反応するのに十分な濃度
および時間でインキュベートすることができる。
【００６８】マーカーを細胞に加える順序は重要であ
る。例えば、定量用DNA着色剤を有糸分裂マーカーの前
に細胞に加えることはできない。二次検出剤は、その二
次検出剤が識別する薬品によって細胞を着色した後に加
えられる。二次検出剤は、細胞が１もしくは２種類また
はそれ以上のマーカーにより着色された後に細胞に加え
られる。
る。例えば、定量用DNA着色剤を有糸分裂マーカーの前
に細胞に加えることはできない。二次検出剤は、その二
次検出剤が識別する薬品によって細胞を着色した後に加
えられる。二次検出剤は、細胞が１もしくは２種類また
はそれ以上のマーカーにより着色された後に細胞に加え
られる。
【００６９】したがって例示的な実施形態においては、
約１〜１０6個の細胞をPBS中で洗浄し、７０％エタノー
ル中で−２０℃で固定する。次いで細胞を遠心分離し、
細胞の透過性をあげるのに十分な時間、約０．０５〜約
１％、好ましくは約０．０５〜約０．５％、最も好まし
くは約０．１〜約０．２％のPBS／トゥイーン80中でイ
ンキュベートすることにより透過性をあげる。適切な時
間は、細胞の型に左右されることになり、小規模の検定
で決めることができる。一般にインキュベーションは、
細胞の透過性をあげるために室温で約５分〜約３０分
間、好ましくは約１０分〜約２０分間、最も好ましくは
約１０分〜約１５分間が好適なはずである。細胞を遠心
分離し、Cell Signaling Technology (Berverly, MA)か
ら市販されている溶液を約１００〜１０００倍、好まし
くは約３００〜７００倍、さらに最も好ましくは約４０
０〜５００倍に希釈したH3（セリン１０）6G3抗体を含
有する溶液中にその細胞のペレットを再度懸濁する。細
胞を３７℃で約１０分〜１時間、好ましくは約３０分〜
１時間、最も好ましくは約４０分間インキュベートす
る。次いでPBSをその溶液に加え、細胞と共に混合し、
細胞を遠心分離する。次いで細胞のペレットをAlexa Fl
uor 488で標識した第二抗体中に再度懸濁し、３７℃で
約１０分〜６０分間、好ましくは約２０分〜約４０分
間、最も好ましくは約３０分間インキュベートする。PB
Sをその細胞に加え、細胞と共に混合し、細胞を遠心分
離し、そのペレットをヨウ化プロピジウムおよび任意選
択でＲＮアーゼを含む溶液中に再度懸濁する。好ましく
はヨウ化プロピジウムは、濃度が少なくとも約0.1μg/m
l〜約100μg/ml、好ましくは少なくとも約0.1μg/ml〜
約10μg/ml、最も好ましくは約1μg/ml〜約5μg/mlで存
在する。ＲＮアーゼは、好ましくは約10μg/ml〜約1000
μg/ml、より好ましくは約50μg/ml〜約500μg/ml、最
も好ましくは約100μg/ml〜約300μg/mlの濃度で加えら
れる。インキュベーションは、好ましくは氷上で少なく
とも約1分間、好ましくは少なくとも約1０分間行われ
る。FACS分析の前、細胞は４℃で保管することができ
る。この細胞は、フローサイトメトリーによってDNAの
内容（蛍光強度）、異数性（倍数性を含む）、および細
胞周期分析の分析を行うことができる。
約１〜１０6個の細胞をPBS中で洗浄し、７０％エタノー
ル中で−２０℃で固定する。次いで細胞を遠心分離し、
細胞の透過性をあげるのに十分な時間、約０．０５〜約
１％、好ましくは約０．０５〜約０．５％、最も好まし
くは約０．１〜約０．２％のPBS／トゥイーン80中でイ
ンキュベートすることにより透過性をあげる。適切な時
間は、細胞の型に左右されることになり、小規模の検定
で決めることができる。一般にインキュベーションは、
細胞の透過性をあげるために室温で約５分〜約３０分
間、好ましくは約１０分〜約２０分間、最も好ましくは
約１０分〜約１５分間が好適なはずである。細胞を遠心
分離し、Cell Signaling Technology (Berverly, MA)か
ら市販されている溶液を約１００〜１０００倍、好まし
くは約３００〜７００倍、さらに最も好ましくは約４０
０〜５００倍に希釈したH3（セリン１０）6G3抗体を含
有する溶液中にその細胞のペレットを再度懸濁する。細
胞を３７℃で約１０分〜１時間、好ましくは約３０分〜
１時間、最も好ましくは約４０分間インキュベートす
る。次いでPBSをその溶液に加え、細胞と共に混合し、
細胞を遠心分離する。次いで細胞のペレットをAlexa Fl
uor 488で標識した第二抗体中に再度懸濁し、３７℃で
約１０分〜６０分間、好ましくは約２０分〜約４０分
間、最も好ましくは約３０分間インキュベートする。PB
Sをその細胞に加え、細胞と共に混合し、細胞を遠心分
離し、そのペレットをヨウ化プロピジウムおよび任意選
択でＲＮアーゼを含む溶液中に再度懸濁する。好ましく
はヨウ化プロピジウムは、濃度が少なくとも約0.1μg/m
l〜約100μg/ml、好ましくは少なくとも約0.1μg/ml〜
約10μg/ml、最も好ましくは約1μg/ml〜約5μg/mlで存
在する。ＲＮアーゼは、好ましくは約10μg/ml〜約1000
μg/ml、より好ましくは約50μg/ml〜約500μg/ml、最
も好ましくは約100μg/ml〜約300μg/mlの濃度で加えら
れる。インキュベーションは、好ましくは氷上で少なく
とも約1分間、好ましくは少なくとも約1０分間行われ
る。FACS分析の前、細胞は４℃で保管することができ
る。この細胞は、フローサイトメトリーによってDNAの
内容（蛍光強度）、異数性（倍数性を含む）、および細
胞周期分析の分析を行うことができる。
【００７０】一方または両方のマーカーで着色した細胞
を分析するための好ましい方法は、多重パラメータ（ま
たはカラー）表示を用いたフローサイトメトリーまたは
レーザー走査サイトメトリーによるものである。さらに
一層好ましい実施形態においては、有糸分裂マーカーお
よび定量用DNA着色剤で着色した細胞を２パラメータフ
ローサイトメトリーにかける。これは、DNA内容に関し
て有糸分裂細胞の可視化を可能にし、また例えば異常染
色体の内容、例えば異数性または倍数性を有する有糸分
裂細胞の異なる分集団の可視化を可能にする。加えてフ
ローサイトメトリーは、有糸分裂細胞の分集団の単離を
可能にし、例えばより少数の染色体を有するすべての細
胞を１つの管で単離することができ、また余分の染色体
を有するすべての細胞を第二の管で単離することができ
る。したがって細胞の多数分集団を互いに、また他の細
胞から分離することができる。次いで細胞のこのような
集団をさらに調べることができる。
を分析するための好ましい方法は、多重パラメータ（ま
たはカラー）表示を用いたフローサイトメトリーまたは
レーザー走査サイトメトリーによるものである。さらに
一層好ましい実施形態においては、有糸分裂マーカーお
よび定量用DNA着色剤で着色した細胞を２パラメータフ
ローサイトメトリーにかける。これは、DNA内容に関し
て有糸分裂細胞の可視化を可能にし、また例えば異常染
色体の内容、例えば異数性または倍数性を有する有糸分
裂細胞の異なる分集団の可視化を可能にする。加えてフ
ローサイトメトリーは、有糸分裂細胞の分集団の単離を
可能にし、例えばより少数の染色体を有するすべての細
胞を１つの管で単離することができ、また余分の染色体
を有するすべての細胞を第二の管で単離することができ
る。したがって細胞の多数分集団を互いに、また他の細
胞から分離することができる。次いで細胞のこのような
集団をさらに調べることができる。
【００７１】フローサイトメトリーは、本明細書にさら
に記載し、当業界で周知の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡ
ＣＳ）を用いて行うことができる。使用することができ
るＦＡＣＳ装置には、FACS-Calibur (Becton Dickinso
n; Mountain View, Calif.)およびコールターフローサ
イトメトリー (Hialeah, Fla., USA) EPICS Elite(登録
商標)がある。定量化は、CellQuest (Becton Dickinso
n; Mountain View, Calif.)、WinList (Verity Softwar
e House, Inc. Topsham, Maine)、Multicycle Software
(Phoenix Flow Systems, San Diego, Calif. USA)、お
よびFACSsan (Becton Dickinson; Mountain View, Cali
f.)のソフトウェアを用いて行うことができる。
に記載し、当業界で周知の蛍光標示式細胞分取器（ＦＡ
ＣＳ）を用いて行うことができる。使用することができ
るＦＡＣＳ装置には、FACS-Calibur (Becton Dickinso
n; Mountain View, Calif.)およびコールターフローサ
イトメトリー (Hialeah, Fla., USA) EPICS Elite(登録
商標)がある。定量化は、CellQuest (Becton Dickinso
n; Mountain View, Calif.)、WinList (Verity Softwar
e House, Inc. Topsham, Maine)、Multicycle Software
(Phoenix Flow Systems, San Diego, Calif. USA)、お
よびFACSsan (Becton Dickinson; Mountain View, Cali
f.)のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００７２】フローサイトメトリーは、各細胞と会合し
た発光物質の量およびその他のパラメータを測定し、例
えばヒストグラム、点図表、または分画表の形でアウト
プットを提供する。各細胞と会合した或る発光物質の量
は、その細胞の集団もさらされた別の発光物質の量、サ
イズ、粒状度、または固有の発光など、その細胞の他の
特性と比較することができる。
た発光物質の量およびその他のパラメータを測定し、例
えばヒストグラム、点図表、または分画表の形でアウト
プットを提供する。各細胞と会合した或る発光物質の量
は、その細胞の集団もさらされた別の発光物質の量、サ
イズ、粒状度、または固有の発光など、その細胞の他の
特性と比較することができる。
【００７３】細胞を含有する鞘液は一般に一滴ずつレー
ザーを通り抜けるので、さまざまな波長の光にさらされ
る。サイトメーターによって検出される各粒子は「事
象」と呼ばれる。事象が入射光の一部を透過または散乱
させる程度は、その事象、例えば会合した発光物質の特
徴の尺度を提供する。例えば事象は、おのずから発光す
るか、または事象に導入された蛍光物質によって生ずる
蛍光を発することができる。このような物質の例は、発
蛍光団と接合した抗体である。抗体は事象の構成成分に
付着し、発蛍光団は例えばサイトメーターの光電子倍増
管（ＰＭＴ）によって検出される周知の周波数で発光す
ることにより特定の周波数の入射光に応答する。放射ま
たは反射光の強度は、サイトメーターによって測定され
記憶される。
ザーを通り抜けるので、さまざまな波長の光にさらされ
る。サイトメーターによって検出される各粒子は「事
象」と呼ばれる。事象が入射光の一部を透過または散乱
させる程度は、その事象、例えば会合した発光物質の特
徴の尺度を提供する。例えば事象は、おのずから発光す
るか、または事象に導入された蛍光物質によって生ずる
蛍光を発することができる。このような物質の例は、発
蛍光団と接合した抗体である。抗体は事象の構成成分に
付着し、発蛍光団は例えばサイトメーターの光電子倍増
管（ＰＭＴ）によって検出される周知の周波数で発光す
ることにより特定の周波数の入射光に応答する。放射ま
たは反射光の強度は、サイトメーターによって測定され
記憶される。
【００７４】サイトメーターは、発光データをヒストグ
ラムにまとめる。ヒストグラムは一次元の形で報告する
ことができる。別法では、他の入射波長の結果得られる
放射光のヒストグラムと組み合わせることができる。こ
のような組合せは一般に、事象が碁盤目上にプロットさ
れ、また碁盤目の軸が測定される２つのパラメータに対
応する「点図表」として報告される。例えば、事象は約
４８８ｎｍの入射光にさらされ、前方光散乱および波長
５３０ｎｍにおける発光を検定することができる。この
波長は、フルオレセインイソチオシアナート（FITC）、
すなわちレーザー走査サイトメトリーに用いられる典型
的なフルオロクローマのピーク発光波長に対応する。
ラムにまとめる。ヒストグラムは一次元の形で報告する
ことができる。別法では、他の入射波長の結果得られる
放射光のヒストグラムと組み合わせることができる。こ
のような組合せは一般に、事象が碁盤目上にプロットさ
れ、また碁盤目の軸が測定される２つのパラメータに対
応する「点図表」として報告される。例えば、事象は約
４８８ｎｍの入射光にさらされ、前方光散乱および波長
５３０ｎｍにおける発光を検定することができる。この
波長は、フルオレセインイソチオシアナート（FITC）、
すなわちレーザー走査サイトメトリーに用いられる典型
的なフルオロクローマのピーク発光波長に対応する。
【００７５】レーザー走査型サイトメーターから得られ
る典型的な二次元点図表では、有糸分裂細胞を非有糸分
裂Ｇ２集団から分離することになる。有糸分裂集団は、
それらのまわりに「ゲート」を作り出すことによって、
すなわち有糸分裂細胞のDNA内容を確立するために受け
入れられるであろう最小および最大着色レベルに対する
閾値を設定することによって、お互いについて、また細
