WO2016166995A1 - 成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法 - Google Patents

成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法 Download PDF

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亮介 高橋
勝弘 神田
祐輔 清水
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • G01N33/5067—Liver cells

Definitions

  • the present invention relates to in vitro (in vitro) evaluation of pharmacokinetics such as drug uptake, metabolism, and excretion, which is useful for new drug development.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 disclose a technique for evaluating a portion (disappearance) excreted from a bile duct of cells by administering a drug to cultured cells so far. This evaluation method evaluates the disappearance of the drug that is excreted into the bile duct without exhibiting toxicity or efficacy, and then excreted outside the body as urine or feces.
  • the prior art is a method for evaluating the amount of gallbladder excretion, that is, the amount of a component having no medicinal effect, and a method for evaluating the disappearance from the body.
  • it is desirable to directly evaluate the amount of components excreted on the blood vessel side, but in the prior art, there is no method for analyzing the amount of components excreted in blood vessels. It was not established.
  • the administered drugs such as the vascular (Basal / Basolateral) drainage fraction, the luminal (Apical) drainage fraction, and the intracellular pool fraction of the administered drug
  • a holding unit that holds a plurality of containers that hold hepatocyte tissue
  • an analysis unit that measures components supplied into the plurality of containers and analyzes the measured components
  • the container is at least a first container and a second container, and a first solution containing a substance that releases adhesion between a plurality of cells forming the hepatocyte tissue is held in the first container, and the second container
  • a buffer solution is held in a container
  • the analysis unit is configured to determine the amount of the component discharged from the hepatocyte tissue in the first container to the first solution and the hepatocyte tissue in the second container.
  • measuring the amount of the component discharged to the buffer solution in the second container and analyzing the amount of the component discharged through the bile duct in the hepatocyte tissue It is an analysis device.
  • components such as drugs excreted on the blood vessel side of cells can be directly evaluated.
  • the blood vessel (Basal / Basolateral) discharge fraction, the luminal (Apical) discharge fraction, and the intracellular residual fraction via the transporter and diffusion of drug candidate compounds (parent compound and metabolites) By quantifying and determining the total amount of drug candidate compounds administered and the distribution ratio to each fraction, it becomes possible to evaluate the dynamics of the administered drug candidate compounds. Among them, it is possible to improve in-vitro screening accuracy for drug candidates that exert their medicinal effects. As a result, drug candidate compounds can be narrowed down early, and unnecessary animal experiments and useless human clinical trials can be reduced. Contribute to reducing new drug development costs, which are a burden for pharmaceutical companies.
  • the component analysis method for the above-described medicinal effect evaluation will be described in accordance with steps 0 to 6 in FIG. Steps 4 to 6 will be described in detail with reference to FIG.
  • explanation will be made based on the method for evaluating medicinal ingredients, but it is merely an example for explaining the invention of the present application, and it is used for evaluation of chemical substances other than drugs and further drug metabolites.
  • the component analysis method of the present invention can also be applied.
  • the specific conditions such as the buffer solution, temperature, and time shown in this embodiment are merely examples, and other conditions may be applied as long as they have the same effect as the technical idea. Needless to say.
  • Each test section has a holding area for holding cells.
  • separate containers may be used for each test section, or a single container having a plurality of holding areas may be divided.
  • Each test section may be set.
  • hepatocytes are first prepared and cultured for verifying the effect of the drug.
  • An example is shown below.
  • Hepatocytes were prepared according to the in situ collagenase perfusion method. Details are as follows. Rats (5-6 weeks old) are laparotomized under pentobarbital anesthesia, a catheter is inserted into the portal vein, and a preperfusion solution (Ca2 + and Mg2 + free, Hanks solution containing EGTA) is injected.
  • a preperfusion solution Ca2 + and Mg2 + free, Hanks solution containing EGTA
  • stop perfusion After stopping blood removal from the liver, stop perfusion. Replace the perfusate with the collagenase solution and perform perfusion. In this example, perfusion is performed using Hank's solution containing 0.05% collagenase, but this is not restrictive. After confirming that the intercellular tissue has been digested by collagenase, the perfusion is stopped. The liver is cut off, minced in cold Hanks solution, and dispersed to cells by pipetting. Use isotonic percoll solution to remove injured hepatocytes by centrifugation at 500G for 5 minutes.
  • the survival rate of the obtained hepatocytes is measured by the trypan blue exclusion method, and hepatocytes with a survival rate of 85% or more are used for culture.
  • hepatocytes having a survival rate of 85% or more are used for the culture, but it goes without saying that the conditions are not necessarily limited thereto.
  • the preparation of hepatocytes is not necessarily limited to the in situ collagenase perfusion method. Hepatocytes to be used are not limited to those derived from rats, and rat strains are not limited. Although hepatocytes are used in this embodiment, the present invention is not limited to this.
  • hepatocytes prepared by the in situ collagenase perfusion method are suspended in a medium, and hepatocytes are suspended in a medium at a density of 5 ⁇ 10 5 cells / mL and seeded on a commercially available collagen-coated culture dish. For example, sandwich culture) is performed.
  • the seeding density, medium, and culture plate 001 are not particularly limited.
  • the culture plate is shown in FIG. Here, a 24-well culture plate including 24 culture regions (wells, 002) is shown.
  • the present invention is not limited to this, and other types of containers may be used as long as they can hold predetermined cells.
  • FCS- a medium obtained by removing FCS from the medium (10% FCS +). The added medium was used. Thereafter, the medium is changed every 24 hours using the medium (FCS-).
  • a 24-well nanopillar cell culture plate may be used for culturing cells in a three-dimensional spheroid, and in this example, culturing a hepatocyte tissue formed three-dimensionally.
  • the number of wells is not particularly limited.
  • the medium used for culturing after 18 hours after seeding is not particularly limited, but in this example, a medium (hereinafter, medium (FCS-)) obtained by removing FCS from the medium (10% FCS +) was used. .
  • the medium used for culture after 48 hours after seeding is not particularly limited, but in this example, Matrigel is used as a medium (hereinafter referred to as medium (FCS-)) obtained by removing FCS from the medium (10% FCS +). A medium supplemented with was used. Thereafter, the medium is changed every 24 hours using the medium (FCS-).
  • FCS- Matrigel is used as a medium (hereinafter referred to as medium (FCS-)) obtained by removing FCS from the medium (10% FCS +). A medium supplemented with was used. Thereafter, the medium is changed every 24 hours using the medium (FCS-).
  • test sections 1, 2, and 3 detailed in step 5
  • three culture plates under the same conditions are prepared independently at this point. To do.
  • Steps 0 to 4 and Step 5 the same test operation is performed in all three types of test sections.
  • Step 1 Conditioning of hepatocytes>
  • the cells cultured in step 0 are prepared for conditioning suitable for drug evaluation. An example is shown below.
  • the culture supernatant of the cells cultured for 4 days in step 0 is removed, 400 ⁇ L of Hank's solution is added as a buffer, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes (step 1 in FIG. 2).
  • the type and amount of buffer are not particularly limited.
  • the operation in step 1 is preferably repeated twice.
  • the buffer solution for example, Hank's solution
  • how many times Step 1 is repeated may be arbitrarily changed according to the type of buffer solution to be used and the type of cells.
  • ⁇ Step 2 Administration of drug solution>
  • a drug solution to be evaluated is administered to the cells.
  • An example is shown below. After removing the buffer, 200 ⁇ L of 10 ⁇ M CDF (fluorescent reagent) was added to the well, incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then kept at 4 ° C. for 5 minutes (step 2 in FIG. 2).
  • CDF fluorescent reagent
  • the type, concentration and amount of reagent are not particularly limited. Since CDF emits fluorescence, it can be easily quantified with a plate reader as a model reagent. Moreover, although the dosage was 200 ⁇ L, this was selected as the amount by which the entire cells in the well were immersed in the reagent. The amount is not limited as long as the entire cell is immersed in the reagent.
  • the concentration of CDF may be any concentration conventionally used as a cell fluorescence assay. It is desirable to apply this concentration as a reagent amount for detection with a plate reader.
  • the incubation time was 30 minutes, which was adopted based on the result of a preliminary study that the time required for drug uptake and excretion to be almost in equilibrium was 30 minutes. The time is not limited depending on the purpose, and a plurality of times may be combined. Further, the incubation is desirably performed under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. using a CO 2 incubator, as in Step 0.
  • the cell In order to prevent leakage of the administered drug to the outside of the cell, by lowering the temperature in the container where the plate temperature is set to 4 ° C. after 30 minutes of incubation, the cell is prevented from discharging the drug to the outside. This is to make it happen.
  • the temperature of the drug is set to a predetermined temperature or less, it is possible to suppress the phenomenon that the drug stays inside the cell and leaks out of the cell.
  • the temperature is set to 4 ° C., but the temperature is not limited to this as long as the administered drug can be prevented from leaking out of the cell.
  • the method is not limited to a method of lowering the temperature.
  • the temperature for preventing discharge and leakage of the administered drug out of the cell is lower than the plate temperature (for example, 37 ° C.) at the time of drug solution administration. This is because uptake of an administered drug solution into a cell is a life phenomenon, and generally a tube is formed when activated at 37 ° C.
  • the timing of drug administration is not limited to this example.
  • drug administration may be performed from the day before or several days before the test day.
  • the drug may be administered at the stage of step 0, and steps 1 and 2 may be omitted.
  • Step 3 Cell washing>
  • the parts other than the drug solution contained in the cells in step 3 are washed away. An example will be described below.
  • the plate was washed 3 times with 400 ⁇ L of ice-cooled Hanks solution (step 3 in FIG. 2).
  • the purpose of 4 ° C is the same as above.
  • the amount of the culture medium during the culture was 400 ⁇ L, and the amount of the washing Hanks solution was 400 ⁇ L for the purpose of removing the medium components remaining on the inner wall of the well.
  • the number of washings in a general biochemical assay is usually three times, and was followed. Each condition such as the amount of washing and the number of washings is not limited. Thereby, it becomes possible to remove other than the chemical solution to be measured, and to further improve the accuracy of the medicinal effect evaluation in the subsequent process.
  • Step 4 Collection of fraction discharged from blood vessel>
  • a pretreatment buffer solution for example, Hank's solution
  • a Hanks solution supernatant
  • the incubation time is defined by the drug used and the purpose, and is not limited to 30 minutes as in this example. Further, the incubation is desirably performed under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. using a CO 2 incubator, as in Step 0.
  • the buffer solution the same type of buffer solution used in step 5 may be used, or another type of buffer solution may be used.
  • the drug stored in the hepatocyte tissue (FIG. 3, 101) up to step 3 is discharged into the Hank's solution via the first blood vessel side, that is, via passive diffusion (FIG. 2, step 4, (1) ′), and In order to discharge through the transporter (TP) (step 4 in FIG. 2, (2) ′ and 102 in the image diagram), the temperature was maintained at 37 ° C.
  • the blood vessel side discharge in the step 4 is defined as the first blood vessel side discharge and the blood vessel side discharge in the step 5 is defined as the second blood vessel side discharge.
  • both are steps of discharging from the cell to the blood vessel side (Basal / Basolateral) (supernatant).
  • the present step 4 can be regarded as a cleaning step before the recovery step according to the step 5.
  • a transporter is a membrane protein responsible for transporting a substance expressed on a cell membrane. Responsible for active mass transport inside and outside the cell.
  • the drug discharged into the Hanks solution in Step 4 was defined as the blood vessel side drainage fraction.
  • the upper surface portion of the cell facing the Hanks solution was the Basal / Basolateral surface (FIGS. 3 and 104). This is because it is assumed in the living body that the portion faces the blood vessel.
  • Step 5 to be described next is a step of collecting the drug by three different types of operations (test sections 1, 2, and 3), but before step 5, the first blood vessel as described above in step 4 is performed.
