JPH07274952A - 肝細胞の培養法 - Google Patents
肝細胞の培養法Info
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- JPH07274952A JPH07274952A JP6099150A JP9915094A JPH07274952A JP H07274952 A JPH07274952 A JP H07274952A JP 6099150 A JP6099150 A JP 6099150A JP 9915094 A JP9915094 A JP 9915094A JP H07274952 A JPH07274952 A JP H07274952A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 肝細胞の培養法を提供する。
【構成】 タイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲル
を培養基材として用い、かつアスコルビン酸を添加物の
一部として含む培養液を用いることを特徴とする肝細胞
培養法。添加するアスコルビン酸はアスコルビン酸リン
酸エステルを含むこと、また、アスコルビン酸以外に、
グルカゴン、Ｌ−プロリン、インシュリン、上皮増殖因
子（ＥＧＦ）、デキサメタゾン、ジメチルスルホキシ
ド、ニコチン酸アミドからなる群の少なくとも１つを培
養液中に含むことを好ましい態様とする。 【効果】 培養肝細胞の高レベルの機能を安定かつ長期
に維持することができ、肝細胞の機能解析や薬物代謝の
研究に有用である。
を培養基材として用い、かつアスコルビン酸を添加物の
一部として含む培養液を用いることを特徴とする肝細胞
培養法。添加するアスコルビン酸はアスコルビン酸リン
酸エステルを含むこと、また、アスコルビン酸以外に、
グルカゴン、Ｌ−プロリン、インシュリン、上皮増殖因
子（ＥＧＦ）、デキサメタゾン、ジメチルスルホキシ
ド、ニコチン酸アミドからなる群の少なくとも１つを培
養液中に含むことを好ましい態様とする。 【効果】 培養肝細胞の高レベルの機能を安定かつ長期
に維持することができ、肝細胞の機能解析や薬物代謝の
研究に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、肝細胞の長期培養を可
能とする培養法に関するものであり、さらに詳しくは、
肝細胞の機能を長期にわたり高いレベルで維持すること
の可能な培養方法であり、培養液の蛋白質やホルモンの
組成が明確であるので、肝細胞の機能解析や薬物代謝の
研究に有用な肝細胞の培養法に関するものである。
能とする培養法に関するものであり、さらに詳しくは、
肝細胞の機能を長期にわたり高いレベルで維持すること
の可能な培養方法であり、培養液の蛋白質やホルモンの
組成が明確であるので、肝細胞の機能解析や薬物代謝の
研究に有用な肝細胞の培養法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】肝臓から分離した肝細胞の初代培養は肝
機能の研究や肝細胞の利用に有用である。特に、最近
は、細胞非接着基材を用いた肝スフェロイド培養法やテ
ロペプチドを取り除いたコラーゲンゲルを用いた培養法
（特開平３−４７８０号公報）など、長期に肝細胞の機
能を維持する培養法が開発されて、応用への期待が高ま
っている。
機能の研究や肝細胞の利用に有用である。特に、最近
は、細胞非接着基材を用いた肝スフェロイド培養法やテ
ロペプチドを取り除いたコラーