JP2016202024A - 成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法 - Google Patents

成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法 Download PDF

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Abstract

【課題】新薬開発に有用な、薬物の取込み、代謝、排泄といった薬物動態の全体像の生体外での評価方法の提供。
【解決手段】肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部とを備え、
前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、前記第2容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置。
【選択図】図3

Description

本発明は、新薬開発に有用な、薬物の取込み、代謝、排泄といった薬物動態の全体像のin vitro(生体外)での評価に関する。
新薬開発工程においては、ヒトの体内に投与し、効能を検証する臨床試験(「ヒト臨床試験」)を行うことが薬事法上必然となるが、ヒト臨床試験や動物実験試験は、莫大な開発費を要する。近年、これら開発費が最大の原因となって、新薬開発全体のコストが増大している。その原因の一つとして、開発工程前期の非臨床動物実験では薬効不良や毒性を検出できなかった薬剤候補について、開発工程後期のヒト臨床試験で初めて薬効不良や毒性が発見され、それまでの開発コストや、ヒト臨床試験にかけたコストが無駄になることに因るところが大きい。
これらの背景から、ヒト臨床試験の通過率を向上させ、新薬開発コストの削減を図るため、薬効を示し、かつ毒性を発現しない新薬候補物質を早期に絞り込むことが重要となる。そこで、多くの製薬企業から、創薬初期段階に、ヒト細胞の特性と相関の低い動物実験のみで薬剤候補を絞り込むのではなく、ヒト細胞を用いて、投与薬物のヒト体内での薬物動態を良好に予測することが可能なin vitro(生体外)評価系が望まれている。
しかしながら、細胞を利用して、投与された医薬品候補化合物の取込み、代謝、胆管・血管排泄といった、薬物動態の全体像を把握、解析する手法は確立されていない。薬剤が体内で薬効を発揮するためには、一旦肝臓に取り込まれた薬剤が、代謝産物になるか、あるいは代謝を受けずに元々の化合物(親化合物)のまま、血管側に排出された後に、再び血流に乗って再循環し、目的の臓器・器官にたどり着く必要がある。
したがって、in vitro試験系においても、投与後に血管側に排出される医薬品候補化合物の再循環分を測定し、新薬開発において最も重要な指標の一つである薬効を評価できれば、非常に有用な薬物動態評価法となりえる。加えて、胆管排泄後に尿や便として体外に排泄される、細胞から胆管に排泄される分(消失分)、細胞内貯留分を含んだ薬物動態全体像を把握することにより、各画分への分配比率が求めることができるようになる。
特許文献1及び特許文献2には、これまでに培養細胞に薬剤を投与し、細胞の胆管から排泄される分(消失分)を評価する手法が開示されている。この評価方法は、投与薬剤が毒性や薬効を発揮せずに胆管に排泄され、その後、尿や便として体外に排泄される薬剤消失分の評価を行うものである。
特開2012−65659 特開平8−503610
従来技術はあくまでも胆菅排泄量、つまりは薬効のなかった成分の量を評価する方法であり、体外消失分を評価する方法であった。しかし、薬効のある成分の情報を得るためには、血管側に排泄される成分の量を直接的に評価することが望ましいが、従来技術では血管に排泄される成分の量を解析する方法は確立されていなかった。さらには、薬物動態の一部を評価できるのではなく、投与薬剤の血管(Basal/Basolateral)側排出画分、管腔(Apical)側排出画分、細胞内貯留画分をといった、投与薬剤が細胞のどこから排泄され、どこに貯留しているのか、細分化して定量することにより、in vitroでの薬物動態全体像を提供し、より精度の高い薬効評価を行うことができるが、このような評価方法についても確立されていなかった。
例えば、肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、前記第2容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置である。
本発明を適用することによって、細胞の血管側に排泄された薬剤等の成分を直接的に評価することができる。さらに、医薬品候補化合物(親化合物および、代謝産物)のトランスポータ経由および、拡散経由での血管(Basal/Basolateral)側排出画分と管腔(Apical)側排出画分、細胞内残留画分を定量し、投与された医薬品候補化合物の総量および、各画分への分配比率を判定することによって、投与された医薬品候補化合物の動態を評価することが可能となり、膨大な数の医薬品候補化合物の中から、薬効を発揮する薬剤候補をin vitroでのスクリーニング精度を向上させることができる。結果として、医薬品候補化合物の早期の絞り込みを可能とし、無駄な動物実験や、無用なヒト臨床試験を減少させることができる。製薬企業にとって重荷となっている新薬開発コスト低減に貢献する。
培養プレート サンプル調製フロー 工程4、5、6の定量対象および薬物分布イメージ図 4-cell加えたフロー 新プロトコルによる回収率 試験区1−工程5の回収薬剤の蛍光強度 分散薬剤の効果 各画分の定義とCDFの結果 CDFの分配比率 Rhodamine123の分配比率 自動計測置構成図 サンプル調製部上面図 サンプル調製部正面図 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート チップヘッドおよびチップ
本実施例では、上述の薬効評価のための成分分析方法について図2の工程0〜6に則して説明する。また、工程4〜6については、図3を用いて詳述する。尚、以下の複数の実施例においては、薬効成分の評価方法に基づいて説明するが、あくまでも本願発明を説明するための一例であって、薬剤以外の化学物質、さらには薬物代謝物の評価にも本願発明の成分分析方法を適用できることは言うまでもない。また、本実施例にて示す、バッファ液や温度、時間等の具体的な条件は、あくまでも一例であって、技術思想として同様の効果を有するのであれば別の条件を適用してもよいことは言うまでもない。
本実施例においては、試験区1〜3の、少なくとも3つの試験区を用いた場合について説明する。各試験区には、細胞を保持する保持領域が存在するが、これら保持領域は、各試験区ごとに別々の容器を用いてもよいし、複数の保持領域を有する一つの容器内を区切って、各試験区を設定してもよい。
<工程0:肝細胞の調製と培養>
本工程では、まず薬剤の効果を検証するための肝細胞の調製・培養を行う。以下一例を示す。肝細胞の調製は、in situコラゲナーゼかん流法にしたがった。詳しくは以下の通りである。ラット(5〜6週齢)を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液(Ca2+とMg2+不含、EGTAを含むハンクス液)を注入する。
肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。本実施例では0.05%コラゲナーゼ含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。肝臓を切り離し、冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。等張パーコール液を使用して500G、5分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。
得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率85%以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率85%以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではないことは言うまでもない。また、肝細胞の調製は必ずしもin situコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。用いる肝細胞もラット由来のものに限らないし、ラットの系統も限定されない。本実施例では肝細胞を利用したが、これに限らない。