胞分裂しない集団のDNA内容について定量することがで
きる。
る典型的な二次元点図表では、有糸分裂細胞を非有糸分
裂Ｇ２集団から分離することになる。有糸分裂集団は、
それらのまわりに「ゲート」を作り出すことによって、
すなわち有糸分裂細胞のDNA内容を確立するために受け
入れられるであろう最小および最大着色レベルに対する
閾値を設定することによって、お互いについて、また細
胞分裂しない集団のDNA内容について定量することがで
きる。
【００７６】同様に細胞の集団の画分は、それらのDNA
内容に基づいて分離されることになる。ピークは、有糸
分裂細胞の正常な４ｎDNAの内容に対応するヨウ化プロ
ピジウムの着色において起こるはずである。ピークはま
た、多分倍数体細胞に対応する、半数体の数ｎのもっと
高い倍数で起こるかもしれない。ピークまたはバックグ
ラウンド上の平坦域はまた、半数体の数ｎの倍数に対応
しないヨウ化プロピジウムの着色レベルで起こるかもし
れない。これらの事象は、異数体細胞、あるいは余分の
染色体部分を持つか、または染色体の一部が欠落した細
胞に対応するかもしれない。ゲートは、実施例で述べる
ようにDNA内容がさまざまな範囲に分かれる細胞をDNA内
容のいろいろ異なる細胞から識別するように形成するこ
とができる。
内容に基づいて分離されることになる。ピークは、有糸
分裂細胞の正常な４ｎDNAの内容に対応するヨウ化プロ
ピジウムの着色において起こるはずである。ピークはま
た、多分倍数体細胞に対応する、半数体の数ｎのもっと
高い倍数で起こるかもしれない。ピークまたはバックグ
ラウンド上の平坦域はまた、半数体の数ｎの倍数に対応
しないヨウ化プロピジウムの着色レベルで起こるかもし
れない。これらの事象は、異数体細胞、あるいは余分の
染色体部分を持つか、または染色体の一部が欠落した細
胞に対応するかもしれない。ゲートは、実施例で述べる
ようにDNA内容がさまざまな範囲に分かれる細胞をDNA内
容のいろいろ異なる細胞から識別するように形成するこ
とができる。
【００７７】二色フロー分析において興味深い２つのマ
ーカーは、レーザー走査サイトメトリーでそれらの識別
を可能にするのに十分異なる蛍光特性を有することにな
る。例えばホスホヒストンH3（セリン１０）6G3単クロ
ーン抗体は、FITCと接合することができる。次いでこの
抗体で標識した細胞は、約４８８ｎｍの入射光に応答し
て約５２０ｎｍで発光することになる。これとは対照的
にヨウ化プロピジウムは、５６０ｎｍから６７０ｎｍま
で発光する。したがって、これらの範囲で感度がよいよ
うに同調させたＰＭＴは、H3−（セリン１０）6G3−FIT
Cおよびヨウ化プロピジウム由来のもう一方のものから
の２つのシグナルを識別することができる。
ーカーは、レーザー走査サイトメトリーでそれらの識別
を可能にするのに十分異なる蛍光特性を有することにな
る。例えばホスホヒストンH3（セリン１０）6G3単クロ
ーン抗体は、FITCと接合することができる。次いでこの
抗体で標識した細胞は、約４８８ｎｍの入射光に応答し
て約５２０ｎｍで発光することになる。これとは対照的
にヨウ化プロピジウムは、５６０ｎｍから６７０ｎｍま
で発光する。したがって、これらの範囲で感度がよいよ
うに同調させたＰＭＴは、H3−（セリン１０）6G3−FIT
Cおよびヨウ化プロピジウム由来のもう一方のものから
の２つのシグナルを識別することができる。
【００７８】次いで各事象は、H3−（セリン１０）6G3
着色の量に応じて「有糸分裂」または「非有糸分裂」の
いずれかとしてゲーティングすることができる。次いで
有糸分裂細胞を、細胞分裂しない集団中で着色するヨウ
化プロピジウムの量に応じて「正倍数体」、「二数
体」、「異数体」、「倍数体」、「過剰二数体」、「欠
落二数体」、またはその他としてゲーティングすること
ができる。
着色の量に応じて「有糸分裂」または「非有糸分裂」の
いずれかとしてゲーティングすることができる。次いで
有糸分裂細胞を、細胞分裂しない集団中で着色するヨウ
化プロピジウムの量に応じて「正倍数体」、「二数
体」、「異数体」、「倍数体」、「過剰二数体」、「欠
落二数体」、またはその他としてゲーティングすること
ができる。
【００７９】有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着色剤
を用いた有糸分裂細胞およびこれら細胞のDNA内容を識
別するためのその他の方法には、組織化学、免疫組織化
学、免疫細胞化学、および当業界で周知のその他の分子
生物学の手法がある。これらの手法はまた、フローサイ
トメトリー分析と組み合わせることができる。例えば有
糸分裂細胞は、フローサイトメトリーを介して他の細胞
から分離することができる。次いでこれらの細胞は、フ
ローサイトメトリーでない手法を用いてDNA内容を分析
することができる。
を用いた有糸分裂細胞およびこれら細胞のDNA内容を識
別するためのその他の方法には、組織化学、免疫組織化
学、免疫細胞化学、および当業界で周知のその他の分子
生物学の手法がある。これらの手法はまた、フローサイ
トメトリー分析と組み合わせることができる。例えば有
糸分裂細胞は、フローサイトメトリーを介して他の細胞
から分離することができる。次いでこれらの細胞は、フ
ローサイトメトリーでない手法を用いてDNA内容を分析
することができる。
【００８０】一実施形態においてこの方法は、細胞中の
数値染色体異常、例えば倍数性を発生させる薬品を特定
するために用いられる。このような薬品には、細胞毒性
薬品、例えば癌誘発性薬品がある。一実施形態において
この方法は、もしあれば娘細胞で、細胞が１または複数
の数値染色体異常の発生を誘発するのに十分な時間、細
胞を供試薬品と接触させ、続いて有糸分裂マーカーおよ
び定量用DNA着色剤で細胞を着色して数値染色体異常を
検出するために有糸分裂時のDNAの量を決定することを
含む方法であって、１または複数の娘細胞中の１または
複数の数値染色体異常の存在は、供試薬品が数値染色体
異常を誘発する薬品であることを示す。別の実施形態に
おいてこの方法は、もしあれば細胞で、薬品が１または
複数の数値染色体異常の発生を誘発するのに十分な時
間、細胞の集団を供試薬品と接触させ、続いて有糸分裂
マーカーおよび定量用DNA着色剤で細胞を着色して数値
染色体異常を検出するために有糸分裂時のDNAの量を決
定することを含む方法であって、１または複数の細胞中
の１または複数の数値染色体異常の存在は、供試薬品が
数値染色体異常を誘発する薬品であることを示す。本発
明の方法は、数値染色体異常の型の決定、すなわちその
異常が異数性または倍数性であるかどうか、あるいは染
色体の余分または欠落部分であるかどうかを決めること
を可能にする。
数値染色体異常、例えば倍数性を発生させる薬品を特定
するために用いられる。このような薬品には、細胞毒性
薬品、例えば癌誘発性薬品がある。一実施形態において
この方法は、もしあれば娘細胞で、細胞が１または複数
の数値染色体異常の発生を誘発するのに十分な時間、細
胞を供試薬品と接触させ、続いて有糸分裂マーカーおよ
び定量用DNA着色剤で細胞を着色して数値染色体異常を
検出するために有糸分裂時のDNAの量を決定することを
含む方法であって、１または複数の娘細胞中の１または
複数の数値染色体異常の存在は、供試薬品が数値染色体
異常を誘発する薬品であることを示す。別の実施形態に
おいてこの方法は、もしあれば細胞で、薬品が１または
複数の数値染色体異常の発生を誘発するのに十分な時
間、細胞の集団を供試薬品と接触させ、続いて有糸分裂
マーカーおよび定量用DNA着色剤で細胞を着色して数値
染色体異常を検出するために有糸分裂時のDNAの量を決
定することを含む方法であって、１または複数の細胞中
の１または複数の数値染色体異常の存在は、供試薬品が
数値染色体異常を誘発する薬品であることを示す。本発
明の方法は、数値染色体異常の型の決定、すなわちその
異常が異数性または倍数性であるかどうか、あるいは染
色体の余分または欠落部分であるかどうかを決めること
を可能にする。
【００８１】供試薬品は、小さな有機分子などの任意の
分子または錯体であることができる。例えば試験するこ
とができる薬品には、潜在的なアノイゲン性（aneugeni
city）を決定するための有望な治療薬が含まれる。例え
ば本発明の方法は、鉛の医薬用化合物のアノイゲン性を
試験するために使用することができる。次いでアノイゲ
ン性であることが分かった化合物を構造的に変えてその
アノイゲン性を低減することを試みることができ、その
化合物各々を本発明の方法に従ってそのアノイゲン性を
試験することができる。
分子または錯体であることができる。例えば試験するこ
とができる薬品には、潜在的なアノイゲン性（aneugeni
city）を決定するための有望な治療薬が含まれる。例え
ば本発明の方法は、鉛の医薬用化合物のアノイゲン性を
試験するために使用することができる。次いでアノイゲ
ン性であることが分かった化合物を構造的に変えてその
アノイゲン性を低減することを試みることができ、その
化合物各々を本発明の方法に従ってそのアノイゲン性を
試験することができる。
【００８２】本発明の方法はまた、細胞の集団中の１ま
たは複数の数値染色体異常を有する１または複数の細胞
を識別および／または検出するために使用することがで
きる。細胞の集団は、例えば被検者の生検材料であって
もよい。この方法は、異常細胞、例えば癌細胞の存在を
決定するために使用することができる。実際、非常に多
くの癌細胞が異数体または倍数体であることが知られて
いる。本発明の方法はまた、数値染色体異常と関連する
疾病の段階を決めるために使用することができ、そのよ
うな段階は数値染色体異常の存在と相関する。したがっ
て本発明の方法は、被検者中の病気の存在を診断するた
めに、または被検者が病気を発現しやすいかどうかを予
見するために使用することができる。
たは複数の数値染色体異常を有する１または複数の細胞
を識別および／または検出するために使用することがで
きる。細胞の集団は、例えば被検者の生検材料であって
もよい。この方法は、異常細胞、例えば癌細胞の存在を
決定するために使用することができる。実際、非常に多
くの癌細胞が異数体または倍数体であることが知られて
いる。本発明の方法はまた、数値染色体異常と関連する
疾病の段階を決めるために使用することができ、そのよ
うな段階は数値染色体異常の存在と相関する。したがっ
て本発明の方法は、被検者中の病気の存在を診断するた
めに、または被検者が病気を発現しやすいかどうかを予
見するために使用することができる。
【００８３】本発明の方法で診断することができる疾病
および染色体異常と関連することが示されている疾病の
例には、悪性組織球増加症、急性単球性白血病、および
大細胞系リンパ腫などの悪性組織球性障害などの腫瘍；
毛様細胞性白血病、Ｔ細胞ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、
Ｂ細胞系白血病、Ｔ細胞系白血病、急性リンパ球性白血
病、慢性リンパ球性白血病、乳細胞白血病、慢性骨髄性
白血病、急性骨髄性白血病、フィラデルフィア陰性骨髄
性白血病、フィラデルフィア陽性骨髄性白血病、急性骨
髄性単球白血病、急性非リンパ球性白血病、およびプラ
ズマ細胞性白血病などの白血病；リンパ管腫、リンパ管
筋腫、リンパ管筋腫症、およびリンパ管内腫などのリン
パ管の腫瘍；ホジキン病、免疫増殖性小腸障害、レッテ
レルシヴェ病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞系リンパ
腫、び慢性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、重度リンパ腫、
中度リンパ腫、大細胞型リンパ腫、低度リンパ腫、混合
型細胞リンパ腫、小細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、未
分化性リンパ腫、プラズマ細胞腫、多発性骨髄腫、細網
内皮増殖症、および乳細胞肉腫などのリンパ腫；腺様リ
ンパ腫、多形性腺腫、腺筋腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、
癌肉腫、胚腫、間葉腫、中胚葉混合型腫瘍、ミュラー混
合型腫瘍、筋上皮腫、腎芽細胞腫、ＷＡＧＲ症候群、中
胚葉腎腫、肺芽腫、杵状腫瘍、子宮内膜間質肉腫、およ
び胸腺腫などの混合型および複合腫瘍；血管脂肪腫、血
管筋脂肪腫、脂肪腫、脂肪肉腫、骨髄脂肪腫、軟骨芽細
胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、粘液腫、粘液肉腫、骨形成性
線維腫、骨の巨細胞腫瘍、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、骨軟
骨腫症、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、皮膚腺維腫、
線維性組織球腫、線維腫、癒着性線維腫、骨形成性線維
腫、腹部線維腫症、急速進行性線維腫症、線維肉腫、隆
起性皮膚線維肉腫、神経線維肉腫、筋線維腫症、腺線維
腫、ブレンネル腫瘍、線維腺腫、明細胞肉腫、小細胞肉
腫、滑液肉腫、顆粒細胞の腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉
腫、筋腫、横紋筋腫、筋肉腫、横紋筋肉腫、肺胞軟部肉
腫、血管肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、粘液肉腫、葉
状腫瘍、およびカポジ肉腫などの結合および軟組織の腫
瘍；胚癌、脊索腫、類皮腫、胚細胞腫、精上皮腫、中腎