  • the side discharge fraction the drug discharged into the Hanks solution
  • the Hanks solution used for grasping each part of the blood vessel side discharge may be the Hanks solution of any test section.
  • the Hanks solutions in test sections 1 to 3 described later may be evaluated, or only a part may be used.
  • Steps 3 and 4 are steps for carrying out the analysis according to the present invention in detail and performing a highly accurate evaluation, and it is possible to skip these steps and perform the operation of Step 5. Needless to say.
  • step 5 the test sections 1 to 3 are processed under different conditions in order to obtain a plurality of index data obtained in the present invention by analysis described later.
  • An example of step 5 is shown below.
  • cells are prepared in advance separately from the cells used in the test groups 1 to 3, and the cells are crushed between Step 3 and Step 4 to obtain the cell extract.
  • a recovery step was added (step 4.0, FIG. 4).
  • the fraction obtained by this process was defined as a 4-cell fraction.
  • the 4-cell fraction corresponds to a container prepared separately from the containers used in the test sections 1 to 3, in other words, the test section 4.
  • the recovery rate of the drug is calculated from the sum of the drug amounts recovered in the test groups 1 to 3 in the subsequent steps 4, 5, and 6 with respect to the total drug amount obtained in the test group 4. It can be obtained. By obtaining the drug recovery rate, the drug balance can be evaluated.
  • fluorescence measurement for example, whether it is a 2D tissue such as a sandwich culture or a 3D tissue such as a spheroid, the drug is collected according to the recovery protocol for fluorescence measurement described in Step 6 of FIG. Recovery and measurement of fluorescence intensity are almost possible.
  • cell adhesion protein is cleaved by trypsin, a proteolytic enzyme, so that the spheroids are made into single cells, making it easy to access water and methanol, and aiming at efficient extraction of intracellular fractions.
  • the reagent is not limited to this reagent as long as cell-cell adhesion can be released from a tissue in which cells such as spheroids are arranged three-dimensionally and can be made into a single cell.
  • any reagent that can extract a fraction in each cell of a three-dimensional tissue without applying a single cell and can be applied to liquid chromatography mass spectrometry (LCMS) measurement may be used.
  • FIG. 5 shows an example in which 10 uM rosuvastatin was administered to cells, LCMS measurement was performed, and drug balance was evaluated.
  • the drug balance can be calculated by (Process 4 + 5 + 6) / 4-Cell * 100.
  • the recovery rate when the 2D tissue was treated with water and methanol was 92.3%
  • the recovery rate when the 2D tissue was treated with water and methanol after trypsin treatment was 94.0%.
  • the recovery rate when the 3D spheroid was treated with water and methanol was 138%, and the recovery rate when the 3D spheroid was treated with water and methanol after trypsin treatment was 92.2%.
  • the recovery rate when 3D spheroids were treated with only water and methanol exceeded 100% because the 4-cell fraction could not be recovered sufficiently with water and methanol alone.
  • the cause was considered that the sum of the drug amounts recovered from 6 exceeded the drug amount of the 4-cell fraction. This suggests that trypsinization single-spheroidized spheroids, facilitated access to water and methanol, and enabled efficient extraction of intracellular fractions.
  • trypsin treatment is not necessary for 2D tissues, but trypsin treatment is essential for 3D spheroids in order to collect intracellular fractions without omission and obtain an accurate drug balance.
  • the reagent is not limited to trypsin / EDTA as long as it is a reagent that releases intercellular adhesion and promotes the formation of a single cell.
  • test section 1 collection of supernatant by 37 ° C. disintegration system>
  • test group 1 as shown in test group 1 of FIG. 3, bile duct side discharge (3) and second blood vessel side discharge (that is, diffusion (1) ) And transporter (TP) (discharged from (2)).
  • TP transporter
  • Hanks (-) solution is a Hanks solution that does not contain calcium ions or magnesium ions, and is used when the intercellular adhesion is not intentionally strengthened as in this test section.
  • a chelator such as EGTA is used as described below for the purpose of positively releasing cell-cell adhesion.
  • EGTA has a chelating action to suppress the action of Ca 2+ and Mg 2+ involved in the adhesion of intercellular adhesion molecules, and is a reagent for releasing the adhesion between cells. This disrupts the bile duct formed in the culture process.
  • the reagent is not limited to EGTA as long as it has a chelating action.
  • the type, amount, and incubation temperature and time of the buffer containing EGTA are not particularly limited.
  • the drug stored in the cell at the stage where the process 4 is completed (the process 5 in FIG. 3 and the image diagrams (1) and (2)), and the drug discharged into the bile duct (FIG. All the 3 steps 5 and the image diagram (3)) are discharged into the supernatant and collected (FIG. 3, step 5, test section 1).
  • step 5 was defined as the biliary effluent fraction because the cell membrane part around the gap formed in the intercellular adhesion part corresponds to the apical surface (Fig. 3, 105) and the gap This is because it is assumed in the capillary bile duct (FIG. 3, 103).
  • process 5 test group 1 the temperature is maintained at 37 ° C., so that the fraction discharged from the cell to the blood vessel side is routed via passive diffusion (step 5, (1) in FIG. 3) and via the transporter ( 3 includes step 5 and (2)).
  • step 5 the fraction discharged from the cell to the blood vessel side is routed via passive diffusion (step 5, (1) in FIG. 3) and via the transporter ( 3 includes step 5 and (2)).
  • step 5 the fraction discharged from the cell to the blood vessel side is routed via passive diffusion (step 5, (1) in FIG. 3) and via the transporter ( 3 includes step 5 and (2)).
  • the release of cell-cell adhesion proceeds even if the cells contain several layers, or if the buffer containing EGTA is processed for an appropriate time for 2D sandwich culture. It was difficult to collect the bile duct discharge fraction (FIG. 6A).
  • Step 2 trypsin / EDTA was used in Step 5—Test Zone 1 for 3D spheroids in which 200 ⁇ L of 10 ⁇ M CDF (fluorescent reagent) was added to the wells and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • CDF fluorescent reagent
  • FIG. 6B shows the results of fluorescence intensity measurement of the supernatant immediately after buffer administration, 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, and 20 minutes after administration. Only the buffer was plotted with ⁇ , EGTA with ⁇ , and trypsin / EDTA with ⁇ . As a result, it was found that the amount of supernatant-side discharge was clearly improved when trypsin / EDTA ( ⁇ ) was treated, unlike when EGTA alone was treated ( ⁇ ) (FIG. 6B).
  • the trypsin / EDTA treatment disrupted the cell-cell adhesion, and the bile duct excretion fraction was discharged to the supernatant side.
  • the process of making cells into single cells is essential.
  • the reagent is not limited to trypsin / EDTA as long as it is a reagent that releases intercellular adhesion and promotes the formation of a single cell.
  • test section 2 collection of supernatant by 37 ° C. maintenance system>
  • the test group 2 does not collapse the bile duct as in the test group 1, but discharges only the second blood vessel side discharge (diffusion (1) and transporter (2)) shown in FIG. 200 ⁇ L of Hanks' solution was added.
  • test group 2 is a test group that does not contain a chelating agent such as EGTA, so that cell-cell adhesion remains maintained, and therefore capillary bile duct collapse is not induced.
  • the incubation is desirably performed under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. using a CO 2 incubator, as in Step 0.
  • step 5 the drug (FIG. 3, step 5 and image diagrams (1) and (2)) stored in the cells at the stage where step 4 is completed is discharged into the supernatant and collected. (FIG. 3, step 5, test section 2).
  • Various conditions are not limited.
  • the drug discharged into the supernatant is defined as the second blood vessel side discharge fraction.
  • the temperature is maintained at 37 ° C., so that the fraction discharged from the cell to the blood vessel side is routed via passive diffusion (step 5, (1) in FIG. 3) and via the transporter ( 3 includes step 5 and (2)).
  • the drug recovered in test zone 2 from the value obtained by quantifying the amount of drug collected in test zone 1 By subtracting the value obtained by quantifying the amount, it is possible to calculate the amount of drug for the bile duct side discharge (3).
  • test section 3 collection of supernatant by 4 ° C. maintenance system>
  • the test group 3 suppresses the drug discharged from the transporter (1) out of the second blood vessel side discharge by setting the temperature condition to be lower than that of the test groups 1 and 2, as will be described later, and the diffusion (2) Only the discharge due to is discharged. After adding 200 ⁇ L of Hanks' solution and incubating at 4 ° C. for 30 minutes, the supernatant was recovered.
  • the test temperature is different from the process 5 test section 2 of the same maintenance system.
  • Each drug has a specific transporter that moves inside and outside the cell. Therefore, eliminating the amount of discharge via passive diffusion and quantifying the amount of discharge via the transporter means that the amount of discharge specific to each drug can be quantified.
  • the type, amount, and incubation temperature and time of the buffer are not particularly limited.
  • the fraction discharged from the transporter can be calculated from the test group 2 and the test group 3 in step 5 by quantifying the recovered drug.
  • the discharge fractions are calculated using test sections 1, 2, and 3, respectively, but the number of test sections is not necessarily three.
  • test sections 1 and 2 may be performed, and the second blood vessel side discharge In this case, if it is desired to simply separate the diffusion (1) and the transporter (2), only the test sections 2 and 3 need be carried out.
  • a separate 4 ° C. disintegration system can be provided to suppress the discharge through the transporter among the discharge to the capillary bile duct side, and only the discharge due to diffusion can be measured.
  • the 4 ° C. disintegration system and the test section 3 it is possible to evaluate separately the discharge to the capillary bile duct side by diffusion and the discharge to the capillary bile duct side via the transporter.
  • the processes in each of the test sections 1 to 3 described above may be performed in any order, and the processes may be performed in parallel.
  • Step 6 Collection of bile duct fraction and intracellular fraction>
  • the operation returns to the common operation in all three test sections.
  • the drug for quantifying the intracellular residual fraction is collected.
  • the obtained sample was transferred to a culture plate, and fluorescence measurement was performed using a plate reader. Prepare wells containing only Hanks solution for blank measurement. The fluorescence intensity is measured at an excitation wavelength of 484 nm and an absorption wavelength of 519 nm.
  • the drug when quantified using a mass spectrometry (LCMS) device or the like, it is suspended using an organic solvent such as methanol after extraction of intracellular residues by hypotonization by water addition, organic solvent treatment, etc. The entire amount is recovered (step 6 in FIG. 2).
  • LCMS mass spectrometry
  • the drug is quantified using an LCMS apparatus as described later.
  • the plate reader measurement of the fluorescent drug and in the case of LCMS measurement of the drug, when 3D spheroid is used as the material, the cell pellet collected after centrifugation in Step 5 of the test section 1 The crushing process and drug quantification are performed.
  • pattern 1 This case is referred to as “pattern 1”. From the six types of values (B 1, B 2, B 3, C 1, C 2, C 3) obtained by the fluorescence amount measurement, distribution ratios to the respective segments as shown in pattern 1 in FIG. 7 are obtained. From these values, ⁇ Extracellular Efflux by Diffusion (ExEfx-Dif) is B3. ⁇ Extracellular Efflux by Transporter (ExEfx-TP) only via the transporter is B2-B3, ⁇ Bile duct side fraction (Bile Canaliculi Efflux, BCEfx) is B1-B2, -Intracellular residual fraction (Cell) is C1 It is corresponded to.
  • B1, B 2, B 3, C 1, C 2, C 3 distribution ratios to the respective segments as shown in pattern 1 in FIG. 7 are obtained. From these values, ⁇ Extracellular Efflux by Diffusion (ExEfx-Dif) is B3. ⁇ Extracellular Efflux by Transporter (ExEfx-TP) only via the transporter is B2-B
  • the calculated CDF score is not limited to these.
  • the score for assessing vascular drainage via the transporter is -It is obtained by (B2-B3) / B2 as the ratio of the amount of drug discharged via the transporter to the amount of discharged drug on the second blood vessel side (Ratio of Extracellular Efflux by Diffusion, RexEMTP).