前述の通りin situコラゲナーゼかん流法により調製した肝細胞を培地に懸濁し、市販のコラーゲンコート培養ディッシュに肝細胞を5X105 cells/mLの密度で培地に懸濁し播種し、2次元平面培養(例えば、サンドイッチ培養)を行う。播種密度、培地、培養プレート001は特に限定されない。
培養プレートを図1に示す。ここでは24個の培養領域(ウェル、002)を含む24ウェル培養プレートを示したが、これに限らず所定の細胞を保持できる容器であれば他の形状の容器を用いても良い。
播種後、CO2インキュベータを用いて5%CO2、37℃の条件下で培養を開始する。18時間以上経過した後に、最初の培地交換を行う。播種後18時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地(10%FCS+)からFCSを除いた培地(以下、培地(FCS-))にマトリゲルを添加した培地を用いた。以降24時間毎に培地(FCS-)を用いて培地交換を行う。
また、細胞を3次元的にスフェロイド、本実施例で言えば、3次元的に形成される肝細胞組織を培養する場合として、24ウェルナノピラー細胞培養プレートを用いてもよい。ウェル数は特に限定されるものではない。
5X105 cells/mLの密度に調製した細胞を播種後、CO2インキュベータを用いて5%CO2、37℃の条件下で培養を開始する。18時間以上経過した後に、最初の培地交換を行う。播種後18時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地(10%FCS+)からFCSを除いた培地(以下、培地(FCS-))を用いた。
播種後、48時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地(10%FCS+)からFCSを除いた培地(以下、培地(FCS-))にマトリゲルを添加した培地を用いた。以降24時間毎に培地(FCS-)を用いて培地交換を行う。
後述するように、工程5で3種類の異なる条件下での試験(試験区1、2、3:工程5で詳述)を行うため、この時点で同条件の培養プレートを独立に3プレート用意する。工程0から4、および工程5においては、3種類の試験区とも同一の試験操作を行う。
<工程1:肝細胞のコンディショニング>
本工程では、工程0にて培養した細胞を、薬剤評価に適したコンディショニングに整える。以下一例を示す。工程0によって4日間培養した細胞の培養上清を除去し、バッファとしてハンクス液を400・L添加し、37℃で10分インキュベーションする(図2工程1)。
バッファの種類と量は特に限定されるものではない。工程1の操作は2回繰り返すのが望ましい。このように工程0の培養にて使用した培地から、バッファ液(例えばハンクス液)へ細胞が馴染む成分を置換させることにより、以下の工程で正確な測定・解析を行うための下地を整えることができる。ただし、工程1を何度繰り返すかは、使用するバッファ液の種類や細胞の種類によって、任意に変更してもよいことは言うまでもない。
<工程2:薬液投与>
本工程では、評価を行う薬液を細胞に投与する。以下一例を示す。バッファを除去後、10μMのCDF(蛍光試薬)200μLをウェルに添加し、37℃で30分間インキュベーションし、その後に4℃で5分間保持した(図2工程2)。
試薬の種類、濃度、量は特に限定されるものではない。CDFは蛍光を発するため、モデル試薬としてプレートリーダで簡便に定量できる。また、投与量を200μLとしたが、これはウェル内の細胞全体が試薬に浸る量として選択した。細胞全体が試薬に浸る量であればこの量に限定されない。CDFの濃度は細胞の蛍光アッセイとして従来用いられている濃度であれば良い。プレートリーダで検出するための試薬量としても本濃度を適用することが望ましい。インキュベーションの時間は30分としたが、これは薬剤の取り込みと排出がほぼ平衡状態になるまでの時間が30分であるという予備検討の結果をもとに採用した。目的に応じて時間は限定されないし、複数の時間を組み合わせてもよい。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5%CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。
投与された薬剤の細胞外への漏出を防ぐ目的で、30分インキュベーション後にプレート温度を4℃にした容器内の温度を低くすることにより、細胞は薬剤を外部へ排出すること抑制する現象を生じさせるためである。
このように薬剤の温度を所定の温度以下にすることにより、薬剤は細胞内へ留まり、細胞外へ漏出する現象を抑制することができる。本実施例では4℃としたが、投与された薬剤が細胞外へ漏出することを抑制できる温度であればこれに限られるものではない。
また、投与された薬剤が細胞外へ漏出することを抑制できる、例えばインヒビターを投与するような方法があれば、温度を下げる方法に限らない。いずれにせよ、薬液投与時のプレート温度(例えば37℃)よりも、投与薬剤の細胞外への排出、漏出を防ぐための温度の方が低い温度となる。投与した薬液の細胞内への取込みは生命現象であり、一般に37℃で活性化すると管がられているためである。
薬剤投与のタイミングは、本実施例に限定されるものではない。例えば、薬剤投与を試験日の前日もしくは数日前から行う場合もある。この場合は、工程0の段階で薬剤を投与し、工程1、2は省略してもよい。
<工程3:細胞洗浄>
本工程では、工程3によって細胞内に含まれた薬液以外を洗い流す。以下一例を説明する。次に、プレートを4℃に保持したまま、氷冷したハンクス液400μLを用いて3回洗浄した(図2工程3)。
4℃の目的は上記と同様である。培養時の培地の量が400μLであり、ウェル内壁に残留している培地成分を除去する目的で、洗浄ハンクス液の量を400μLとした。一般的な生化学アッセイでの洗浄回数は3回が通例となっており、踏襲した。洗浄量、洗浄回数等の各条件は限定されない。これにより、測定対象となる薬液以外を除去し、後の工程における薬効評価の精度をより向上させることが可能となる。
<工程4:血管側排出画分回収>
薬効を評価する一つの指標として、投与した薬剤が、細胞内に長時間留まりやすいものであるか、または短期間にしか留まりにくいものであるかを分析することが有効である。そこで本工程では、上記指標のためのデータを取得するべく、後述の工程5にて各試験区内の細胞を評価する前に、薬剤が細胞内から所定時間以内に漏出させる。以下一例を示す。まず、前処理用のバッファ液(例えばハンクス液)を投与し、37℃で30分間インキュベーションし、薬剤を含むハンクス液(上清)を回収した(図2工程4)。
インキュベーション時間は使用薬剤や目的によって規定されるものであって、本実施例に様に30分に限られるものではない。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5%CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。バッファ液は、工程5にて使用するバッファ液と同一種のものを使用してもよいし、別の種類のものを使用してもよい。
工程3までにより肝細胞組織(図3、101)内に貯留させた薬剤を、ハンクス液中に、第一血管側排出、つまりは受動拡散経由(図2工程4、(1)’)および、トランスポータ(TP)経由(図2工程4、(2)’およびイメージ図中102)で排出させるため、37℃に維持した。後述の通り、工程5においても血管側排出が行われるため、区別するため、工程4おける血管側排出を第一血管側排出、工程5における血管側排出を第二血管側排出と定義した。
本質的には、ともに細胞内から血管側(Basal/Basolateral)(上清)に排出される工程である。あるいは、目的によっては、本工程4を工程5による回収工程前の洗浄工程と捉えることもできる。トランスポータは細胞膜上に発現している物質輸送を担う膜タンパク質である。細胞内外での能動的な物質輸送を担う。
