KR20040062979A - 수치적 염색체 이상을 갖는 세포를 검출하는 방법 - Google Patents

수치적 염색체 이상을 갖는 세포를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포에서 수치적 염색체 이상을 갖는 유사분열 세포, 및 세포에서 수치적 염색체 이상을 유도하는 시약을 검출하는 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 유사분열시의 세포를 검출하는 유사분열성 표지, 및 유사분열 세포에서 DNA의 양을 나타내는 정량적 DNA 염색액으로 세포를 염색하는 단계를 포함한다. 염색된 세포는 바람직하게는 유세포 분석법에 의해 분석된다.

Description

수치적 염색체 이상을 갖는 세포를 검출하는 방법{METHODS FOR DETECTING CELLS WITH NUMERICAL CHROMOSOMAL ABNORMALITIES}
이수성 및 배수성과 같은 수치적 염색체 이상은 선천적 결손증, 임신 소모 및 암을 비롯한 수많은 질병과 연관되어 있다. 예시적인 질환으로는 다운 증후군, 클라인펠터 증후군, 터너 증후군, 트리플로-X(triplo-X) 증후군, 테트라-X 증후군, 펜타-X 증후군, XYY 증후군, 7, 10, 11, 13, 18, 21, X 및 Y를 비롯한 임의의 염색체의 일염색체성 또는 다수 염색체성을 들 수 있다. 또한, 이수성 및 배수성과 같은 수치적 염색체 이상은 인간의 자연 유산에서 종종 발견된다.
수치적 염색체 이상과 연관된 예시적인 종양으로는 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), 급성 비-림프성 백혈병(ANL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML)과 같은 백혈병; 및 방광 암종, 대장암, 대장 암종, 악성 흑색종 및 자궁 암종과 같은 고형 종양을 들 수 있다. 또한, 설치류의 암 발생의 다단계 공정에서 이수성의 역할은 다수의 종양 발생 모델에서 나타나 있다.
또한, 베노밀, 다이아제팜 및 그리세오풀빈과 같은 수많은 화합물이 수치적 염색체 이상을 야기하는 것으로 보고되어 있다.
수치적 염색체 이상을 검출하는 현존하는 최고의 방법은 중기의 세포를 김사(Giemsa)와 같은 DNA 특이적 염색액으로 염색하고, 개개의 염색체의 수를 측정하는 염색체 계수법에 의존한다. 이 방법은 수천개의 세포를 수동 방식으로 계수하기 때문에 매우 힘이 들 수 있다. 대안으로는, 미소핵의 유도를 이용하여 화학적 클라스토겐(clastogen)을 검출한다. 그러나, 이 방법은 클라스토겐과 아뉴겐(aneugen)을 용이하게 구별하지 못하고, 염색체 미분열에 민감하다. 또 다른 기법은, 염색체상의 상보적 서열에 어닐링될 수 있어 특이적 표지로서 작용하는 염색체 특이적 DNA 탐침을 사용하는 형광 동소 보합(FISH)법을 들 수 있다. 이들 DNA 탐침으로는 특정 염색체의 길이 전체를 통해 균일하거나 거의 균일한 일련의 형광 신호를 야기하는 영역 특이적 또는 전체 염색체 탐침을 들 수 있다.
그러나, 이들 기법 모두는 노동 집약적이고, 시간-소모적이다. 따라서, 수치적 염색체 이상을 검출하기 위해 신속하고 저렴하며 믿을 만한 방법이 요구되고 있다. 이러한 방법은 생물학적 시료에서 수치적 염색체 이상을 검출하고, 수많은 염색체이상을 유도하는 화합물을 확인하는데 사용될 수 있다.
본원 전체에서 인용된 바와 같이 문헌 참고물, 등록된 특허, 공개된 특허출원을 비롯한 모든 인용된 참고물의 내용은 본원에서 전체가 명백히 참고로 인용한다.
발명의 요약
본 발명은 세포에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 염색체 이상은 배수성 또는 이수성과 같은 비정상 배수성일 수 있다. 한 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액을 표지하여, 유사분열시의 세포에서의 DNA의 양을 정량화하는 단계, 및 유사분열 세포에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 유사분열성 표지는 유사분열 세포의 특징, 예를 들어 유사분열시에 크로마틴의 축합과 관련된 히스톤의 인산화, 예를 들어 세린-10상의 히스톤 H3의 인산화를 검출하는 시약일 수 있다. 상기 시약은 6G3 단일 클론성 항체와 같은 항체일 수 있다. 임의의 정량적 DNA 염색액은, 예를 들어 삽입성 염료, 소홈 결합제(minor-groove binder) 및 사이아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 정량적 DNA 염색액은 요오드화프로피듐이다. 상기 방법은 바람직하게는 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 염색된 세포를 염색된 세포의 분석용 유세포 분석법(flow cytometry)에 적용시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 세포의 개체군중 하나 이상의 세포에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상을 검출하는 방법으로서, 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 세포의 개체군을 염색하여, 유사분열시의 세포내 DNA의 양을 정량화하는 단계, 및 하나 이상의 세포에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상의 존재를 측정하는 단계를포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포의 개체군에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상을 갖는 하나 이상의 세포를 단리하는 방법으로서, 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 세포의 개체군을 염색하는 단계, 세포를 유세포 분석법에 적용하여 세포의 DNA 함량을 가시화하여, 하나 이상의 염색체 이상을 갖는 세포를 확인하는 단계, 및 세포의 개체군으로부터 하나 이상의 염색체 이상을 갖는 하나 이상의 세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 분석 및 분리의 바람직한 방법으로는 유세포 분석법을 들 수 있다. 상기 방법은 세포 각각으로부터 및 세포의 개체군으로부터 2개 이상의 상이한 세포의 아형 개체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 유사분열을 겪고 있는 세포, 또는 마이토겐(mitogen)에 의해 자극되어 유사분열을 겪고 있는 세포의 임의의 유형, 예를 들어 진핵 세포에 적용할 수 있다. 예시적인 세포로는 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 들 수 있다. 바람직한 세포로는 체세포 및 생식 세포를 들 수 있다. 세포는 생물학적 시료, 예를 들어 생체 검사에서 유래하거나 배양된 세포로부터 유래하거나, 예를 들어 세포주로부터의 세포일 수 있다.
본 발명은 세포내 수치적 염색체 이상을 유도하는 화합물을 확인하는 분석법을 추가로 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 분석법은 딸세포에서 임의의 가능한 수치적 염색체 이상을 유도하기에 충분한 시간 동안 세포의 개체군을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 세포를 본 발명에 방법에 적용하는 단계, 및 세포내 염색체 이상의 존재를 측정하여, 시험 화합물과 접촉하지 않는 세포의 유사한 개체군에 비해 시험 화합물과 접촉한 세포의 개체군에서 염색체 이상을 갖는 보다 많은 세포가 시험 화합물이 세포에서 수치적 염색체 이상을 유도한다는 것을 나타내는 단계를 포함한다. 임의의 진핵세포, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간 세포가 이 분석법에 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 인간 객체 또는 동물로부터의 세포의 개체군에서 하나 이상의 염색체 이상을 함유하는 세포의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 인간 객체 또는 동물로부터 세포의 시료를 수득하는 단계, 및 세포의 시료를 본 발명의 방법에 적용하여 인간 객체 또는 동물에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상을 함유하는 세포의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 예시적인 질환으로는 암, 생식세포 이수성 뿐만 아니라 삼염색체성 및 일염색체성과 같은 유전 질환의 임의의 유형을 들 수 있다.
본 발명은 세포에서 수치적 염색체 이상을 검출하기 위한 키트를 추가로 제공한다. 상기 키트는 세포 독성인 화합물을 확인하거나, 시료에서 수치적 염색체 이상을 확인하기 위한 키트일 수 있다. 상기 키트는 유사분열성 표지와 같은 표지 또는 정량적 DNA 염색액을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 키트는 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액 둘다를 포함한다. 키트가 포함할 수 있는 다른 성분으로는 부가적인 표지, 검출 시약, 완충액, 네가피브 또는 포지티브 대조군, 및 생물학적 시료를 수득하기 위한 장치를 들 수 있다. 상기 키트는 또한 사용 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액을 포함하는 조성물을제공한다.
본 발명은 적어도 세포내 수치적 염색체 이상의 분석에 대한 상당히 증가된 속도, 자료의 변화의 감소, 통계력의 증가 및 유사분열 개체군내 수많은 변이에 대한 전반적으로 향상된 판단을 제공한다는 이점을 제공한다.
본 발명은 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액을 사용하여 세포에서 수치적 염색체 이상을 검출하는 것에 관한 것이다. 이수성(aneuploidy) 및 배수성(polyploidy)과 같은 수치적 염색체 이상은 세포 독성 및 종양 가능성의 척도일 수 있다.
도 1A는 세포의 순환 개체군의 완전한 수득을 확보하기 위해 적절한 "관문화 설정(gating set-up)"을 나타내는 것으로, 인간 림프구의 유세포 분석에 의해 수득된 2파라미터 도트 플럿(FL2-W/FL2-A)을 나타낸다.
도 1B는 다중 세포 주기 동안의 DNA 함량(예를 들어, G0-G1-S 및 G2)에 기초한 상이한 개체군의 유사분열 세포를 확인하는 적절한 "관문화 설정"을 나타내는 것으로, 정상 인간 림프구의 유세포 분석에 의해 수득된 2파라미터 도트 플럿(항-H3 mAb/FL2-A)을 나타낸다.
도 2A는 DNA 함량이 증가함에 따른 세포의 "관문화된" 순환 개체군을 나타낸 것으로, 노스카핀(Noscapine)으로 처리된 인간 림프구의 유세포 분석에 의해 수득된 2파라미터 도트 플럿(FL2-W/FL2-A)의 예를 나타낸다.
도 2B는 하이포-이배체(R2), 이배체(R3), 하이퍼-이배체(R4) 및 다중 이배체(R5) 세포를 정량화하는 적절한 "관문화 설정"을 나타내는 것으로, 노스카핀으로 처리된 인간 림프구의 유세포 분석에 의해 수득된 2파라미터 도트 플럿(항-H3mAb/FL2-A)의 예를 나타낸다.
도 3A는 DNA의 G1및 G2피크의 수동 배열을 나타낸 것으로, MODFIT 3.0 소프트웨어로부터의 DNA "설정" 히스토그램의 예를 나타낸다.
도 3B는 계산된 수많은 G1, G2및 S기의 세포, 세포 집성체, 및 세포 잔사를 나타내는 것으로, MODFIT 3.0 소프트웨어로부터의 DNA "분석" 히스토그램의 예를 나타낸다.
도 4는 노스카핀의 양이 상이하게 처리된 인간 림프구의 개체군에서의 배수성 세포의 수동 분석과 유세포 분석을 비교한 것을 나타낸다.
도 5는 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 시안화칼륨(KCN)의 양이 상이하게 처리된 인간 림프구의 개체군에서 하이포-이배체, 하이퍼-이배체 및 다중 이배체 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 6은 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 사이토칼라신(cytochalasin) B의 양이 상이하게 처리된 인간 림프구의 개체군에서 하이포-이배체, 하이퍼-이배체 및 다중 이배체 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 7은 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 콜세미드(colcemid)의 양이 상이하게 처리된 인간 림프구의 개체군에서 하이포-이배체, 하이퍼-이배체 및 다중 이배체 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 8은 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 그리세오풀빈의 양이 상이하게 처리된 인간 림프구의 개체군에서 하이포-이배체, 하이퍼-이배체 및 다중 이배체 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 노스카핀의 양이 상이하게 처리된 인간 림프구의 개체군에서 하이포-이배체, 하이퍼-이배체 및 다중 이배체 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 유사분열의 표지로 순환 세포의 개체군을 라벨링하고, DNA 함량을 염색하고, 유세포 분석법을 통한 염색된 세포를 가시화하면 세포의 개체군내에서 수치적 염색체 이상을 갖는 세포를 검출하는 직접적인 방법을 제공한다는 발견에 기초한다. 이 결과는 과도한 염색체, 결손 염색체 또는 배수성의 과도한 염색체를 갖는 수많은 유사분열 세포의 수를 나타낸다.