  • the score for evaluating excretion into the bile duct is (B1-B2) / (C1 + C2) as a ratio of biliary excretion drug amount (Biliary Retention Drug, BiRD) to the total drug amount taken up into cells Or another way,
  • the ratio of the amount of drug excreted in the bile duct to the amount of drug remaining in the cell is (C2-C1) / C2 or (B1-B2) / C1 Etc.
  • FIG. 9A The result (pattern 1) shown in FIG. 9A can be obtained by changing the CDF to Rhodamine 123 and performing the same operation as described above. It can be seen that a distribution ratio clearly different from FIG. 8A (pattern 1) showing the result of CDF can be detected.
  • the ratio of the amount of drug discharged via the transporter to the blood vessel side discharged drug amount of CDF (RexEMTP) and the ratio of the amount of bile duct excreted drug to the total amount of drug taken into cells (BiRD) are 41.08 and 18.58, while those of Rhodamine 123 are 52.52 and 4.92, indicating that CDF is more easily excreted in the bile duct than Rhodamine 123 and is less likely to be excreted on the blood vessel side.
  • Example 2 describes a case where a method different from that in Example 1 is used for determination of the distribution ratio to each fraction and scoring based on the measurement result.
  • Example 2 by using the quantitative value of S # (corresponding to step 4) shown in FIG. 3, in addition to the distribution ratio to each fraction shown in pattern 1 of example 1, Information on whether it is likely to stay in the cell or whether it is difficult to stay can be given, and a more precise evaluation can be performed.
  • the distribution ratio to each section as shown in pattern 2 in FIG. 7 is obtained from the nine types of values obtained by the fluorescence amount measurement. From these values,
  • the first blood vessel side discharge fraction (Sup fraction) is S1 ( ⁇ S2 ⁇ S3)
  • ⁇ Extracellular Efflux by Diffusion is B3.
  • ⁇ Extracellular Efflux by Transporter (ExEfx-TP) only via the transporter is B2-B3
  • ⁇ Bile duct side fraction Bile Canaliculi Efflux, BCEfx
  • B1-B2 -Intracellular residual fraction (Cell) is C1 It is corresponded to.
  • Example 1 This is consistent with the evaluation of the intracellular residual fraction of Example 1. Furthermore, based on the quantitative result, scoring unique to the drug becomes possible, as described in Example 1.
  • Example 3 describes an example of an apparatus that realizes automation of the series of steps described in Examples 1 and 2.
  • movement of the apparatus mentioned later, the role of each structure, etc., description may be abbreviate
  • test group 1 a plurality of containers of the above-mentioned “well culture plate” may be set for each test section, or within one well culture plate.
  • the plurality of wells may be divided, and for example, “first container”, “second container”, “third container”, or the like may be set for each divided region.
  • the 4-cell fraction (test group 4) described in Example 1 is a “fourth container” different from the first to third containers.
  • this apparatus includes a culture unit 106, a sample preparation unit 107 (including an input unit 107A), an analysis unit 108, and a display unit 109.
  • the sample preparation unit 107 includes a temperature adjustment unit 107B that adjusts the temperature in each container (plate), which will be described later, and a liquid feeding unit 107C that can supply or recover the liquid to the container.
  • the sample preparation unit is desirably 5% CO 2 and 37 ° C. environment.
  • the analysis unit 108 measures the amount of a component such as a drug and the amount of the component such as the drug acquired from the measurement unit, and discharges from the transporter, via the bile duct, remaining in the cell, other than the transporter and the bile duct There is an analysis unit 108B that analyzes each amount of the amount (diffusion).
  • the above apparatus configuration is an example, and it goes without saying that, for example, only the analysis unit may be executed by another apparatus, and the information acquired from the measurement unit may be transmitted to the other apparatus.
  • sample preparation unit The purpose of the sample preparation unit is to automatically prepare each fraction to be analyzed as described in Example 1-2.
  • FIG. 13 An automatic measurement apparatus operation flowchart is shown in FIG.
  • the flowchart in FIG. 13 is merely an example, and this is not the case when the timing of drug administration is different as described in Example 1 ⁇ Step 2>.
  • a container for holding cells will be described using a plate having a plurality of cell holding regions (wells) as an example.
  • the container is not limited to a plate, and can hold cells. It goes without saying.
  • hepatocyte tissue is cultured in the culture unit 106 (FIG. 10, FIG. 13A sub-step 1). Thereafter, the plate holding the cultured hepatocyte tissue is transferred onto the plate holder 210 with the first temperature control function and the plate holder with the second temperature control function (211) of the sample preparation unit (FIG. 10, FIG. 13A substep 2).
  • Example preparation equivalent to step 1 in Examples 1 and 2>
  • a suction head 205 provided with a suction nozzle for sucking a liquid installed in the liquid feeding unit 107C moves to the well 002 of the culture plate 001 filled with the medium to be removed on the plate holder.
  • the medium is aspirated from the wells to remove the whole amount (FIG. 13A, substep 3).
  • the removed medium is discarded and collected in the waste liquid tank 206.
  • the chip 302 holding the liquid 301 is mounted on the chip head 204 attached to the suction nozzle from the chip rack 207 in which a plurality of chips are stored.
  • the chip head moves to the room temperature chemical rack 209 and sucks the buffer (substep 4 in FIG. 13A).
  • the chip head moves to the dust box 214 and the chip is discarded.
  • a replaceable chip is used here, but this is not the case.
  • the suction head moves to the well filled with the buffer and removes the buffer (substep 6 in FIG. 13A).
  • the removed medium is discarded and collected in the waste liquid tank 206. This process is repeated twice in total (cleaning process) (FIG. 13A, sub-process 7).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, the chip head moves to the room temperature chemical rack 209, and the buffer is sucked (substep 8 in FIG. 13A). After moving to the target well and adding the buffer, the chip head moves to the dust box 214 and the chip is discarded. Wait for 10 minutes at 37 ° C. (conditioning) (FIG. 13A, substep 9). Thereafter, the suction head 205 moves to the well filled with the buffer and removes the entire amount of the buffer (sub-process 10 in FIG. 13A).
  • Example preparation equivalent to step 2 in Examples 1 and 2>
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, the chip head moves to the room temperature chemical liquid rack 209, and sucks the chemical (substep 11 in FIG. 13A).
  • the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip. Wait 30 minutes at 37 ° C. (FIG. 13A, sub-step 12).
  • the suction head 205 moves to the well filled with the chemical solution and removes the entire amount of the chemical solution (sub-step 14 in FIG. 13A).
  • the temperature adjustment unit is described as having a temperature adjustment function mounted on the plate folder, but it goes without saying that the temperature adjustment unit may exist separately from the container holding unit.
  • Example preparation equivalent to step 3 in Examples 1 and 2>
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, the chip head moves to the refrigeration chemical rack 208, and the buffer is sucked (substep 15 in FIG. 13A).
  • the refrigerated chemical solution is used to stop an active life phenomenon such as transporter activity.
  • the refrigerated chemical solution rack 208 is used to keep the chemical solution, buffer, etc. at a low temperature. After moving to the target well and adding the buffer (substep 16 in FIG. 13A), the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip.
  • the suction head moves to the well filled with the buffer, and the buffer is removed (substep 17 in FIG. 13A).
  • the removed medium is discarded in the waste liquid tank 206. This process is repeated a total of three times (cleaning process) (FIG. 13A sub-process 18).
  • Example preparation equivalent to step 4 of Examples 1 and 2>
  • the chips in the chip rack 207 are mounted on the chip head 204.
  • the chip head moves to the refrigerated drug solution rack 208 and sucks the buffer (substep 20 in FIG. 13A).
  • the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip.
  • Example preparation equivalent to 4-Cell fraction preparation in Examples 1 and 2> [For 2D tissue]
  • the chip head 207 has the chip rack 207.
  • the chip is mounted, the chip head moves to the room temperature chemical rack 209, and 1% Triton X-100 or pure water / methanol is sucked (substep 20 in FIG. 14).
  • the chip head 204 After moving to the well for test section 4 on the plate holder (210) with the first temperature control function and adding 1% Triton X-100 or pure water / methanol (FIG. 14, sub-step 21), the chip head 204 is moved. It moves to the dust box 214 and discards the chip.
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to the well filled with the reagent, and the whole cell suspension is aspirated and dispensed to a collection plate for collection on the first plate holder 212. (Recovery) (FIG. 14, sub-step 22).
  • the chip head 204 After moving to the well for test section 4 on the plate holder (210) with the first temperature control function and adding 1% Triton X-100 or pure water / methanol (FIG. 15B sub-step 23), the chip head 204 is moved. It moves to the dust box 214 and discards the chip.
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to the well filled with the reagent, and the whole cell suspension is aspirated and dispensed to a collection plate for collection on the first plate holder 212. (Recovery) (FIG. 15B sub-step 24).
  • the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip. Wait 30 minutes at 37 ° C. (FIG. 13B, sub-step 26).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, the chip head moves to the room temperature chemical rack 209, and the buffer is sucked (substep 27 in FIG. 13B).
  • the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip. Wait for 30 minutes at 37 ° C. (FIG. 13B, sub-step 28).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, the chip head moves to the refrigerated chemical solution rack 209, and the buffer is sucked (substep 29 in FIG. 13B).
  • the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip. Wait for 30 minutes at 4 ° C. (sub-process 30 in FIG. 13B).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to a well filled with the EGTA buffer containing the drug, the EGTA buffer (supernatant) containing the drug is sucked, and collected on the first plate holder 212 Are dispensed (collected) onto the collection plate (FIG. 13B, sub-step 31).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to a well filled with a buffer containing a drug, the buffer (supernatant) containing the drug is sucked, and the recovery for recovery on the first plate holder 212 is performed. Dispensing (collecting) the plate (FIG. 13B sub-step 32).
  • a chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to a well filled with an EGTA buffer containing a drug, a buffer (supernatant) containing the drug is sucked, and a recovery plate on the first plate holder 213 is collected. Dispense (collect) into the collection plate (FIG. 13B sub-step 33).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, and the chip The head moves to the room temperature chemical rack 209 and sucks 1% Triton X-100 or pure water / methanol (sub-process 35 in FIG. 13B).
  • a chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to a well filled with the reagent, and the whole cell suspension is aspirated and collected on the first plate holder 212 and the second plate holder 213. (Collected) (collected in FIG. 13B sub-step 37).
  • the operation of the above apparatus has been described in the case where the operations in each of the test sections 1 to 3 of Examples 1 and 2 are sequentially performed. However, the respective steps may be performed in order or in parallel. May be.
  • the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip. Wait 30 minutes at 37 ° C. (FIG. 16B, sub-step 26).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, the chip head moves to the room temperature chemical rack 209, and the buffer is sucked (substep 27 in FIG. 16B).
  • the chip head 204 moves to the dust box 214, and the chip is discarded. Wait 30 minutes at 37 ° C. (FIG. 16B, sub-step 28).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, the chip head moves to the refrigerated chemical solution rack 209, and the buffer is sucked (substep 29 in FIG. 16B).
  • the chip head 204 moves to the dust box 214 and discards the chip. Wait for 30 minutes at 4 ° C. (FIG. 16B, sub-step 30).
  • a chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to a well filled with a trypsin / EDTA buffer containing a drug, a cell suspension is sucked, and a collection plate for collection on the first plate holder 212 Are dispensed (collected) into a sub-step 31 (FIG. 16B).
  • the dispensing plate is centrifuged by a centrifuge, and separated into a supernatant and a cell pellet, and then the supernatant is dispensed (collected) onto a collecting plate for collection on the first plate holder 212 (FIG. 16B, sub-step 32). ).
  • centrifugation is used here, it is needless to say that the method is not limited to this method as long as the method separates the supernatant and the pellet.