また、受動拡散は、トランスポータ経由以外による細胞外への排出であり、細胞膜からの漏出等を含む。工程4でハンクス液に排出された薬剤を血管側排出画分と定義したのは、ハンクス液に面している細胞上面部分は、ベーサル(Basal)/バソラテラル(Basolateral)面(図3、104)に相当し、生体内では血管に面している部分と想定されるためである。
次に説明する工程5では、異なる3種類の操作で薬剤の回収を行う工程(試験区1、2、3)となるが、工程5の前に、工程4にて上述のように第一血管側排出画分(ハンクス液に排出された薬剤)を取得しておくことにより、薬剤が細胞に留まりやすいものかどうかを検証する指標を取得することができる。
尚、血管側排出各分を把握するのに用いるハンクス液は、どの試験区のハンクス液を用いてもよい。例えば、後述の試験区1〜3すべてのハンクス液について評価してもよいし、一部のみ用いても良い。また、工程3や4は本発明による分析をより詳細に実施し高精度の評価を行うための工程であって、これらの工程をスキップして工程5の作業を行うことも可能であることは言うまでもない。
上記工程0〜4は、図2に示すように、少なくとも試験区1〜3において行われるものである。工程5では、本発明で求める複数の指標データを後述の解析によって取得するべく、試験区1〜3夫々について、別条件で処理を行う。工程5の一例を以下に示す。
一方、細胞に投与された薬剤総量を定量するために、予め試験区1〜3に用いる細胞とは別に細胞を用意し、工程3と工程4の間に、細胞を破砕して細胞抽出液を回収する工程を加えた(工程4.0、図4)。
この工程により得られる画分を4-cell画分とした。この4-cell画分とは、試験区1〜3にて用いられる容器とは別途用意した容器、いわば、試験区4に相当する。この工程を加えることにより、試験区4にて得られる総薬剤量に対する、以降の工程4、5、6における試験区1〜3にて回収される薬剤量の和から、当該薬剤の回収率を求めることが可能となる。薬剤の回収率を求めることにより、薬剤収支を評価することが可能になる。
蛍光測定の場合には、例えばサンドイッチ培養のような2D組織であっても、スフェロイドのような3D組織であっても、図2の工程6に記載の蛍光測定用の回収プロトコルに従えば薬剤の回収および、蛍光強度の測定はほぼ可能である。
また、LCMS測定においても、例えばサンドイッチ培養のような2D組織であれば、図2の工程6に記載のLCMS測定用の回収プロトコルに従えば薬剤の回収および、LCMS測定はほぼ可能である。
一方、スフェロイドのような3D組織の場合には、図2の工程6に記載のLCMS測定用の回収プロトコルであっても、薬剤の全量回収は困難であった。したがって、図4記載の工程4.0のように、トリプシン/EDTAを添加するプロトコルを考案した。
これは、タンパク分解酵素であるトリプシンにより細胞間接着タンパク質を切断することでスフェロイドをシングルセル化し、水とメタノールのアクセスを容易にし、効率的な細胞内画分の抽出を狙うためである。
スフェロイドのような各細胞が立体的に配置している組織から細胞間接着を解除し、シングルセル化が可能であればこの試薬に限定されない。また、シングルセル化せずとも立体組織内の各細胞内の画分を抽出でき、かつ液体クロマトグラフ質量分析(LCMS)測定に適用可能な試薬であればよい。10uMのロスバスタチンを細胞に投与し、LCMS測定を行い、薬剤収支を評価した一例を、図5に示す。
薬剤収支は、(工程4+5+6)/4−Cell*100による計算でできる。その結果、2D組織に水とメタノール処理をした場合の回収率は92.3%、2D組織にトリプシン処理後に水とメタノール処理をした場合の回収率は94.0%であった。
一方、3Dスフェロイドに水とメタノール処理をした場合の回収率は138%、3Dスフェロイドにトリプシン処理後に水とメタノール処理をした場合の回収率は92.2%であった。3Dスフェロイドに水とメタノールのみを処理した際の回収率が100%超になったのは、水とメタノールのみでは4-cell画分の回収が十分に出来なかったため、以降の工程4、5、6より回収された薬剤量の和が4-cell画分の薬剤量を上回ったことが原因と考えられた。これは、トリプシン処理が、スフェロイドをシングルセル化し、水とメタノールのアクセスを容易にし、効率的な細胞内画分の抽出を可能にしたことを示唆する。
この結果から明らかなように、細胞内画分を漏れなく回収し、正確な薬剤収支を得るには、2D組織ではトリプシン処理は不要であるが、3Dスフェロイドにはトリプシン処理が必須であることがわかる。当然のことながら、細胞間接着を解除し、シングルセル化を促す試薬であればトリプシン/EDTAに限らないことは言うまでもない。
<工程5、試験区1:37℃崩壊系による上清の回収>
試験区1では、図3の試験区1にて示すように、細胞からバッファ液(例えばハンクス(−)液)に、胆管側排出(3)と、第二血管側排出(つまりは拡散(1)とトランスポータ(TP)(2)とからの排出)との合算分を排出させる。
ハンクス(−)液は、カルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まないハンクス液のことであり、本試験区のような細胞間接着をあえて強化しない場合等に用いる。2次元平面的なサンドイッチ培養の場合、細胞間接着を積極的に解除する目的としては、以下述べるようにEGTAのようなキレーターを用いる。
次に、1mMのEGTAを含むハンクス(−)液を200μL添加した。EGTAは細胞間接着分子の接着に関与しているCa2+、Mg2+の作用を抑えるキレート作用を持ち、細胞間接着を解除するための試薬である。これにより培養過程において形成された胆管を崩壊させる。
37℃で30分間インキュベーションした後に、上清を回収した。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5%CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。キレート作用を持つ試薬であればEGTAに限定されない。EGTAを含むバッファの種類、量、およびインキュベーション温度と時間は特に限定されない。
工程5の試験区1では、工程4が終了した段階で細胞内に貯留している薬剤(図3工程5、およびイメージ図(1)、(2))、および胆管に排出されている薬剤(図3工程5およびイメージ図(3))がすべて上清中に排出され、回収される(図3工程5、試験区1)。
工程5で(3)を胆管側排出画分と定義したのは、細胞間接着部分に形成される間隙周囲の細胞膜部分は、アピカル(Apical)面(図3、105)に相当し、かつ間隙は毛細胆管(図3、103)に想定されるためである。
工程5試験区1では、温度は37℃に維持されているため、細胞内から血管側に排出される画分には受動拡散経由(図3工程5、(1))、およびトランスポータ経由(図3工程5、(2))が含まれる。また、3Dスフェロイド培養の場合、細胞が数層を形成しているためか、2次元サンドイッチ培養にとっては適正な時間でEGTAを含むバッファを処理した場合であっても、細胞間接着の解除が進行せず胆管排出画分の回収が困難であった(図6(a))。
そこで、工程2において、10μMのCDF(蛍光試薬)200μLをウェルに添加し、37℃で30分間インキュベーションした3Dスフェロイドに対し、工程5−試験区1においてトリプシン/EDTAを用いた。
これはEGTAのみでは数層の細胞から構成される立体組織の細胞間接着を至適時間内で解除するのは困難と考えられたため、タンパク質分解酵素のトリプシンを用いて、より積極的に細胞間接着タンパク質を切断し、シングルセル化することを目的として行った。
プロトコルの詳細は、図4−試験区1の工程5に記載の通りである。バッファ投与直後、投与2分、5分、10分、20分後の上清の蛍光強度測定の結果を図6(a)に示す。バッファのみは▲、EGTAは■、トリプシン/EDTAは●でプロットした。その結果、EGTAのみを処理した場合(■)とは異なり、トリプシン/EDTA(●)を処理した場合に、明らかに上清側排出量が向上していることがわかった(図6(a))。
図6(b)の位相差顕微鏡画像からも明らかなように、トリプシン/EDTA処理により、細胞間接着が崩壊し、胆管排出画分が上清側に排出されたためと考えられた。3Dスフェロイドから胆管排出画分を漏れなく回収するためには、細胞をシングルセル化する処理が必須であることを示している。当然のことながら、細胞間接着を解除し、シングルセル化を促す試薬であればトリプシン/EDTAに限らないことは言うまでもない。
<工程5、試験区2:37℃維持系による上清の回収>
試験区2は、試験区1のように胆管を崩壊させず、図3に言う第二血管側排出(拡散(1)とトランスポータ(2))のみを排出させる。ハンクス液は200μL添加した。試験区2は、試験区1とは異なり、EGTA等のキレート剤を含まないため、細胞間接着は維持されたままであり、したがって、毛細胆管の崩壊も誘起されない試験区である。
37℃で30分間インキュベーションした後に、上清を回収した。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5%CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。
工程5の試験区2では、工程4が終了した段階で細胞内に貯留している薬剤(図3工程5、およびイメージ図(1)、(2))が上清中に排出され、回収される(図3工程5、試験区2)。各種条件は限定されない。
これまでの説明にしたがい、上清中に排出される薬剤は、第二血管側排出画分と定義される。工程5試験区2では、温度は37℃に維持されているため、細胞内から血管側に排出される画分には受動拡散経由(図3工程5、(1))、およびトランスポータ経由(図3工程5、(2))が含まれる。
工程5の試験区1と試験区2から、回収した薬剤の量を定量的に解析することにより、例えば、試験区1で回収した薬剤量を定量化した値から、試験区2で回収した薬剤量を定量化した値を減算することにより、胆管側排出(3)の薬剤量を算出することができる。
<工程5、試験区3:4℃維持系による上清の回収>
試験区3は、後述のように試験区1、2よりも低い温度条件とすることで、第二血管側排出のうち、トランスポータ(1)から排出される薬剤を抑制し、拡散(2)による排出分のみを排出させる。ハンクス液を200μL添加し、4℃で30分間インキュベーションした後に、上清を回収した。同じ維持系の工程5試験区2とは試験温度が異なる。
これは、4℃にすることにより、トランスポータ経由の血管側排出を抑制させるためである。工程5試験区3において、トランスポータ活性を抑制させる低温4℃の試験区を採用することにより、受動拡散経由の排出量のみを定量し(図3工程5、(1))、工程5試験区2との比較においてトランスポータ経由による血管側薬剤排出量を算出(定量)することが可能となる。
各薬剤には細胞内外を移動するための特異的なトランスポータが存在する。したがって、受動拡散経由の排出量を排除し、トランスポータ経由での排出量を定量できることは、各薬剤に特異的な排出量を定量できることを意味する。バッファの種類、量、およびインキュベーション温度と時間は特に限定されない。
上述同様に、工程5の試験区2と試験区3から、回収薬剤を定量することにより、トランスポータ経由の排出画分を算出することができる。尚、本実施例では試験区1、2、3を用いて排出画分を夫々算出する例について示したが、試験区の数は必ず3つである必要はない。
例えば、胆管側排出(3)と、第二血管側排出((1)+(2))のみを分離したいのであれば、試験区1および2のみを実施すればよいし、第二血管側排出において、拡散(1)とトランスポータ(2)を単に分離したいのであれば、試験区2、3のみを実施すればよい。
また、必要に応じて、別途4℃の崩壊系を設けることにより、毛細胆管側への排出のうち、トランスポータ経由の排出を抑制し、拡散による排出分のみを測定することができる。これにより、例えば、この4℃崩壊系と試験区3との比較から、拡散による毛細胆管側への排出とトランスポータ経由による毛細胆管側への排出分を切り分けて評価することが可能となる。上述した試験区1〜3夫々における工程は、どの順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。
<工程6:胆管画分、細胞内画分の回収>
再び工程6では3試験区とも共通の操作に戻る。工程6では、細胞内残留画分の定量を行うための薬剤の回収を行う。蛍光薬剤等をプレートリーダ等を用いて定量を行う場合には、1%の界面活性剤を含むハンクス液を例えば200μL添加し、懸濁し、全量を回収することが望ましい(図2工程6)。
これにより、細胞膜を破砕し、細胞内に残留する薬剤を排出させることが可能となる。得られたサンプルを培養プレートに移し、プレートリーダを用いて蛍光計測を行った。ブランク測定用にハンクス液のみを添加したウェルを準備する。励起波長484nm、吸収波長519nmで蛍光強度を測定する。
また、薬剤を質量分析(LCMS)装置等を用いて定量する場合には、水添加による低張化、有機溶剤処理等により、細胞内残留分抽出後にメタノール等の有機溶剤を用いて懸濁し、全量を回収する(図2工程6)。
その後、LCMS装置を用い、後述のように薬剤の定量を行う。また、上記蛍光薬剤のプレートリーダ測定の場合においても、薬剤のLCMS測定の場合においても、3Dスフェロイドを材料に用いる場合は、試験区1の工程5で遠心後に回収した細胞ペレットに対して、上記破砕工程、および薬剤の定量を行う。
<測定結果をもとにした各画分への分配比率の決定、およびスコア付け>
上記工程により得られた薬剤量を反映した蛍光強度をもとに、各画分への分配比率を計算する。ここでは、工程5、6の総和(図3、B#+C#=(1)+(2)+(3)+(4))を薬剤量100%とする。
この場合を「パターン1」とする。蛍光量測定により求めた6種類の値(B1、B2、B3、C1、C2、C3)から、図7のパターン1に示すような各区分への分配比率が求められる。これらの値から、
・拡散のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif)はB3、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP)はB2−B3、
・胆管側排出画分(Bile Canaliculi Efflux、BCEfx)はB1−B2、
・細胞内残留画分(Cell)はC1
に対応づけられる。
この結果をもとに、図8のパターン1のような円グラフが描画でき、各画分への分配比率の全体像を視覚的に理解することが可能となる。さらに、定量結果をもとに、以下のような薬剤固有のスコア付けが可能になる。
本実施例では、算出したCDFのスコアの一例を示す。算出されるスコアはこれらに限らない。トランスポータ経由での血管側排出を評価するスコアは、
・第二血管側排出薬剤量に対するトランスポータ経由で排出された薬剤量の割合(Ratio of Extracellular Efflux by Diffusion、RexEMTP)として(B2−B3)/B2によって求められる。胆管への排泄を評価するスコアは、
・細胞内に取り込まれた全薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合(Biliary Retention Drug、BiRD)として(B1−B2)/(C1+C2)、
または、別法の、
・細胞内に残留している薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合として(C2−C1)/C2、あるいは(B1−B2)/C1
等によって求められる。
<異なる薬剤間の分配比率およびスコアの比較>
CDFをRhodamine123に変えて上記と同様の操作により、図9に示す結果(パターン1)を得ることができる。CDFの結果を示す図8(パターン1)とは明らかに異なる分配比率を検出できることが分かる。
また、例えば、CDFの血管側排出薬剤量に対するトランスポータ経由で排出された薬剤量の割合(RexEMTP)と、細胞内に取り込まれた全薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合(BiRD)は、それぞれ、41.08、18.58であるのに対し、Rhodamine123のそれらは、52.52、4.92となり、CDFはRhodamine123に比べて胆管に排泄されやすく、血管側には排出されにくい性質を保持した薬剤であることがわかる。以上のように、本発明により、それぞれの化合物がどのような薬物動態を示すかを評価することが可能になる。
実施例2では、測定結果をもとにした各画分への分配比率の決定、およびスコア付けについて、実施例1とは異なる方法を用いた場合について説明する。本実施例では、図3に記載のS#(工程4に相当)の定量値を利用することにより、実施例1のパターン1で示した各画分への分配比率に加えて、投与薬物が細胞内に留まりやすいのか、留まりにくいのかの情報も与えることができ、より精密な評価をすることが可能となる。