본 발명의 검출 방법, 확인 방법, 단리 방법 및 분석법의 양태에서, 세포를 먼저 유사분열성 표지로 처리하고, 이어 정량적 DNA 염색액으로 처리할 수 있거나, 순서를 반대로 할 수 있다. 다르게는, 세포를 먼저 정량적 DNA 염색액으로 처리한 후, DNA 정량화를 수행할 수 있다. 이어, 수치적 염색체 이상을 나타내는 이들 세는 유사분열성 표지로 처리함으로써 유사분열성 또는 비유사분열 상태인 것으로 확인될 수 있다. 다른 대안으로서, 세포를 먼저 유사분열성 또는 비유사분열 상태인 것으로 확인하고, 이어 정량적 DNA 염색액으로 처리하여 수치적 염색체 이상을 확인할 수 있다. 상기 대안 모두는 본 발명의 범위내에 있다.
본원에서 사용된 용어는 당해 기술분야에서의 그의 통상적인 의미를 갖지만,편의상 본 발명을 명확히 하기 위해 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구의 범위에서 사용된 용어의 의미는 하기에서 제공한다.
"아뉴겐"이란 용어는 이수성을 야기하는 화학 약품과 같은 시약이다. "비-아뉴겐"이란 용어는 이수성을 야기하지 않는 시약이다.
"이수성" 및 "배수성"이란 용어는 세포가 통상적인 반수체 수("n") 또는 배수체 수("2n")와는 상이한 염색체의 수를 갖는 상태이다. 인간에서, 염색체의 정상 반수체 수는 23이고, 배수체 수는 46이다. 정상 세포는 46개의 염색체의 이배체 염색체 함량을 가져야 한다. 이수체 세포는 정상 반수체 수의 전체 배수와 동일하지 않는 염색체의 수를 갖는다. 예를 들어, 이수체 세포는 삼염색체성, 예를 들어 하나의 염색체를 3벌 갖는 세포, 또는 일염색체성, 예를 들어 하나의 염색체를 한 벌 갖는 세포일 수 있다. 이수성은 유사분열 동안에 염색체 미분열에 의해 야기될 수 있다. 배수체 세포는 통상적인 이배체 수, 예를 들어 2n을 초과하는 정상 반수체의 수의 일부 배수인 염색체의 수를 갖는 세포이다. 예를 들어, 배수체 세포는 삼배체(n=69) 또는 사배체(n=92) 세포일 수 있다.
"생물학적 시료"란 용어는 유기체 및 유기체의 성분(예를 들어, 세포)으로부터 수득된 시료를 지칭한다. 상기 시료는 임의의 생물학적 조직 또는 유체일 수 있다. 종종, 시료는 환자로부터 유래한 시료인 "임상적 시료"일 것이다. 상기 시료로는 타액, 혈액, 혈액 세포(예를 들어, 백혈구), 조직 또는 세침 생체 검사 시료, 소변, 복막액 및 늑막액, 또는 이로부터의 세포를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료는 또한 조직학적 목적을 위해 취한 냉동 절편과 같은조직의 절편을 포함할 수 있다.
세포의 "수치적 염색체 이상"이란 용어는 정상 세포에 비해 많은 부가적인 염색체 또는 그의 일부분이 존재하거나, 많은 염색체 또는 그의 일부분이 결핍된 상태를 지칭한다.
세포의 "염색체 함량"이란 용어는 염색체 및 이의 일부분의 수를 지칭한다. 이배체 세포의 정상 염색체 함량은 2n이고, 반수체 세포의 경우에는 n이다. 유사분열시의 이배체 세포의 정상 염색체 함량은 4n이다.
"정량적 DNA 염색액"이란 용어는 세포의 DNA의 검출 및 정량화를 가능케 하는 시약을 지칭한다. 바람직한 정량적 DNA 염색액은 DNA를 염색하는 시약, 예를 들어 삽입제이다. 예시적인 정량적 DNA 염색액은 요오드화프로피듐이다.
"하이포-배수체" 세포란 용어는 동일한 종의 정상 배수체 세포보다 적은 염색체 DNA를 갖는 세포이다. "하이퍼-이배체" 세포란 용어는 동일한 종의 정상 이배체 세포보다 많은 염색체 DNA를 갖는 세포이다.
"라벨" 및 "검출가능한 라벨"이란 용어는, 방사선 동위원소, 형광물질, 화학발광 잔기, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 염료, 금속 이온, 리간드(예를 들어 비오틴 또는 합텐) 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는 검출가능한 분자를 지칭한다. "형광 물질"이란 용어는 검출가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 이의 일부분을 지칭한다. 본 발명하에 사용될 수 있는 라벨의 예로는 플루오레신, 로다민, 단실, 움벨리페론, 텍사스 레드(Texas red), 루미놀, NADPH, α- 및 β-갈락토시다제 및 양고추냉이 퍼옥시다제를 들 수 있다.
"표지"란 용어는 세포의 일부 특징, 예를 들어 세포 주기의 단계, 또는 세포 성분, 예를 들어 DNA의 존재 및/또는 양을 표지하는 시약일 수 있다.
"유사분열성 표지"란 용어는 유사분열시기인 세포을 표지하는 시약이다. 바람직한 유사분열성 표지는 Ser-10 부위상의 히스톤 H3의 인산화를 검출하는 시약이다.
"배수성"이란 용어는 염색체의 정상 수의 반복 정도를 지칭한다. "배수성"을 갖는 세포는 동일한 종의 정상 세포와는 상이한 염색체 수를 갖는 세포이고, 예를 들어 이수체 또는 배수체 세포일 수 있다. 세포의 "배수성의 측정"이란 용어는 세포에서 염색체의 수를 측정하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작은 분자"란 용어는 분자량이 약 5kD 미만, 가장 바람직하게는 4kD 미만인 조성을 지칭하는 것으로 의미한다. 작은 분자는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩티도미멕틱스(peptidomimetics), 탄수화물, 지방 또는 기타 유기(탄소 함유) 또는 무기 분자일 수 있다. 많은 제약 회사는, 수치적 염색체 이상을 야기하는 화합물을 확인하기 위한 본 발명의 임의의 분석법으로 스크리닝될 수 있는 화학 및/또는 생물학적 혼합물, 종종 진균, 박테리아 또는 조류 추출물의 광범위한 라이브러리를 갖는다.
"염색액"이란 용어는 표적, 예를 들어 DNA 염료를 검출할 수 있는 임의의 시약을 지칭한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 세포의 염색체 함량, 예를 들어 배수성을 측정하기 위한 방법으로서, 유사분열성 표지로 세포를 라벨링하는 단계, DNA 함량을 위해 염색하여, 유사분열시의 세포의 DNA의 양을 정량화하는 단계, 및 이어 세포의 염색체 함량을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 유사분열성 표지에 의해 수득된 라벨링의 존재는 세포가 유사분열을 겪고 있다는 것을 나타낸다. 정량적 DNA 염색액에 의해 수득된 염색량은 세포에서 DNA의 양, 예를 들어 세포에서 염색체 또는 그의 일부의 수와 일치한다. 유사분열성 표지를 사용하면 DNA 함량의 분석이 유사분열 세포에 한정된다. 세포의 염색체 함량을 측정하는 단계는, 세포에서 이수성 또는 배수성의 존재, 또는 염색체의 일부의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함한다. 따라서, 유사분열성이고, 4n이 아닌 DNA 함량을 갖는 세포는 수치적 염색체 이상을 갖는 것을 판정된다. DNA 함량이 4n 초과의 정상 배수체 수의 일부 배수, 예를 들어 8n인 경우에, 세포는 배수성인 것으로 간주된다. 함량이 실질적으로 4n과 일치하지 않고, 4n 초과의 n의 전체 배수가 아닌 경우에, 세포는 이수성인 것으로 간주된다. 다양한 기법을 사용하여 염색을 검출하고/하거나 정량화할 수 있다. 바람직한 방법은 유세포 분석법이다.
세포에서의 수치적 염색체 이상, 예를 들어 이수성 및 배수성의 존재는 유사분열 상태와는 관계없이 세포의 DNA 함량을 측정함으로써 간단히 판단할 수 있다. 그러나, 유사분열시의 세포를 우선적으로 평가함으로써, 수치적 염색체 이상의 검출이 향상된다. 이는, 유사분열 세포가 죽은 세포, 프로그래밍된 세포 죽음(세포사멸(apoptosis)로도 공지됨)을 겪고 있는 세포, 및 세포 단편 또는 잔사를 비롯한 배경 오차의 다수의 공급원을 주로 제거한 세포의 순화 개체군으로부터 선택되며, 이들 모두가 DNA 함량 측정에 의해 수치적 염색체 이상인 것으로 나타날 수 있기때문이다.
세포는 세포의 개체군내의 세포일 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포의 개체군에서 하나 이상의 세포의 수치적 염색체 이상의 존재를 측정하는 방법으로서, 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액에 의해 세포의 개체군을 염색하여, 유사분열시의 세포의 DNA의 양을 정량화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포의 개체군에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상을 갖는 수많은 세포를 정량화하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 4n과는 상이한 염색체 수를 갖는 유사분열 세포를 계수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 세포주 뿐만 아니라, 원발성 세포의 배양물 및 동물로부터의 생물학적 시료, 예를 들어 생체 검사에 적용할 수 있다. 유사분열을 겪고 있는 임의의 세포를 사용할 수 있다. 바람직한 세포로는 진핵세포를 들 수 있다. 상기 세포는 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 비인간 영장류, 쥐 또는 래트 세포일 수 있다. 상기 세포는 진핵 생물의 임의의 기관 또는 조직, 예를 들어 혈액 세포, 상피세포, 골수 세포, 폐 세포, 신장 세포 또는 양수 세포일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 효모 세포, 드로소필라(Drosophila) 세포, 제노푸스(Xenopus) 세포, C. 엘레강스(C. elegans) 세포, 또는 염색체를 갖는 임의의 기타 세포에 적용될 수 있다.
예를 들어, 수치적 염색체 이상을 야기하는 시약을 확인하는데 사용하는 세포주는, 예를 들어 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러버드 10801 소재의 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 구할 수 있다.
세포의 생물학적 시료는 "침습성" 또는 "비침습성" 샘플링 수단을 사용하여 개체군으로부터 수득될 수 있다. 샘플링 수단은 동물의 피부 또는 기관의 내부로부터 세포를 수집하는 것을 포함하는 경우에 "침습성"이라고 얘기된다. 침습성 방법의 예로는 혈액 수집, 정액 수집, 침 생체검사, 늑막 흡출, 탯줄 생체검사, 양수 생체검사 등을 들 수 있다. 상기 방법의 예는 문헌[Kim, C. H. et al. (J. Virol. 66:3879-3882 (1992))], 문헌[Biswas, B. et al. (Annals NY Acad. Sci. 590:582-583 (1990))] 및 문헌[Biswas, B. et al. (J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233 (1991))]에 토의되어 있다.
대조적으로, "비침습성" 샘플링 수단은 세포를 동물의 내피 또는 외피로부터 회수한 것이다. 이러한 "비침습성" 샘플링 수단의 예로는 눈물, 타액, 소변, 대변, 땀 또는 발한, 모근 등의 "면봉법" 수집을 들 수 있다. 이러한 수집법은 비강, 구강, 직장, 질 또는 귀 개구를 면봉으로 훔치거나, 피부 또는 누관을 접촉하거나, 모낭 등을 수집함으로써 달성될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면봉법"이란 용어는 흡착제 물질을 함유하거나 포함하는 작은 주걱/수집기("면봉")를 세포를 수집하기에 충분한 방식으로 표피에 접촉시키는 것을 포함한다.
세포의 개체군은, 예를 들어 세포주로부터의 세포와 같은 세포의 순수한 개체군 또는 세포의 다양한 개체군일 수 있다. 한 실시태양에서, 세포는 말초 혈액 단핵구(PBMC)이다. 또한, 세포의 상이한 유형으로 이루어진 개체군은 하나 이상의 아형이 풍부할 수 있다. 예를 들어, 림프구는 PBMC로부터 단리될 수 있다. 세포의 아형 개체군의 단리는 다양한 방법, 예를 들어 세포 표면 표지와 특이적으로 반응하는 항체를 사용하는 친화도 정제 또는 패닝법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 단일 세포상에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 102, 103, 104, 105, 106, 107또는 108개 이상의 세포의 개체군상에서 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 세포는 스핀들 블록(spindle block)(예를 들어, 콜세미드(Colcemid, 등록상표) 또는 콜치신(GIBCO, BLR) 및 TN16(와코 퓨어 케미칼(Wako Pure chemical)))으로 배양된다. 예를 들어, 세포는 고정되기 전에 1 내지 3시간 동안 콜세미드(약 0.1㎍/㎖; GIBCO)에 노출될 수 있다. "스핀들 블록"이란 용어는 세포가 유사분열시에 축적되도록 하는 시약이다.
염색 전후에, 세포막을 고정시키고 선택적으로 투과성화하기 위해 세포를 용매로 선택적으로 처리한다. 수많은 고정제 및 고정 조건이 이러한 목적에 적합하다. 유용한 고정제로는 폼알데하이드, 예를 들어 2% 파라폼알데하이드; 냉각된 메탄올; 냉각된 에탄올, 예를 들어 70% 에탄올을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 세포 고정은 또한 파라폼알데하이드의 3.7% 용액에서 약 15 내지 30분 동안 배양함으로써 달성될 수 있다.
고정 이전에, 세포를 작은 천공 피펫을 통해 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 확보한다. 또한, 세포를 이러한 목적을 위해, 예를 들어 35㎛ 여과기 캡(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))을 통해 여과할수 있다.
일반적으로, 세포를 특정한 시약으로 특정한 방법, 예를 들어 유세포 분석법에 사용하기에 충분한 시간 동안 고정할 수 있다. 특정한 세포 유형에 적합한 고정 방법은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들어 상이한 고정 방법을 사용하여 분석을 수행하여 어떠한 고정 방법이 특정한 방법에서 사용하기 위해 세포를 적절하게 염색할 수 있는 지를 결정한다.
사용된 유사분열성 표지 및/또는 정량적 DNA 염색액에 따라, 유사분열성 표지로 라벨링하기 전에 세포를 투과성화할 필요가 있다. 예를 들어, 세포를 항체로 라벨링하기 전에, 세포는 바람직하게는 투과성화된다. 투과성화는 벌크한 표지가 세포성 막에 대해 통상적으로 불침투성일 수 있는 세포성 공간에 들어가도록 하기 위해 사용된다. 투과성화는 아세톤, 에탄올 및 DMSO와 같은 시약, 또는 다양한 시약, 예를 들어 트윈-80 또는 트리톤 X-100에서 세포를 배양함으로써 달성된다. 예를 들어, 세포는, 임의의 경우에 세포를 고정하는 동안 또는 그 이후에 약 0.05 내지 1.0% 트리톤 X-100에서 배양함으로써 투과성화될 수 있다.
일반적으로, 세포가 투과성화되는 경우에, 이들은 시약에 의해, 및 사용된 특정한 염색, 표지 및/또는 검출 시약이 세포상 또는 세포에서 이들 표적을 반응시키기에 충분한 시간 동안 투과성화된다. 상기 방법에서 사용된 특정한 세포 및 시약에 적합한 투과성화 방법은, 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라, 예를 들어 어떠한 투과성화 방법이 세포를 적합하게 염색하는 지를 결정하기 위한 것과 같이 다수의 상이한 투과성화 방법으로 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다.
매우 다양한 고정제, 고정 조건 및 투과성화제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 염색액과 함께 시료 세포를 고정화하거나 투과성화하는 기타 방법이 통상적인 숙련자에게 자명할 것이다.
바람직한 정량적 DNA 염색액은 요오드화프로피듐이다(PI: 분자 탐침, 제품 번호: P-3566; 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 칼바이오켐(Calbiochem)). 기타 유용한 정량적 DNA 염색액은 형광 핵산 염색액이다. 다양하고 적절한 핵산 염색액은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 티아졸 오렌지, 에티듐 호모다이머, 에티듐 브로마이드, 훽스트(HOECHST) 33258 및 DAPI를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 핵산 염색액은 삽입성 염료(예를 들어, 페난트리다인 및 아크리다인, 예를 들어 에티듐 브로마이드 및 요오드화프로피듐), 소홈 결합제(예를 들어, DAPI 및 훽스트 염료) 또는 이들 2개의 범주중 어디에도 속하지 않는 시약, 예를 들어 아크리다인 오렌지, 7-AAD 및 하이드록시스틸바미다인일 수 있다. 사이아닌 염료는 높은 몰 흡착도, 매우 낮은 고유 형광성, 핵산에 결합시 및 핵산에 대한 매우 높은 친화도에 적합한 큰 형광 향상에 기초하여 선택되며, 기타 생중합체를 거의 염색하지 않는 염료이다. 일부 핵산 염색액은 세포 불투과성이고, 다른 염색액은 세포 투과성 염색액이다. 세포 투과성 염색액은 염색하기 전에 세포를 투과성화할 필요가 없다. 예시적인 세포 투과성 염료는 사이아닌 염료(SYTO 핵산 염색액), 요오드화헥시듐, 다이하이드로에티듐 및 에티듐 호모다이머이다.
기타 이용가능한 염료로는 삽입제(예를 들어, 7-아미노 악티노마이신 D 및 악티노마이신 D), 다중 색상 하이드록시스틸바미다인, 롱-웨이브렝쓰(Long-Wavelength) LDS751 및 뉴르트라스 형광 니슬(Neurtrace Fluorescent Nissl) 염색액을 들 수 있다. 다른 정량적 DNA 염색액은 염기 유사체인 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU, 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)로부터 구입가능함)이다. 부가적인 유용한 헥산 염색액은 국제 특허 공개공보 제 WO 93/06482 호(1993년 4월 1일자로 공개됨); 국제 특허 공개공보 제 WO 94/24213 호(1994년 10월 27일자로 공개됨); 유(Yue) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,321,130 호(1994); 유 등에게 허여된 미국 특허 제 5,410,030 호(1995); 하우그랜드 등에게 허여된 미국 특허 제 5,436,134 호(1995); 및 하우그랜드 등에게 허여된 미국 특허 제 5,437,980 호(1995)에 개시되어 있다. 본 발명의 유사분열성 표지와 함께 적절한 핵산 염색액의 용도는 유사분열 세포 및 DNA 함량을 동시 또는 연속해서 관찰하도록 선택될 수 있다.
요오드화프로피듐(PI, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재의 칼바이오켐)은 약 0.1 이상 내지 약 100㎍/㎖, 바람직하게는 약 0.1 이상 내지 약 10㎍/㎖ 이상, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 5㎍/㎖ 이상의 농도로 세포 개체군에 첨가될 수 있다. 상기 세포를 실온에서 약 1 분 내지 약 2시간, 바람직하게는 약 10분 내지 약 1시간, 가장 바람직하게는 약 15분 내지 약 30분 동안, 선택적으로는 어두운 상태에서 배양할 수 있다. 배양은 또한 얼음상에서 약 1분 이상, 바람직하게는 약 5분 이상, 가장 바람직하게는 약 15분 이상 동안 수행할 수 있다.
일반적으로는, 세포내 DNA를 검출하고 정량화하기에 충분한 양으로 및 시간 동안 세포를 정량적 DNA 염색액으로 염색한다. 특정한 세포 유형에 적합한 염색방법 및 검출 방법은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 어떠한 조건이 세포를 적절하게 염색하는 지를 결정하기 위해 다수의 DNA 염색액, 농축 및 배양 시간을 사용하는 분석법을 수행함으로써 결정될 수 있다.
DNA 함량에 대한 세포의 염색은 염색체 DNA가 아닌 핵산, 예를 들어 RNA의 염색을 방지하는 시약으로 세포를 처리함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 세포를 RNA를 분해하는 시약, 예를 들어 RNase로 처리한다. 예를 들어, RNase A(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 BD 클론테크(Clontech))는 약 100 내지 500㎍/㎖로 첨가될 수 있다.
일반적으로는, 세포는 다른 핵산의 염색에 대해 염색체 DNA를 주로 염색하기에 충분한 농도에서 및 시간 동안 염색체 DNA가 아닌 핵산의 염색을 방지하는 시약과 함께 배양한다. 적합한 조건은 당해 기술분야의 방법에 따라, 예를 들어 사용된 방법에 적합한 조건을 결정하기 위해 상이한 조건으로 상이한 시약을 사용하여 분석법을 수행함으로써 측정될 수 있다.
바람직한 유사분열성 표지는 비-유사분열 세포에서 본질적으로 존재하지 않거나 검출될 수 없는 유사분열 세포(M)의 특징을 검출함으로써 유사분열 세포를 특이적으로 검출하는 시약이다. 바람직한 실시태양에서, 유사분열성 표지는 간기 동안이 아닌 유사분열(G0, G1, S 또는 G2기가 아님)시에 발생하는 크로마틴 응축을 검출하는 표지이다. 더욱더 바람직한 유사분열성 표지는 Ser-10상의 히스톤 H3(항 H3-P 항체)의 인산화를 검출하는 시약이다(문헌[Juan et al. (1998) Cytometry32:71]). 상기 시약은 단일클론성 항체와 같은 항체일 수 있다. 바람직한 항체는 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, 미국 메사추세츠주 버벨리 소재)(문헌[Juan et al., (1998) Cytometry 32:71])로부터 시판되는 항-H3-P 항체인 6G3이다. 항체는 비-인산화된 형태가 아닌 Ser-10 잔기의 인산화된 형태를 특이적으로 검출한다. 전기 내지 말기의 유사분열 세포가 항 H3-P 항체에 의해 검출된다. 반대로, 간기 세포(즉, G0, G1, S 및 G2기)의 크로마틴에의 항체의 결합은 수배 약하다. 따라서, 이 항체에 결합하는 세포만이 유사분열중의 세포이다.
사용될 수 있는 기타 유사분열성 표지로는 TG-3 단일클론성 항체를 들 수 있다(문헌[Anderson 1998, Experimental Cell Res 238, 498-502]).
일반적으로는, 세포는 사용된 특정한 방법, 예를 들어 유세포 분석법으로 유사분열 세포를 검출하기에 충분한 농도로 및 시간 동안 유사분열성 표지로 라벨링한다. 적합한 조건은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 적합한 조건을 확인하기 위해 유사분열성 표지로 상이한 조건에서 세포를 배양함으로써 측정될 수 있다.
특정한 실시태양에서, 세포를 1종 이상의 부가적인 표지로 염색할 수 있다. 예를 들어, 제 3 표지는 다른 2개의 표지에 의해 수득된 결과를 확인하기 위한 다른 유사분열성 표지 또는 DNA 표지일 수 있다. 다르게는, 다른 표지는 세포 또는 세포성 세포기관의 크기 또는 과립성을 검출하는 표지일 수 있다.
예를 들어, 부가적인 표지는 세포막, 핵, 골지체, 소포체 및 리소좀과 같은세포성 세포기관을 선택적으로 염색하는 임의의 탐침 또는 염색일 수 있거나, 제 2 미토콘트리아 염색액(예를 들어, 로다민 123), 또는 하우그랜드 등에게 허여된 미국 특허 제 5,459,268 호(1995)에 개시된 고정가능한 미토콘트리아 염색액이다. 부가적인 표지의 특정한 예로는 산성 세포기관에 대한 염색액, 예를 들어 라이소트래커(LYSOTRACKER)(미국 오리곤주 유젠 소재의 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)), 및 미국 특허 제 6,291,203 호에 기술된 리소좀에 대한 기타 염색액을 들 수 있다. 본 발명의 염색액과 함께 리소좀에 선택적인 염색이 사용되면 유사분열 세포, DNA 함량, 및 예를 들어 세포에서의 미토콘드리아 및 산성 세포기관을 다중 색상 가시화된다.
유사분열성 표지 및/또는 정량적 DNA 염색액은 이들 자체는 검출되지 않지만, 2차 시약 또는 "검출 시약"에 의해 검출될 수 있는 시약일 수 있다. 예를 들어, 표지는 항체일 수 있다. 항체는, 하기에 기술된 라벨에서와 같이 직접 라벨링된다. 다르게는, 항체는 항체를 인지하는 2차 시약(제 2 시약)과 반응할 수 있다. 다양한 2차 시약은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 FITC이다. 또한, 항체는 비오틴에 연결될 수 있고, 2차 시약은 아비딘 또는 스트렙타비딘에 연결될 수 있다. 일반적으로, 2차 시약은 라벨을 갖고 있을 것이다. 라벨을 갖는 시약은 "검출 시약"으로서 지칭된다.
