JP2016202024A - 成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法 - Google Patents
成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部とを備え、
前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、前記第2容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置。
【選択図】図3
Description
本工程では、まず薬剤の効果を検証するための肝細胞の調製・培養を行う。以下一例を示す。肝細胞の調製は、in situコラゲナーゼかん流法にしたがった。詳しくは以下の通りである。ラット(5〜6週齢)を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液(Ca2+とMg2+不含、EGTAを含むハンクス液)を注入する。
本工程では、工程0にて培養した細胞を、薬剤評価に適したコンディショニングに整える。以下一例を示す。工程0によって4日間培養した細胞の培養上清を除去し、バッファとしてハンクス液を400・L添加し、37℃で10分インキュベーションする(図2工程1)。
本工程では、評価を行う薬液を細胞に投与する。以下一例を示す。バッファを除去後、10μMのCDF(蛍光試薬)200μLをウェルに添加し、37℃で30分間インキュベーションし、その後に4℃で5分間保持した(図2工程2)。
本工程では、工程3によって細胞内に含まれた薬液以外を洗い流す。以下一例を説明する。次に、プレートを4℃に保持したまま、氷冷したハンクス液400μLを用いて3回洗浄した(図2工程3)。
薬効を評価する一つの指標として、投与した薬剤が、細胞内に長時間留まりやすいものであるか、または短期間にしか留まりにくいものであるかを分析することが有効である。そこで本工程では、上記指標のためのデータを取得するべく、後述の工程5にて各試験区内の細胞を評価する前に、薬剤が細胞内から所定時間以内に漏出させる。以下一例を示す。まず、前処理用のバッファ液(例えばハンクス液)を投与し、37℃で30分間インキュベーションし、薬剤を含むハンクス液(上清)を回収した(図2工程4)。
試験区1では、図3の試験区1にて示すように、細胞からバッファ液(例えばハンクス(−)液)に、胆管側排出(3)と、第二血管側排出(つまりは拡散(1)とトランスポータ(TP)(2)とからの排出)との合算分を排出させる。
試験区2は、試験区1のように胆管を崩壊させず、図3に言う第二血管側排出(拡散(1)とトランスポータ(2))のみを排出させる。ハンクス液は200μL添加した。試験区2は、試験区1とは異なり、EGTA等のキレート剤を含まないため、細胞間接着は維持されたままであり、したがって、毛細胆管の崩壊も誘起されない試験区である。
試験区3は、後述のように試験区1、2よりも低い温度条件とすることで、第二血管側排出のうち、トランスポータ(1)から排出される薬剤を抑制し、拡散(2)による排出分のみを排出させる。ハンクス液を200μL添加し、4℃で30分間インキュベーションした後に、上清を回収した。同じ維持系の工程5試験区2とは試験温度が異なる。
再び工程6では3試験区とも共通の操作に戻る。工程6では、細胞内残留画分の定量を行うための薬剤の回収を行う。蛍光薬剤等をプレートリーダ等を用いて定量を行う場合には、1%の界面活性剤を含むハンクス液を例えば200μL添加し、懸濁し、全量を回収することが望ましい(図2工程6)。
上記工程により得られた薬剤量を反映した蛍光強度をもとに、各画分への分配比率を計算する。ここでは、工程5、6の総和(図3、B#+C#=(1)+(2)+(3)+(4))を薬剤量100%とする。
・拡散のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif)はB3、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP)はB2−B3、
・胆管側排出画分(Bile Canaliculi Efflux、BCEfx)はB1−B2、
・細胞内残留画分(Cell)はC1
に対応づけられる。
・第二血管側排出薬剤量に対するトランスポータ経由で排出された薬剤量の割合(Ratio of Extracellular Efflux by Diffusion、RexEMTP)として(B2−B3)/B2によって求められる。胆管への排泄を評価するスコアは、
・細胞内に取り込まれた全薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合(Biliary Retention Drug、BiRD)として(B1−B2)/(C1+C2)、
または、別法の、
・細胞内に残留している薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合として(C2−C1)/C2、あるいは(B1−B2)/C1
等によって求められる。
CDFをRhodamine123に変えて上記と同様の操作により、図9に示す結果(パターン1)を得ることができる。CDFの結果を示す図8(パターン1)とは明らかに異なる分配比率を検出できることが分かる。
・第一血管側排出画分(Sup画分)はS1(≒S2≒S3)、
・拡散のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif)はB3、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP)はB2−B3、
・胆管側排出画分(Bile Canaliculi Efflux、BCEfx)はB1−B2、
・細胞内残留画分(Cell)はC1
に対応づけられる。
特に試験区1用ウェルと試験区2用ウェルは、ほぼ同じ温度調整を行うため、ひとつのウェル培養プレート内を区切って設定した方が精度や速度の観点から効率的に評価することが可能となる。
尚、後述の装置動作について各試験区用ウェル(容器)の交換作業については、自動で交換しても手作業で交換してもよい。当該容器の交換や設置作業については、以下省略して説明することとする。
本装置は、図10に示すように、培養部106、サンプル調製部107(含む入力部107A)、分析部108、および表示部109により構成される。さらにサンプル調製部107は、後述する各容器(プレート)内の温度を調整する温度調整部107Bと、液体を容器に供給または回収可能な送液部107C等を有している。サンプル調製部は、5%CO2、37℃環境下であることが望ましい。
まず、肝細胞組織が培養部106において培養される(図10、図13(a)サブ工程1)。その後、培養された肝細胞組織を保持したプレートはサンプル調製部の第一温調機能付きプレートホルダ210上、および第二温調機能付きプレートホルダ(211)上に移送される(図10、図13(a)サブ工程2)。
送液部107Cに設置されている、液体を吸引するための吸引ノズルが付加された吸引ヘッド205が、上記プレートホルダ上の、除去すべき培地が満たされた培養プレート001のウェル002に移動し、ウェルから培地を吸引して全量除去する(図13サブ工程3)。除去された培地は、廃液槽206に廃棄回収される。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、薬液を吸引する(図13(a)サブ工程11)。目的のウェルに移動し、薬液を添加した後(図13(a)サブ工程12)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する(図13(a)サブ工程12)。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック208に移動し、バッファを吸引する(図13(a)サブ工程15)。冷蔵した薬液を用いるのは、トランスポータ活性のような能動的な生命現象を停止させるためであることは前述の通りである。
第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が4℃から37℃に変化した後(図13(a)サブ工程19)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック208に移動し、バッファを吸引する(図13(a)サブ工程20)。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後(図13(a)サブ工程21)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。
[2D組織用]第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が4℃から37℃に変化した後(図14サブ工程19)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを吸引する(図14サブ工程20)。
[3D組織用]第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が4℃から37℃に変化した後(図15(a)サブ工程19)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、トリプシン/EDTAを吸引する(図15(b)サブ工程20)。
[2D組織用]第一温調付きプレートホルダ210が4℃から37℃に変化した後(図13(a)サブ工程24)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック(209)に移動し、EGTAを含むバッファを吸引する(図13(a)サブ工程24)。
[3D組織用]第一温調付きプレートホルダ210が4℃から37℃に変化した後(図16(a)サブ工程24)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック(209)に移動し、トリプシン/EDTAを含むバッファを吸引する(図16(b)サブ工程25)。
培養プレートの回収された薬剤は、測定部に移送される(図13(b)サブ工程38)。測定部において、プレートリーダ、あるいはLCMSによる薬剤の測定がおこなわれる(図13(b)サブ工程39)。
測定結果から各画分への分配比率とスコアを算出する(図13(b)サブ工程40)。その後、得られた算出値を表示部に表示する(図13(b)サブ工程41)。
以上、実施例1〜3にて説明した構成について、あくまで一例として挙げると、例えば以下のようになる。
肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、前記第2容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置である。
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部をさらに有し、前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、前記温度調整部は、前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、前記分析部は、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を解析することを特徴とする構成1記載の成分分析装置である。
薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内の液体を供給する送液部と、前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部と、前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、前記送液部は、前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、前記温度調整部は、前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、前記分析部は、前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析装置である。
肝細胞組織を保持する複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析工程を備え、前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、前記第2容器に、バッファ液が保持され、前記分析部工程において、前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析方法である。
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度工程をさらに有し、前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、前記温度工程において、前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、前記分析工程において、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を解析することを特徴とする構成4記載の成分分析方法である。
薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器内の液体を供給する送液工程と、前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整工程と、前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析工程と、を有し、前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、
前記送液工程において、前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、前記温度調整工程において、前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、前記分析工程において、前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析方法である。
002 ウェル
106 培養部
107 サンプル調製部
107A 入力部
107B 温度調整部
107C 送液部
107D 遠心分離部
108 分析部
108A 測定部
108B 解析部
109 表示部
201 シリンジポンプコントローラ
202 温調コントローラ
203 シリンジポンプ
204 チップヘッド
205 吸引ヘッド
206 廃液槽
207 チップラック
208 冷蔵薬液ラック
209 常温薬液ラック
210 第一温調機能付きプレートホルダ
211 第二温調機能付きプレートホルダ
212 第一プレートホルダ
213 第二プレートホルダ
214 ダストボックス
215 サーキュレータ
216 サクションポンプ
301 吸引した液体
302 チップ
Claims (6)
- 肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、
前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、
を備え、
前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、
前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、
前記第2容器に、バッファ液が保持され、
前記分析部は、
前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、
前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、
前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置。 - 前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部をさらに有し、
前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、
前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、
前記温度調整部は、
前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、
前記分析部は、
前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、
を測定し、
前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、
前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
を解析することを特徴とする請求項1記載の成分分析装置。 - 薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、
前記複数の容器内の液体を供給する送液部と、
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部と、
前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析部と、
を備え、
前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、
前記送液部は、
前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、
前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、
前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、
前記温度調整部は、
前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、
前記分析部は、
前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、
前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、
前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、
前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析装置。 - 肝細胞組織を保持する複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析工程を備え、
前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、
前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、
前記第2容器に、バッファ液が保持され、
前記分析部工程において、
前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、
前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、
前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析方法。 - 前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度工程をさらに有し、
前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、
前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、
前記温度工程において、
前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、
前記分析工程において、
前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、
を測定し、
前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、
前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
を解析することを特徴とする請求項4記載の成分分析方法。 - 薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器内の液体を供給する送液工程と、
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整工程と、
前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析工程と、
を有し、
前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、
前記送液工程において、
前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、
前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、
前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、
前記温度調整工程において、
前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、
前記分析工程において、
前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、
前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、
前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、
前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析方法。
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