すなわち、工程4、5、6の総和(図3、S#+B#+C#=(1)’+(2)’+(1)+(2)+(3)+(4))を100%の投与薬物量とする。この場合を「パターン2」とする。したがって、工程4、5、6の各試験区により求められる9種類(S1、S2、S3、B1、B2、B3、C1、C2、C3)を評価指標として用いることができる。
蛍光量測定により求めた9種類の値から、図7のパターン2に示すような各区分への分配比率が求められる。これらの値から、
・第一血管側排出画分(Sup画分)はS1(≒S2≒S3)、
・拡散のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif)はB3、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分(Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP)はB2−B3、
・胆管側排出画分(Bile Canaliculi Efflux、BCEfx)はB1−B2、
・細胞内残留画分(Cell)はC1
に対応づけられる。
この結果をもとに、図8のパターン2のような円グラフが描画でき、各画分への分配比率全体像を視覚的に理解することが可能となる。実施例2で示した方法を用いることにより、細胞内に留まりやすいか留まりにくいかの指標となるSup画分が、CDFでは70.82であるのに対し、Rhodamine123では39.29(図9、パターン2)となり、CDFが血管側に排出されやすい傾向にあることがわかる。
このことは、実施例1の細胞内残留画分評価に一致する。さらに、定量結果をもとに、薬剤固有のスコア付けが可能になるが、これは実施例1に記載の通りである。
実施例3では、実施例1および2で述べてきた一連の工程を自動化を実現する装置の一例について述べる。尚、後述する装置の動作の目的、各構成の役割等について、上記実施例1、2と重複する場合は、記載を省略する場合がある。
実施例1〜2で示した試験区1〜3の夫々に設定される細胞を保持する領域について、後述する装置構成においては、「試験区1用ウェル」「試験区2用ウェル」「試験区3用ウェル」等の表現を用いて説明するが、これらは、例えば上述の「ウェル培養プレート」の複数の容器を夫々の試験区ごとに設定してもよいし、一つのウェル培養プレートの中の複数のウェルを区切って、区切った領域ごとに、例えば「第1容器」「第2容器」「第3容器」等として設定してもよい。尚、この場合、上記実施例1にて説明した4-cell画分(試験区4)は、第1〜3容器とは別の「第4容器」となる。
特に試験区1用ウェルと試験区2用ウェルは、ほぼ同じ温度調整を行うため、ひとつのウェル培養プレート内を区切って設定した方が精度や速度の観点から効率的に評価することが可能となる。
尚、後述の装置動作について各試験区用ウェル(容器)の交換作業については、自動で交換しても手作業で交換してもよい。当該容器の交換や設置作業については、以下省略して説明することとする。
本装置は、図10に示すように、培養部106、サンプル調製部107(含む入力部107A)、分析部108、および表示部109により構成される。さらにサンプル調製部107は、後述する各容器(プレート)内の温度を調整する温度調整部107Bと、液体を容器に供給または回収可能な送液部107C等を有している。サンプル調製部は、5%CO2、37℃環境下であることが望ましい。
分析部108は、薬剤等の成分の量を測定する測定部108Aと、測定部から取得した薬剤等の成分の量から、トランスポータ経由、胆管経由、細胞内残存、トランスポータと胆管以外から排出される分(拡散)の夫々の量を解析する解析部108Bを有する。上記装置構成は一例であり、例えば解析部のみ別の装置に実行させ、当該別の装置に測定部から取得した情報を送信する等の構成としてもよいことは言うまでもない。
また、サンプル調製部の詳細構成を図11、および12に示す。サンプル調製部では、これまで実施例1−2で述べてきたように、分析対象となる各画分を自動調製することが目的となる。
各構成要素の説明は、後述のフローチャートにしたがって述べる。自動計測装置動作フローチャートは図13に示す。図13のフローチャートは一例にすぎず、実施例1<工程2>に記載の通り、薬剤投与のタイミングが異なる場合は、この限りではない。本実施例においては、細胞を保持する容器について、複数の細胞保持領域(ウェル)を有するプレートを一例として用いて説明するが、容器はプレートに限られるものでなく、細胞を保持できるものであれば良いことは言うまでもない。
<培養部からサンプル調製部への移送>
まず、肝細胞組織が培養部106において培養される(図10、図13(a)サブ工程1)。その後、培養された肝細胞組織を保持したプレートはサンプル調製部の第一温調機能付きプレートホルダ210上、および第二温調機能付きプレートホルダ(211)上に移送される(図10、図13(a)サブ工程2)。
<サンプル調製:実施例1、2の工程1に相当>
送液部107Cに設置されている、液体を吸引するための吸引ノズルが付加された吸引ヘッド205が、上記プレートホルダ上の、除去すべき培地が満たされた培養プレート001のウェル002に移動し、ウェルから培地を吸引して全量除去する(図13サブ工程3)。除去された培地は、廃液槽206に廃棄回収される。
次に、液体301を保持するチップ302を、吸引ノズルに取り付けられたチップヘッド204に、複数のチップが保管されているチップラック207から装着する。チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する(図13サブ工程4)。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後(図13(a)サブ工程5)、チップヘッドがダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。コンタミネーション等を防ぐため、取替え可能なチップをここでは利用するが、その限りではない。
吸引ヘッドは、バッファで満たされているウェルに移動し、バッファの除去を行う(図13(a)サブ工程6)。除去された培地は、廃液槽206に廃棄回収される。この工程を合計2回繰り返す(洗浄工程)(図13(a)サブ工程7)。
次に、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する(図13サブ工程8)。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後、チップヘッドがダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で10分間待機する(コンディショニング)(図13(a)サブ工程9)。その後、吸引ヘッド205が、バッファで満たされているウェルに移動し、バッファを全量除去する(図13(a)サブ工程10)。
<サンプル調製:実施例1、2の工程2に相当>
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、薬液を吸引する(図13(a)サブ工程11)。目的のウェルに移動し、薬液を添加した後(図13(a)サブ工程12)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する(図13(a)サブ工程12)。
その後、容器を保持する容器保持部の一構成例である、第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が37℃から4℃に変化した後(図13(a)サブ工程13)、吸引ヘッド205が、薬液で満たされているウェルに移動し、薬液を全量除去する(図13(a)サブ工程14)。尚、本実施例における温度調整部は、プレートフォルダに温調機能を搭載する説明としたが、温度調節部が容器保持部と別離して存在しても良いことは言うまでもない。
<サンプル調製:実施例1、2の工程3に相当>
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック208に移動し、バッファを吸引する(図13(a)サブ工程15)。冷蔵した薬液を用いるのは、トランスポータ活性のような能動的な生命現象を停止させるためであることは前述の通りである。