일반적으로, 검출 시약은 검출가능한 반응을 야기하는 수단을 도입한다. 검출가능한 반응이란, 직접 관찰에 의해 또는 도구에 의해 인식될 수 있고, 세포 시료내에 특이적 결합 쌍의 특이적으로 표적화된 일원의 존재에 의한 작용인 시험 시스템에서의 파라미터의 변화 또는 이의 발생을 의미한다. 적합한 검출가능한 반응으로는 색상, 형광, 반사도, pH, 화학발광 또는 적외선 방출의 변화 또는 발생을 들 수 있다. 검출가능한 반응을 제공하는 적합한 라벨로는 가시 또는 형광 염료, 효소 작용(예를 들어, 다이아미노벤지딘에 대한 양고추냉이 퍼옥사이드의 반응)시 가시성 또는 형광 침전물을 생성하는 효소 기질, 효소적 전환시에 형광 또는 가시광선 색상을 생성하는 효소 기질, 가시 또는 형광 라벨링된 라텍스 미립자, 또는 시약(예를 들어, 광분해 또는 다이아미노벤지딘에 대한 광의 반응에 의해 활성화되는 바구니형 발색단)에 대한 광의 반응에 의해 방출되는 신호를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
흥미 있는 형광 잔기 또는 라벨로는 쿠마린 및 그의 유도체(예를 들어, 7-아미노-4-메틸쿠마린 및 아미노쿠마린), 보디피(bodipy) 염료(예를 들어, 보디피 FL), 케스케이드 블루(cascade blue), 플루오레신 및 그의 유도체(예를 들어, 플루오레신 아이소티오사이아네이트), 오리곤 그린(Oregon green), 로다민 염료(예를 들어, 텍사스 레드 및 테트라메틸로다민), 에오신 및 에리트로신, 사이아닌 염료(예를 들어, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7), 플루오르X(FluorX), 란탄계 이온(예를 들어, 콴툼(quantum) 염료, 상표명)의 마크로사이클릭 킬레이트, 형광 에너지 전달 염료(예를 들어, 티아졸 오렌지-에티듐 헤테로다이머), TOTAB, 단신 등을 들 수 있다. 검출 시약에 연결하기 위한 작용성을 갖거나, 상기 작용성을 혼입하도록 개질될 수 있는 개개의 형광 화합물로는, 예를 들어 단실 클로라이드; 3,6-다이하이드록시-9-페닐크산티드롤과 같은 플루오레신; 로다민 아이소시오사이아닌;N-페닐 1-아미노-8-설포네이토나트탈렌; N-페닐 2-아미노-6-설포네이토나프탈렌; 4-아세트아미도-4-아이소티오시아네이토-스틸벤-2,2'-다이설폰산; 피렌-3-설폰산; 2-톨루이디노나프탈렌-6-설포네이트; N-페닐-N-메틸-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트; 에티듐 브로마이드; 스테프라인; 아우로마인-0,2-(9'-안트로일)팔미테이트; 단실 포스페이티딜에탄올아마인; N,N'-다이옥타데실 옥사카보사이아닌; N,N'-다이헥실 옥사카보사이아닌; 메로사이아닌; 4-(3'-피레닐)스테아레이트; d-3-아미노데속시-에퀼레닌; 12-(9'-안트로일)스테아레이트; 2-메틸안트라센; 9-비닐안트라센; 2,2'-(비닐렌-p-페닐렌)비스벤즈옥사졸; p-비스(2-메틸-5-페닐-옥사졸릴))벤젠; 6-다이메틸아미노-1,2-벤조페나진; 레틴올; 비스(3'-아미노피리디늄) 1,10-데칸디일 다이요오다이드; 헬리브리에닌(hellibrienin)의 설포나프틸하이드라존; 클로로테트라사이클라인; N-(7-다이메틸아미노-4-메틸-2-옥소-3-크로멘일)말레이미드; N-(p-(2-벤즈이미다졸일)-페닐)말레이미드; N-(4-플루오르안틸)말레이미드; 비스(호모바닐산); 레사자린; 4-클로로-7-니트로-2,1,3-벤즈옥사다이아졸; 메로사이아닌 540; 레소루핀; 로즈 벵갈(rose bengal); 및 2,4-다이페닐-3(2H)-루라논을 들 수 있다(예를 들어, 문헌[Kricka, 1992, Non-isotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif.] 참조). 많은 플루오레신 태그(tag)는 시그마 케미칼 캄파니(미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 아머샴(Amersham), 몰레큘라 프로브스, R&D 시스템즈(R&D systems, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재), 파마시아 LKB 바이오텍크놀로지(Pharmacia LKB Biotechnology, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 클론테크 레보러토리즈 인코포레이티드(CLONTECH Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), 켐 진스 코포레이션(Chem Genes Corp.), 알드리히 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company, 미국 위시콘신주 밀워키 소재), 글렌 리서치 인코포레이티드(Glen Research, Inc.), 집코 BRL 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(GIBCO BRL Life Technologies, Inc., 미국 메릴랜드주 가이터버그), 플루카 케미카-바이오케미카 아날리티카(Fluka Chemica-Biochemika Analytika, 스위스 부크스 플루카 케미 아게 소재), 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 뿐만 아니라 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 기타 제품 공급체로부터 시판된다.
화학발광 라벨로는 루시페린 및 2,3-다이하이드로프탈아진다이온, 예를 들어 루민올을 들 수 있다. 흥미 있는 동위원소 잔기 또는 라벨로는32P,33P,35S,125I,2H,14C 등을 들 수 있다(문헌[Zhao et al. (1995) Gene 156:207; Pietu et al. (1996) Genome Res. 6:492] 참조).
라벨은 검출가능한 신호를 제공하기 위한 동일한 시스템의 1종 이상의 부가적인 일원에 관해 작용하는 신호 발생 시스템의 일원이다. 상기 라벨의 예로는 리간드, 예를 들어 비오틴, 플루오레신, 디옥시제닌, 항원, 다가 양이온, 킬레이트기 등과 같은 특정한 결합 쌍의 일원이며, 이때 상기 부가적인 일원은 신호 발생 시스템의 부가적인 일원에 특이적으로 결합하고, 상기 부가적인 일원은 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공하며, 이들은, 예를 들어 기질을 발색성 생성물로 전환할 수 있는 형광 잔기 또는 효소 잔기에 접합된 항체, 예를 들어 알칼라인 포스파타제 접합 항체 등이다. 사용될 수 있는 시약의 예시적인 쌍으로는 효소와 효소 기질, 항원과 항체, 비오틴과 아비딘(또는 스트렙타비딘), 면역그로블린과 단백질 A 또는 단백질 G, 및 탄수화물과 렉틴을 들 수 있다.
적절한 효소의 존재하에 형광 침전물을 생성하는 수단으로서 효소 기질은 하우그랜드에게 허여된 미국 특허 제 5,316,906 호(1994) 및 하우그랜드에게 허여된 미국 특허 제 5,443,986 호(1995)에 개시되어 있다.
예를 들어, 6G3과 함께 사용될 수 있는 것으로, 항체의 불변 영역을 인식하는 예시적인 라벨링된 항체는 형광 색소, 예를 들어 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 448(몰레큘라 프로브스, A-11011), 플루오레신 아이소티오사이아닌(FITC), 파이코에리트린(PE), R-파이코에리트린(R-PE), 사이-크롬(Cy-Chrome, 상표명), 및 PerCP(BD 파밍겐(BD PharMingen))으로 라벨링된 항체를 들 수 있다. 항체는 또한 알로파이코사이아닌(APC) 및 텍사스 레드(상표명)에 접합될 수 있다. 이같은 라벨링된 2차 항체는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있거나, 수많은 제품 공급체로부터 구입가능하다. 기타 적합한 부가적인 검출 시약으로는 쿤(Kuhn) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,453,517 호(1995); 쿤 등에게 허여된 미국 특허 제 5,405,975 호(1995); 및 문헌[Haugland, supra]에 기술된 것과 같은 선택된 형광 pH 또는 금속 이온 지시계를 들 수 있다. 또 다른 흥미 있는 라벨로는 미국 특허 제 5,563,037 호, 국제 특허 공개공보 제 WO 97/17471 호 및 국제 특허 공개공보 제 WO 97/17076 호에서 기술된 것을 들 수 있다.
함께 측정될 상이한 표지상에서 사용하기 위한 구별가능한 라벨의 예는 당해기술분야에 널리 공지되어 있으며, 2종 이상의 상이한 방출 파장 형광 염료(예를 들어, Cy3과 Cy5); 형광 단백질과 염료의 조합(예를 들어, 파이코에리트린과 Cy5); 방출의 상이한 에너지를 갖는 2종 이상의 동위원소(예를 들어,32P와33P); 상이한 산란 스펙트럼을 갖는 금 또는 은 입자; 온도, pH, 부가적인 화학 학품의 처리 등과 같은 상이한 처리 조건하에 신호를 발생하거나, 처리 이후의 상이한 시점에서 신호를 발생하는 라벨를 들 수 있다. 신호 발생을 위해 1종 이상의 효소를 사용하면 효소의 상이한 기질 특이성(알칼라인 포스파타제/퍼옥시다제)에 기초하여 훨씬 더 다양한 구별가능한 라벨을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 방법은 세포를 고정시키기에 적합한 용액에서 및 시간 동안 세포를 고정시키는 단계를 포함한다. 이어, 세포를 상기 방법에서 사용된 염색액에 적합한 세포의 투과성화를 위해 시약을 포함하는 용액에서 배양한다. 세포는 바람직하게는 특정한 유사분열성 표지 및 선택적으로는 2차 검출 시약에 대해 세포를 투과성화하기에 충분한 시간 동안 세정제를 함유하는 용액에서 배양된다. 투과성화 단계는 선택적이고, 세포 비투과성 표지 또는 검출 시약이 사용되는 경우에만 필요하다. 이어, 세포를 표지가 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 100%의 이의 표적 분자에 결합하기에 충분한 양에서 및 시간 동안 제 1 표지, 예를 들어 유사분열성 표지의 존재하에 배양할 수 있다. 제 1 표지와 함께 배양한 후, 세포를 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 100%의 이의 표적 분자와 반응하기에 충분한 양에서 및 시간 동안 2차 검출시약과 함께 배양할 수 있다. 세포를 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 100%의 이의 표적 분자와 반응하기에 충분한 농도에서 및 시간 동안 제 2 표지, 예를 들어 정량적 DNA 염색액과 함께 배양할 수 있다.
표지가 세포에 첨가되는 순서가 중요하다. 예를 들어, 정량적 DNA 염색액을 첨가한 후에 유사분열성 표지를 첨가할 수 있다. 2차 검출 시약은 2차 검출 시약이 인식하는 시약으로 세포를 염색한 후에 첨가한다. 2차 검출 시약을 세포가 2종 이상의 표지로 염색된 후에 첨가할 수 있다.
따라서, 예시적인 실시태양에서, 약 1 내지 10×106세포를 PBS에서 세척하고, -20℃에서 70% 에탄올에서 고정시켰다. 이어, 세포를 원심분리하고, 세포를 투과성화하기에 충분한 시간 동안 약 0.05 내지 약 1% PBS/트윈 80, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.5% PBS/트윈 80, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.2% PBS/트윈 80에서 배양함으로써 투과성화한다. 적절한 시간은 세포의 유형에 따라 좌우될 것이고, 소규모 분석법에서 측정될 수 있다. 일반적으로, 실온에서 약 5 내지 약 30분, 바람직하게는 약 10 내지 약 20분, 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 15분 동안의 배양이 세포를 투과성화하는데 적절할 것이다. 세포를 원심분리하고, 셀 시그날링 테크놀로지(미국 메사추세츠주 비벌리 소재)로부터 시판되는 용액으로부터 약 100 내지 1,000배, 바람직하게는 약 300 내지 700배, 가장 바람직하게는 약 400 내지 500배 희석된 H3(Ser 10) 6G3 항체를 함유하는 용액에서 세포 펠릿을 재현탁하였다. 세포를 37℃에서 약 10분 내지 1시간, 바람직하게는 약 30 분 내지 1시간, 가장 바람직하게는 약 40 분 동안 배양하였다. 이어, PBS를 용액에 첨가하고, 세포와 혼합하고, 세포를 원심분리하였다. 이어, 알렉사 플루오르 488 라벨링된 2차 항체에서 세포 펠릿을 재현탁하고, 37℃에서 약 10 내지 60분, 바람직하게는 약 20 내지 약 40분, 가장 바람직하게는 약 30분 동안 배양하였다. PBS를 세포에 첨가하고, 세포와 혼합하고, 세포를 원심분리하고, 펠릿을 요오드화프로피듐, 및 선택적으로는 RNase를 포함하는 용액에서 재현탁하였다. 요오드화프로피듐은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100㎍/㎖ 이상, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10㎍/㎖ 이상, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 5㎍/㎖ 이상의 농도로 존재한다. RNase는 바람직하게는 약 10 내지 약 1,000㎍/㎖ 이상, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500㎍/㎖ 이상, 가장 바람직하게는 약 100 내지 약 300㎍/㎖ 이상의 농도로 첨가된다. 배양은 바람직하게는 1분 이상, 바람직하게는 약 10분 이상 동안 얼음상에서 수행한다. FACS 분석 이전에 세포를 4℃에서 저장할 수 있다. 유세포 분석법에 의해 DNA 함량(형광 강도), 이수성(배수성을 포함함) 및 세포 주기 분석을 위해 세포를 분석하였다.