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to a well filled with a buffer containing a drug, the buffer (supernatant) containing the drug is sucked, and the recovery for recovery on the first plate holder 212 is performed. Dispense (collect) into the plate (FIG. 16B sub-step 33).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, moved to a well filled with a buffer containing a drug, the buffer (supernatant) containing the drug is sucked, and the recovery for recovery on the first plate holder 213 is performed. Dispense (collect) into the plate (FIG. 16B sub-step 34).
  • the chip in the chip rack 207 is mounted on the chip head 204, and the chip The head moves to the room temperature chemical rack 209 and sucks 1% Triton X-100 or pure water / methanol (substep 36 in FIG. 16B).
  • a holding unit that holds a plurality of containers that hold hepatocyte tissue; and an analysis unit that measures the components supplied into the plurality of containers and analyzes the measured components.
  • a first solution containing at least a first container and a second container, wherein the first container contains a substance that releases adhesion between a plurality of cells forming the hepatocyte tissue;
  • a buffer solution is retained, and the analysis unit is configured to extract the amount of the component discharged from the hepatocyte tissue in the first container into the first solution and the hepatocyte tissue in the second container. Measuring the amount of the component discharged into the buffer solution in the second container, and analyzing the amount of the component discharged through the bile duct in the liver cell tissue It is.
  • the apparatus further includes a temperature adjusting unit that adjusts the temperature of the liquid in the plurality of containers, wherein the plurality of containers are at least the first container, the second container, and the third container, In addition, the buffer solution is held, and the temperature adjusting unit adjusts the second temperature in the third container to be lower than the first temperature in the first container and the second container.
  • the analysis unit measures the amount of the component discharged from the hepatocyte tissue in the third container to the buffer solution in the third container, and passes through the hepatocyte tissue transporter. 2.
  • the component analysis apparatus according to Configuration 1 wherein the amount of the component discharged and the amount of the component discharged from other than the transporter and bile duct of the hepatocyte tissue are analyzed.
  • a holding unit that holds a plurality of containers that hold hepatocyte tissue that has absorbed the drug, a liquid feeding unit that supplies liquid in the plurality of containers, and a temperature adjustment unit that adjusts the temperature of the liquid in the plurality of containers
  • an analysis unit that measures the amount of medicine in the plurality of containers and analyzes the measured medicine, wherein the plurality of containers are a first container, a second container, a third container, and a fourth container.
  • the liquid supply unit supplies a first solution containing a substance for releasing adhesion between a plurality of cells forming the hepatocyte tissue to the fourth container, and the first container includes the first container.
  • a first solution is supplied, a buffer solution is supplied to the second container and the third container, and the temperature adjusting unit is configured to have a temperature higher than that in the first container and the second container.
  • the temperature is adjusted so that the inner temperature is lower, and the analysis unit sets the hepatocyte group in the first container.
  • the amount of the drug discharged into the first solution, the amount of the drug discharged from the hepatocyte tissue in the second container into the buffer solution in the second container, and the first The amount of the drug discharged from the hepatocyte tissue in the three containers into the buffer solution in the third container, and the hepatocyte tissue in the fourth container from the hepatocyte tissue in the fourth container.
  • the amount of the drug discharged to the liver, the amount of the drug discharged from the hepatocyte tissue transporter, the amount of the drug discharged from the bile duct of the hepatocyte tissue, and the hepatocyte tissue transporter And an amount of the component discharged from other than the bile duct, respectively.
  • the buffer solution is held, and in the temperature step, the second temperature in the third container is adjusted to be lower than the first temperature in the first container and the second container,
  • the amount of the component discharged from the hepatocyte tissue in the third container to the buffer solution in the third container is measured and discharged through the transporter of the hepatocyte tissue. 5.
  • the component analysis method according to Configuration 4 wherein the amount of the component to be discharged and the amount of the component discharged from other than the transporter and bile duct of the hepatocyte tissue are analyzed.
  • a first solution containing a substance for releasing adhesion between a plurality of cells forming the hepatocyte tissue is supplied to the fourth container, and the first solution is supplied to the first container.
  • a buffer solution is supplied to the second container and the third container, and in the temperature adjustment step, the temperature in the third container is higher than the temperature in the first container and the second container.
  • the amount of the drug discharged into the first solution from the hepatocyte tissue in the first container and the hepatocyte tissue in the second container in the analysis step From the amount of the drug discharged into the buffer solution in the second container and the amount of the drug discharged into the buffer solution in the third container from the hepatocyte tissue in the third container From the amount and hepatocyte tissue in the fourth container, The amount of the drug discharged into the buffer solution, the amount of the drug discharged from the transporter of the hepatocyte tissue, the amount of the drug discharged from the bile duct of the hepatocyte tissue, and the hepatocyte tissue The amount of the component discharged from other than the transporter and the bile duct is analyzed respectively.

Abstract

本発明は、細胞に投与した薬物の血管（Basal/Basolateral）側排出画分、管腔（Apical）側排出画分、細胞内貯留画分を定量することにより、各画分への分配比率を求め、in vitroでの薬物動態全体像を把握できる装置及び方法を提供することを目的としている。一例としては、肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、少なくとも第１容器、第２容器であって、前記第１容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第１溶液が保持され、前記第２容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第１容器内の前記肝細胞組織から、前記第１溶液へ排出された前記成分の量と、前記第２容器内の前記肝細胞組織から、前記第２容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置を提供する。

Description

成分分析装置、薬剤成分分析装置、成分分析方法及び薬剤成分分析方法
　本発明は、新薬開発に有用な、薬物の取込み、代謝、排泄といった薬物動態の全体像のin vitro（生体外）での評価に関する。
　新薬開発工程においては、ヒトの体内に投与し、効能を検証する臨床試験（「ヒト臨床試験」）を行うことが薬事法上必然となるが、ヒト臨床試験や動物実験試験は、莫大な開発費を要する。近年、これら開発費が最大の原因となって、新薬開発全体のコストが増大している。その原因の一つとして、開発工程前期の非臨床動物実験では薬効不良や毒性を検出できなかった薬剤候補について、開発工程後期のヒト臨床試験で初めて薬効不良や毒性が発見され、それまでの開発コストや、ヒト臨床試験にかけたコストが無駄になることに因るところが大きい。
　これらの背景から、ヒト臨床試験の通過率を向上させ、新薬開発コストの削減を図るため、薬効を示し、かつ毒性を発現しない新薬候補物質を早期に絞り込むことが重要となる。そこで、多くの製薬企業から、創薬初期段階に、ヒト細胞の特性と相関の低い動物実験のみで薬剤候補を絞り込むのではなく、ヒト細胞を用いて、投与薬物のヒト体内での薬物動態を良好に予測することが可能なin vitro（生体外）評価系が望まれている。