腫、神経外胚葉の腫瘍、奇形癌、奇形腫、および栄養膜
の新生物などの胚芽細胞および胚の腫瘍；腺腫および腺
癌、基底細胞癌、基底細胞母斑症候群、基底有棘細胞
癌、毛質腫、浸潤性腺管の癌、非浸潤性腺管内の癌、乳
房のパジェット病、小葉の癌、骨髄癌、膵管の癌、乳房
外のパジェット病、管内乳頭腫、ムチン腺癌、粘膜表皮
の癌、印環細胞の癌、クルーケンベルグ腫、嚢胞腺癌、
嚢胞腺腫、腺腫様腫瘍、中皮腫、乳頭癌、扁平上皮細胞
の癌、いぼ状の癌、乳頭腫、逆方向性乳頭腫、および嚢
胞性中皮腫などの腺および上皮の腫瘍；神経膠腫、星状
細胞腫、脳室上衣腫、神経節膠腫、神経膠内腫、髄芽
腫、希突起膠腫、視神経膠腫、神経細胞腫、松果体腫、
および網膜芽腫などの感覚上皮の腫瘍；副副腎の腫瘍、
男性ホルモン産生細胞腫、顆粒膜細胞腫、ライディヒ細
胞腫、黄体腫、セルトーリ細胞腫、および性索間質腫な
どの性腺組織の腫瘍；髄膜腫、神経鞘腫、神経線維腫、
叢状神経線維腫、神経線維腫症、神経線維肉腫、神経
腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、および神経鞘粘液腫などの
神経組織の腫瘍；血管線維腫、被角血管腫、糸球腫、血
管腫、血管内皮腫、および血管周囲細胞腫などの脈管組
織の腫瘍；エナメル上皮腫、セメント質腫、石灰化歯原
性嚢胞、および歯牙腫などの歯原性腫瘍がある。
および染色体異常と関連することが示されている疾病の
例には、悪性組織球増加症、急性単球性白血病、および
大細胞系リンパ腫などの悪性組織球性障害などの腫瘍；
毛様細胞性白血病、Ｔ細胞ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、
Ｂ細胞系白血病、Ｔ細胞系白血病、急性リンパ球性白血
病、慢性リンパ球性白血病、乳細胞白血病、慢性骨髄性
白血病、急性骨髄性白血病、フィラデルフィア陰性骨髄
性白血病、フィラデルフィア陽性骨髄性白血病、急性骨
髄性単球白血病、急性非リンパ球性白血病、およびプラ
ズマ細胞性白血病などの白血病；リンパ管腫、リンパ管
筋腫、リンパ管筋腫症、およびリンパ管内腫などのリン
パ管の腫瘍；ホジキン病、免疫増殖性小腸障害、レッテ
レルシヴェ病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞系リンパ
腫、び慢性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、重度リンパ腫、
中度リンパ腫、大細胞型リンパ腫、低度リンパ腫、混合
型細胞リンパ腫、小細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、未
分化性リンパ腫、プラズマ細胞腫、多発性骨髄腫、細網
内皮増殖症、および乳細胞肉腫などのリンパ腫；腺様リ
ンパ腫、多形性腺腫、腺筋腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、
癌肉腫、胚腫、間葉腫、中胚葉混合型腫瘍、ミュラー混
合型腫瘍、筋上皮腫、腎芽細胞腫、ＷＡＧＲ症候群、中
胚葉腎腫、肺芽腫、杵状腫瘍、子宮内膜間質肉腫、およ
び胸腺腫などの混合型および複合腫瘍；血管脂肪腫、血
管筋脂肪腫、脂肪腫、脂肪肉腫、骨髄脂肪腫、軟骨芽細
胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、粘液腫、粘液肉腫、骨形成性
線維腫、骨の巨細胞腫瘍、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、骨軟
骨腫症、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、皮膚腺維腫、
線維性組織球腫、線維腫、癒着性線維腫、骨形成性線維
腫、腹部線維腫症、急速進行性線維腫症、線維肉腫、隆
起性皮膚線維肉腫、神経線維肉腫、筋線維腫症、腺線維
腫、ブレンネル腫瘍、線維腺腫、明細胞肉腫、小細胞肉
腫、滑液肉腫、顆粒細胞の腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉
腫、筋腫、横紋筋腫、筋肉腫、横紋筋肉腫、肺胞軟部肉
腫、血管肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、粘液肉腫、葉
状腫瘍、およびカポジ肉腫などの結合および軟組織の腫
瘍；胚癌、脊索腫、類皮腫、胚細胞腫、精上皮腫、中腎
腫、神経外胚葉の腫瘍、奇形癌、奇形腫、および栄養膜
の新生物などの胚芽細胞および胚の腫瘍；腺腫および腺
癌、基底細胞癌、基底細胞母斑症候群、基底有棘細胞
癌、毛質腫、浸潤性腺管の癌、非浸潤性腺管内の癌、乳
房のパジェット病、小葉の癌、骨髄癌、膵管の癌、乳房
外のパジェット病、管内乳頭腫、ムチン腺癌、粘膜表皮
の癌、印環細胞の癌、クルーケンベルグ腫、嚢胞腺癌、
嚢胞腺腫、腺腫様腫瘍、中皮腫、乳頭癌、扁平上皮細胞
の癌、いぼ状の癌、乳頭腫、逆方向性乳頭腫、および嚢
胞性中皮腫などの腺および上皮の腫瘍；神経膠腫、星状
細胞腫、脳室上衣腫、神経節膠腫、神経膠内腫、髄芽
腫、希突起膠腫、視神経膠腫、神経細胞腫、松果体腫、
および網膜芽腫などの感覚上皮の腫瘍；副副腎の腫瘍、
男性ホルモン産生細胞腫、顆粒膜細胞腫、ライディヒ細
胞腫、黄体腫、セルトーリ細胞腫、および性索間質腫な
どの性腺組織の腫瘍；髄膜腫、神経鞘腫、神経線維腫、
叢状神経線維腫、神経線維腫症、神経線維肉腫、神経
腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、および神経鞘粘液腫などの
神経組織の腫瘍；血管線維腫、被角血管腫、糸球腫、血
管腫、血管内皮腫、および血管周囲細胞腫などの脈管組
織の腫瘍；エナメル上皮腫、セメント質腫、石灰化歯原
性嚢胞、および歯牙腫などの歯原性腫瘍がある。
【００８４】異常倍数性または細胞のDNA質量と関連す
るその他の疾病には、クラインフェルター症候群；ター
ナー症候群；ダウン症候群；脆弱X染色体症候群；ハン
チントン症候群；トリプロX症候群；テトラX症候群；ペ
ンタX症候群；XYY症候群；７、１０、１１、１３、１
８、２１、X、およびYを含む任意の染色体のモノソーム
またはポリソーム；慢性関節リウマチ；および骨関節症
がある。
るその他の疾病には、クラインフェルター症候群；ター
ナー症候群；ダウン症候群；脆弱X染色体症候群；ハン
チントン症候群；トリプロX症候群；テトラX症候群；ペ
ンタX症候群；XYY症候群；７、１０、１１、１３、１
８、２１、X、およびYを含む任意の染色体のモノソーム
またはポリソーム；慢性関節リウマチ；および骨関節症
がある。
【００８５】本発明はさらに、細胞中の数値染色体異常
を検出するためのキットを提供する。このキットは、ア
ノイゲンである化合物を特定するための、または試料中
の数値染色体異常を識別するためのキットであってもよ
い。キットは、有糸分裂マーカーまたは定量用DNA着色
剤などの１種類のマーカーを含むことができる。好まし
い実施形態においてキットは、有糸分裂マーカーと定量
用DNA着色剤の両方を含む。キットが含むことができる
その他の構成要素には、補助のマーカー、検出試薬、緩
衝液、固定試薬、易透化試薬、ＲＮアーゼ、負または正
の対照標準、および生物学的試料を得るための装置が含
まれる。このキットはまた、取扱説明書を含む。本発明
はまた、有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着色剤を含
む組成物を提供する。
を検出するためのキットを提供する。このキットは、ア
ノイゲンである化合物を特定するための、または試料中
の数値染色体異常を識別するためのキットであってもよ
い。キットは、有糸分裂マーカーまたは定量用DNA着色
剤などの１種類のマーカーを含むことができる。好まし
い実施形態においてキットは、有糸分裂マーカーと定量
用DNA着色剤の両方を含む。キットが含むことができる
その他の構成要素には、補助のマーカー、検出試薬、緩
衝液、固定試薬、易透化試薬、ＲＮアーゼ、負または正
の対照標準、および生物学的試料を得るための装置が含
まれる。このキットはまた、取扱説明書を含む。本発明
はまた、有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着色剤を含
む組成物を提供する。
【００８６】本発明をさらに下記の実施例によって例示
するが、これらはいかなる形でも限定するものと解釈さ
れるべきではない。
するが、これらはいかなる形でも限定するものと解釈さ
れるべきではない。
【００８７】本発明の実施には、別に示されない場合
は、当業技術の範囲内にある従来の技術の細胞生物学、
細胞培養、分子生物学、形質転換生物学、微生物学、組
換えDNA、および免疫学を採用することになる。このよ
うな手法は文献の中によく説明されている。例えば、Sa
mbrook、Frisch、およびManiatis編、Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, 2nd Ed, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press: 1989); D. N. Glover編、DNA Clon
ing, Volumes I and II (1985); M. J. Gait編、Oligon
ucleotide Synthesis (1984); Mullis他の米国特許第4,
683,195号; B. D.HamesおよびS. J. Higgins編、Nuclei
c Acid Hybridization (1984); B. D. HamesおよびS.
J. Higgins編、Transcription And Translation (198
4); R. I. Freshney著、Culture Of Animal Cells ( Al
an R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enz
ymes (IRL Press, 1986); B. Perbal著、A Practical G
uide to Molecular Cloning (1984); 論文、The Treati
se, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.,
N. Y.); J. H. MillerおよびM. P. Calos編、Gene Tran
sfer Vectors For Mammalian Cells (Cold Spring Harb
or Laboratory, 1987); Wu等編、Methods In Enzymolog
y, Vols. 154 and 155; MayerおよびWalker編、Immunoc
hemical Methods In Cell And Molecular Biology (Aca
demic Press, London, 1987); D. M. WeirおよびC. C.
Blackwell編、Handbook Of Experimental Immunology,
Volumes I 〜 IV (1986) を参照されたい。
は、当業技術の範囲内にある従来の技術の細胞生物学、
細胞培養、分子生物学、形質転換生物学、微生物学、組
換えDNA、および免疫学を採用することになる。このよ
うな手法は文献の中によく説明されている。例えば、Sa
mbrook、Frisch、およびManiatis編、Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, 2nd Ed, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press: 1989); D. N. Glover編、DNA Clon
ing, Volumes I and II (1985); M. J. Gait編、Oligon
ucleotide Synthesis (1984); Mullis他の米国特許第4,
683,195号; B. D.HamesおよびS. J. Higgins編、Nuclei
c Acid Hybridization (1984); B. D. HamesおよびS.
J. Higgins編、Transcription And Translation (198
4); R. I. Freshney著、Culture Of Animal Cells ( Al
an R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enz
ymes (IRL Press, 1986); B. Perbal著、A Practical G
uide to Molecular Cloning (1984); 論文、The Treati
se, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.,
N. Y.); J. H. MillerおよびM. P. Calos編、Gene Tran
sfer Vectors For Mammalian Cells (Cold Spring Harb
or Laboratory, 1987); Wu等編、Methods In Enzymolog
y, Vols. 154 and 155; MayerおよびWalker編、Immunoc
hemical Methods In Cell And Molecular Biology (Aca
demic Press, London, 1987); D. M. WeirおよびC. C.