하나 또는 두 개의 표지로 염색한 세포를 분석하기 위한 바람직한 방법은 다중-파라미터(또는 색상) 표시를 사용하는 유세포 분석법 또는 레이저 주사 세포 분석법에 의한 것이다. 더욱 더 바람직한 실시태양에서, 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 염색된 세포를 2-파리미터 유세포 분석법에 수행하였다. 이는 DNA 함량에 대해 유사분열 세포의 시각화를 허용하고, 예를 들어 이상 염색체 함량, 예를 들어 이수성 또는 배수성을 갖는 유사분열 세포의 상이한 아형 개체군의 시각화를 허용한다. 또한, 유세포 분석법은 유사분열 세포의 아형 개체군을 단리할 수 있고, 예를 들어 보다 적은 염색체를 갖는 모든 세포가 하나의 시험관에서 단리될 수 있고, 과도한 염색체를 갖는 모든 세포가 제 2 시험관에서 단리될 수 있다. 따라서, 세포의 다중 아형 개체군을 각각으로부터 또는 기타 세포로부터 분리할 수 있다. 이어, 세포의 이러한 개체군을 추가로 검토할 수 있다.
유세포 분석법은 본원에서 추가로 기술되고 당해 기술분양에서 공지된 바와 같이 형광 활성화 세포 분류기(fluorescent activated cell sorter, FACS)에 의해 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 FACS 기기로는 FACS-칼리버(FACS-Calibur, 미국 캘리포니아주 마운튼 뷰 소재의 벡톤 디킨슨), 코울터(Coulter) 유세포 분석기(미국 플로리다주 하이알리아 소재)인 EPICS 엘라이트(EPICS Elite, 등록상표)를 들 수 있다. 셀퀘스트(미국 캘리포니아주 마운튼 뷰 소재의 벡톤 디킨슨), 윈리스트(WinList, 미국 메인주 톱샴 소재의 베리티 소프트웨어 하이스(Verity Software House)), 멀티사이클 소프트웨어(Multicycle software, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 피닉스 플로우 시스템즈(Phoenix Flow Systems)) 및 FACScan(미국 캘리포니아주 마운튼 뷰 소재의 벡톤 디킨슨) 소프트웨어를 사용하여 정량화를 수행하였다.
유세포 분석법을 각각의 세포와 연관된 발광 물질의 양 및 기타 파라미터를 측정하고, 예를 들어 히스토그램, 도트 플럿 또는 분류 표의 형태로 결과를 제공한다. 각각의 세포와 연관된 하나의 발광 물질의 양을, 세포 개체군이 또한 노출되었던 다른 발광 물질의 양, 크기, 과립성 또는 고유 발광과 같은 그 세포의 기타특성과 비교할 수 있다.
세포를 함유하는 시쓰 유체(sheath fluid)가 전형적으로는 하나씩 레이저를 통과함에 따라, 이들은 다양한 파장의 광에 노출된다. 세포 분석기에 의해 검출된 각각의 입자는 "사건"으로 지칭된다. 사건이 입사광의 일부를 투과하거나, 산란시키는 정도는 사건의 특성, 예를 들어 연관된 발광 물질의 측정치를 제공한다. 예를 들어, 사건은 자발적으로 발광할 수 있거나, 사건에 도입된 형광 물질에 의해 발생된 형광 광을 방출할 수 있다. 각각의 물질의 예는 형광물질 접합된 항체이다. 항체는 사건의 성분에 부착되고, 형광물질은, 예를 들어 세포 분석기의 광증폭관(PMT)에 의해 검출되는 공지된 빈도로 발광함으로써 특정한 빈도의 입사광에 반응한다. 방출광 또는 반사광의 강도를 세포 분석기에 의해 측정하고 저장한다.
세포 분석기는 방출 데이터를 히스토그램으로 편집한다. 히스토그램은 1차원 형태로 기록될 수 있다. 다르게는, 이는 기타 입사 파장으로부터 기인하는 방출광의 히스토그램과 조합될 수 있다. 이러한 조합은 전형적으로 사건이 그리드상에서 플러팅되고, 그리드의 축이 측정된 2개의 파라미터에 상응하는 "도트 플럿"으로서 기록된다. 예를 들어, 사건이 약 488㎚의 입사광에 노출될 수 있고, 530㎚ 파장에서 전방 광 산란 및 방출에 대해 분석하였다. 이 파장은 레이저 주사 세포 분석법에서 사용된 전형적인 플루오로크로마(fluorochroma)인 플루오레신 아이소티오사이아네이트(FITC)에 대한 피크 방출 파장에 상응한다.
레이저 주사 세포 분석법으로부터의 전형적인 2차원 도트 플럿 결과에서, 유사분열 세포는 비유사분열성 G2개체군으로부터 분리될 것이다. 유사분열 개체군은 서로에 대해 정량화될 수 있고, 이들 주변에 "관문"을 생성함으로써, 예를 들어 유사분열 세포의 DNA 함량을 확립하기 위해 허용될 수 있는 최소 및 최대 염색 정도에 대한 문턱값을 설정함으로써 미분화 개체군의 DNA 함량에 대해 정량화될 수 있다.
유사하게는, 세포 개체군의 소부분을 이들의 DNA 함량에 기초하여 분리할 것이다. 유사분열 세포의 정상 4n DNA 함량에 상응하는 요오드화프로피듐 염색에서 피크가 발생할 것이다. 배수체 세포에 가능한 한 상응하는 반수체 수(n)의 고도의 배수에서 피크가 발생할 수도 있다. 요오드화프로피듐 염색이 반수체 수(n)의 배수에 상응하지 않는 경우에 피크 및 상기 배경 평원이 발생할 것이다. 이들 사건은 염색체의 부가적인 일부를 갖거나 염색체의 일부가 없는 이수성 세포 또는 세포들에 상응할 수 있다. 관문을 형성하여, 하기 실시예에서 기술된 바와 같이 DNA 함량이 상이한 세포로부터 다양한 범위의 DNA 함량을 갖는 세포를 구별할 수 있다.
2-색 유동 분석에서, 흥미 있는 2개의 표지는 레이저 주사 세포 분석법에서 이들을 구별할 수 있기 위해 매우 상이한 형광 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 포스포히스톤 H3(Ser10) 6G3 단일클론성 항체를 FITC에 접합할 수 있다. 이어, 이 항체로 태깅된 세포는 약 488㎚의 입사광에 반응하여 약 520㎚에서 발광할 수 있다. 대조적으로, 요오드화프로피듐은 560에서 670㎚ 이하까지 방출한다. 따라서, 이 범위에서 민감성이 되도록 조절된 PMT는 H3-(Ser 10) 6G3-FITC로부터 2개의 신호를 구별할 수 있고, 요오드화프로피듐으로부터 기타 신호를 구별할 수 있다.
이어, 각각의 사건은 H3-(Ser 10) 6G3 염색의 양에 따라 "유사분열 상태" 또는 "비유사분열 상태"로서 관문화될 수 있다. 이어, 유사분열 세포는 미분화 개체군에서 요오드화프로피듐 염색의 양에 따라 "정배수체", "이배체", "이수체", "배수체", "하이퍼-이배체", "하이포-이배체" 등으로서 관문화될 수 있다.
유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액을 사용하여 유사분열 세포 및 이들 세포의 DNA 함량을 확인하는 기타 방법으로는 조직 화학법, 면역 조직 화학법, 면역 세포 화학법 및 당해 기술분야에 공지된 기타 분자 생물학 기법을 들 수 있다. 이들 기법은 유세포 분석과 조합될 수 있다. 예를 들어, 유사분열 세포는 유세포 분석법을 통해 기타 세포로부터 분리될 수 있다. 이어, 이들 세포를 비-유세포 분석법을 사용하여 DNA 함량에 대해 분석할 수 있다.
한 실시태양에서, 세포에서 수치적 염색체 이상, 예를 들어 배수성의 발생을 야기하는 시약을 확인하기 위해 상기 방법을 사용한다. 이러한 시약으로는 세포 독성제, 예를 들어 암 유발제를 들 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 방법은, 존재하는 경우에 시약이 딸세포에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상의 발생을 유도하기에 충분한 시간 동안 세포를 시험 시약과 접촉시킨 이후에 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 세포를 염색하는 단계, 및 수치적 염색체 이상을 검출하기 위해 유사분열시의 DNA의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 하나 이상의 딸세포에서의 하나 이상의 수치적 염색체 이상이 존재하면 시험 시약이 수치적 염색체 이상을 유도하는 시약임이 증명된다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은, 존재하는경우에 시약이 세포에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상의 발생을 유도하기에 충분한 시간 동안 세포 개체군을 시험 시약과 접촉시킨 이후에 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 세포를 염색하는 단계, 및 수치적 염색체 이상을 검출하기 위해 유사분열시의 DNA의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 하나 이상의 세포에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상이 존재하면 시험 시약이 수치적 염색체 이상을 유도하는 시약임이 증명된다. 본 발명의 방법은 수치적 염색체 이상의 유형, 즉 이상이 이수성 또는 배수성이거나, 염색체의 과도한 일부분 또는 결손된 일부분인지의 여부를 측정할 수 있다.
시험 시약은 작은 유기 분자와 같은 임의의 분자 또는 착체일 수 있다. 예를 들어, 시험될 수 있는 시약으로는 잠재적 이수성을 측정하기 위한 잠재적인 치료제를 들 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 주요한 약학 화합물의 이수성을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 이어, 이수성인 것으로 밝혀진 화합물을 구조적으로 변화시켜 이들의 이수성을 감소시키려고 하였으며, 이들 각각의 화합물은 본 발명의 방법에 따라 이의 이수성에 대해 시험할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 세포의 개체군에서 하나 이상의 수치적 염색체 이상을 갖는 하나 이상의 세포를 확인하고/하거나 검출하기 위해 사용될 수 있다. 세포의 개체군이, 예를 들어 객체의 생체검사일 수 있다. 상기 방법은 이상 세포, 예를 들어 암 세포의 존재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 사실, 수많은 암 세포가 이수체 또는 배수체라는 것이 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 방법은 수치적 염색체 이상과 연관된 질병의 단계를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 각각의단계는 수치적 염색체 이상의 존재와 상호 연관되어 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 개체군에서의 질병의 존재를 진단하거나, 객체가 질환을 발병시킬 수 있는지의 여부를 예상하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법으로 진단할 수 있고 염색체 이상과 연관된 것으로 나타난 예시적인 질환으로는 종양, 예를 들어 악성 조직구증식, 급성 단핵구성 백혈병 및 대세포 림프종과 같은 악성 조직구성 질병; 모근 세포 백혈병, T-세포, HTLV-II-연관된 백혈병, B-세포 백혈병, T-세포 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 비만세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 필라델피아-네가티브(Philadelphia-Negative) 골수성 백혈병, 필라델피아-포지티브(Philadelphia-Positive) 골수성 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 급성 비림프성 백혈병 및 형질세포성 백혈병과 같은 백혈병; 림프관종, 림프관근종, 림프관근종증 및 림프관육종과 같은 림프관 종양; 호지킨병, 면역증식성 소장 질환, 레테러시웨병, 비호지킨 림프종, B-세포 림프종, 미만성 림프종, 모낭성 림프종, 악성 림프종, 중성 림프종, 대세포 림프종, 양성 림프종, 혼합 세포 림프종, 소세포 림프종, T-세포 림프종, 미분화 림프종, 형질세포증, 다발성 골수종, 세망내피종 및 비만세포 육종과 같은 림프종; 아데노림프종, 다형성 선종, 선근종, 선육종, 선편평세포 암종, 암육종, 간아세포종, 간엽종, 중배엽성 혼합 종양, 뮐러 혼합 종양, 근상피종, 신모세포종, WAGR 증후군, 중배엽성 신종, 폐 모세포종, 횡문양 종양, 간질내막육종 및 흉선종과 같은 혼합 및 복합 종양; 혈관지방종, 신혈관근지방종, 지방종, 지방육종, 근지방족, 연골모세포종, 연골종, 연곡육종, 점액종, 점액육종, 골화 섬유종,뼈의 거대세포 종양, 골아세포종, 골연골종, 골연골종증, 골종, 골육종, 유잉육종, 피부섬유종, 섬유성 조직구종, 섬유종, 결합조직형성 섬유종, 골화 섬유종, 복부 섬유종증, 침습성 섬유종증, 섬유육종, 피부섬유육종, 신경섬유육종, 근섬유종증, 선암종, 브레너 종양, 섬유선종, 투명세포육종, 소세포육종, 활액막육종, 과립세포 종양, 평활근종, 평활근육종, 근종, 횡문근종, 근육종, 횡문근육종, 포상연부육종, 혈관주위세포종, 지방육종, 림프관육종, 점액육종, 엽상종양 및 카포시 육종과 같은 연결 및 연조지 종양; 배아 암종, 척삭종, 유피상종, 배아종, 정낭피중신종, 신경외배엽성 종양, 기형암종, 기형종 및 융모성 종양과 같은 생식 세포 및 배아세포 종양; 선종 및 선암, 기저세포 암종, 기저세포 모반 증후군, 염기성편평 암종, 털기질종, 침투관 암종, 비침투성 담관내 암종, 유방 페젯트병, 소엽 암종, 척수 암종, 위장관 암종, 유방외 페젯트병, 유관 유두종, 점액성 선암, 점액표피양 암종, 인환세포형 암종, 크루켄베르크 종양 , 낭선암종, 낭선종, 유선종성종양, 중피종, 유두상 암종, 편평세포 암종, 사마귀 암종, 유두종, 도립유두종 및 포낭성 중피종과 같은 과립성 및 상피성 종양; 신경교종, 성상세포종, 상의세포종, 신경절교종, 신경교육종, 수아세포종, 핍지교종, 시신경교종, 신경세포종, 송과체종 및 망막아세포종과 같은 신경상피 종양; 부부신 종약, 부신아세포종, 과립막세포종양, 레이디히 세포종, 황체종, 셀토리(Sertoli) 세포종 및 성삭종-간질 종양과 같은 생식선 조직 종양; 수막종, 신경초종, 신경섬유종, 망상 신경섬유종, 신경섬유종증, 신경섬유육종, 신경종, 신경초종, 두개인두종 및 신경초 점액종과 같은신경 조직 종양; 혈관모세포종, 맥관각화증, 사구종양, 혈관종, 혈관내피종 및 혈관주피종과 같은유관속 조직 종양; 및 에나멜모세포종, 치조골막종, 석화 치원성낭 및 치아종과 같은 치성종양을 들 수 있다.