　しかしながら、細胞を利用して、投与された医薬品候補化合物の取込み、代謝、胆管・血管排泄といった、薬物動態の全体像を把握、解析する手法は確立されていない。薬剤が体内で薬効を発揮するためには、一旦肝臓に取り込まれた薬剤が、代謝産物になるか、あるいは代謝を受けずに元々の化合物（親化合物）のまま、血管側に排出された後に、再び血流に乗って再循環し、目的の臓器・器官にたどり着く必要がある。
　したがって、in vitro試験系においても、投与後に血管側に排出される医薬品候補化合物の再循環分を測定し、新薬開発において最も重要な指標の一つである薬効を評価できれば、非常に有用な薬物動態評価法となりえる。加えて、胆管排泄後に尿や便として体外に排泄される、細胞から胆管に排泄される分（消失分）、細胞内貯留分を含んだ薬物動態全体像を把握することにより、各画分への分配比率が求めることができるようになる。
　特許文献１及び特許文献2には、これまでに培養細胞に薬剤を投与し、細胞の胆管から排泄される分（消失分）を評価する手法が開示されている。この評価方法は、投与薬剤が毒性や薬効を発揮せずに胆管に排泄され、その後、尿や便として体外に排泄される薬剤消失分の評価を行うものである。
特開２０１２－６５６５９ 特開平８－５０３６１０
　従来技術はあくまでも胆菅排泄量、つまりは薬効のなかった成分の量を評価する方法であり、体外消失分を評価する方法であった。しかし、薬効のある成分の情報を得るためには、血管側に排泄される成分の量を直接的に評価することが望ましいが、従来技術では血管に排泄される成分の量を解析する方法は確立されていなかった。さらには、薬物動態の一部を評価できるのではなく、投与薬剤の血管（Basal/Basolateral）側排出画分、管腔（Apical）側排出画分、細胞内貯留画分をといった、投与薬剤が細胞のどこから排泄され、どこに貯留しているのか、細分化して定量することにより、in vitroでの薬物動態全体像を提供し、より精度の高い薬効評価を行うことができるが、このような評価方法についても確立されていなかった。
　例えば、肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、少なくとも第１容器、第２容器であって、前記第１容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第１溶液が保持され、前記第２容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第１容器内の前記肝細胞組織から、前記第１溶液へ排出された前記成分の量と、前記第２容器内の前記肝細胞組織から、前記第２容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置である。
　本発明を適用することによって、細胞の血管側に排泄された薬剤等の成分を直接的に評価することができる。さらに、医薬品候補化合物（親化合物および、代謝産物）のトランスポータ経由および、拡散経由での血管（Basal/Basolateral）側排出画分と管腔（Apical）側排出画分、細胞内残留画分を定量し、投与された医薬品候補化合物の総量および、各画分への分配比率を判定することによって、投与された医薬品候補化合物の動態を評価することが可能となり、膨大な数の医薬品候補化合物の中から、薬効を発揮する薬剤候補をin vitroでのスクリーニング精度を向上させることができる。結果として、医薬品候補化合物の早期の絞り込みを可能とし、無駄な動物実験や、無用なヒト臨床試験を減少させることができる。製薬企業にとって重荷となっている新薬開発コスト低減に貢献する。
培養プレート サンプル調製フロー 工程４、５、６の定量対象および薬物分布イメージ図 4-cell加えたフロー 新プロトコルによる回収率 試験区1－工程5の回収薬剤の蛍光強度 試験区1－工程5の回収薬剤の蛍光強度 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 分散薬剤の効果 各画分の定義とＣＤＦの結果 ＣＤＦの分配比率 ＣＤＦの分配比率 Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の分配比率 Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の分配比率 自動計測置構成図 サンプル調製部上面図 サンプル調製部正面図 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート 自動計測装置動作フローチャート チップヘッドおよびチップ
　本実施例では、上述の薬効評価のための成分分析方法について図２の工程０～６に則して説明する。また、工程４～６については、図３を用いて詳述する。尚、以下の複数の実施例においては、薬効成分の評価方法に基づいて説明するが、あくまでも本願発明を説明するための一例であって、薬剤以外の化学物質、さらには薬物代謝物の評価にも本願発明の成分分析方法を適用できることは言うまでもない。また、本実施例にて示す、バッファ液や温度、時間等の具体的な条件は、あくまでも一例であって、技術思想として同様の効果を有するのであれば別の条件を適用してもよいことは言うまでもない。
　本実施例においては、試験区１～３の、少なくとも３つの試験区を用いた場合について説明する。各試験区には、細胞を保持する保持領域が存在するが、これら保持領域は、各試験区ごとに別々の容器を用いてもよいし、複数の保持領域を有する一つの容器内を区切って、各試験区を設定してもよい。
　＜工程０：肝細胞の調製と培養＞
本工程では、まず薬剤の効果を検証するための肝細胞の調製・培養を行う。以下一例を示す。肝細胞の調製は、in situコラゲナーゼかん流法にしたがった。詳しくは以下の通りである。ラット（5～6週齢）を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液（Ca2+とMg2+不含、EGTAを含むハンクス液）を注入する。
　肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。本実施例では0.05％コラゲナーゼ含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。肝臓を切り離し、冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。等張パーコール液を使用して500G、5分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。
　得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率85％以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではないことは言うまでもない。また、肝細胞の調製は必ずしもin situコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。用いる肝細胞もラット由来のものに限らないし、ラットの系統も限定されない。本実施例では肝細胞を利用したが、これに限らない。
　前述の通りin situコラゲナーゼかん流法により調製した肝細胞を培地に懸濁し、市販のコラーゲンコート培養ディッシュに肝細胞を5X105cells/mLの密度で培地に懸濁し播種し、2次元平面培養（例えば、サンドイッチ培養）を行う。播種密度、培地、培養プレート００１は特に限定されない。
　培養プレートを図１に示す。ここでは24個の培養領域（ウェル、００２）を含む24ウェル培養プレートを示したが、これに限らず所定の細胞を保持できる容器であれば他の形状の容器を用いても良い。
　播種後、CO2インキュベータを用いて5％CO2、37℃の条件下で培養を開始する。18時間以上経過した後に、最初の培地交換を行う。播種後18時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地（10％FCS+）からFCSを除いた培地（以下、培地（FCS-））にマトリゲルを添加した培地を用いた。以降24時間毎に培地（FCS-）を用いて培地交換を行う。
　また、細胞を3次元的にスフェロイド、本実施例で言えば、3次元的に形成される肝細胞組織を培養する場合として、24ウェルナノピラー細胞培養プレートを用いてもよい。ウェル数は特に限定されるものではない。
　5X105cells/mLの密度に調製した細胞を播種後、CO2インキュベータを用いて5％CO2、37℃の条件下で培養を開始する。18時間以上経過した後に、最初の培地交換を行う。播種後18時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地（10％FCS+）からFCSを除いた培地（以下、培地（FCS-））を用いた。
　播種後、48時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地（10％FCS+）からFCSを除いた培地（以下、培地（FCS-））にマトリゲルを添加した培地を用いた。以降24時間毎に培地（FCS-）を用いて培地交換を行う。
　後述するように、工程５で3種類の異なる条件下での試験（試験区１、２、３：工程５で詳述）を行うため、この時点で同条件の培養プレートを独立に３プレート用意する。工程０から４、および工程５においては、３種類の試験区とも同一の試験操作を行う。
　＜工程１：肝細胞のコンディショニング＞
本工程では、工程０にて培養した細胞を、薬剤評価に適したコンディショニングに整える。以下一例を示す。工程０によって4日間培養した細胞の培養上清を除去し、バッファとしてハンクス液を400・L添加し、37℃で10分インキュベーションする（図２工程１）。
　バッファの種類と量は特に限定されるものではない。工程１の操作は２回繰り返すのが望ましい。このように工程０の培養にて使用した培地から、バッファ液（例えばハンクス液）へ細胞が馴染む成分を置換させることにより、以下の工程で正確な測定・解析を行うための下地を整えることができる。ただし、工程１を何度繰り返すかは、使用するバッファ液の種類や細胞の種類によって、任意に変更してもよいことは言うまでもない。
　＜工程２：薬液投与＞
本工程では、評価を行う薬液を細胞に投与する。以下一例を示す。バッファを除去後、10μMのＣＤＦ（蛍光試薬）200μLをウェルに添加し、37℃で30分間インキュベーションし、その後に4℃で5分間保持した（図２工程２）。
　試薬の種類、濃度、量は特に限定されるものではない。ＣＤＦは蛍光を発するため、モデル試薬としてプレートリーダで簡便に定量できる。また、投与量を２００μＬとしたが、これはウェル内の細胞全体が試薬に浸る量として選択した。細胞全体が試薬に浸る量であればこの量に限定されない。ＣＤＦの濃度は細胞の蛍光アッセイとして従来用いられている濃度であれば良い。プレートリーダで検出するための試薬量としても本濃度を適用することが望ましい。インキュベーションの時間は３０分としたが、これは薬剤の取り込みと排出がほぼ平衡状態になるまでの時間が３０分であるという予備検討の結果をもとに採用した。目的に応じて時間は限定されないし、複数の時間を組み合わせてもよい。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5％CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。
　投与された薬剤の細胞外への漏出を防ぐ目的で、３０分インキュベーション後にプレート温度を４℃にした容器内の温度を低くすることにより、細胞は薬剤を外部へ排出すること抑制する現象を生じさせるためである。
　このように薬剤の温度を所定の温度以下にすることにより、薬剤は細胞内へ留まり、細胞外へ漏出する現象を抑制することができる。本実施例では４℃としたが、投与された薬剤が細胞外へ漏出することを抑制できる温度であればこれに限られるものではない。
　また、投与された薬剤が細胞外へ漏出することを抑制できる、例えばインヒビターを投与するような方法があれば、温度を下げる方法に限らない。いずれにせよ、薬液投与時のプレート温度（例えば37℃）よりも、投与薬剤の細胞外への排出、漏出を防ぐための温度の方が低い温度となる。投与した薬液の細胞内への取込みは生命現象であり、一般に37℃で活性化すると管がられているためである。
　薬剤投与のタイミングは、本実施例に限定されるものではない。例えば、薬剤投与を試験日の前日もしくは数日前から行う場合もある。この場合は、工程０の段階で薬剤を投与し、工程１、２は省略してもよい。
　＜工程３：細胞洗浄＞
本工程では、工程３によって細胞内に含まれた薬液以外を洗い流す。以下一例を説明する。次に、プレートを４℃に保持したまま、氷冷したハンクス液４００μＬを用いて３回洗浄した（図２工程３）。
　４℃の目的は上記と同様である。培養時の培地の量が４００μＬであり、ウェル内壁に残留している培地成分を除去する目的で、洗浄ハンクス液の量を４００μＬとした。一般的な生化学アッセイでの洗浄回数は３回が通例となっており、踏襲した。洗浄量、洗浄回数等の各条件は限定されない。これにより、測定対象となる薬液以外を除去し、後の工程における薬効評価の精度をより向上させることが可能となる。
　＜工程４：血管側排出画分回収＞
薬効を評価する一つの指標として、投与した薬剤が、細胞内に長時間留まりやすいものであるか、または短期間にしか留まりにくいものであるかを分析することが有効である。そこで本工程では、上記指標のためのデータを取得するべく、後述の工程５にて各試験区内の細胞を評価する前に、薬剤が細胞内から所定時間以内に漏出させる。以下一例を示す。まず、前処理用のバッファ液（例えばハンクス液）を投与し、３７℃で３０分間インキュベーションし、薬剤を含むハンクス液（上清）を回収した（図２工程４）。
　インキュベーション時間は使用薬剤や目的によって規定されるものであって、本実施例に様に30分に限られるものではない。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5％CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。バッファ液は、工程５にて使用するバッファ液と同一種のものを使用してもよいし、別の種類のものを使用してもよい。
　工程３までにより肝細胞組織（図３、１０１）内に貯留させた薬剤を、ハンクス液中に、第一血管側排出、つまりは受動拡散経由（図２工程４、（１）’）および、トランスポータ（TP）経由（図２工程４、（２）’およびイメージ図中１０２）で排出させるため、３７℃に維持した。後述の通り、工程５においても血管側排出が行われるため、区別するため、工程４おける血管側排出を第一血管側排出、工程５における血管側排出を第二血管側排出と定義した。
　本質的には、ともに細胞内から血管側（Basal/Basolateral）（上清）に排出される工程である。あるいは、目的によっては、本工程４を工程５による回収工程前の洗浄工程と捉えることもできる。トランスポータは細胞膜上に発現している物質輸送を担う膜タンパク質である。細胞内外での能動的な物質輸送を担う。
　また、受動拡散は、トランスポータ経由以外による細胞外への排出であり、細胞膜からの漏出等を含む。工程４でハンクス液に排出された薬剤を血管側排出画分と定義したのは、ハンクス液に面している細胞上面部分は、ベーサル（Basal）/バソラテラル（Basolateral）面（図３、１０４）に相当し、生体内では血管に面している部分と想定されるためである。
　次に説明する工程５では、異なる３種類の操作で薬剤の回収を行う工程（試験区１、２、３）となるが、工程５の前に、工程４にて上述のように第一血管側排出画分（ハンクス液に排出された薬剤）を取得しておくことにより、薬剤が細胞に留まりやすいものかどうかを検証する指標を取得することができる。
　尚、血管側排出各分を把握するのに用いるハンクス液は、どの試験区のハンクス液を用いてもよい。例えば、後述の試験区１～３すべてのハンクス液について評価してもよいし、一部のみ用いても良い。また、工程３や４は本発明による分析をより詳細に実施し高精度の評価を行うための工程であって、これらの工程をスキップして工程５の作業を行うことも可能であることは言うまでもない。
　上記工程０～４は、図２に示すように、少なくとも試験区１～３において行われるものである。工程５では、本発明で求める複数の指標データを後述の解析によって取得するべく、試験区１～３夫々について、別条件で処理を行う。工程５の一例を以下に示す。
　一方、細胞に投与された薬剤総量を定量するために、予め試験区１～３に用いる細胞とは別に細胞を用意し、工程3と工程4の間に、細胞を破砕して細胞抽出液を回収する工程を加えた（工程４．０、図4）。
　この工程により得られる画分を4-cell画分とした。この4-cell画分とは、試験区１～３にて用いられる容器とは別途用意した容器、いわば、試験区４に相当する。この工程を加えることにより、試験区４にて得られる総薬剤量に対する、以降の工程４、５、６における試験区１～３にて回収される薬剤量の和から、当該薬剤の回収率を求めることが可能となる。薬剤の回収率を求めることにより、薬剤収支を評価することが可能になる。