Blackwell編、Handbook Of Experimental Immunology,
Volumes I 〜 IV (1986) を参照されたい。
【００８８】
【実施例】本実施例は、有糸分裂特異的バイオマーカ
ー、すなわち細胞周期分析用ホスホヒストンH3（セリン
１０）6G3単クローン抗体（H3-P）およびDNA内容を評価
するためのヨウ化プロピジウムで着色した細胞への二色
フローサイトメトリー分析の使用について具体的に説明
する。H3-Pバイオマーカーは有糸分裂（Ｍ）集団を間期
集団（すなわちＧ0Ｇ1、Ｓ、およびＧ2）と識別するの
で、細胞の集団、例えば異数体および倍数体細胞の集団
の推定は、DNA内容分析を有糸分裂細胞に限定すること
によって容易に行うことができる。３種類の周知のアノ
イゲン（ノスカピン、コルセミド(登録商標)、およびグ
リセオフルビン）、倍数性だが異数性ではない周知の誘
発物質（サイトカシンＢ）、および異数性および／また
は倍数性を誘発すると思われない毒性化合物（シアン化
カリウム）で、精製した刺激ヒトリンパ球を２４時間処
理して得られるフローデータを下記に記述する。このデ
ータは、フローサイトメトリーによる、例えば異数性お
よび倍数性の数値染色体異常の有糸分裂集団の分析が、
これらの細胞の集団を分析するための標準的な手作業に
よる顕微鏡法に匹敵することを示している。加えて、こ
こに記述した方法を利用することにより、分析速度を劇
的に速め、データのばらつきを減らし、有糸分裂集団中
の数値異常の評価を全体的に改善することになる。
ー、すなわち細胞周期分析用ホスホヒストンH3（セリン
１０）6G3単クローン抗体（H3-P）およびDNA内容を評価
するためのヨウ化プロピジウムで着色した細胞への二色
フローサイトメトリー分析の使用について具体的に説明
する。H3-Pバイオマーカーは有糸分裂（Ｍ）集団を間期
集団（すなわちＧ0Ｇ1、Ｓ、およびＧ2）と識別するの
で、細胞の集団、例えば異数体および倍数体細胞の集団
の推定は、DNA内容分析を有糸分裂細胞に限定すること
によって容易に行うことができる。３種類の周知のアノ
イゲン（ノスカピン、コルセミド(登録商標)、およびグ
リセオフルビン）、倍数性だが異数性ではない周知の誘
発物質（サイトカシンＢ）、および異数性および／また
は倍数性を誘発すると思われない毒性化合物（シアン化
カリウム）で、精製した刺激ヒトリンパ球を２４時間処
理して得られるフローデータを下記に記述する。このデ
ータは、フローサイトメトリーによる、例えば異数性お
よび倍数性の数値染色体異常の有糸分裂集団の分析が、
これらの細胞の集団を分析するための標準的な手作業に
よる顕微鏡法に匹敵することを示している。加えて、こ
こに記述した方法を利用することにより、分析速度を劇
的に速め、データのばらつきを減らし、有糸分裂集団中
の数値異常の評価を全体的に改善することになる。
【００８９】実施例１：塩酸ノスカピン処理したヒトリ
ンパ球培養液の数値染色体異常のフローサイトメトリー
による評価 ヒトリンパ球は、健康なドナーからヘパリン添加したバ
キュテーナー管に静脈穿刺によって得た。
ンパ球培養液の数値染色体異常のフローサイトメトリー
による評価 ヒトリンパ球は、健康なドナーからヘパリン添加したバ
キュテーナー管に静脈穿刺によって得た。
【００９０】健康な男性および女性のボランティア（＜
４０歳）から末梢血液をヘパリン添加したバキュテーナ
ー中に集めた。全血液の約10mlを、無菌リン酸緩衝塩類
液〜10mlを含有するLymphoprep(商標)管（Nycomed Phar
ma AS Diagnostic, Oslo, Norway）に分配した。２００
０ｒｐｍで２０分間の遠心分離に続いて、リンパ球集団
を単離し、PBS中で洗浄した（１X）。単離したリンパ球
の原料培養液を、１０％ウシ胎児血清、100U/mlペニシ
リンと100ug/mlストレプトマイシン、2mMＬ−グルタミ
ン、および１．０％フィトヘマグルタニンＭ型（すべて
の試薬をGibco BRL Life Technologies, Inc., Grand I
sland, NYから入手した）を補ったウィリアムスＥ培養
液中で樹立した。原料培養液を５％ＣＯ2雰囲気に３７
℃で約４８時間保った。リンパ球をアノイゲン、すなわ
ち周知のアノイゲンであるノスカピン（Sigma Chemical
s）0〜100μg/mlで３７℃で２４時間処理した。
４０歳）から末梢血液をヘパリン添加したバキュテーナ
ー中に集めた。全血液の約10mlを、無菌リン酸緩衝塩類
液〜10mlを含有するLymphoprep(商標)管（Nycomed Phar
ma AS Diagnostic, Oslo, Norway）に分配した。２００
０ｒｐｍで２０分間の遠心分離に続いて、リンパ球集団
を単離し、PBS中で洗浄した（１X）。単離したリンパ球
の原料培養液を、１０％ウシ胎児血清、100U/mlペニシ
リンと100ug/mlストレプトマイシン、2mMＬ−グルタミ
ン、および１．０％フィトヘマグルタニンＭ型（すべて
の試薬をGibco BRL Life Technologies, Inc., Grand I
sland, NYから入手した）を補ったウィリアムスＥ培養
液中で樹立した。原料培養液を５％ＣＯ2雰囲気に３７
℃で約４８時間保った。リンパ球をアノイゲン、すなわ
ち周知のアノイゲンであるノスカピン（Sigma Chemical
s）0〜100μg/mlで３７℃で２４時間処理した。
【００９１】次いでノスカピン処理および非処理リンパ
球を１０００ｒｐｍで６分間遠心分離し、上澄み液を取
り除き、リンパ球をリン酸緩衝塩類液（PBS;GIBCO BR
L）5ml中に再度懸濁させた。次いでリンパ球を遠心分離
し、上澄み液を取り除き、細胞をPBS 0.5ml中に再度懸
濁させた。確実に単細胞懸濁液にするために細胞懸濁液
を9 in.パスツールピペット（Kimble Glass Inc.）を通
して完全に移し替えた。−２０℃（７０％）のエタノー
ル（体積約4.5ml）を入れた管を渦状運動させながら細
胞懸濁液を一滴ずつ加えた。蒸留水30mlをPhamco Produ
ctsから入手した２００プルーフエタノール70mlに加え
ることによりエタノール溶液を調製した。次いで細胞を
このエタノール中に−２０℃で少なくとも２４時間保管
した。
球を１０００ｒｐｍで６分間遠心分離し、上澄み液を取
り除き、リンパ球をリン酸緩衝塩類液（PBS;GIBCO BR
L）5ml中に再度懸濁させた。次いでリンパ球を遠心分離
し、上澄み液を取り除き、細胞をPBS 0.5ml中に再度懸
濁させた。確実に単細胞懸濁液にするために細胞懸濁液
を9 in.パスツールピペット（Kimble Glass Inc.）を通
して完全に移し替えた。−２０℃（７０％）のエタノー
ル（体積約4.5ml）を入れた管を渦状運動させながら細
胞懸濁液を一滴ずつ加えた。蒸留水30mlをPhamco Produ
ctsから入手した２００プルーフエタノール70mlに加え
ることによりエタノール溶液を調製した。次いで細胞を
このエタノール中に−２０℃で少なくとも２４時間保管
した。
【００９２】フロー分析用の試料および対照標準を下記
のように調製した。 （１） H3-P（ブランク）：−２０℃に少なくとも２４
時間保管した細胞を遠心分離し、上澄み液を取り除き、
細胞ペレットを０．１％PBS／トゥイーン80 1〜3ml中に
再度懸濁させた。この後者の溶液は、Sigma Chemicals
から入手したトゥイーン80 1mlをPBS 1000mlに混合す
ることによって調製した。細胞を室温で１０〜１５分間
インキュベートした。次いで細胞を遠心分離し、上澄み
液を取り除き、主要なH3-P抗体溶液（Cell Signaling T
echnology製品番号9706L、抗体は抗体36μlをPBS 14.4m
lに混ぜることにより１：４００に希釈した）400μl中
に細胞ペレットを再度懸濁させた。細胞を３７℃で４０
分間インキュベートした。PBS 5.0mlを細胞に加え、細
胞を遠心分離し、上澄み液を取り除き、細胞ペレットを
PBS 1 ml中に再度懸濁させた。この細胞は分析するまで
そのまま保管した。 （２） H3-P＋PI（レッド）：−２０℃に少なくとも２
４時間保管した細胞を、「ブランク」対照標準用に上述
のようにH3-P抗体で着色した。抗体と共に４０分間イン
キュベートした後に細胞にPBS 5.0mlを加え、細胞を遠
心分離し、上澄み液を取り除き、ヨウ化プロピジウム／
ＲＮアーゼＡ着色剤1ml中に細胞ペレットを再度懸濁さ
せた。この後者の溶液は、ＲＮアーゼＡ（BD Clontech
製品番号4030-1）4mgと、PBS 20mlに溶かしたヨウ化プ
ロピジウム（1mg/mlのMolecular Probes製品番号P-356
6）75μlを混合することによって調製した。この細胞は
分析するまで氷上に保管した。 （３） H3-P＋Alexa（グリーン）：−２０℃に少なく
とも２４時間保管した細胞を、「ブランク」対照標準用
に上述のようにH3-P抗体で着色した。抗体と共に４０分
間インキュベートした後に細胞にPBS 5.0mlを加え、細
胞を遠心分離し、上澄み液を取り除き、Alexa蛍光体４
８８／ヤギ抗マウスIgG（H+L）接合体（2mg/ml）400μl
中に細胞ペレットを再度懸濁させた。Alexa蛍光体試薬
は、PBS 13.5mlにAlexa（Molecular Probes製品番号A-1
1011）13.5μlを加え、それを光から遠ざけて保管する
ことによって調製した。細胞を３７℃で３０分間インキ
ュベートした。次いでPBS 5.0mlを細胞に加え、細胞を
遠心分離し、上澄み液を取り除き、細胞ペレットをPBS
1.0 ml中に再度懸濁させた。この細胞は分析するまで氷
上に保管した。 （４）対照標準および処理培養液用のH3-P＋Alexa＋PI
（ジュアルカラー）：−２０℃に少なくとも２４時間保
管した細胞を、H3-P＋Alexa（グリーン）で着色した細
胞用に上述のようにH3-P抗体とAlexa蛍光体で着色し
た。細胞をAlexa蛍光体と共に３７℃で３０分間インキ
ュベートした後に細胞にPBS 5mlを加え、細胞を遠心分
離し、上澄み液を取り除き、細胞ペレットをPI／ＲＮア
ーゼＡ着色剤1.0ml中に再度懸濁させた（上述と同
様）。この細胞は分析するまで氷上に保管した。
のように調製した。 （１） H3-P（ブランク）：−２０℃に少なくとも２４
時間保管した細胞を遠心分離し、上澄み液を取り除き、
細胞ペレットを０．１％PBS／トゥイーン80 1〜3ml中に
再度懸濁させた。この後者の溶液は、Sigma Chemicals
から入手したトゥイーン80 1mlをPBS 1000mlに混合す
ることによって調製した。細胞を室温で１０〜１５分間
インキュベートした。次いで細胞を遠心分離し、上澄み
液を取り除き、主要なH3-P抗体溶液（Cell Signaling T
echnology製品番号9706L、抗体は抗体36μlをPBS 14.4m
lに混ぜることにより１：４００に希釈した）400μl中
に細胞ペレットを再度懸濁させた。細胞を３７℃で４０
分間インキュベートした。PBS 5.0mlを細胞に加え、細
胞を遠心分離し、上澄み液を取り除き、細胞ペレットを
PBS 1 ml中に再度懸濁させた。この細胞は分析するまで
そのまま保管した。 （２） H3-P＋PI（レッド）：−２０℃に少なくとも２
４時間保管した細胞を、「ブランク」対照標準用に上述
のようにH3-P抗体で着色した。抗体と共に４０分間イン
キュベートした後に細胞にPBS 5.0mlを加え、細胞を遠
心分離し、上澄み液を取り除き、ヨウ化プロピジウム／
ＲＮアーゼＡ着色剤1ml中に細胞ペレットを再度懸濁さ
せた。この後者の溶液は、ＲＮアーゼＡ（BD Clontech
製品番号4030-1）4mgと、PBS 20mlに溶かしたヨウ化プ
ロピジウム（1mg/mlのMolecular Probes製品番号P-356
6）75μlを混合することによって調製した。この細胞は
分析するまで氷上に保管した。 （３） H3-P＋Alexa（グリーン）：−２０℃に少なく
とも２４時間保管した細胞を、「ブランク」対照標準用
に上述のようにH3-P抗体で着色した。抗体と共に４０分
間インキュベートした後に細胞にPBS 5.0mlを加え、細
胞を遠心分離し、上澄み液を取り除き、Alexa蛍光体４
８８／ヤギ抗マウスIgG（H+L）接合体（2mg/ml）400μl
中に細胞ペレットを再度懸濁させた。Alexa蛍光体試薬
は、PBS 13.5mlにAlexa（Molecular Probes製品番号A-1
1011）13.5μlを加え、それを光から遠ざけて保管する
ことによって調製した。細胞を３７℃で３０分間インキ
ュベートした。次いでPBS 5.0mlを細胞に加え、細胞を
遠心分離し、上澄み液を取り除き、細胞ペレットをPBS
1.0 ml中に再度懸濁させた。この細胞は分析するまで氷
上に保管した。 （４）対照標準および処理培養液用のH3-P＋Alexa＋PI
（ジュアルカラー）：−２０℃に少なくとも２４時間保
管した細胞を、H3-P＋Alexa（グリーン）で着色した細
胞用に上述のようにH3-P抗体とAlexa蛍光体で着色し
た。細胞をAlexa蛍光体と共に３７℃で３０分間インキ
ュベートした後に細胞にPBS 5mlを加え、細胞を遠心分
離し、上澄み液を取り除き、細胞ペレットをPI／ＲＮア