이상 배수성 또는 세포성 DNA 질량과 연관된 기타 질환으로는 클라인펠터 증후군, 터너 증후군, 다운 증후군, 유약 X 증후군, 헌팅톤 증후군, 트리플로-X 증후군, 테트라-X 증후군, 펜탄-X 증후군, XYY 증후군, 7, 10, 11, 13, 18, 21, X 및 Y를 비롯한 임의의 염색체의 일염색체성 또는 다수 염색체성, 류마티스성 관절염 및 골관절염을 들 수 있다.
추가로, 본 발명은 세포에서 수치적 염색체 이상을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 아뉴겐인 화합물을 확인하거나, 시료에서 수치적 염색체 이상을 확인하기 위한 키트일 수 있다. 키트는 유사분열성 표지 또는 정량적 DNA 염색액과 같은 하나의 표지를 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 키트는 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액과 둘다를 포함한다. 키트가 포함할 수 있는 기타 성분으로는 부가적인 표지, 검출 시약, 완충액, 고정 시약, 투과성화 시약, RNase, 네가티브 또는 포지티브 대조군, 및 생물 시료를 수득하기 위한 장치를 들 수 있다. 상기 키트는 또한 사용 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액을 포함하는 조성물을 제공한다.
실시예에 의해 본 발명을 추가로 예시하지만, 본 발명은 임의의 방식으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 실행은 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이며, 이들은 당해 기술분야의 기능내에 있다. 이러한 기법을 하기 문헌에서 상세하게 설명한다. 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)]; 문헌[DNA Cloning, Volumes I and II(D.N. Glover ed., 1985)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed., 1984)]; 뮬리스(Mullis) 등에게 허여된 미국 특허 제 4,683,195 호; 문헌[Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)]; 문헌[Transcription And Translation(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)]; 문헌[Culture Of Animal Cells(R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)]; 문헌[Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986)]; 문헌[B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; 문헌[the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.)]; 문헌[Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)]; 문헌[Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155(Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)]; 문헌[Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조한다.
실시예는 세포 주기 분석을 위해 유사분열 특이적 생물 표지인 포스포-히스톤 H3(Ser-10) 6G3 단일클론성 항체(H3-P) 및 DNA 함량을 분석하기 위해 요오드화프로피듐으로 염색된 세포에 대해 2-색 유세포 분석의 사용을 논증한다. H3-P 생물 표지가 간기 개체군(예를 들어, G0, G1, S 및 S2)으로부터 유사분열 개체군을 구별하므로, DNA 함량의 분석을 유사분열 세포에 제한함으로써, 예를 들어 이수성 및 배수체 세포 개체군을 용이하게 측정할 수 있다. 3개의 공지된 안뉴젠(노스카핀 콜세미드(등록상표) 및 그리세오풀빈), 이수성이 아닌 배수성의 공지된 유도체(사이토카신 B(Cytochasin B)) 및 이수성 및/또는 배수성을 유도하는 것으로 예상되지 않는 독성 화합물(시안화칼륨)로 정제되고 자극받은 인간 림프구에서 24시간 처리로부터의 유도 데이터가 하기에 개시되어 있다. 데이터는, 유세포 분석법에 의한 수치적 염색체 이상, 예를 들어 이수성 및 배수성에 대한 유사분열 개체군의 분석이 이들 세포 개체군을 분석하는 표준 수동 현미경법에 상응한다는 것을 나타낸다. 또한, 본원에서 기술된 방법을 사용하면 분석 속도가 상당히 증가되고, 데이터의 변이성이 감소되며, 유사분열 개체군에서의 수많은 변이의 측정이 전반적으로 개선될 것이다.
실시예 1:노스카핀 하이드로클로라이드 처리된 인간 림프구 배양액에서의 수치적 염색체 이상의 유세포 분석 측정
인간 림프구를 헤파린화 진공 시험관에서 정맥천자에 의해 건강한 도너로부터 수득하였다.
말초혈을 건강한 남성 및 여성 지원자(40세 초과)로부터 헤파린화 진공 시험관에서 수집하였다. 전체 혈액 약 10㎖를 멸균된 포스페이트 완충 염수 약 10㎖를 함유하는 림포프렙(Lymphoprep, 상표명) 시험관(노르웨이 오슬로 소재의 나이코메드 파마 AS 다이아그노스틱(Nycomed Pharma AS Diagnostic))에 분배하였다. 2,000rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 림프구 개체군을 분리하고, PBS로 세척하였다(1회). 단리된 림프구의 저장 배양액을 10% 소 태아 혈청, 100U/㎖ 페니실린 및 100μg/㎖ 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민 및 1.0% 파이토헤마글루타닌-M 형으로 보충된 윌리암스(Williams) E 배지에서 확립하였다(모든 시약은 뉴욕 그랜드 아이스랜드 소재의 집코 BRL 라이프 테크놀로지스의 제품임). 저장 배양액을 5% CO2분위기하에 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 림프구를 37℃에서 24 시간 동안 공지된 아뉴젠인 노스카핀(시그마 케미칼즈) 0 내지 100㎍/㎖로 처리하였다.
이어, 노스카핀 처리 및 미처리 림프구를 1,000rpm에서 6분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 림프구를 포스페이트 완충 염수(PBS, 집코 BRL) 5㎖에 재현탁하였다. 이어, 림프구를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포를 PBS 0.5㎖에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 9-인치 파스테르 피펫(킴블 글라스 인코포레이트드(Kimble Glass Inc.))을 통해 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 확보하였다. -20℃(70%) 에탄올(약 4.5㎖ 부피)을 함유하는 시험관을 볼텍싱하면서, 세포 현탁액을 적가하였다. 증류수 30㎖를 팜코 프로덕츠(Phamco Products) 제품의 200 프루프에틸 알콜(proof ethyl alcohol) 70㎖에 첨가함으로써 에탄올 용액을 제조하였다. 이어, 세포를 -20℃에서 24시간 이상 동안 에탄올에서 저장하였다.
유동 분석용 시료 및 대조군을 하기와 같이 준비하였다.
(1)H3-P(블랭크)
-20℃에서 24시간 이상 동안 저장된 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 0.1%PBS/트윈 80 1 내지 3㎖에 재현탁하였다. 시그마 케미칼즈 제품의 트윈 80 1㎖를 PBS 1,000㎖에 혼합함으로써 이러한 후자의 용액을 준비한다. 세포를 실온에서 10 내지 15분 동안 배양하였다. 이어, 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 원발성 H3-P 항체 용액(셀 시그날링 테크날로지 제품 번호: 9706L; 항체 36㎕를 PBS 14.4㎖에 혼합함으로써 항체를 희석함) 400㎕에 재현탁하였다. 세포는 37℃에서 40분 동안 배양하였다. PBS 5.0㎖를 세포에 첨가하고, 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 PBS 1㎖에 재현탁하였다. 세포를 분석할 때까지 상기와 같이 저장하였다.
(2)H3-P + PI(적색)
"블랭크" 대조군에 대해 상기에서 기술된 바와 같이, -20℃에서 24시간 이상 동안 저장된 세포를 H3-P 항체로 염색하였다. 항체로 40분 동안 배양한 후, PBS 5.0㎖를 세포에 첨가하고, 세포를 원분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 요오드화트로피듐/RNase A 염색액 1㎖에 재현탁하였다. PBS 20㎖중의 RNase A(BD 클론테크 제품 번호:4030-1) 및 요오드화프로피듐(몰레큘라 프로브스 제품 번호: P-3566(1㎎/㎖))을 혼합함으로써 이러한 후자의 용액을 준비한다. 세포를 분석할 때까지 상기와 같이 저장하였다.
(3)H3-P + 알렉사(녹색)
"블랭크" 대조군에 대해 상기에서 기술된 바와 같이, -20℃에서 24시간 이상 동안 저장된 세포를 H3-P 항체로 염색하였다. 항체로 40분 동안 배양한 후, PBS 5.0㎖를 세포에 첨가하고, 세포를 원분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 알렉사 플루오르 488 염소 항-생쥐 IgG(H+L) 접합체(2㎎/㎖) 400㎕에 재현탁하였다. 알렉사(몰레큘라 프로브 제품 번호: A-11011) 13.5㎕를 PBS 13.5㎖에 첨가하고, 광이 없는 곳에 이를 저장함으로써 알렉사 플루오르 시약을 준비하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어, PBS 5.0㎖를 세포에 첨가하고, 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 PBS 1.0㎖에 재현탁하였다. 세포를 분석할 때까지 얼음에 저장하였다.
(4)대조군 및 처리 배양액에 대한 H3-P + 알렉사 + PI(이중 색상)
H3-P + 알렉사(녹색) 염색된 세포에 대해 상기에서 기술된 바와 같이, -20℃에서 24시간 이상 동안 저장된 세포를 H3-P 항체 및 알렉사 플루오르로 염색하였다. 37℃에서 30분 동안 알렉사 플루오르와 함께 세포를 배양한 후, PBS 5.0㎖를 세포에 첨가하고, 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 PI/RNase A 염색액(상술된 바와 같음) 1.0㎖에 재현탁하였다. 세포를 분석할 때까지 얼음에 저장하였다.
벡톤 디킨슨(BD) 유세포 분석기(488 아르곤 레이저)를 사용하여 세포를 분석하였으며, 하기와 같이 측정하였다. 시쓰 유체(FACSFlow, 벡톤 디킨슨 제품 번호:340398) 1㎖를 캐핑된 12×75 팰콘 폴리스티렌 둥근 바닥 시험관(제품 번호: 35205)에 첨가하였다. 시쓰 유체 3㎖를 제 2 캐핑된 12×75 팰콘 5㎖ 폴리스티렌 둥근 바닥 시험관에 첨가하였다. 액을 분배하기 전에 라벨링되지 않은 비드를 수회 회전시킨 후, 한방울의 라벨링되지 않은 CaliBRITE(상표명) 비드(벡톤 디킨슨 제품 번호: 349502)를 각각의 시험관에 첨가하였다. 제 1 시험관은 라벨링된 시험관 A이었다. 각각 한방울의 플루오레신 아이소티오사이아네이트(FITC) 및 CaliBRITE(상표명) 파이코에리트린(PE) 비드를 제 2 5㎖ 시험관(시험관 B)에 첨가하였다. 기기를 작동시키기 전에, 시쓰 저장소를 정리하고, 폐기 탱크를 비웠다. 필요한 경우에 진공 라인을 시쓰 유체로 플러싱하였다. 세포 분석기를 켜고, 약 10분 동안 가온하였다. 컴퓨터를 켜고, FACSComp 소프트웨어(벡톤 디킨슨 애플 시스템즈(Becton Dickinson Apple Systems) 7.5.3 버젼 4.0)를 시작하였다.