冷蔵薬液ラック208はこの目的のため、薬液、バッファ等を低温に保持するためのものである。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後(図13(a)サブ工程16)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。
吸引ヘッドがバッファで満たされているウェルに移動し、バッファを除去する(図13(a)サブ工程17)。除去された培地は、廃液槽206に廃棄される。この工程を合計3回繰り返す(洗浄工程)(図13(a)サブ工程18)。
<サンプル調製:実施例1、2の工程4に相当>
第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が4℃から37℃に変化した後(図13(a)サブ工程19)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック208に移動し、バッファを吸引する(図13(a)サブ工程20)。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後(図13(a)サブ工程21)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。
37℃で30分間待機する(図13(a)サブ工程20)。その後、第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が37℃から4℃に変化した後(図13(a)サブ工程22)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ(上清)を吸引し、第一プレートホルダ212、および第二プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する(回収)(図13(a)サブ工程23)。
<サンプル調製:実施例1、2の4-Cell画分調製に相当>
[2D組織用]第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が4℃から37℃に変化した後(図14サブ工程19)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを吸引する(図14サブ工程20)。
第一温調機能付きプレートホルダ(210)上の試験区4用のウェルに移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを添加した後(図14サブ工程21)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注する(回収)(図14サブ工程22)。
上記装置の動作は、実施例1、2の試験区1〜3の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。また、図14中のサブ工程1から18までは、図13(a)のそれと共通である。
[3D組織用]第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が4℃から37℃に変化した後(図15(a)サブ工程19)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、トリプシン/EDTAを吸引する(図15(b)サブ工程20)。
第一温調機能付きプレートホルダ(210)上の試験区4用のウェルに移動し、トリプシン/EDTAを添加した後、37℃で30分間待機する(図15(b)サブ工程21).1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを吸引する(図15(b)サブ工程22)。
第一温調機能付きプレートホルダ(210)上の試験区4用のウェルに移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを添加した後(図15(b)サブ工程23)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注する(回収)(図15(b)サブ工程24)。
上記装置の動作は、実施例1、2の試験区1〜3の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。また、図15(a)中のサブ工程1から18までは、図13(a)のそれと共通である。
<サンプル調製:実施例1、2の工程5、6に相当>
[2D組織用]第一温調付きプレートホルダ210が4℃から37℃に変化した後(図13(a)サブ工程24)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック(209)に移動し、EGTAを含むバッファを吸引する(図13(a)サブ工程24)。
第一プレートホルダ212上の試験区1用のウェルに移動し、EGTAを含むバッファを添加した後(図13(b)サブ工程25)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する(図13(b)サブ工程26)。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する(図13(b)サブ工程27)。
第一プレートホルダ212上の試験区2用のウェルに移動し、バッファを添加した後(図13(b)サブ工程28)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する(図13(b)サブ工程28)。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する(図13(b)サブ工程29)。
第二プレートホルダ213上の試験区3用のウェルに移動し、バッファを添加した後(図13(b)サブ工程30)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。4℃で30分間待機する(図13(b)サブ工程30)。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、薬剤を含むEGTAバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むEGTAバッファ(上清)を吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注(回収)する(図13(b)サブ工程31)。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ(上清)を吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注(回収)する(図13(b)サブ工程32)。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、薬剤を含むEGTAバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ(上清)を吸引し、第一プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する(回収)する(図13(b)サブ工程33)。
第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211がともに室温に変化した後(図13(b)サブ工程34)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを吸引する(図13(b)サブ工程35)。
第一温調機能付きプレートホルダ(210)、および第二温調機能付きプレートホルダ211上の試験区1、2、3用のウェルに移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを添加した後(図13(b)サブ工程36)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ212および、第二プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する(回収)(図13(b)サブ工程37)。上記装置の動作は、実施例1、2の試験区1〜3の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。