ーゼＡ着色剤1.0ml中に再度懸濁させた（上述と同
様）。この細胞は分析するまで氷上に保管した。
【００９３】これらの細胞を、下記のように較正したBe
cton Dickinson (BD) Flow Cytometer （４８８アルゴ
ンレーザー）を用いて分析した。シース液（FACSFlow、
Becton Dickinson製品番号340398）1mlをふた付の１２
×７５ｍｍのFalcon 製5mlポリスチレン丸底管（製品番
号35205）に加えた。シース液3mlを二番目の１２×７５
ｍｍのFalcon 製5mlポリスチレン丸底管に加えた。標識
していないCaliBRITE(商標)ビーズ（Becton Dickinson
製品番号349502）を、その滴状物を分注するに先立って
標識していないビーズを数回逆さにした後、各管に１滴
加えた。第一の管に管Ａのラベルを貼った。フルオレセ
インイソチオシアナート（FITC）およびCaliBRITE(商
標)フィコエリトリン（ＰＥ）ビーズの各１滴を第二の5
ml管（管Ｂ）に加えた。測定器を起動する前にシース貯
蔵槽を整理し、廃液槽を空にした。必要な場合は真空配
管にシース液を流した。サイトメーターのスイッチを入
れ、約10分間ウォームアップした。コンピュータのスイ
ッチを入れ、ソフトウェアFACSComp（Becton Dickinson
Apple Systems 7.5.3 Version 4.0）を開いた。
cton Dickinson (BD) Flow Cytometer （４８８アルゴ
ンレーザー）を用いて分析した。シース液（FACSFlow、
Becton Dickinson製品番号340398）1mlをふた付の１２
×７５ｍｍのFalcon 製5mlポリスチレン丸底管（製品番
号35205）に加えた。シース液3mlを二番目の１２×７５
ｍｍのFalcon 製5mlポリスチレン丸底管に加えた。標識
していないCaliBRITE(商標)ビーズ（Becton Dickinson
製品番号349502）を、その滴状物を分注するに先立って
標識していないビーズを数回逆さにした後、各管に１滴
加えた。第一の管に管Ａのラベルを貼った。フルオレセ
インイソチオシアナート（FITC）およびCaliBRITE(商
標)フィコエリトリン（ＰＥ）ビーズの各１滴を第二の5
ml管（管Ｂ）に加えた。測定器を起動する前にシース貯
蔵槽を整理し、廃液槽を空にした。必要な場合は真空配
管にシース液を流した。サイトメーターのスイッチを入
れ、約10分間ウォームアップした。コンピュータのスイ
ッチを入れ、ソフトウェアFACSComp（Becton Dickinson
Apple Systems 7.5.3 Version 4.0）を開いた。
【００９４】キャリブレーションプロセスは下記のよう
に行った。CaliBRITE(商標)ビーズのロット情報をセッ
トアップページに入力した。サイトメーターを高速に設
定し、待機状態から実行に切り替えた。サイトメーター
上の水を入れた5ml管を取り除き、標識していないビー
ズ（管Ａ）をサイトメーター上に置いた。標識していな
いビーズがＰＭＴを設定するように「実行」を選択し
た。急ぐ場合は管Ａを除去し管Ｂと交換した。混合ビー
ズが蛍光補償および感度試験を設定するように「実行」
を選択した。次いで管Ｂを取り除き、水を入れた5ml管
と交換した。サイトメーターを待機状態に切り替え、キ
ャリブレーションの記録をプリントアウトした。
に行った。CaliBRITE(商標)ビーズのロット情報をセッ
トアップページに入力した。サイトメーターを高速に設
定し、待機状態から実行に切り替えた。サイトメーター
上の水を入れた5ml管を取り除き、標識していないビー
ズ（管Ａ）をサイトメーター上に置いた。標識していな
いビーズがＰＭＴを設定するように「実行」を選択し
た。急ぐ場合は管Ａを除去し管Ｂと交換した。混合ビー
ズが蛍光補償および感度試験を設定するように「実行」
を選択した。次いで管Ｂを取り除き、水を入れた5ml管
と交換した。サイトメーターを待機状態に切り替え、キ
ャリブレーションの記録をプリントアウトした。
【００９５】サイトメーターを下記のように有糸分裂細
胞の存在の測定およびDNA分析用にセットアップした。
ソフトウェアCellQuest(商標)（Becton Dickinson, Ver
sion3.1）を開いた。選択項目「Choose Connect to Cyt
ometer」を獲得メニューから選択した。選択項目「Choo
se Acquisition & Storage」を獲得メニューから選択し
た。事象の数を10,000事象に設定した（デフォルト）。
次いで「Choose Acquisition & Storage」の選択を終了
した。選択項目「Choose Parameter Description」を獲
得メニューから選択した。Parameter Descriptionウィ
ンドウから、ファイルメニュー、ファイルの記憶場所、
およびパラメータラベルを選択した。事象速度、全事
象、および獲得中の経過時間を閲覧するために獲得メニ
ューから選択項目「Choose Counters」を選択した。各
パラメータに対する増幅モード（LinまたはLog）を選択
するためにサイトメーターメニューから選択項目「Choo
seDetectors / Amps」を選択した。試料の補償を調整す
るために選択項目「ChooseCompensation from the Cyto
meter」メニューを選択した。
胞の存在の測定およびDNA分析用にセットアップした。
ソフトウェアCellQuest(商標)（Becton Dickinson, Ver
sion3.1）を開いた。選択項目「Choose Connect to Cyt
ometer」を獲得メニューから選択した。選択項目「Choo
se Acquisition & Storage」を獲得メニューから選択し
た。事象の数を10,000事象に設定した（デフォルト）。
次いで「Choose Acquisition & Storage」の選択を終了
した。選択項目「Choose Parameter Description」を獲
得メニューから選択した。Parameter Descriptionウィ
ンドウから、ファイルメニュー、ファイルの記憶場所、
およびパラメータラベルを選択した。事象速度、全事
象、および獲得中の経過時間を閲覧するために獲得メニ
ューから選択項目「Choose Counters」を選択した。各
パラメータに対する増幅モード（LinまたはLog）を選択
するためにサイトメーターメニューから選択項目「Choo
seDetectors / Amps」を選択した。試料の補償を調整す
るために選択項目「ChooseCompensation from the Cyto
meter」メニューを選択した。
【００９６】獲得用点図表およびヒストグラム図表は下
記のように得た。「Dot Plots andHistogram Plots」を
ツールバーから選択し、下記のようにセットアップし
た。
記のように得た。「Dot Plots andHistogram Plots」を
ツールバーから選択し、下記のようにセットアップし
た。
【００９７】１．Acquisition Dot Plot: (X) PARAMETE
R = FSC-Height 1024 FSC (LIN目盛)、(Y) PARAMETER =
SSC-Height 1024 (LIN目盛)、ゲートなし、OPTIONSの
もとでSHOWを2000ドットに設定し、次いで終了した。
R = FSC-Height 1024 FSC (LIN目盛)、(Y) PARAMETER =
SSC-Height 1024 (LIN目盛)、ゲートなし、OPTIONSの
もとでSHOWを2000ドットに設定し、次いで終了した。
【００９８】２．Acquisition Histogram Plot: PARAME
TER = FL1-Height 1024 (H3-P)、LOG目盛、ゲートな
し、OPTIONSのもとでMANUAL SCALEを50に設定し、SHOW
を2000事象に設定し、次いで終了した。
TER = FL1-Height 1024 (H3-P)、LOG目盛、ゲートな
し、OPTIONSのもとでMANUAL SCALEを50に設定し、SHOW
を2000事象に設定し、次いで終了した。
【００９９】３．Acquisition Histogram Plot: PARAME
TER = FL2-Height 1024 (PI)、LOG目盛、ゲートなし、O
PTIONSのもとでMANUAL SCALEを50に設定し、SHOWを2000
事象に設定し、次いでクローズした。
TER = FL2-Height 1024 (PI)、LOG目盛、ゲートなし、O
PTIONSのもとでMANUAL SCALEを50に設定し、SHOWを2000
事象に設定し、次いでクローズした。
【０１００】４．Acquisition Histogram Plot: PARAME
TER = FL2-Area 1024 (PI)、ゲートなし、OPTIONSのも
とでMANUAL SCALEを200に設定し、SHOWを全事象に設定
し、次いでクローズした。
TER = FL2-Area 1024 (PI)、ゲートなし、OPTIONSのも
とでMANUAL SCALEを200に設定し、SHOWを全事象に設定
し、次いでクローズした。
【０１０１】５．Acquisition Dot Plot: (X) PARAMETE
R = FL2-Area 1024 (PI)、LIN目盛、(Y) PARAMETER = F
L2-Width 1024 (PI)、LIN目盛、ゲートなし（後に設
定）、OPTIONSのもとでSHOWを全ドットに設定し、次い
でクローズした。
R = FL2-Area 1024 (PI)、LIN目盛、(Y) PARAMETER = F
L2-Width 1024 (PI)、LIN目盛、ゲートなし（後に設
定）、OPTIONSのもとでSHOWを全ドットに設定し、次い
でクローズした。
【０１０２】６．Acquisition Dot Plot: (X) PARAMETE
R = FL2-Area 1024 (PI)、LIN目盛、(Y) PARAMETER = F
L1-Height 1024 (H3-P)、LOG目盛、ゲートなし（後に設
定）、OPTIONSのもとでSHOWを5000ドットに設定し、次
いでクローズした。
R = FL2-Area 1024 (PI)、LIN目盛、(Y) PARAMETER = F
L1-Height 1024 (H3-P)、LOG目盛、ゲートなし（後に設
定）、OPTIONSのもとでSHOWを5000ドットに設定し、次
いでクローズした。
【０１０３】試料は下記のように得た。サイトメーター
を速度LOWでRUNに設定し、次いでBLANK（色素なし）試
料をサイトメーター上に置いた。FSC/SSC点図表パネル
を見ながら、点図表上のBLANK細胞試料が角度約４５度
でウィンドウを斜めに横切るように見えるようになるま
で、検出器／増幅器ウィンドウ中のＦＳＣおよびＳＳＣ
パラメータに対して電圧設定を修正した。細胞試料の基
線は、できるだけ０軸交点に近接して位置決めした。電
圧は、すべてのまたは大部分の細胞がフィールドに現れ
るまで調整を続けた。次いでFL1-Height Histogramを閲
覧し、BLANK細胞試料がヒストグラムパネルの左側の四
半分に見えるまでFL1検出器の電圧を上下させた。電圧
を調整して細胞試料を図表の０軸切片にできるだけ近接
させた（ピークを軸の左側へ限度いっぱい持って行っ
た）。次いで、FL2-Height Histogramを閲覧し、BLANK
細胞試料がヒストグラムパネルの左側の四半分に見える
までFL2検出器の電圧を上下させた。電圧を調整して細
胞試料を図表の０軸切片にできるだけ近接させた（ピー
クを軸の左側へ限度いっぱい持って行った）。
を速度LOWでRUNに設定し、次いでBLANK（色素なし）試
料をサイトメーター上に置いた。FSC/SSC点図表パネル
を見ながら、点図表上のBLANK細胞試料が角度約４５度
でウィンドウを斜めに横切るように見えるようになるま
で、検出器／増幅器ウィンドウ中のＦＳＣおよびＳＳＣ
パラメータに対して電圧設定を修正した。細胞試料の基
線は、できるだけ０軸交点に近接して位置決めした。電
圧は、すべてのまたは大部分の細胞がフィールドに現れ
るまで調整を続けた。次いでFL1-Height Histogramを閲
覧し、BLANK細胞試料がヒストグラムパネルの左側の四
半分に見えるまでFL1検出器の電圧を上下させた。電圧
を調整して細胞試料を図表の０軸切片にできるだけ近接
させた（ピークを軸の左側へ限度いっぱい持って行っ
た）。次いで、FL2-Height Histogramを閲覧し、BLANK
細胞試料がヒストグラムパネルの左側の四半分に見える
までFL2検出器の電圧を上下させた。電圧を調整して細
胞試料を図表の０軸切片にできるだけ近接させた（ピー
クを軸の左側へ限度いっぱい持って行った）。
【０１０４】BLANK試料を除去し、GREEN（Alexa蛍光
体）試料と交換した。FL2-Height Histogramを閲覧しな
がら、FL1検出器の電圧を調整して細胞試料ピークを図
表の０軸切片に近接するようにした（細胞ピーク全体が