측정 공정은 하기와 같이 수행하였다. CaliBRITE(상표명) 비드 롯트 정보를 "설정(Set-up)" 페이지에 기입하였다. 세포 분석기를 고속으로 설정하고, 중지에서 작동으로 이동시켰다. 세포 분석기상에서 물을 함유하는 5㎖ 시험관을 제거하고, 라벨링되지 않는 비드(시험관 A)를 세포 분석기에 놓았다. 라벨링되지 않는 비드가 "PMT"를 설정하도록 "작동(Run)"을 선택하였다. 프롬프트되었을 때, 시험관 A를 제거하고, 시험관 B로 대치하였다. 혼합 비드가 형광 보상 및 선택성 시험을 설정하도록 "작동"을 선택하였다. 이어, 시험관 B를 제거하고, 이어 물을 함유하는 5㎖ 시험관으로 대치하였다. 세포 분석기를 중지로 이동시키고, 측정 보고서를 인쇄하였다.
세포 분석기를 유사분열 세포의 존재 및 DNA 분석을 하기와 같이 측정하기 위해 설정하였다. 셀퀘스트(상표명) 소프트웨어(벡톤 디킨슨, 버젼 3.1)를 시작하였다. 선택 메뉴로부터 "세포 분석기로의 연결을 선택하기"를 선택하였다. 선택 메뉴로부터 "수득 및 저장을 선택하기"를 선택하였다. 사건의 수를 10,000 사건(디폴트)에 설정하였다. 이어, "수득 및 저장을 선택하기"에서 나왔다. 선택 메뉴로부터 "파라미터 설명을 선택하기"를 선택하였다. 파라미터 설명 창에서, 파일 메뉴, 파일 저장 위치 및 파라미터 라벨을 선택하였다. 선택 메뉴로부터 "계수장치를 선택하기"를 선택하여 사건 속도, 총 사건 및 수득 동안의 경과된 시간을 관찰하였다. 세포 분석기 메뉴로부터 "검출기/앰프스(Amps)를 선택하기"를 선택하여 각각의 파라미터에 대한 증폭기 모드(린(Lin) or 로그(Log))를 선택하였다. 메뉴로부터 "세포 분석기로부터의 상쇄를 선택하기"를 선택하여 시료에 대한 상쇄를 조정하였다.
수득치에 대한 도트 플럿 및 히스토그램 플럿을 하기와 같이 수득하였다. "도트 플럿 및 히스토그램 플럿"을 툴 바(tool bar)에서 선택하고, 하기와 같이 설정하였다:
1. 수득 도트 플럿: (X) 파라미터 = FSC-높이 1024 FSC(린 스케일), (Y) 파라미터 = SSC-높이 1024(린 스케일), 관문 없음, 선택 메뉴하에 "SHOW"는 2000도트로 설정하고, 이어 닫음.
2. 수득 히스토그램 플럿: 파라미터 = FL1-높이 1024(H3-P), 로그 스케일, 관문 없음, 선택 메뉴하에 "MANUAL SCALE"를 50으로 설정하고, "SHOW"는 2000 사건으로 설정하고, 이어 닫음.
3. 수득 히스토그램 플럿: 파라미터 = FL2-높이 1024(PI), 로그 스케일, 관문 없음, 선택 메뉴하에 "MANUAL SCALE"를 50으로 설정하고, "SHOW"는 2000 사건으로 설정하고, 이어 닫음.
4. 수득 히스토그램 플럿: 파라미터 = FL2-면적 1024(PI), 관문 없음, 선택 메뉴하에 "MANUAL SCALE"를 200으로 설정하고, "SHOW"는 모든 사건으로 설정하고, 이어 닫음.
5. 수득 도트 플럿: (X) 파라미터 = FL2-면적 1024(PI), 린 스케일, (Y) 파라미터 = FL2-너비 1024(PI), 린 스케일, 관문 없음(후에 설정됨), 선택 메뉴하에 "SHOW"는 모든 사건으로 설정하고, 이어 닫음.
6. 수득 도트 플럿: (X) 파라미터 = FL2-면적 1024(PI), 린 스케일, (Y) 파라미터 = FL2-높이 1024(H3-P), 로그 스케일, 관문 없음(후에 설정됨), 선택 메뉴하에 "SHOW"는 5000 도트에 대해 설정하고, 이어 닫음.
시료를 하기와 같이 수득하였다. 세포 분석기를 "저속"에서 "작동"으로 설정하고, 이어 블랭크(염료 없음) 시료를 세포 분석기에 놓았다. FSC/SSC 도트 플럿 패널을 관찰하면서, 도트 플럿상의 블랭크 세포 시료가 약 45°각으로 창에서 대각선으로 나타날 때까지 검출기/앰프스 창에서 전압 설정을 FSC 및 SSC 파라미터에 대해 변형하였다. 세포 시료의 베이스를 가능한 한 0 축-교차점에 가깝게 위치시킨다. 전압을 모든 또는 대부분의 세포가 필드에 나타날 때까지 계속해서 조절한다. 이어, FL1-높이 히스토그램을 관측하고, 블랭크 세포 시료가 히스토그램 패널의 좌측 4분면에 관측될 때까지 FL1 검출기의 전압을 증가시키거나 감소시킨다. 전압을 조정하여 세포 시료를 플럿의 0 축-교차점에 가능한 한 가깝게 한다(축의 좌측 방향으로 향하는 피크). 이어, FL2-높이 히스토그램을 관찰하면서, 블랭크 세포 시료가 히스토그램 패널의 좌측 4분면에 관측될 때까지 FL2 검출기의 전압을 증가시키거나 감소시킨다. 전압을 조정하여 세포 시료를 플럿의 0 축-교차점에 가능한 한 가깝게 한다(축의 좌측 방향으로 향하는 피크).
플랭크 시료를 제거하고, 녹색(알렉사 플루오르) 시료로 대치하였다. FL1-높이 히스토그램을 관찰하면서, FL1 검출기의 전압을 조정하여 세포 시료 피크를 도트 플럿의 0 축-교차점(전체 세포 피크가 도트상에서 관측되어야 함)에 가능한 한 가깝게 한다. FL2-높이 히스토그램을 관찰하면서, 필요한 경우에 상쇄(FL2 - % FL1)를 조정하였다. 작은 제 2 피크가 존재하는 경우에, 상쇄치는 제 2 피크가 사라질 때까지 증가하였다.
"녹색" 시료를 제거하고, "적색(PI)" 시료로 대치하였다. FL2-높이 히스토그램을 관찰하면서, FL2 검출기의 전압을 조정하여 103초과의 "적색" 세포 시료 피크를 (X) 축상에 위치하게 한다. 이렇게 조정하여 "적색" 세포 시료의 G1피크를 FL2-면적 히스토그램 및 FL2-면적/FL1-너비 도트 플럿에서 200 (X) 축 포인트에 위치하도록 했다. FL1-높이 히스토그램을 관찰하면서, 필요한 경우에 상쇄(FL1 - % FL2)를 조정하였다. 히스토그램에 하나의 피크만이 존재하고, 이 피크는 0 축-교차점에 근접하였다. 작은 제 2 피크가 존재하는 경우에, 상쇄치는 제 2 피크가 사라질 때까지 증가하였다.
"적색(PI)" 시료를 제거하고, "이중 색상(알렉사 및 PI)" 시료로 대치하였다. 전압을 최종적으로 조정하여 "이중 색상" 세포 시료의 G1피크를 FL2-면적 히스트그램에서 X-축의 200 정수위에 위치하도록 하였다. 이는 세포 시료를 FL2-면적/FL2-높이 도트 플럿상에 200 포인트위에 위치하도록 하였다. 2,000 내지 4,000개의 세포를 설정 모드에서 수득하여 순환 개체군(이 개체군은 미처리된 세포에서 X-축상의 200 내지 400개의 범위임)을 확인하였다. 순환 개체군의 약간의 좌측에서 시작하여 제 2 Y 축에서 도트 플럿 말단 관문의 극우 영역으로 이어지게 함으로써 DNA 분산치를 측정하기 위해 관문을 설정하였다. 도트 플럿의 제 2 Y-축으로의 이 관문의 확장은 4n 초과의 DNA를 갖는 세포를 수용한다는 것이다. FL2-면적(PI)/FL1-높이(H3-P) 수득 도트 플럿을 선택하고, 포맷(Format) 도트 플럿을 툴바로부터 선택하였다. 관문 G1=G2가 선택되었다. 이러한 조정은 수득 공정동안에 유사분열 세포를 관찰할 수 있게 한다. 유사분열 개체군은 둘다가 4n DNA를 함유하므로 G2개체군상에서 직접 나타난다.
출구된 기구는 모드를 수득 모드로 절정하였다. DNA 분석을 위한 수득을 시작하고, 10,000 비관문화된 세포를 수득하였다. 처리된 시료가 수득됨에 따라, (X) 측상의 G1피크의 이동 및 순환 세포 개체군의 확장이 관측되어, 세포의 순환 개체군이 도트 플럿의 끝에서 떨어져 나가는 경우에 이수성 및 배수성 수득(DNA 수득이 이어짐)을 위해 FL2 전압이 이후에 저하되었다. 필요한 경우에, 이수성 및배수성 수득을 위해 (즉, G1피크를 FL2-A x-축의 200으로 유지하기 위해) 시료에 따라 FL2 전압을 최적화하였다. 50,000개의 비관문화된 세포를 시료로부터 수득하였다. 데이터를 목록 모드 포맷에서 저장하였다.
림프구에서의 이수체 및 배수체의 존재를 하기와 같이 측정하였다. 셀퀘스트(상표명) 소프트웨어를 시작하고, 도트 플럿을 생성하기 위해 툴바로부터 대화 박스를 플롯팅하고 시작한다. "파일(FILE)"을 선택하고, 데이터 파일을 시작한다. "파라미터"를 설정하여 "순환 세포 개체군"을 확인하였다: (X) = FL2-면적 1024(PI) 및 (Y) = FL2-너비 1024, "옵션(OPTION)"은 "SHOW" 100%를 나타내고, 관문 없음. 도트 플럿을 종이의 너비까지 확장하였다. 순환 개체군의 약간 좌측에서 시작하여 제 2 Y-축에서 관문을 끝내는 도트 플럿의 극우 영역까지 이어지게 함으로써 DNA 분산에 대한 관문을 설정하였다. 제 2 Y-축까지의 이 관문의 확장은 4n 초과의 DNA를 갖는 세포를 수용한다는 것이다(도 1A 참조). "플럿" 및 "오픈" 대화박스를 도트 플럿을 생성하기 위한 툴바로부터 선택하였다. "파라미터"를 설정하여 "순환 세포 개체군"을 확인하였다: (X) = FL2-면적 1024(PI) 및 (Y) = FL1-높이 1024(H3-P), "옵션"은 "SHOW" 100%를 나타내고, 관문은 G1=R1로 설정됨.
간기 세포를 가이드로 사용하여, 제 1 관문을 G0G1-S기 면적 위의 유사분열 세포 면적에 대해 설정하였다. 이어, 제 1 관문의 끝에서 시작하여, 제 2 관문을 G2면적 위의 유사분열 세포에 대해 설정하였다(즉, 유사분열 세포중 가장 큰 개체군인 4n DNA). 제 2 관문의 끝에서 시작하여, 제 3 관문을 다음 세포 주기의 측정된 G0G1-S기 면적에 대해 설정하였다. 이 범위를 설정하기 위해, G2(X) 축의 값을 가이드로 사용하고, 상기 값의 배수는 다음 주기의 대략 G2면적과 동일시하며, 예를 들어 G2가 (X) 축(제 1 주기)상의 400에 위치하는 경우에 순환 D2세포의 제 2 개체군은 (X) 축상의 대략 800에서 나타나야 한다(도 1 참조). "STATS"를 툴바로부터 선택하고, "REGION GATE"를 선택하였다. 소프트웨어는 도트 플럿의 각각의 관문화된 영역에 대해 관문화된 개체군(%)을 자동적으로 산정하였다:
영역(ID): 관문(1): 영역 1(R1) = 순환 세포 개체군
관문(2): 영역 2(R2) = 하이포-이배체 유사분열 개체군
관문(3): 영역 3(R3) = 정상 분사분열 세포
관문(4): 영역 4(R4) = 하이퍼-이배체 유사분열 개체군
관문(5): 영역 5(R5) = 배수체 유사분열 개체군
도 2B는 영역 통계치의 예이다.