　蛍光測定の場合には、例えばサンドイッチ培養のような2D組織であっても、スフェロイドのような3D組織であっても、図２の工程６に記載の蛍光測定用の回収プロトコルに従えば薬剤の回収および、蛍光強度の測定はほぼ可能である。
　また、LCMS測定においても、例えばサンドイッチ培養のような2D組織であれば、図２の工程６に記載のLCMS測定用の回収プロトコルに従えば薬剤の回収および、LCMS測定はほぼ可能である。
　一方、スフェロイドのような3D組織の場合には、図２の工程６に記載のLCMS測定用の回収プロトコルであっても、薬剤の全量回収は困難であった。したがって、図４記載の工程４．０のように、トリプシン／ＥＤＴＡを添加するプロトコルを考案した。
　これは、タンパク分解酵素であるトリプシンにより細胞間接着タンパク質を切断することでスフェロイドをシングルセル化し、水とメタノールのアクセスを容易にし、効率的な細胞内画分の抽出を狙うためである。
　スフェロイドのような各細胞が立体的に配置している組織から細胞間接着を解除し、シングルセル化が可能であればこの試薬に限定されない。また、シングルセル化せずとも立体組織内の各細胞内の画分を抽出でき、かつ液体クロマトグラフ質量分析（LCMS）測定に適用可能な試薬であればよい。10uMのロスバスタチンを細胞に投与し、ＬＣＭＳ測定を行い、薬剤収支を評価した一例を、図５に示す。
　薬剤収支は、（工程４＋５＋６）/４－Cell＊１００による計算でできる。その結果、2D組織に水とメタノール処理をした場合の回収率は92.3%、2D組織にトリプシン処理後に水とメタノール処理をした場合の回収率は94.0%であった。
　一方、3Dスフェロイドに水とメタノール処理をした場合の回収率は138%、3Dスフェロイドにトリプシン処理後に水とメタノール処理をした場合の回収率は92.2%であった。3Dスフェロイドに水とメタノールのみを処理した際の回収率が100%超になったのは、水とメタノールのみでは4-cell画分の回収が十分に出来なかったため、以降の工程４、５、６より回収された薬剤量の和が4-cell画分の薬剤量を上回ったことが原因と考えられた。これは、トリプシン処理が、スフェロイドをシングルセル化し、水とメタノールのアクセスを容易にし、効率的な細胞内画分の抽出を可能にしたことを示唆する。
　この結果から明らかなように、細胞内画分を漏れなく回収し、正確な薬剤収支を得るには、2D組織ではトリプシン処理は不要であるが、3Dスフェロイドにはトリプシン処理が必須であることがわかる。当然のことながら、細胞間接着を解除し、シングルセル化を促す試薬であればトリプシン／ＥＤＴＡに限らないことは言うまでもない。
　＜工程５、試験区１：３７℃崩壊系による上清の回収＞
試験区１では、図３の試験区１にて示すように、細胞からバッファ液（例えばハンクス（－）液）に、胆管側排出（３）と、第二血管側排出（つまりは拡散（１）とトランスポータ（TP）（２）とからの排出）との合算分を排出させる。
　ハンクス（－）液は、カルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まないハンクス液のことであり、本試験区のような細胞間接着をあえて強化しない場合等に用いる。2次元平面的なサンドイッチ培養の場合、細胞間接着を積極的に解除する目的としては、以下述べるようにＥＧＴＡのようなキレーターを用いる。
　次に、１ｍＭのＥＧＴＡを含むハンクス（－）液を２００μＬ添加した。ＥＧＴＡは細胞間接着分子の接着に関与しているＣａ２+、Ｍｇ２＋の作用を抑えるキレート作用を持ち、細胞間接着を解除するための試薬である。これにより培養過程において形成された胆管を崩壊させる。
　３７℃で３０分間インキュベーションした後に、上清を回収した。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5％CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。キレート作用を持つ試薬であればＥＧＴＡに限定されない。ＥＧＴＡを含むバッファの種類、量、およびインキュベーション温度と時間は特に限定されない。
　工程５の試験区１では、工程４が終了した段階で細胞内に貯留している薬剤（図３工程５、およびイメージ図（１）、（２））、および胆管に排出されている薬剤（図３工程５およびイメージ図（３））がすべて上清中に排出され、回収される（図３工程５、試験区１）。
　工程５で（３）を胆管側排出画分と定義したのは、細胞間接着部分に形成される間隙周囲の細胞膜部分は、アピカル（Apical）面（図３、１０５）に相当し、かつ間隙は毛細胆管（図３、１０３）に想定されるためである。
　工程５試験区１では、温度は３７℃に維持されているため、細胞内から血管側に排出される画分には受動拡散経由（図３工程５、（１））、およびトランスポータ経由（図３工程５、（２））が含まれる。また、3Dスフェロイド培養の場合、細胞が数層を形成しているためか、2次元サンドイッチ培養にとっては適正な時間でＥＧＴＡを含むバッファを処理した場合であっても、細胞間接着の解除が進行せず胆管排出画分の回収が困難であった（図６Ａ）。
　そこで、工程２において、10μMのＣＤＦ（蛍光試薬）200μLをウェルに添加し、37℃で30分間インキュベーションした３Dスフェロイドに対し、工程５－試験区１においてトリプシン／ＥＤＴＡを用いた。
　これはEGTAのみでは数層の細胞から構成される立体組織の細胞間接着を至適時間内で解除するのは困難と考えられたため、タンパク質分解酵素のトリプシンを用いて、より積極的に細胞間接着タンパク質を切断し、シングルセル化することを目的として行った。
　プロトコルの詳細は、図４－試験区１の工程５に記載の通りである。バッファ投与直後、投与2分、5分、10分、20分後の上清の蛍光強度測定の結果を図６Ｂに示す。バッファのみは▲、EGTAは■、トリプシン/EDTAは●でプロットした。その結果、ＥＧＴＡのみを処理した場合（■）とは異なり、トリプシン/EDTA（●）を処理した場合に、明らかに上清側排出量が向上していることがわかった(図６Ｂ)。
　図６Ｃ～図６Ｌの位相差顕微鏡画像からも明らかなように、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により、細胞間接着が崩壊し、胆管排出画分が上清側に排出されたためと考えられた。3Dスフェロイドから胆管排出画分を漏れなく回収するためには、細胞をシングルセル化する処理が必須であることを示している。当然のことながら、細胞間接着を解除し、シングルセル化を促す試薬であればトリプシン／ＥＤＴＡに限らないことは言うまでもない。
　＜工程５、試験区２：３７℃維持系による上清の回収＞
試験区２は、試験区１のように胆管を崩壊させず、図３に言う第二血管側排出（拡散（１）とトランスポータ（２））のみを排出させる。ハンクス液は２００μＬ添加した。試験区２は、試験区１とは異なり、ＥＧＴＡ等のキレート剤を含まないため、細胞間接着は維持されたままであり、したがって、毛細胆管の崩壊も誘起されない試験区である。
　３７℃で３０分間インキュベーションした後に、上清を回収した。また、インキュベーションは、工程0と同様に、CO2インキュベータを用いて5％CO2、37℃の条件下で行うことが望ましい。
　工程５の試験区２では、工程４が終了した段階で細胞内に貯留している薬剤（図３工程５、およびイメージ図（１）、（２））が上清中に排出され、回収される（図３工程５、試験区２）。各種条件は限定されない。
　これまでの説明にしたがい、上清中に排出される薬剤は、第二血管側排出画分と定義される。工程５試験区２では、温度は３７℃に維持されているため、細胞内から血管側に排出される画分には受動拡散経由（図３工程５、（１））、およびトランスポータ経由（図３工程５、（２））が含まれる。
　工程５の試験区１と試験区２から、回収した薬剤の量を定量的に解析することにより、例えば、試験区１で回収した薬剤量を定量化した値から、試験区２で回収した薬剤量を定量化した値を減算することにより、胆管側排出（３）の薬剤量を算出することができる。
　＜工程５、試験区３：４℃維持系による上清の回収＞
試験区３は、後述のように試験区１、２よりも低い温度条件とすることで、第二血管側排出のうち、トランスポータ（１）から排出される薬剤を抑制し、拡散（２）による排出分のみを排出させる。ハンクス液を２００μＬ添加し、４℃で３０分間インキュベーションした後に、上清を回収した。同じ維持系の工程５試験区２とは試験温度が異なる。
　これは、４℃にすることにより、トランスポータ経由の血管側排出を抑制させるためである。工程５試験区３において、トランスポータ活性を抑制させる低温４℃の試験区を採用することにより、受動拡散経由の排出量のみを定量し（図３工程５、（１））、工程５試験区２との比較においてトランスポータ経由による血管側薬剤排出量を算出（定量）することが可能となる。
　各薬剤には細胞内外を移動するための特異的なトランスポータが存在する。したがって、受動拡散経由の排出量を排除し、トランスポータ経由での排出量を定量できることは、各薬剤に特異的な排出量を定量できることを意味する。バッファの種類、量、およびインキュベーション温度と時間は特に限定されない。
　上述同様に、工程５の試験区２と試験区３から、回収薬剤を定量することにより、トランスポータ経由の排出画分を算出することができる。尚、本実施例では試験区１、２、３を用いて排出画分を夫々算出する例について示したが、試験区の数は必ず３つである必要はない。
　例えば、胆管側排出（３）と、第二血管側排出（（１）+（２））のみを分離したいのであれば、試験区１および２のみを実施すればよいし、第二血管側排出において、拡散（１）とトランスポータ（２）を単に分離したいのであれば、試験区２、３のみを実施すればよい。
　また、必要に応じて、別途4℃の崩壊系を設けることにより、毛細胆管側への排出のうち、トランスポータ経由の排出を抑制し、拡散による排出分のみを測定することができる。これにより、例えば、この4℃崩壊系と試験区３との比較から、拡散による毛細胆管側への排出とトランスポータ経由による毛細胆管側への排出分を切り分けて評価することが可能となる。上述した試験区１～３夫々における工程は、どの順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。
　＜工程６：胆管画分、細胞内画分の回収＞
再び工程６では３試験区とも共通の操作に戻る。工程６では、細胞内残留画分の定量を行うための薬剤の回収を行う。蛍光薬剤等をプレートリーダ等を用いて定量を行う場合には、１％の界面活性剤を含むハンクス液を例えば２００μＬ添加し、懸濁し、全量を回収することが望ましい（図２工程６）。
　これにより、細胞膜を破砕し、細胞内に残留する薬剤を排出させることが可能となる。得られたサンプルを培養プレートに移し、プレートリーダを用いて蛍光計測を行った。ブランク測定用にハンクス液のみを添加したウェルを準備する。励起波長４８４ｎｍ、吸収波長５１９ｎｍで蛍光強度を測定する。
　また、薬剤を質量分析（ＬＣＭＳ）装置等を用いて定量する場合には、水添加による低張化、有機溶剤処理等により、細胞内残留分抽出後にメタノール等の有機溶剤を用いて懸濁し、全量を回収する（図２工程６）。
　その後、ＬＣＭＳ装置を用い、後述のように薬剤の定量を行う。また、上記蛍光薬剤のプレートリーダ測定の場合においても、薬剤のＬＣＭＳ測定の場合においても、3Dスフェロイドを材料に用いる場合は、試験区1の工程5で遠心後に回収した細胞ペレットに対して、上記破砕工程、および薬剤の定量を行う。
　＜測定結果をもとにした各画分への分配比率の決定、およびスコア付け＞
上記工程により得られた薬剤量を反映した蛍光強度をもとに、各画分への分配比率を計算する。ここでは、工程５、６の総和（図３、Ｂ＃＋Ｃ＃＝（１）＋（２）＋（３）＋（４））を薬剤量１００％とする。
　この場合を「パターン１」とする。蛍光量測定により求めた６種類の値（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）から、図７のパターン１に示すような各区分への分配比率が求められる。これらの値から、
・拡散のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif）はＢ３、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP）はＢ２－Ｂ３、
・胆管側排出画分（Bile Canaliculi Efflux、BCEfx）はＢ１－Ｂ２、
・細胞内残留画分（Cell）はＣ１
に対応づけられる。
　この結果をもとに、図８Ａのパターン１のような円グラフが描画でき、各画分への分配比率の全体像を視覚的に理解することが可能となる。さらに、定量結果をもとに、以下のような薬剤固有のスコア付けが可能になる。
　本実施例では、算出したＣＤＦのスコアの一例を示す。算出されるスコアはこれらに限らない。トランスポータ経由での血管側排出を評価するスコアは、
・第二血管側排出薬剤量に対するトランスポータ経由で排出された薬剤量の割合（Ratio of Extracellular Efflux by Diffusion、RexEMTP）として（Ｂ２－Ｂ３）／Ｂ２によって求められる。胆管への排泄を評価するスコアは、
・細胞内に取り込まれた全薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合（Biliary Retention Drug、BiRD）として（Ｂ１－Ｂ２）／（Ｃ１＋Ｃ２）、
または、別法の、
・細胞内に残留している薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合として（Ｃ２－Ｃ１）／Ｃ２、あるいは（Ｂ１－Ｂ２）／Ｃ１
等によって求められる。
　＜異なる薬剤間の分配比率およびスコアの比較＞
ＣＤＦをＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３に変えて上記と同様の操作により、図９Ａに示す結果（パターン１）を得ることができる。ＣＤＦの結果を示す図８Ａ（パターン１）とは明らかに異なる分配比率を検出できることが分かる。
　また、例えば、ＣＤＦの血管側排出薬剤量に対するトランスポータ経由で排出された薬剤量の割合（RexEMTP）と、細胞内に取り込まれた全薬剤量に対する胆管排泄薬剤量の割合（BiRD）は、それぞれ、41.08、18.58であるのに対し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３のそれらは、52.52、4.92となり、ＣＤＦはＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３に比べて胆管に排泄されやすく、血管側には排出されにくい性質を保持した薬剤であることがわかる。以上のように、本発明により、それぞれの化合物がどのような薬物動態を示すかを評価することが可能になる。
　実施例２では、測定結果をもとにした各画分への分配比率の決定、およびスコア付けについて、実施例１とは異なる方法を用いた場合について説明する。本実施例では、図３に記載のＳ＃（工程４に相当）の定量値を利用することにより、実施例１のパターン１で示した各画分への分配比率に加えて、投与薬物が細胞内に留まりやすいのか、留まりにくいのかの情報も与えることができ、より精密な評価をすることが可能となる。
　すなわち、工程４、５、６の総和（図３、Ｓ＃＋Ｂ＃＋Ｃ＃＝（１）’＋（２）’＋（１）＋（２）＋（３）＋（４））を１００％の投与薬物量とする。この場合を「パターン２」とする。したがって、工程４、５、６の各試験区により求められる９種類（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を評価指標として用いることができる。
　蛍光量測定により求めた９種類の値から、図７のパターン２に示すような各区分への分配比率が求められる。これらの値から、
・第一血管側排出画分（Sup画分）はＳ１（≒Ｓ２≒Ｓ３）、
・拡散のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif）はＢ３、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP）はＢ２－Ｂ３、
・胆管側排出画分（Bile Canaliculi Efflux、BCEfx）はＢ１－Ｂ２、
・細胞内残留画分（Cell）はＣ１
に対応づけられる。
　この結果をもとに、図８Ｂのパターン２のような円グラフが描画でき、各画分への分配比率全体像を視覚的に理解することが可能となる。実施例２で示した方法を用いることにより、細胞内に留まりやすいか留まりにくいかの指標となるＳｕｐ画分が、ＣＤＦでは70.82であるのに対し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３では39.29（図９Ｂ、パターン２）となり、ＣＤＦが血管側に排出されやすい傾向にあることがわかる。
　このことは、実施例１の細胞内残留画分評価に一致する。さらに、定量結果をもとに、薬剤固有のスコア付けが可能になるが、これは実施例１に記載の通りである。
　実施例３では、実施例１および２で述べてきた一連の工程を自動化を実現する装置の一例について述べる。尚、後述する装置の動作の目的、各構成の役割等について、上記実施例１、２と重複する場合は、記載を省略する場合がある。