図表上に見えるべきである）。FL2-Height Histogramを
閲覧しながら必要に応じて補償（FL2-％FL1）を調整し
た。ヒストグラム中にはピークは１つだけあり、そのピ
ークは０軸切片にきわめて近接した。小さな第二のピー
クが存在する場合、第二のピークが消えるまで補償値を
増加させた。
体）試料と交換した。FL2-Height Histogramを閲覧しな
がら、FL1検出器の電圧を調整して細胞試料ピークを図
表の０軸切片に近接するようにした（細胞ピーク全体が
図表上に見えるべきである）。FL2-Height Histogramを
閲覧しながら必要に応じて補償（FL2-％FL1）を調整し
た。ヒストグラム中にはピークは１つだけあり、そのピ
ークは０軸切片にきわめて近接した。小さな第二のピー
クが存在する場合、第二のピークが消えるまで補償値を
増加させた。
【０１０５】GREEN試料を除去し、RED（PI）試料と交換
した。FL2-Height Histogramを閲覧しながら (X) 軸上
で１０3個にわたってRED細胞試料のピークが生ずるよう
にFL2検出器の電圧を調整した。この調整は、FL2-Area
HistogramおよびFL2-Area / FL2-Width点図表中の(X)
軸点200にわたってRED細胞試料のG1ピークを生じた。FL
1-Height Histogramを閲覧しながら必要に応じて補償
（FL1-％FL2）を調整した。ヒストグラム中にはピーク
は１つだけあり、そのピークは０軸切片に近接する。小
さな第二のピークが存在する場合、第二のピークが消え
るまで補償値を増加させた。
した。FL2-Height Histogramを閲覧しながら (X) 軸上
で１０3個にわたってRED細胞試料のピークが生ずるよう
にFL2検出器の電圧を調整した。この調整は、FL2-Area
HistogramおよびFL2-Area / FL2-Width点図表中の(X)
軸点200にわたってRED細胞試料のG1ピークを生じた。FL
1-Height Histogramを閲覧しながら必要に応じて補償
（FL1-％FL2）を調整した。ヒストグラム中にはピーク
は１つだけあり、そのピークは０軸切片に近接する。小
さな第二のピークが存在する場合、第二のピークが消え
るまで補償値を増加させた。
【０１０６】RED（PI）試料を除去し、DUAL COLOR (Ale
xaおよびPI) 試料と交換した。FL2-Area Histogram中の
X軸の整数200にわたってDUAL COLOR細胞試料のG1ピーク
を生じるように電圧を最終調整した。これは、FL2-Area
/ FL2-Width点図表上に点200にわたって細胞試料をも
たらした。その周期集団（この集団は非処理細胞におい
てはX軸上で200から400の範囲に及ぶ）を特定するため
に2000〜4000個の細胞をセットアップモードで獲得し
た。周期性集団のわずか左寄りで出発し、次いで第二Y
軸の点図表の終了ゲートのずっと右側の領域まで続ける
ことによってDNA分布を測定するためのゲートを設定し
た。このゲートを点図表の第二Y軸まで延長することに
より、４ｎDNAよりも大きな細胞を収容することができ
た。FL2-Area（PI）／FL1-Height（H3-P）Acquisition
Dot Plotを選択し、Format Dot Plotをツールバーから
選んだ。Gate G1=R2を選択した。この調整は、獲得プロ
セス中の有糸分裂細胞の閲覧を可能にした。有糸分裂集
団とG2集団は両方とも４ｎDNAを含有するので、有糸分
裂集団は直接G2集団の上方に現れる。
xaおよびPI) 試料と交換した。FL2-Area Histogram中の
X軸の整数200にわたってDUAL COLOR細胞試料のG1ピーク
を生じるように電圧を最終調整した。これは、FL2-Area
/ FL2-Width点図表上に点200にわたって細胞試料をも
たらした。その周期集団（この集団は非処理細胞におい
てはX軸上で200から400の範囲に及ぶ）を特定するため
に2000〜4000個の細胞をセットアップモードで獲得し
た。周期性集団のわずか左寄りで出発し、次いで第二Y
軸の点図表の終了ゲートのずっと右側の領域まで続ける
ことによってDNA分布を測定するためのゲートを設定し
た。このゲートを点図表の第二Y軸まで延長することに
より、４ｎDNAよりも大きな細胞を収容することができ
た。FL2-Area（PI）／FL1-Height（H3-P）Acquisition
Dot Plotを選択し、Format Dot Plotをツールバーから
選んだ。Gate G1=R2を選択した。この調整は、獲得プロ
セス中の有糸分裂細胞の閲覧を可能にした。有糸分裂集
団とG2集団は両方とも４ｎDNAを含有するので、有糸分
裂集団は直接G2集団の上方に現れる。
【０１０７】測定器のセットアップモードを獲得モード
に戻した。DNA分析の獲得が開始され、10,000個のゲー
トされていない細胞が獲得された。処理試料が獲得され
るに従って、（X）軸上のG1ピークの移動および周期性
細胞の集団の広がりが観察され、その結果細胞の周期性
集団が点図表の端からそれる場合には、異数性および倍
数性獲得（DNA獲得に続く）のためにあとでFL2電圧を下
げた。FL2電圧は、異数性および倍数性獲得のために試
料ごとに必要に応じて（すなわち、FL2-AのX軸の200上
にG1ピークを持ち続けるように）最適化した。50,000個
のゲートされていない細胞が各試料から獲得された。デ
ータはリストモード・フォーマット中にセーブされた。
に戻した。DNA分析の獲得が開始され、10,000個のゲー
トされていない細胞が獲得された。処理試料が獲得され
るに従って、（X）軸上のG1ピークの移動および周期性
細胞の集団の広がりが観察され、その結果細胞の周期性
集団が点図表の端からそれる場合には、異数性および倍
数性獲得（DNA獲得に続く）のためにあとでFL2電圧を下
げた。FL2電圧は、異数性および倍数性獲得のために試
料ごとに必要に応じて（すなわち、FL2-AのX軸の200上
にG1ピークを持ち続けるように）最適化した。50,000個
のゲートされていない細胞が各試料から獲得された。デ
ータはリストモード・フォーマット中にセーブされた。
【０１０８】リンパ球中の異数性および倍数性細胞の存
在は、下記のように決定された。ソフトウェアCellQues
t(商標)を開き、点図表を作るためにツールバーからダ
イアログボックスをPLOTおよびOPENした。FILEを選択し
データファイルを開いた。「周期性細胞の集団」を特定
するためにPARAMETERSをセットアップした。すなわち、
（X）= FL2-Area 1024（PI）および（Y）＝FL2-Width 1
024、OPTIONSはSHOW 100%を示し、ゲートなし。点図表
を用紙の幅に拡大した。周期性集団のわずか左寄りで出
発し、次いで第二Y軸でゲートを終了する点図表のずっ
と右側の領域まで続けることによってDNA分布のための
ゲートを設定した。このゲートを点図表の第二Y軸まで
延長することにより、４ｎDNAよりも大きな細胞を収容
することができた（図１参照）。点図表を作るためにツ
ールバーからダイアログボックスのPLOTおよびOPENが選
択された。「周期性細胞の集団」を特定するためにPARA
METERSを設定した。すなわち、（X）= FL2-Area 1024
（PI）および（Y）＝FL1-Height 1024（H3-P）、OPTION
SはSHOW 100%を示し、GATEはG1=R1に設定した。
在は、下記のように決定された。ソフトウェアCellQues
t(商標)を開き、点図表を作るためにツールバーからダ
イアログボックスをPLOTおよびOPENした。FILEを選択し
データファイルを開いた。「周期性細胞の集団」を特定
するためにPARAMETERSをセットアップした。すなわち、
（X）= FL2-Area 1024（PI）および（Y）＝FL2-Width 1
024、OPTIONSはSHOW 100%を示し、ゲートなし。点図表
を用紙の幅に拡大した。周期性集団のわずか左寄りで出
発し、次いで第二Y軸でゲートを終了する点図表のずっ
と右側の領域まで続けることによってDNA分布のための
ゲートを設定した。このゲートを点図表の第二Y軸まで
延長することにより、４ｎDNAよりも大きな細胞を収容
することができた（図１参照）。点図表を作るためにツ
ールバーからダイアログボックスのPLOTおよびOPENが選
択された。「周期性細胞の集団」を特定するためにPARA
METERSを設定した。すなわち、（X）= FL2-Area 1024
（PI）および（Y）＝FL1-Height 1024（H3-P）、OPTION
SはSHOW 100%を示し、GATEはG1=R1に設定した。
【０１０９】目安として間期細胞を用いて、G0G1〜S相
域より上の有糸分裂細胞域にわたって第一ゲートを設定
した。次いで第一ゲートの端から開始して、G2域（すな
わち、有糸分裂細胞の最も大きな集団である４ｎDNA）
より上の有糸分裂細胞にわたって第二ゲートを設定し
た。第二ゲートの端から開始して、次の細胞周期の推定
G0G1〜S相域にわたって第三ゲートを設定した。この範
囲を推定するためには、G 2（X）軸の値を目安として使
用し、その値を2倍することにより次の周期のおおよそ
のG2域を特定する。例えばG2が（X）軸（第一周期）上
の400に位置するならば、周期性G2細胞の第二集団はそ
の（X）軸上のほぼ800のところに現れるはずである（図
１−２参照）。ツールバーからSTATSを選択し、REGION
GATEを選択した。ソフトウェアは自動的に点図表の各ゲ
ートされた領域のゲートされた集団％を計算する。
域より上の有糸分裂細胞域にわたって第一ゲートを設定
した。次いで第一ゲートの端から開始して、G2域（すな
わち、有糸分裂細胞の最も大きな集団である４ｎDNA）
より上の有糸分裂細胞にわたって第二ゲートを設定し
た。第二ゲートの端から開始して、次の細胞周期の推定
G0G1〜S相域にわたって第三ゲートを設定した。この範
囲を推定するためには、G 2（X）軸の値を目安として使
用し、その値を2倍することにより次の周期のおおよそ
のG2域を特定する。例えばG2が（X）軸（第一周期）上
の400に位置するならば、周期性G2細胞の第二集団はそ
の（X）軸上のほぼ800のところに現れるはずである（図
１−２参照）。ツールバーからSTATSを選択し、REGION
GATEを選択した。ソフトウェアは自動的に点図表の各ゲ
ートされた領域のゲートされた集団％を計算する。
【０１１０】Regions (ID): Gate (1): Region 1 (R1)
＝周期性細胞集団 Gate (2): Region 2 (R2) ＝二倍体欠損有糸分裂集団 Gate (3): Region 3 (R3) ＝正常な有糸分裂細胞 Gate (4): Region 4 (R4) ＝二倍体過剰有糸分裂集団 Gate (5): Region 5 (R5) ＝倍数体有糸分裂集団 図４は、領域の統計の例である。
＝周期性細胞集団 Gate (2): Region 2 (R2) ＝二倍体欠損有糸分裂集団 Gate (3): Region 3 (R3) ＝正常な有糸分裂細胞 Gate (4): Region 4 (R4) ＝二倍体過剰有糸分裂集団 Gate (5): Region 5 (R5) ＝倍数体有糸分裂集団 図４は、領域の統計の例である。
【０１１１】領域：
R１＝領域１；ゲートされた間期細胞
R２＝領域２；或るDNA内容（＞２ｎだが＜４ｎのDNA）
を有するゲートされた有糸分裂細胞（二倍体欠損細胞集
団） R３＝領域３；４ｎのDNA内容を有するゲートされた有糸
分裂細胞（正常な細胞集団） R４＝領域４；＞４ｎだが＜８ｎのDNA内容を有するゲー
トされた有糸分裂細胞（二倍体過剰細胞集団） R５＝領域５；８ｎのDNA内容を有するゲートされた有糸
分裂細胞（倍数体細胞集団） 計算： １．二倍体欠損細胞の頻度（％）
を有するゲートされた有糸分裂細胞（二倍体欠損細胞集
団） R３＝領域３；４ｎのDNA内容を有するゲートされた有糸
分裂細胞（正常な細胞集団） R４＝領域４；＞４ｎだが＜８ｎのDNA内容を有するゲー
トされた有糸分裂細胞（二倍体過剰細胞集団） R５＝領域５；８ｎのDNA内容を有するゲートされた有糸
分裂細胞（倍数体細胞集団） 計算： １．二倍体欠損細胞の頻度（％）
【０１１２】
【数１】
【０１１３】２．二倍体過剰細胞の頻度（％）
【０１１４】
【数２】
【０１１５】３．倍数体細胞の頻度（％）
【０１１６】
【数３】
【０１１７】DNAは下記のように分析した。ソフトウェ
アMODFIT LT（Verity Software House, Version 3.0 To
psham, Maine）をこの目的に使用した。ツールバーから
FILEを選び、データファイルを選択した。Choose Param
eter for AnalysisのダイアログボックスでP6 FL2 Aを
選んだ。Choose Gateのダイアログボックスでボックス
をノーチェックのままにした。ツールボックスからMOD
を選んだ。Edit Properties for Manual Analysisのダ
イアログボックスには下記のような選択対象があった。
すなわち、自己残屑（チェック）、自己凝集物（チェッ
ク）、アポトーシス（ノーチェック）、直線性は2.00に
