JP5337169B2 - 動物肝細胞の培養方法 - Google Patents
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Description
102 細胞培養ディッシュ
103 接着剤
104 I型コラーゲン溶液
105 減圧用容器
106 減圧用ポンプ
107 洗浄用生理食塩水(Phosphate buffered saline(−);以下、PBS(−))
108 培地
109 肝細胞
110 肝細胞スフェロイド
111 減圧チャンバー
112 減圧部投入・取出口
113 開閉バルブ
114 接続部
115 減圧ポンプ
116 インキュベータ
117 液化炭酸ガスボンベ
118 脱イオン水
119 投入口
120 取出口
121 内部投入口
122 内部取出口
123 保管室
肝細胞の調製は、in situコラゲナーゼかん流法にしたがった。詳しくは以下の通りである。Fisher344系雄ラット(7〜10週齢)を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液(Ca2+とMg2+不含,EGTAを含むハンクス液)を注入する。同時に肝臓下部の下大静脈を切開して血液を放出させる。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、肝臓下部の下大静脈をかん止で止めてかん流を行なう。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。本実施例では0.05%コラゲナーゼ含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。肝臓を切り離し、冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。次いでガーゼろ過により未消化の組織を除去する。細胞懸濁液は、50G、1分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去する。次いで等張パーコール液を使用して500G、5分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率85%以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率85%以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではないことはいうまでもない。また、肝細胞の調製は必ずしもin situコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。
培養ディッシュ(102)底面にNPシート(101)を貼り付ける(図1(a))。NPシート(101)の貼付は特に限定されるものではなく、例えば瞬間接着剤であってもよく、両面テープであってもよい。また、NPシート(101)を貼付する容器も特に限定されるものではなく、市販の細胞培養用ディッシュであってもよく、チャンバースライドであってもよい。実施例1では、市販の細胞培養ディッシュ(102)に瞬間接着剤(103)でNPシート(101)を貼付した例を示す。NPシート(101)は、後述する所定の頭頂部直径を有するNPシートを複数用いるものとする。
前述の通りin situコラゲナーゼかん流法により調製した肝細胞109を培地108に懸濁し、同じく前述の通り準備したI型コラーゲンを塗布したNPシートに播種する(図1(e))。培地は特に限定されるものではないが、血清(FCS)、インシュリン、デキザメタゾンを含んだ培地(以下、培地(10%FCS+))を含むウィリアムズE培地を用いる。本実施例では、特に10%FCS、8.6nMインシュリン、255nMデキザメタゾンを含んだウィリアムズE培地を用いる。播種後、CO2インキュベータを用いて5%CO2、37℃の条件下で培養を開始し、18時間以上経過した後に、最初の培地交換を行い、以降24時間毎に培地交換を行う。播種後18時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地(10%FCS+)からFCSを除いた培地(以下、培地(FCS−))を用いる。また、肝細胞の播種密度は、本実施例では1×105cells/mlとしたが、この濃度に限定されない。ここで、培養に用いるNPシートには、(1)頭頂部の直径が0.18μmのNPシート(以下、0.18NP)、(2)同0.5μmのNPシート(以下、0.5NP)、(3)同1.0 μmのNPシート(以下、1.0NP)、(4)同2.0 μmのNPシート(以下、2.0NP)の4種類とする。また、NPシートに添加するI型コラーゲンの濃度は、(1)1/106%(W/V)以上、(2)1/106%(W/V)、(3)1/108%(W/V)、(4)1/108%(W/V)以下、の4種類とする。計16種類の条件で培養を行う。条件によってはスフェロイド110が形成されるものもある(図1(f))。16種類の条件で培養した結果は図2に示す通りであり、これによりスフェロイド形成のための最適な条件が決まる。これによれば、いずれのNPシートを用いても、I型コラーゲン濃度が1/106%(W/V)以上1/108%(W/V)以下が最も好ましい条件であることが明らかとなった。