　実施例１～２で示した試験区１～３の夫々に設定される細胞を保持する領域について、後述する装置構成においては、「試験区１用ウェル」「試験区２用ウェル」「試験区３用ウェル」等の表現を用いて説明するが、これらは、例えば上述の「ウェル培養プレート」の複数の容器を夫々の試験区ごとに設定してもよいし、一つのウェル培養プレートの中の複数のウェルを区切って、区切った領域ごとに、例えば「第１容器」「第２容器」「第３容器」等として設定してもよい。尚、この場合、上記実施例１にて説明した4-cell画分（試験区４）は、第１～３容器とは別の「第４容器」となる。
特に試験区1用ウェルと試験区２用ウェルは、ほぼ同じ温度調整を行うため、ひとつのウェル培養プレート内を区切って設定した方が精度や速度の観点から効率的に評価することが可能となる。
尚、後述の装置動作について各試験区用ウェル（容器）の交換作業については、自動で交換しても手作業で交換してもよい。当該容器の交換や設置作業については、以下省略して説明することとする。
本装置は、図１０に示すように、培養部１０６、サンプル調製部１０７（含む入力部１０７Ａ）、分析部１０８、および表示部１０９により構成される。さらにサンプル調製部１０７は、後述する各容器（プレート）内の温度を調整する温度調整部１０７Ｂと、液体を容器に供給または回収可能な送液部１０７Ｃ等を有している。サンプル調製部は、5％CO2、37℃環境下であることが望ましい。
　分析部１０８は、薬剤等の成分の量を測定する測定部１０８Ａと、測定部から取得した薬剤等の成分の量から、トランスポータ経由、胆管経由、細胞内残存、トランスポータと胆管以外から排出される分（拡散）の夫々の量を解析する解析部１０８Ｂを有する。上記装置構成は一例であり、例えば解析部のみ別の装置に実行させ、当該別の装置に測定部から取得した情報を送信する等の構成としてもよいことは言うまでもない。
　また、サンプル調製部の詳細構成を図１１、および１２に示す。サンプル調製部では、これまで実施例１－２で述べてきたように、分析対象となる各画分を自動調製することが目的となる。
　各構成要素の説明は、後述のフローチャートにしたがって述べる。自動計測装置動作フローチャートは図１３に示す。図１３のフローチャートは一例にすぎず、実施例１<工程２>に記載の通り、薬剤投与のタイミングが異なる場合は、この限りではない。本実施例においては、細胞を保持する容器について、複数の細胞保持領域（ウェル）を有するプレートを一例として用いて説明するが、容器はプレートに限られるものでなく、細胞を保持できるものであれば良いことは言うまでもない。
　＜培養部からサンプル調製部への移送＞
まず、肝細胞組織が培養部１０６において培養される（図１０、図１３Ａサブ工程１）。その後、培養された肝細胞組織を保持したプレートはサンプル調製部の第一温調機能付きプレートホルダ２１０上、および第二温調機能付きプレートホルダ（２１１）上に移送される（図１０、図１３Ａサブ工程２）。
　＜サンプル調製：実施例１、２の工程１に相当＞
送液部１０７Cに設置されている、液体を吸引するための吸引ノズルが付加された吸引ヘッド２０５が、上記プレートホルダ上の、除去すべき培地が満たされた培養プレート００１のウェル００２に移動し、ウェルから培地を吸引して全量除去する（図１３Ａサブ工程３）。除去された培地は、廃液槽２０６に廃棄回収される。
　次に、液体３０１を保持するチップ３０２を、吸引ノズルに取り付けられたチップヘッド２０４に、複数のチップが保管されているチップラック２０７から装着する。チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、バッファを吸引する（図１３Ａサブ工程４）。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１３Ａサブ工程５）、チップヘッドがダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。コンタミネーション等を防ぐため、取替え可能なチップをここでは利用するが、その限りではない。
　吸引ヘッドは、バッファで満たされているウェルに移動し、バッファの除去を行う（図１３Ａサブ工程６）。除去された培地は、廃液槽２０６に廃棄回収される。この工程を合計２回繰り返す（洗浄工程）（図１３Ａサブ工程７）。
　次に、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、バッファを吸引する（図１３Ａサブ工程８）。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後、チップヘッドがダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。３７℃で１０分間待機する（コンディショニング）（図１３Ａサブ工程９）。その後、吸引ヘッド２０５が、バッファで満たされているウェルに移動し、バッファを全量除去する（図１３Ａサブ工程１０）。
　＜サンプル調製：実施例１、２の工程２に相当＞
チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、薬液を吸引する（図１３Ａサブ工程１１）。目的のウェルに移動し、薬液を添加した後（図１３Ａサブ工程１２）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。３７℃で３０分間待機する（図１３Ａサブ工程１２）。
　その後、容器を保持する容器保持部の一構成例である、第一温調機能付きプレートホルダ２１０、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１が３７℃から４℃に変化した後（図１３Ａサブ工程１３）、吸引ヘッド２０５が、薬液で満たされているウェルに移動し、薬液を全量除去する（図１３Ａサブ工程１４）。尚、本実施例における温度調整部は、プレートフォルダに温調機能を搭載する説明としたが、温度調節部が容器保持部と別離して存在しても良いことは言うまでもない。
　＜サンプル調製：実施例１、２の工程３に相当＞
チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック２０８に移動し、バッファを吸引する（図１３Ａサブ工程１５）。冷蔵した薬液を用いるのは、トランスポータ活性のような能動的な生命現象を停止させるためであることは前述の通りである。
　冷蔵薬液ラック２０８はこの目的のため、薬液、バッファ等を低温に保持するためのものである。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１３Ａサブ工程１６）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。
　吸引ヘッドがバッファで満たされているウェルに移動し、バッファを除去する（図１３Ａサブ工程１７）。除去された培地は、廃液槽２０６に廃棄される。この工程を合計３回繰り返す（洗浄工程）（図１３Ａサブ工程１８）。
　＜サンプル調製：実施例１、２の工程４に相当＞
第一温調機能付きプレートホルダ２１０、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１が４℃から３７℃に変化した後（図１３Ａサブ工程１９）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック２０８に移動し、バッファを吸引する（図１３Ａサブ工程２０）。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１３Ａサブ工程２１）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。
　３７℃で３０分間待機する（図１３Ａサブ工程２０）。その後、第一温調機能付きプレートホルダ２１０、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１が３７℃から４℃に変化した後（図１３Ａサブ工程２２）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ２１２、および第二プレートホルダ２１３上の回収用の回収プレートに分注する（回収）（図１３Ａサブ工程２３）。
　＜サンプル調製：実施例１、２の４-Cell画分調製に相当＞
［２Ｄ組織用］第一温調機能付きプレートホルダ２１０、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１が４℃から３７℃に変化した後（図１４サブ工程１９）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを吸引する（図１４サブ工程２０）。
　第一温調機能付きプレートホルダ（２１０）上の試験区４用のウェルに移動し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを添加した後（図１４サブ工程２１）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。
　チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ２１２上の回収用の回収プレートに分注する（回収）（図１４サブ工程２２）。
　上記装置の動作は、実施例１、２の試験区１～３の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。また、図１４中のサブ工程１から１８までは、図１３Ａのそれと共通である。
［３Ｄ組織用］第一温調機能付きプレートホルダ２１０、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１が４℃から３７℃に変化した後（図１５Ａサブ工程１９）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、トリプシン/ＥＤＴＡを吸引する（図１５Ｂサブ工程２０）。
　第一温調機能付きプレートホルダ（２１０）上の試験区４用のウェルに移動し、トリプシン/ＥＤＴＡを添加した後、３７℃で３０分間待機する（図１５Ｂサブ工程２１）．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを吸引する（図１５Ｂサブ工程２２）。
　第一温調機能付きプレートホルダ（２１０）上の試験区４用のウェルに移動し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを添加した後（図１５Ｂサブ工程２３）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。
　チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ２１２上の回収用の回収プレートに分注する（回収）（図１５Ｂサブ工程２４）。
　上記装置の動作は、実施例１、２の試験区１～３の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。また、図１５Ａ中のサブ工程１から１８までは、図１３Ａのそれと共通である。
　＜サンプル調製：実施例１、２の工程５、６に相当＞
［２Ｄ組織用］第一温調付きプレートホルダ２１０が４℃から３７℃に変化した後（図１３Ａサブ工程２４）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック（２０９）に移動し、ＥＧＴＡを含むバッファを吸引する（図１３Ａサブ工程２４）。
　第一プレートホルダ２１２上の試験区１用のウェルに移動し、ＥＧＴＡを含むバッファを添加した後（図１３Ｂサブ工程２５）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。３７℃で３０分間待機する（図１３Ｂサブ工程２６）。
チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、バッファを吸引する（図１３Ｂサブ工程２７）。
　第一プレートホルダ２１２上の試験区２用のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１３Ｂサブ工程２８）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。３７℃で３０分間待機する（図１３Ｂサブ工程２８）。チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック２０９に移動し、バッファを吸引する（図１３Ｂサブ工程２９）。
　第二プレートホルダ２１３上の試験区３用のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１３Ｂサブ工程３０）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。４℃で３０分間待機する（図１３Ｂサブ工程３０）。チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、薬剤を含むＥＧＴＡバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むＥＧＴＡバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ２１２上の回収用の回収プレートに分注（回収）する（図１３Ｂサブ工程３１）。
　チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ２１２上の回収用の回収プレートに分注（回収）する（図１３Ｂサブ工程３２）。
　チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、薬剤を含むＥＧＴＡバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ２１３上の回収用の回収プレートに分注する（回収）する（図１３Ｂサブ工程３３）。
　第一温調機能付きプレートホルダ２１０、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１がともに室温に変化した後（図１３Ｂサブ工程３４）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを吸引する（図１３Ｂサブ工程３５）。
　第一温調機能付きプレートホルダ（２１０）、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１上の試験区１、２、３用のウェルに移動し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを添加した後（図１３Ｂサブ工程３６）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。
　チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ２１２および、第二プレートホルダ２１３上の回収用の回収プレートに分注する（回収）（図１３Ｂサブ工程３７）。上記装置の動作は、実施例１、２の試験区１～３の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。
［３Ｄ組織用］第一温調付きプレートホルダ２１０が４℃から３７℃に変化した後（図１６Ａサブ工程２４）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック（２０９）に移動し、トリプシン/ＥＤＴＡを含むバッファを吸引する（図１６Ｂサブ工程２５）。
　第一プレートホルダ２１２上の試験区１用のウェルに移動し、トリプシン/ＥＤＴＡを含むバッファを添加した後（図１６Ｂサブ工程２６）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。３７℃で３０分間待機する（図１６Ｂサブ工程２６）。チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、バッファを吸引する（図１６Ｂサブ工程２７）。
　第一プレートホルダ２１２上の試験区２用のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１６Ｂサブ工程２８）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。３７℃で３０分間待機する（図１６Ｂサブ工程２８）。チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック２０９に移動し、バッファを吸引する（図１６Ｂサブ工程２９）。
　第二プレートホルダ２１３上の試験区３用のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１６Ｂサブ工程３０）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。４℃で３０分間待機する（図１６Ｂサブ工程３０）。チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、薬剤を含むトリプシン/ＥＤＴAバッファで満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を吸引し、第一プレートホルダ２１２上の回収用の回収プレートに分注（回収）する（図１６Ｂサブ工程３１）。