設定、標準（０）、モデルテンプレート＝二倍体、レン
ジポジションは「Compute Range Position」に設定すべ
きである。ツールバー上のRANGEボタンは押されている
（呼び出されている）ように見えた。G1および G2ピー
クは自動的に識別された（図５−６参照）。FITをツー
ルバー上で選び、ソフトウェアMODFIT LTによりG1相、G
2相、およびＳ相細胞％を決定した（図５−６参照）。
アMODFIT LT（Verity Software House, Version 3.0 To
psham, Maine）をこの目的に使用した。ツールバーから
FILEを選び、データファイルを選択した。Choose Param
eter for AnalysisのダイアログボックスでP6 FL2 Aを
選んだ。Choose Gateのダイアログボックスでボックス
をノーチェックのままにした。ツールボックスからMOD
を選んだ。Edit Properties for Manual Analysisのダ
イアログボックスには下記のような選択対象があった。
すなわち、自己残屑（チェック）、自己凝集物（チェッ
ク）、アポトーシス（ノーチェック）、直線性は2.00に
設定、標準（０）、モデルテンプレート＝二倍体、レン
ジポジションは「Compute Range Position」に設定すべ
きである。ツールバー上のRANGEボタンは押されている
（呼び出されている）ように見えた。G1および G2ピー
クは自動的に識別された（図５−６参照）。FITをツー
ルバー上で選び、ソフトウェアMODFIT LTによりG1相、G
2相、およびＳ相細胞％を決定した（図５−６参照）。
【０１１８】異数性誘発剤のノスカピンで処理したヒト
リンパ球のフローサイトメトリー分析の結果を図３−４
に示す。負の対照標準、すなわちノスカピンで処理して
いないリンパ球を図１に示す。結果はノスカピンで処理
した細胞の集団中には、二倍体欠損細胞（Ｒ２象限中
に）、正常な二倍体細胞（Ｒ３象限中に）、二倍体過剰
細胞（Ｒ４象限中に）、および倍数体細胞（Ｒ５象限中
に）が存在することを示す。異常細胞（すなわち、Ｒ
２、Ｒ４、およびＲ５中に観察される細胞）の増加は、
ノスカピンで処理していなかった細胞の集団中には観察
されなかった。二倍体欠損細胞は正常な細胞よりもDNA
が少ない細胞であるのに対し、二倍体過剰細胞は正常な
細胞よりもDNAが多い細胞である。
リンパ球のフローサイトメトリー分析の結果を図３−４
に示す。負の対照標準、すなわちノスカピンで処理して
いないリンパ球を図１に示す。結果はノスカピンで処理
した細胞の集団中には、二倍体欠損細胞（Ｒ２象限中
に）、正常な二倍体細胞（Ｒ３象限中に）、二倍体過剰
細胞（Ｒ４象限中に）、および倍数体細胞（Ｒ５象限中
に）が存在することを示す。異常細胞（すなわち、Ｒ
２、Ｒ４、およびＲ５中に観察される細胞）の増加は、
ノスカピンで処理していなかった細胞の集団中には観察
されなかった。二倍体欠損細胞は正常な細胞よりもDNA
が少ない細胞であるのに対し、二倍体過剰細胞は正常な
細胞よりもDNAが多い細胞である。
【０１１９】したがってこの実施例は、有糸分裂マーカ
ーで着色した細胞および定量用DNA着色剤で着色した細
胞のフローサイトメトリー分析が、異常な数値染色体内
容を有する細胞をはっきりと識別することを実証する。
ーで着色した細胞および定量用DNA着色剤で着色した細
胞のフローサイトメトリー分析が、異常な数値染色体内
容を有する細胞をはっきりと識別することを実証する。
【０１２０】実施例２：ノスカピン処理した培養ヒトリ
ンパ球中の染色体異常頻度のフローサイトメトリー分析
および手作業による分析の比較 本実施例は、本明細書に記述した数値染色体異常のサイ
トメトリーによる分析が、数値染色体異常の古典的な手
作業による分析と同様の結果をもたらすことを実証す
る。
ンパ球中の染色体異常頻度のフローサイトメトリー分析
および手作業による分析の比較 本実施例は、本明細書に記述した数値染色体異常のサイ
トメトリーによる分析が、数値染色体異常の古典的な手
作業による分析と同様の結果をもたらすことを実証す
る。
【０１２１】前述のヒトリンパ球および前述のノスカピ
ン処理または非処理ヒトリンパ球を、実施例１で得られ
た数値染色体異常（すなわち倍数性）を有する細胞数と
比較するために数値染色体異常の手作業による分析にか
けた。手作業による分析の場合、細胞試料を6分間、100
0 rpmで遠心分離した。上澄み液を取り除き、細胞ペレ
ットを予加温（３７℃）した１％クエン酸ナトリウム5m
l中に懸濁させた。後者溶液は、蒸留水100ml中にクエン
酸（Sigma Chemicals）1gを混ぜることにより調製し
た。この細胞を前述のように直ちに遠心分離した。上澄
み液を取り除き、ペレットを４℃の固定液（メタノー
ル：酢酸が３：１）5ml中で勢いよく再度懸濁させた。
次いでこの細胞を前述のように遠心分離し、ペレットを
４℃の固定液（メタノール：酢酸が３：１）5ml中に再
度懸濁させた。次いでこの細胞を−２０℃で一晩、また
はスライドの調製まで保管した。
ン処理または非処理ヒトリンパ球を、実施例１で得られ
た数値染色体異常（すなわち倍数性）を有する細胞数と
比較するために数値染色体異常の手作業による分析にか
けた。手作業による分析の場合、細胞試料を6分間、100
0 rpmで遠心分離した。上澄み液を取り除き、細胞ペレ
ットを予加温（３７℃）した１％クエン酸ナトリウム5m
l中に懸濁させた。後者溶液は、蒸留水100ml中にクエン
酸（Sigma Chemicals）1gを混ぜることにより調製し
た。この細胞を前述のように直ちに遠心分離した。上澄
み液を取り除き、ペレットを４℃の固定液（メタノー
ル：酢酸が３：１）5ml中で勢いよく再度懸濁させた。
次いでこの細胞を前述のように遠心分離し、ペレットを
４℃の固定液（メタノール：酢酸が３：１）5ml中に再
度懸濁させた。次いでこの細胞を−２０℃で一晩、また
はスライドの調製まで保管した。
【０１２２】スライドは下記のように調製した。細胞を
前述のように遠心分離し、次いで上澄み液を流し出し
た。ペレットを新鮮な固定液約2ml中に再度懸濁させ
た。懸濁液を冷やした湿潤スライド上に滴下し、このス
ライドを強熱して細胞をスライドに固定した。スライド
を２〜１０％ギームザ（GIBCO, BRL）溶液中で着色し
た。
前述のように遠心分離し、次いで上澄み液を流し出し
た。ペレットを新鮮な固定液約2ml中に再度懸濁させ
た。懸濁液を冷やした湿潤スライド上に滴下し、このス
ライドを強熱して細胞をスライドに固定した。スライド
を２〜１０％ギームザ（GIBCO, BRL）溶液中で着色し
た。
【０１２３】倍数体指標は、低倍率下（明視野）で8n有
糸分裂細胞の頻度について1000個の連続する有糸分裂細
胞に規則正しく点数を付けることにより決定した。
糸分裂細胞の頻度について1000個の連続する有糸分裂細
胞に規則正しく点数を付けることにより決定した。
【０１２４】図７に示す結果は、手作業でカウントした
場合とフローサイトメトリーによる評価によりカウント
した場合でノスカピンの各濃度でカウントされた倍数体
の数が似ていることを示している。したがってフローサ
イトメトリー分析は、倍数体細胞をカウントする古典的
な方法で得られるデータと本質的に同一のデータを提供
する。
場合とフローサイトメトリーによる評価によりカウント
した場合でノスカピンの各濃度でカウントされた倍数体
の数が似ていることを示している。したがってフローサ
イトメトリー分析は、倍数体細胞をカウントする古典的
な方法で得られるデータと本質的に同一のデータを提供
する。
【０１２５】実施例３：KCN処理したヒトリンパ球中の
数値染色体異常のフローサイトメトリー分析 前述のように得られたヒトリンパ球を、KCN（FLUKA Che
micals）0〜0.04μg/mlの存在または不在下で３７℃で
２４時間〜インキュベートした。図８に示す結果は、KC
Nが数値異常を誘発しないことが知られているので、予
想されるように異常細胞（二倍体欠損、二倍体過剰、ま
たは倍数体）のパーセントが最少限であることを示す。
数値染色体異常のフローサイトメトリー分析 前述のように得られたヒトリンパ球を、KCN（FLUKA Che
micals）0〜0.04μg/mlの存在または不在下で３７℃で
２４時間〜インキュベートした。図８に示す結果は、KC
Nが数値異常を誘発しないことが知られているので、予
想されるように異常細胞（二倍体欠損、二倍体過剰、ま
たは倍数体）のパーセントが最少限であることを示す。
【０１２６】実施例４：サイトカラシンＢ処理したヒト
リンパ球中の数値染色体異常のフローサイトメトリー分
析 前述のように得られたヒトリンパ球を、サイトカラシン
Ｂ（Sigma Chemicals）0〜6μg/mlの存在または不在下
で３７℃で２４時間インキュベートした。図９に示す結
果は、サイトカラシンＢが主に倍数性を誘発することが
知られているので、予想されるように二倍体過剰細胞の
パーセントが最少限であるであるのに対し、二倍体欠損
細胞および倍数体細胞の数が高いことを示している。
リンパ球中の数値染色体異常のフローサイトメトリー分
析 前述のように得られたヒトリンパ球を、サイトカラシン
Ｂ（Sigma Chemicals）0〜6μg/mlの存在または不在下
で３７℃で２４時間インキュベートした。図９に示す結
果は、サイトカラシンＢが主に倍数性を誘発することが
知られているので、予想されるように二倍体過剰細胞の
パーセントが最少限であるであるのに対し、二倍体欠損
細胞および倍数体細胞の数が高いことを示している。
【０１２７】実施例５：コルセミド(登録商標)処理した
ヒトリンパ球中の数値染色体異常のフローサイトメトリ
ー分析 前述のように得られたヒトリンパ球を、コルセミド(登
録商標)（GIBCO BRL）0〜0.04μg/mlの存在または不在
下で３７℃で２４時間〜インキュベートした。図１０に
示す結果は、コルセミド(登録商標)が異数性を誘発する
ことが知られているので、予想されるように二倍体過剰
細胞および二倍体欠損細胞のパーセントが増加し、倍数
体細胞の数が高いことを示している。
ヒトリンパ球中の数値染色体異常のフローサイトメトリ
ー分析 前述のように得られたヒトリンパ球を、コルセミド(登
録商標)（GIBCO BRL）0〜0.04μg/mlの存在または不在
下で３７℃で２４時間〜インキュベートした。図１０に
示す結果は、コルセミド(登録商標)が異数性を誘発する
ことが知られているので、予想されるように二倍体過剰
細胞および二倍体欠損細胞のパーセントが増加し、倍数
体細胞の数が高いことを示している。
【０１２８】実施例６：グリセオフルビン処理したヒト
リンパ球中の数値染色体異常のフローサイトメトリー分
析 前述のように得られたヒトリンパ球を、グリセオフルビ
ン（Sigma Chemicals）0〜100μg/mlの存在または不在
下で〜３７℃で〜２４時間インキュベートした。図１１
に示す結果は、グリセオフルビンが異数性を誘発するこ
とが知られているので、予想されるように二倍体過剰細
胞、二倍体欠損細胞、および倍数体細胞のパーセントが
高いことを示している。
リンパ球中の数値染色体異常のフローサイトメトリー分
析 前述のように得られたヒトリンパ球を、グリセオフルビ
ン（Sigma Chemicals）0〜100μg/mlの存在または不在
下で〜３７℃で〜２４時間インキュベートした。図１１
に示す結果は、グリセオフルビンが異数性を誘発するこ
とが知られているので、予想されるように二倍体過剰細
胞、二倍体欠損細胞、および倍数体細胞のパーセントが
高いことを示している。
【０１２９】実施例７：ノスカピン処理したヒトリンパ
球中の数値染色体異常のフローサイトメトリー分析 前述のように得られたヒトリンパ球を、ノスカピン（Si
gma Chemicals）0〜100μg/mlの存在または不在下で３
７℃で２４時間インキュベートした。図１２に示す結果
は、ノスカピンが異数性を誘発することが知られている
ので、予想されるように二倍体過剰細胞、二倍体欠損細
胞、および倍数体細胞のパーセントが高いことを示して
いる。
球中の数値染色体異常のフローサイトメトリー分析 前述のように得られたヒトリンパ球を、ノスカピン（Si
gma Chemicals）0〜100μg/mlの存在または不在下で３
７℃で２４時間インキュベートした。図１２に示す結果
は、ノスカピンが異数性を誘発することが知られている
ので、予想されるように二倍体過剰細胞、二倍体欠損細
胞、および倍数体細胞のパーセントが高いことを示して
いる。
【０１３０】均等物：当業者は、単に定型化した実験法
を用いて本明細書に記述された本発明の特定の実施形態
の多くの均等物を認識し、または確かめることができる
はずである。このような均等物も、特許請求の範囲に包
含される。
を用いて本明細書に記述された本発明の特定の実施形態
の多くの均等物を認識し、または確かめることができる
はずである。このような均等物も、特許請求の範囲に包
含される。
【図１】細胞の周期性集団の完全な獲得を保証するため
の適正な「ゲート設定」を示す、ヒトのリンパ球のフロ
ーサイトメトリー分析によって得られた２パラメータ点
図表（ＦＬ２−Ｗ／ＦＬ２−Ａ）を表す図である。
の適正な「ゲート設定」を示す、ヒトのリンパ球のフロ
ーサイトメトリー分析によって得られた２パラメータ点