[3D組織用]第一温調付きプレートホルダ210が4℃から37℃に変化した後(図16(a)サブ工程24)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック(209)に移動し、トリプシン/EDTAを含むバッファを吸引する(図16(b)サブ工程25)。
第一プレートホルダ212上の試験区1用のウェルに移動し、トリプシン/EDTAを含むバッファを添加した後(図16(b)サブ工程26)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する(図16(b)サブ工程26)。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する(図16(b)サブ工程27)。
第一プレートホルダ212上の試験区2用のウェルに移動し、バッファを添加した後(図16(b)サブ工程28)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する(図16(b)サブ工程28)。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する(図16(b)サブ工程29)。
第二プレートホルダ213上の試験区3用のウェルに移動し、バッファを添加した後(図16(b)サブ工程30)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。4℃で30分間待機する(図16(b)サブ工程30)。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、薬剤を含むトリプシン/EDTAバッファで満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注(回収)する(図16(b)サブ工程31)。
分注プレートを遠心分離部にて遠心分離し、上清と細胞ペレットに分離後、上清を第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注(回収)する(図16(b)サブ工程32)。ここでは遠心分離を用いたが、上清とペレットを分離する方法であればこの方法に限らないことはいうまでもない。
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ(上清)を吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注(回収)する(図16(b)サブ工程33)。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ(上清)を吸引し、第一プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する(回収)する(図16(b)サブ工程34)。
第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211がともに室温に変化した後(図16(b)サブ工程35)、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを吸引する(図16(b)サブ工程36)。
第一温調機能付きプレートホルダ(210)、および第二温調機能付きプレートホルダ211上の試験区1、2、3用のウェルに移動し、1%TritonX−100あるいは、純水/メタノールを添加した後(図16(b)サブ工程37)、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ212および、第二プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する(回収)(図16(b)サブ工程38)。
上記装置の動作は、実施例1、2の試験区1〜3の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。また、図16(a)中のサブ工程1から24までは、図13(a)のそれと共通である。
<サンプル調製部から測定部への移送>
培養プレートの回収された薬剤は、測定部に移送される(図13(b)サブ工程38)。測定部において、プレートリーダ、あるいはLCMSによる薬剤の測定がおこなわれる(図13(b)サブ工程39)。
<解析部による分配比率とスコアの算出および結果の表示>
測定結果から各画分への分配比率とスコアを算出する(図13(b)サブ工程40)。その後、得られた算出値を表示部に表示する(図13(b)サブ工程41)。
以上、実施例1〜3にて説明した構成について、あくまで一例として挙げると、例えば以下のようになる。
<構成1>
肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、前記第2容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置である。
<構成2>
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部をさらに有し、前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、前記温度調整部は、前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、前記分析部は、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を解析することを特徴とする構成1記載の成分分析装置である。
<構成3>
薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内の液体を供給する送液部と、前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部と、前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、前記送液部は、前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、前記温度調整部は、前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、前記分析部は、前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析装置である。
<構成4>
肝細胞組織を保持する複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析工程を備え、前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、前記第2容器に、バッファ液が保持され、前記分析部工程において、前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析方法である。
<構成5>
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度工程をさらに有し、前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、前記温度工程において、前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、前記分析工程において、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を解析することを特徴とする構成4記載の成分分析方法である。
<構成6>
薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器内の液体を供給する送液工程と、前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整工程と、前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析工程と、を有し、前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、