　分注プレートを遠心分離部にて遠心分離し、上清と細胞ペレットに分離後、上清を第一プレートホルダ２１２上の回収用の回収プレートに分注（回収）する（図１６Ｂサブ工程３２）。ここでは遠心分離を用いたが、上清とペレットを分離する方法であればこの方法に限らないことはいうまでもない。
　チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ２１２上の回収用の回収プレートに分注（回収）する（図１６Ｂサブ工程３３）。チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、薬剤を含むバッファで満たされたウェルに移動し、薬剤を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ２１３上の回収用の回収プレートに分注する（回収）する（図１６Ｂサブ工程３４）。
　第一温調機能付きプレートホルダ２１０、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１がともに室温に変化した後（図１６Ｂサブ工程３５）、チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック２０９に移動し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを吸引する（図１６Ｂサブ工程３６）。
　第一温調機能付きプレートホルダ（２１０）、および第二温調機能付きプレートホルダ２１１上の試験区１、２、３用のウェルに移動し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００あるいは、純水/メタノールを添加した後（図１６Ｂサブ工程３７）、チップヘッド２０４がダストボックス２１４に移動し、チップを廃棄する。チップヘッド２０４にチップラック２０７内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ２１２および、第二プレートホルダ２１３上の回収用の回収プレートに分注する（回収）（図１６Ｂサブ工程３８）。
　上記装置の動作は、実施例１、２の試験区１～３の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。また、図１６Ａ中のサブ工程１から２４までは、図１３Ａのそれと共通である。
　＜サンプル調製部から測定部への移送＞
培養プレートの回収された薬剤は、測定部に移送される（図１３Ｂサブ工程３８）。測定部において、プレートリーダ、あるいはＬＣＭＳによる薬剤の測定がおこなわれる（図１３Ｂサブ工程３９）。
　＜解析部による分配比率とスコアの算出および結果の表示＞
測定結果から各画分への分配比率とスコアを算出する（図１３Ｂサブ工程４０）。その後、得られた算出値を表示部に表示する（図１３Ｂサブ工程４１）。
以上、実施例１～３にて説明した構成について、あくまで一例として挙げると、例えば以下のようになる。
　＜構成１＞ 
肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、少なくとも第１容器、第２容器であって、前記第１容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第１溶液が保持され、前記第２容器に、バッファ液が保持され、前記分析部は、前記第１容器内の前記肝細胞組織から、前記第１溶液へ排出された前記成分の量と、前記第２容器内の前記肝細胞組織から、前記第２容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置である。
　＜構成２＞ 
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部をさらに有し、前記複数の容器は、少なくとも前記第１容器、前記第２容器、及び第３容器であって、前記第３容器内に、前記バッファ液が保持され、前記温度調整部は、前記第１容器内及び前記第２容器内の第１温度よりも、前記第３容器内の第２温度の方が低くなるように調整し、前記分析部は、前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を解析することを特徴とする構成１記載の成分分析装置である。
　＜構成３＞ 
薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、前記複数の容器内の液体を供給する送液部と、前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部と、前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析部と、を備え、前記複数の容器は、第１容器、第２容器、第３容器、及び第４容器であって、前記送液部は、前記第４容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第１溶液を供給し、前記第１容器に、前記第１溶液を供給し、前記第２容器及び前記第３容器に、バッファ液を供給し、前記温度調整部は、前記第１容器内及び前記第２容器内の温度よりも、前記第３容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、前記分析部は、前記第１容器内の肝細胞組織から、前記第１溶液内に排出された前記薬剤の量と、前記第２容器内の肝細胞組織から、前記第２容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第４容器内の肝細胞組織から、前記第４容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析装置である。
　＜構成４＞ 
肝細胞組織を保持する複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析工程を備え、前記複数の容器は、少なくとも第１容器、第２容器であって、前記第１容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第１溶液が保持され、前記第２容器に、バッファ液が保持され、前記分析部工程において、前記第１容器内の前記肝細胞組織から、前記第１溶液へ排出された前記成分の量と、前記第２容器内の前記肝細胞組織から、前記第２容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析方法である。
　＜構成５＞ 
前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度工程をさらに有し、前記複数の容器は、少なくとも前記第１容器、前記第２容器、及び第３容器であって、前記第３容器内に、前記バッファ液が保持され、前記温度工程において、前記第１容器内及び前記第２容器内の第１温度よりも、前記第３容器内の第２温度の方が低くなるように調整し、前記分析工程において、前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を解析することを特徴とする構成４記載の成分分析方法である。
　＜構成６＞ 
薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器内の液体を供給する送液工程と、前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整工程と、前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析工程と、を有し、前記複数の容器は、第１容器、第２容器、第３容器、及び第４容器であって、
前記送液工程において、前記第４容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第１溶液を供給し、前記第１容器に、前記第１溶液を供給し、前記第２容器及び前記第３容器に、バッファ液を供給し、前記温度調整工程において、前記第１容器内及び前記第２容器内の温度よりも、前記第３容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、前記分析工程において、前記第１容器内の肝細胞組織から、前記第１溶液内に排出された前記薬剤の量と、前記第２容器内の肝細胞組織から、前記第２容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記第４容器内の肝細胞組織から、前記第４容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析方法である。
００１　培養プレート
００２　ウェル
１０６　培養部
１０７　サンプル調製部
１０７A　入力部
１０７B　温度調整部
１０７C　送液部
１０７D　遠心分離部
１０８　分析部
１０８A　測定部
１０８B　解析部
１０９　表示部
２０１　シリンジポンプコントローラ
２０２　温調コントローラ
２０３　シリンジポンプ
２０４　チップヘッド
２０５　吸引ヘッド
２０６　廃液槽
２０７　チップラック
２０８　冷蔵薬液ラック
２０９　常温薬液ラック
２１０　第一温調機能付きプレートホルダ
２１１　第二温調機能付きプレートホルダ
２１２　第一プレートホルダ
２１３　第二プレートホルダ
２１４　ダストボックス
２１５　サーキュレータ
２１６　サクションポンプ
３０１　吸引した液体
３０２　チップ
 

Claims (6)

  1. 肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、
    前記複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析部と、
    を備え、
    前記複数の容器は、少なくとも第１容器、第２容器であって、
    前記第１容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第１溶液が保持され、
    前記第２容器に、バッファ液が保持され、
    前記分析部は、
    前記第１容器内の前記肝細胞組織から、前記第１溶液へ排出された前記成分の量と、
    前記第２容器内の前記肝細胞組織から、前記第２容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、
    前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析装置。
  2. 前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部をさらに有し、
    前記複数の容器は、少なくとも前記第１容器、前記第２容器、及び第３容器であって、
    前記第３容器内に、前記バッファ液が保持され、
    前記温度調整部は、
    前記第１容器内及び前記第２容器内の第１温度よりも、前記第３容器内の第２温度の方が低くなるように調整し、
    前記分析部は、
    前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、
    を測定し、
    前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を解析することを特徴とする請求項１記載の成分分析装置。
  3. 薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器を保持する保持部と、
    前記複数の容器内の液体を供給する送液部と、
    前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整部と、
    前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析部と、
    を備え、
    前記複数の容器は、第１容器、第２容器、第３容器、及び第４容器であって、
    前記送液部は、
    前記第４容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第１溶液を供給し、
    前記第１容器に、前記第１溶液を供給し、
    前記第２容器及び前記第３容器に、バッファ液を供給し、
    前記温度調整部は、
    前記第１容器内及び前記第２容器内の温度よりも、前記第３容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、
    前記分析部は、
    前記第１容器内の肝細胞組織から、前記第１溶液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第２容器内の肝細胞組織から、前記第２容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第４容器内の肝細胞組織から、前記第４容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析装置。
  4. 肝細胞組織を保持する複数の容器内に供給された成分を測定し、当該測定した前記成分を解析する分析工程を備え、
    前記複数の容器は、少なくとも第１容器、第２容器であって、
    前記第１容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除する物質を含む第１溶液が保持され、
    前記第２容器に、バッファ液が保持され、
    前記分析部工程において、
    前記第１容器内の前記肝細胞組織から、前記第１溶液へ排出された前記成分の量と、
    前記第２容器内の前記肝細胞組織から、前記第２容器内のバッファ液へ排出された前記成分の量と、を測定し、
    前記所肝細胞組織における胆管を介して排出される前記成分の量を解析することを特徴とする成分分析方法。
  5. 前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度工程をさらに有し、
    前記複数の容器は、少なくとも前記第１容器、前記第２容器、及び第３容器であって、
    前記第３容器内に、前記バッファ液が保持され、
    前記温度工程において、
    前記第１容器内及び前記第２容器内の第１温度よりも、前記第３容器内の第２温度の方が低くなるように調整し、
    前記分析工程において、
    前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液へ排出された前記成分の量と、
    を測定し、
    前記肝細胞組織のトランスポータを介して排出される前記成分の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を解析することを特徴とする請求項４記載の成分分析方法。
  6. 薬剤を吸収した肝細胞組織を保持する複数の容器内の液体を供給する送液工程と、
    前記複数の容器内の液体の温度を調整する温度調整工程と、
    前記複数の容器内の薬剤の量を測定し、当該測定した薬剤を解析する分析工程と、
    を有し、
    前記複数の容器は、第１容器、第２容器、第３容器、及び第４容器であって、
    前記送液工程において、
    前記第４容器に、前記肝細胞組織を形成する複数の細胞間の接着を解除させる物質を含む第１溶液を供給し、
    前記第１容器に、前記第１溶液を供給し、
    前記第２容器及び前記第３容器に、バッファ液を供給し、
    前記温度調整工程において、
    前記第１容器内及び前記第２容器内の温度よりも、前記第３容器内の温度の方が低くなるように温度を調整し、
    前記分析工程において、
    前記第１容器内の肝細胞組織から、前記第１溶液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第２容器内の肝細胞組織から、前記第２容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第３容器内の肝細胞組織から、前記第３容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記第４容器内の肝細胞組織から、前記第４容器内の前記バッファ液内に排出された前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータから排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織の胆管から排出される前記薬剤の量と、
    前記肝細胞組織のトランスポータ及び胆管以外から排出される前記成分の量と、
    を夫々解析することを特徴とする薬剤成分分析方法。
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