영역:
R1= 영역 1; 관문화된 간기 세포
R2= 영역 2; DNA 함량(2n 초과 4n 미만의 DNA)을 갖는 관문화된 유사분열 세포(하이포-이배체 세포 개체군)
R3= 영역 3; 4n의 DNA 함량을 갖는 관문화된 유사분열 세포(정상 세포 개체군)
R4= 영역 4; 4n 초과 8n 미만의 DNA 함량을 갖는 관문화된 유사분열 세포(하이퍼-이배체 세포 개체군)
R5= 영역 2; 8n의 DNA 함량을 갖는 관문화된 유사분열 세포(배수체 세포 개체군)
산정:
1. 하이포-이배체 세포의 빈도(%)
하기와 같이 DNA를 분석하였다. MODFITLT소프트웨어(미국 메인주 톱샴 소재의 베리티 소프트웨어 하우스), 버전 3.0)를 이 목적을 위해 사용하였다. 툴바로부터 "FILE"을 선택하고, 데이터 파일을 선택하였다. "분석 대화 박스용 파라미터 선택하기"에서, P6 FL2를 선택하였다. "관문 대화 박스 선택하기"에서, 박스를선택하지 않았다. 툴 박스로부터 MOD를 선택하였다. "수동 분석 대화 박스용 편집 특성"에서, 하기와 같이 선택하였다: 자가 잔해(체크), 자가 집성체(체크), 세포사멸(미체크), 2.00으로 설정된 1차 방정식, 표준(0) 모델 템플레이트 = 이배체, 범위 위치(Range Position)를 "범위 위치 계산하기"에서 설정되어야 한다. 툴바상의 "RANGE" 단추는 눌려져 있다(활성화되어 있다). G1및 G2피크는 자동적으로 동일화된다(도 3 참조). "FIT"는 툴바상에서 선택하고, G1, G2및 S기의 세포(%)를 MODFITLT소프트웨어에 의해 측정하였다(도 3 참조).
이수성 유도제인 노스카핀으로 처리된 인간 림프구의 유세포 분석의 결과는 도 2에 나타나 있다. 네가티브 대조군, 즉 노스카핀으로 처리되지 않은 림프구는 도 1에 나타나 있다. 상기 결과는 노스카핀으로 처리된 세포의 개체군에서 (4분면 R2중의) 하이포-이배체 세포, (4분면 R3중의) 정상 세포, (4분면 R4중의) 하이퍼-이배체 세포 및 (4분면 R5중의) 배수체 세포의 존재를 나타낸다. 이상 세포(즉, R2, R4 및 R5에서 관측된 세포)의 증가는 노스카핀으로 처리되지 않은 세포의 개체군에서는 관측되지 않았다. 하이포-이배체 세포는 정상 세포보다 적은 DNA를 갖는 세포이다. 하이퍼-이배체 세포는 정상 세포보다 많은 DNA를 갖는 세포이다.
따라서, 이 실시예는, 유사분열성 세포로 염색된 세포 및 정량적 DNA 염색액으로 염색된 세포의 유세포 분석에 의해 명백히 수많은 이상 염색체 함량을 갖는 세포가 확인된다는 것을 증명한다.
실시예 2:노스카핀으로 처리된 배양된 인간 림프구의 염색체 이상 빈도의 유세포분석과 수동 분석의 비교
이 실시예는 본원에서 기술된 수치적 염색체 이상의 세포 분석이 수치적 염색체 이상의 전통의 수동 분석에 대해 유사한 결과는 나타낸다는 것을 증명한다.
상술한 바와 같이 노스카핀으로 처리되거나 처리되지 않은 상술한 인간 림프구를 실시예 1에서 수득된 수치적 염색체 이상(즉, 배수성)을 갖는 세포의 수와 비교하기 위해 수치적 염색체 이상의 수동 분석에 수행하였다. 수동 분석을 위해, 세포의 시료를 1,000rpm에서 6분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 1% 예열된(37℃) 시트르산나트륨 5㎖에서 재현탁하였다. 증류수 100㎖중의 시트르산(시그마 케미칼스) 1g을 혼합함으로써 세포 펠릿을 준비하였다. 상술한 바와 같이 세포를 즉시 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 펠릿을 4℃ 고정액(3:1 메탄올:아세트산) 5㎖에서 격렬하게 재현탁하였다. 이어, 세포을 상술한 바와 같이 원심분리하고, 펠렛을 4℃ 고정액(3:1 메탄올:아세트산) 5㎖에서 재현탁하였다. 이어, 세포를 하룻밤 동안 저장하거나, 슬라이드 제조 때까지 저장하였다.
슬라이드는 하기와 같이 준비하였다. 세포을 상술한 바와 같이 원심분리하고, 이어 상층액을 부어서 제거하였다. 펠릿을 신선한 고정 용액 약 2㎖에서 재현탁하였다. 현탁액을 냉각된 습윤 슬라이드상에 떨어뜨리고, 슬라이드에 불을 붙여 세포를 슬라이드에 고정시켰다. 슬라이드를 2 내지 10% 김사(집코 BRL) 용액에서 염색하였다.
저배율(명시야)하에 8n 유사분열 세포의 빈도에 대해 1,000개의 연속적인 유사분열 세포를 계통적으로 기록함으로써 배수체 지표를 결정하였다.
도 4에 나타나 있는 결과는 각각의 농도의 노스카핀에서 산정된 배수체 세포의 수가 수동으로 산정되는 경우와 유세포 분석 측정에 의해 산정되는 경우와 유사하다는 것을 나타낸다. 따라서, 유세포 분석은 배수체 세포를 산정하는 통상적인 방법에 의해 수득된 것과 본질적으로 동일한 데이터를 제공한다.
실시예 3:KCN으로 처리된 인간 림프구의 수치적 염색체 이상의 유세포 분석
상술한 바와 같이 수득된 인간 림프구를 37℃에서 24시간 동안 KCN(플루카 케미칼즈(FLUKA Chemicals)) 0 내지 0.04㎍/㎖의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 도 5에 나타나 있는 결과는 KCN이 수많은 이상을 유도하지 않는 것으로 공지되어 있으므로 이상 세포(하이포-이배체, 하이퍼-이배체 또는 배수체)의 백분율이 예상대로 최소임을 나타낸다.
실시예 4:사이토칼라신 B로 처리된 인간 림프구의 수치적 염색체 이상의 유세포 분석
상술한 바와 같이 수득된 인간 림프구를 37℃에서 24시간 동안 사이토칼라신 B(시그마 케미칼즈) 0 내지 6㎍/㎖의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 도 6에 나타나 있는 결과는 하이퍼-이배체 세포의 백분율이 최소인 반면, 사이토칼라신 B가 주로 배수성을 유도하는 것으로 공지되어 있으므로 예상대로 하이포-이배체 및 배수체 세포의 수가 높다는 것을 나타낸다.
실시예 5:콜세미드(등록상표)로 처리된 인간 림프구의 수치적 염색체 이상의 유세포 분석
상술한 바와 같이 수득된 인간 림프구를 37℃에서 24시간 동안 콜세미드(등록상표, 집코 BRL) 0 내지 0.4㎍/㎖의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 도 7에 나타나 있는 결과는 하이퍼-이배체 및 하이포-이배체 세포의 백분율이 증가하였고, 콜세미드(등록상표)가 이수성을 유도하는 것으로 공지되어 있으므로 예상대로 배수체 세포의 수가 높다는 것을 나타낸다.
실시예 6:그리세오풀빈으로 처리된 인간 림프구의 수치적 염색체 이상의 유세포 분석
상술한 바와 같이 수득된 인간 림프구를 37℃에서 24시간 동안 그리세오풀빈(시그마 케미칼즈) 0 내지 100㎍/㎖의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 도 8에 나타나 있는 결과는 그리세오풀빈이 이수성을 유도하는 것으로 공지되어 있으므로 예상대로 하이퍼-이배체, 하이포-이배체 및 배수체 세포의 백분율이 높다는 것을 나타낸다.
실시예 7:노스카핀으로 처리된 인간 림프구의 수치적 염색체 이상의 유세포 분석
상술한 바와 같이 수득된 인간 림프구를 37℃에서 24시간 동안 노스카핀(시그마 케미칼즈) 0 내지 100㎍/㎖의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 도 8에 나타나 있는 결과는 노스카핀이 이수성을 유도하는 것으로 공지되어 있으므로 예상대로 하이퍼-이배체, 하이포-이배체 및 배수체 세포의 백분율이 높다는 것을 나타낸다.
등가물
본 발명의 숙련자는 통상적인 실험만을 사용하여 본원에서 기술된 발명의 특정한 실시태양의 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 특허청구의 범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (15)

  1. 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 유사분열 세포를 처리하는 단계, 및 정량적 DNA 염색액을 사용하여 상기 세포중의 DNA의 양을 정량화하는 단계를 포함하는, 수치적 염색체 이상을 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    DNA의 정량화 단계가 유세포 분석법을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    세포가 상기 정량화에 의해 정상 배수성을 갖는 세포에서보다 더 많은 DNA를 함유하거나 더 적은 DNA를 함유하는 것으로 결정되는 경우 상기 세포를 수치적 염색체 이상을 갖는 것으로 특징화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 세포의 개체군으로부터 수치적 염색체 이상을 갖는 세포를 확인하는 방법으로서, 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 세포의 개체군을 처리하는 단계, 및
    상기 세포가 유사분열성 표지에 의해 유사분열 상태인 것으로 확인되고, 추가로 상기 세포가 정상 배수성을 갖는 세포에서보다 더 많은 DNA를 함유하거나 더 적은 DNA를 함유하는 것으로 상기 정량적 DNA 염색액에 의해 결정되는 경우 상기 개체군으로부터의 세포를 수치적 염색체 이상을 갖는 것으로 확인하는 단계를 포함하는방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    유세포 분석법을 사용하여, 상기 세포가 유사분열 상태인 것을 확인하고, 상기 세포가 정상 배수성을 갖는 세포에서보다 더 많은 DNA를 함유하거나 더 적은 DNA를 함유하는 것으로 결정하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
    유사분열성 표지가 유사분열 동안에 발생하는 히스톤의 인산화를 검출하는 시약인 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
    유사분열성 표지가 6G3 단일클론성 항체인 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
    정량적 DNA 염색액이 삽입성(intercalating) 염료, 소홈 결합제(minor-groove binder), 사이아닌 염료 및 요오드화프로피듐으로부터 선택되는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서,
    정량적 DNA 염색액이 요오드화프로피듐인 방법.
  10. 세포의 개체군으로부터 수치적 염색체 이상을 갖는 세포를 단리하는 방법으로서, 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 세포의 개체군을 처리하는 단계,
    상기 세포가 유사분열성 표지에 의해 유사분열 상태인 것으로 확인되고, 추가로 상기 세포가 정상 배수성을 갖는 세포에서보다 더 많은 DNA를 함유하거나 더 적은 DNA를 함유하는 것으로 상기 정량적 DNA 염색액에 의해 결정되는 경우 상기 개체군으로부터의 세포를 수치적 염색체 이상을 갖는 것으로 확인하는 단계, 및
    상기 세포를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포 개체군이 상이한 수치적 염색체 이상을 각각 갖는 2 종 이상의 세포의 아형 개체군을 함유하고, 세포의 상기 아형 개체군을 각각으로부터 및 상기 세포 개체군으로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 세포에서 수치적 염색체 이상을 유도하는 시약을 확인하는 분석법으로서,
    세포를 상기 시약으로 처리하는 단계,
    유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 상기 세포 또는 그의 자손을 처리하는 단계, 및
    상기 세포 및 그의 자손이 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액으로 처리하는 동안에 유사분열 상태인 경우 정량적 DNA 염색액을 사용하여 상기 세포에서 DNA의 양을 정량화하는 단계를 포함하는 분석법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 세포가 말초혈 단핵구, 임파구, 상피 세포 및 결합 조직 세포인 분석법.
  14. 세포에서 수치적 염색체 이상을 검출하는 키트로서, 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액을 포함하는 키트.
  15. 유사분열성 표지 및 정량적 DNA 염색액을 포함하는 조성물.
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