前記送液工程において、前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、前記温度調整工程において、前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、前記分析工程において、前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析方法である。
001 培養プレート
002 ウェル
106 培養部
107 サンプル調製部
107A 入力部
107B 温度調整部
107C 送液部
107D 遠心分離部
108 分析部
108A 測定部
108B 解析部
109 表示部
201 シリンジポンプコントローラ
202 温調コントローラ
203 シリンジポンプ
204 チップヘッド
205 吸引ヘッド
206 廃液槽
207 チップラック
208 冷蔵薬液ラック
209 常温薬液ラック
210 第一温調機能付きプレートホルダ
211 第二温調機能付きプレートホルダ
212 第一プレートホルダ
213 第二プレートホルダ
214 ダストボックス
215 サーキュレータ
216 サクションポンプ
301 吸引した液体
302 チップ

Claims (6)

  1. 肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、
    前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、
    を備え、
    前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、
    前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、
    前記第2容器に、バッファ液が保持され、
    前記分析部は、
    前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、
    前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、
    前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置。
  2. 前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部をさらに有し、
    前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、
    前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、
    前記温度調整部は、
    前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、
    前記分析部は、
    前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、
    を測定し、
    前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を解析することを特徴とする請求項1記載の成分分析装置。
  3. 薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、
    前記複数の容器内の液体を供給する送液部と、
    前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部と、
    前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析部と、
    を備え、
    前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、
    前記送液部は、
    前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、
    前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、
    前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、
    前記温度調整部は、
    前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、
    前記分析部は、
    前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析装置。
  4. 肝細胞組織を保持する複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析工程を備え、
    前記複数の容器は、少なくとも第1容器、第2容器であって、
    前記第1容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第1溶液が保持され、
    前記第2容器に、バッファ液が保持され、
    前記分析部工程において、
    前記第1容器内の前記肝細胞組織から、前記第1溶液へ排出された前記成分の量と、
    前記第2容器内の前記肝細胞組織から、前記第2容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、
    前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析方法。
  5. 前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度工程をさらに有し、
    前記複数の容器は、少なくとも前記第1容器、前記第2容器、及び第3容器であって、
    前記第3容器内に、前記バッファ液が保持され、
    前記温度工程において、
    前記第1容器内及び前記第2容器内の第1温度よりも、前記第3容器内の第2温度の方が低くなるように調整し、
    前記分析工程において、
    前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、
    を測定し、
    前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を解析することを特徴とする請求項4記載の成分分析方法。
  6. 薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器内の液体を供給する送液工程と、
    前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整工程と、
    前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析工程と、
    を有し、
    前記複数の容器は、第1容器、第2容器、第3容器、及び第4容器であって、
    前記送液工程において、
    前記第4容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第1溶液を供給し、
    前記第1容器に、前記第1溶液を供給し、
    前記第2容器及び前記第3容器に、バッファ液を供給し、
    前記温度調整工程において、
    前記第1容器内及び前記第2容器内の温度よりも、前記第3容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、
    前記分析工程において、
    前記第1容器内の肝細胞組織から、前記第1溶液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第2容器内の肝細胞組織から、前記第2容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第3容器内の肝細胞組織から、前記第3容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第4容器内の肝細胞組織から、前記第4容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析方法。
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