形成した肝細胞スフェロイドの構造が生体内の肝臓組織の構造に近いことを示すために免疫染色を行う。着目した分子は、細胞−細胞間接着タンパク質であるE−カドヘリンと細胞骨格タンパク質であるアクチンである。E−カドヘリンとは、細胞−細胞間の接着結合を担う膜タンパク質のひとつで、細胞同士が結合し合いより高次な組織を構築していく上で必須のタンパク質である。また、アクチンとは細胞同士が接着し高次構造を形成していく際に細胞に対して物理的な支持を与える細胞骨格タンパク質である。これらふたつのタンパク質の発現は組織が組織として成立していることを示すためには必須の指標である。
次に、生体に近い構造を持つスフェロイドの機能を検証するため、肝臓の重要な機能であるアンモニア代謝能を測定する。生体内では、アンモニアは主に腸内や腎臓で生成され、血流に乗って肝臓にたどり着き、肝臓は尿素回路を利用してアンモニアを尿素に変換する。このような肝臓のアンモニア代謝能を測定するため、市販の専用キットを使用する。まず、前出の方法にしたがって、2.0NPシートを用いたNP通常培養によって肝細胞スフェロイドを形成させる。比較のため、前出の平面培養法にしたがって培養を行う。ともに、培養開始72時間後にアンモニア培地に交換し、培地の一部をサンプリングする。培地交換後24時間培養後に、同様に培地をサンプリングする。各サンプリング液に対し、キットの説明にしたがってサンプルを調製する。630nmの吸光度を測定し、当該24時間のアンモニア減少(代謝)量を算出する。なお、予めアンモニア濃度が既知のサンプルを使用して検量線を求めておく。一方、サンプリング時点での細胞数の測定は、細胞をSDSによって可溶化した後、ヘキスト33258を添加し蛍光強度を測定して求める(励起波長355 nm、蛍光波長460 nm)。本実施例では市販のキットを採用したが、いずれの方法であってもかまわない。
NPによって形成したスフェロイドの肝機能を検証するため、肝臓の重要な機能の一つである毛細胆管への排泄能を測定する。本実施例では、毛細胆管を形成する細胞膜上に局在するタンパク質であるMRP2の基質である5-カルボキシ-2’,7’-ジクロロフルオレッセイン二酢酸(CDFDA)を投与して胆管への排泄の有無を検証した。MRP2が活性を持っていれば5-カルボキシ-2’,7’-ジクロロフルオレッセイン(CDF)として胆管に排泄される。
形成したスフェロイドが肝臓組織のような高次構造を維持していること、あるいは肝臓特異的な機能を保持していることを検証するために、リアルタイムPCR法を用いて定量的な遺伝子発現解析を行う。採取直後の肝細胞のターゲット遺伝子(表1)の発現量を測定し,その値を1としたときの各培養条件における発現量を算出し、発現量の比較を行う。
Claims (9)
- 動物肝細胞の培養方法において、
肝細胞の相当直径よりも小さい相当間隔を有するナノピラーシートに、インテグリンと結合するタンパク質を塗布する工程と、
インテグリンと結合するタンパク質が塗布された上記ナノピラーシートに、所定の培地に所定の細胞密度に調製された肝細胞を播種する工程と、
所定時間周期で培地交換する工程を有し、
上記ナノピラーシートにインテグリンと結合するタンパク質を塗布する工程の後に、減圧工程を有し、
前記インテグリンと結合するタンパク質は、細胞外マトリクスの成分であり、
前記細胞外マトリクス成分は、I型コラーゲンを含み、
前記I型コラーゲンの濃度は、1/10 6 −1/10 8 %(W/V)の範囲であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項1に記載の動物肝細胞の培養方法において、
上記肝細胞を播種する工程では、上記肝細胞がナノピラーシートには接着するがアクチンストレスファイバーを形成するまではいかない範囲で接着させ、肝細胞スフェロイドを形成させることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項1に記載の動物肝細胞の培養方法において、
培養液中に、インシュリンおよびデキサメタゾンを添加することを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項3に記載の動物肝細胞の培養方法において、
培養液中のインシュリンの濃度は1nM−100nMの範囲であって、およびデキサメタゾンの濃度は、1nM−250nMの範囲であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項1に記載の動物肝細胞の培養方法において、
前記肝細胞の播種密度が1×104−1×106cells/mlの密度であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項1に記載の動物肝細胞の培養方法において、
前記肝細胞を相応表面処理を施したナノピラーシートに播種後、24−48時間後に生物学的マトリクスを重層することを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項6に記載の動物肝細胞の培養方法において、
生物学的マトリクスが、基底膜由来成分を含むことを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項1に記載の動物肝細胞の培養方法において、
形成されたスフェロイドの直径が、30−100μm以下であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。 - 請求項1に記載の動物肝細胞の培養方法において、
培地交換をする時間周期は4時間から24時間であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
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