図表（ＦＬ２−Ｗ／ＦＬ２−Ａ）を表す図である。
【図２】複数細胞周期のDNA内容（すなわちＧ０−Ｇ１
−ＳおよびＧ２）に基づいて異なる有糸分裂細胞の集団
を見分けるための適正な「ゲート設定」を示す、正常な
ヒトのリンパ球のフローサイトメトリー分析によって得
られた２パラメータ点図表（抗H3ｍＡｂ／ＦＬ２−Ａ）
を表す図である。
−ＳおよびＧ２）に基づいて異なる有糸分裂細胞の集団
を見分けるための適正な「ゲート設定」を示す、正常な
ヒトのリンパ球のフローサイトメトリー分析によって得
られた２パラメータ点図表（抗H3ｍＡｂ／ＦＬ２−Ａ）
を表す図である。
【図３】DNA内容の増加した細胞の「ゲートされた」周
期性集団を示す、ノスカピン処理したヒトのリンパ球の
フローサイトメトリー分析によって得られた２パラメー
タ点図表（ＦＬ２−Ｗ／ＦＬ２−Ａ）の例を表す図であ
る。
期性集団を示す、ノスカピン処理したヒトのリンパ球の
フローサイトメトリー分析によって得られた２パラメー
タ点図表（ＦＬ２−Ｗ／ＦＬ２−Ａ）の例を表す図であ
る。
【図４】二倍体欠損細胞（Ｒ２）、二倍体細胞（Ｒ
３）、二倍体過剰細胞（Ｒ４）、および倍数体細胞（Ｒ
５）を定量するための適正な「ゲート設定」を示す、ノ
スカピン処理したヒトのリンパ球のフローサイトメトリ
ー分析によって得られた２パラメータ点図表（抗H3ｍＡ
ｂ／ＦＬ２−Ａ）の例を表す図である。
３）、二倍体過剰細胞（Ｒ４）、および倍数体細胞（Ｒ
５）を定量するための適正な「ゲート設定」を示す、ノ
スカピン処理したヒトのリンパ球のフローサイトメトリ
ー分析によって得られた２パラメータ点図表（抗H3ｍＡ
ｂ／ＦＬ２−Ａ）の例を表す図である。
【図５】DNAのＧ１およびＧ２のピークの手作業による
位置合わせを示す、ソフトウェアMODIFIT 3.0から得ら
れたDNA「セットアップ」ヒストグラムの例を表す図で
ある。
位置合わせを示す、ソフトウェアMODIFIT 3.0から得ら
れたDNA「セットアップ」ヒストグラムの例を表す図で
ある。
【図６】Ｇ１、Ｇ２、およびＳ相、細胞凝集体、および
細胞残屑中の細胞の計算された数を示す、ソフトウェア
MODIFIT 3.0から得られたDNA「分析」ヒストグラムの例
を表す図である。
細胞残屑中の細胞の計算された数を示す、ソフトウェア
MODIFIT 3.0から得られたDNA「分析」ヒストグラムの例
を表す図である。
【図７】異なる量のノスカピンで処理したヒトのリンパ
球の集団中の倍数体細胞の手作業とフローサイトメトリ
ー分析の比較を示すグラフである。
球の集団中の倍数体細胞の手作業とフローサイトメトリ
ー分析の比較を示すグラフである。
【図８】フローサイトメトリー分析により求めた、異な
る量のシアン化カリウム（ＫＣＮ）で処理したヒトのリ
ンパ球の集団中の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、お
よび倍数体細胞の比率を示すグラフである。
る量のシアン化カリウム（ＫＣＮ）で処理したヒトのリ
ンパ球の集団中の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、お
よび倍数体細胞の比率を示すグラフである。
【図９】フローサイトメトリー分析により求めた、異な
る量のサイトカラシンＢで処理したヒトのリンパ球の集
団中の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数体
細胞の比率を示すグラフである。
る量のサイトカラシンＢで処理したヒトのリンパ球の集
団中の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数体
細胞の比率を示すグラフである。
【図１０】フローサイトメトリー分析により求めた、異
なる量のコルセミドで処理したヒトのリンパ球の集団中
の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数体細胞
の比率を示すグラフである。
なる量のコルセミドで処理したヒトのリンパ球の集団中
の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数体細胞
の比率を示すグラフである。
【図１１】フローサイトメトリー分析により求めた、異
なる量のグルセオフルビンで処理したヒトのリンパ球の
集団中の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数
体細胞の比率を示すグラフである。
なる量のグルセオフルビンで処理したヒトのリンパ球の
集団中の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数
体細胞の比率を示すグラフである。
【図１２】フローサイトメトリー分析により求めた、異
なる量のノスカピンで処理したヒトのリンパ球の集団中
の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数体細胞
の比率を示すグラフである。
なる量のノスカピンで処理したヒトのリンパ球の集団中
の二倍体欠損細胞、二倍体過剰細胞、および倍数体細胞
の比率を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 マイク ユールゲン シュラー，シニア
アメリカ合衆国，コネチカット 06340,
グロトン，イースタン ポイント ロー
ド，ファイザー グローバル リサーチ
アンド ディベロップメント
Ｆターム(参考） 2G045 AA24 BA13 BB24 CA01 CA25
DA13 FA37 FB03 JA01
4B063 QA01 QA18 QA19 QQ08 QQ42
QR66 QS36 QS39 QX02
Claims (15)
- 【請求項１】 有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着色
剤で有糸分裂細胞を処理すること、および前記定量用DN
A着色剤を用いて前記細胞中のDNAの量を定量することを
含む、数値染色体異常を検出する方法。 - 【請求項２】 前記DNAの定量化がフローサイトメトリ
ーの使用を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 さらに、前記細胞が正常な倍数性を有す
る細胞中のDNAよりも多いかまたは少ないDNAを含有する
ことが前記定量化によって決定されるという前提で、前
記細胞を数値染色体異常を有するものと特徴づけること
を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 細胞が有糸分裂マーカーによって有糸分
裂性であることが確認されるという前提で、さらに前記
細胞が定量用DNA着色剤によって正常な倍数性を有する
細胞中のDNAよりも多いかまたは少ないDNAを含有するこ
とが決定されるという前提で、細胞の集団を前記有糸分
裂マーカーおよび前記定量用DNA着色剤で処理するこ
と、および前記細胞を数値染色体異常を有するものとし
て前記集団から識別することを含む、細胞の集団から数
値染色体異常を有する細胞を識別する方法。 - 【請求項５】 前記細胞が有糸分裂性であることを確認
するために、また前記細胞が正常な倍数性を有する細胞
中のDNAよりも多いかまたは少ないDNAを含有することを
決定するために細胞サイトメトリーを使用する、請求項
４に記載の方法。 - 【請求項６】 有糸分裂マーカーが、有糸分裂中に起こ
るヒストンのリン酸化を検出する薬品である、請求項１
または４に記載の方法。 - 【請求項７】 有糸分裂マーカーが6G3単クローン抗体
である、請求項１または４に記載の方法。 - 【請求項８】 定量用DNA着色剤が、挿入性色素、副溝
バインダ、シアニン色素、およびヨウ化プロピジウムか
ら選択される、請求項１または４に記載の方法。 - 【請求項９】 定量用DNA着色剤がヨウ化プロピジウム
である、請求項１または４に記載の方法。 - 【請求項１０】 細胞が有糸分裂マーカーによって有糸
分裂性であることが確認されるという前提で、さらに前
記細胞が定量用DNA着色剤によって正常な倍数性を有す
る細胞中のDNAよりも多いかまたは少ないDNAを含有する
ことが決定されるという前提で、細胞の集団を前記有糸
分裂マーカーおよび前記定量用DNA着色剤で処理するこ
と、前記細胞を数値染色体異常を有するものとして前記
集団から識別すること、および前記細胞を単離すること
を含む、細胞の集団から数値染色体異常を有する細胞を
単離する方法。 - 【請求項１１】 前記細胞の集団が各々異なる数値染色
体異常を有する少なくとも２つの細胞の分集団を包含す
る、また前記方法がさらに前記分集団を互いにまた前記
細胞の集団から分離することを含む、請求項１０に記載
の方法。 - 【請求項１２】 細胞またはその子孫が有糸分裂マーカ
ーおよび定量用DNA着色剤で処理されている間ずっと有
糸分裂性であるという前提で、前記細胞を供試薬品で処
理すること、前記細胞またはその子孫を有糸分裂マーカ
ーおよび定量用DNA着色剤で処理すること、および前記
定量用DNA着色剤を用いて前記細胞中のDNAの量を定量す
ることを含む、細胞中で数値染色体異常を誘発する作用
物質を特定する検定法。 - 【請求項１３】 前記細胞が、末梢血液の単核細胞、リ
ンパ球、上皮細胞、および結合組織細胞である、請求項
１２に記載の検定法。 - 【請求項１４】 有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着
色剤を含む、細胞中の数値染色体異常を検出するための
キット。 - 【請求項１５】 有糸分裂マーカーおよび定量用DNA着
色剤を含む、組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33728201P | 2001-11-30 | 2001-11-30 | |
| US60/337282 | 2001-11-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003210198A true JP2003210198A (ja) | 2003-07-29 |
Family
ID=23319873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002347133A Pending JP2003210198A (ja) | 2001-11-30 | 2002-11-29 | 数値染色体異常を有する細胞の検出方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030104461A1 (ja) |
| EP (1) | EP1316619A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003210198A (ja) |
| KR (1) | KR20040062979A (ja) |
| CN (1) | CN1606628A (ja) |
| AU (1) | AU2002347468A1 (ja) |
| CA (1) | CA2413177A1 (ja) |
| HR (1) | HRP20040488A2 (ja) |
| IL (1) | IL161856A0 (ja) |
| NO (1) | NO20042180L (ja) |
| RU (1) | RU2004116344A (ja) |
| WO (1) | WO2003046218A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008500558A (ja) * | 2004-05-21 | 2008-01-10 | ベックマン コールター，インコーポレイティド | 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法 |
Families Citing this family (16)
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|---|---|---|---|---|
| WO2004029221A2 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-08 | The General Hospital Corporation | Microfluidic device for cell separation and uses thereof |
| GB0319376D0 (en) | 2003-08-18 | 2003-09-17 | Chroma Therapeutics Ltd | Histone modification detection |
| JP2008538282A (ja) * | 2005-04-05 | 2008-10-23 | セルポイント ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド | 装置および循環腫瘍細胞および他の粒子の濃縮および変更のための方法 |
| US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
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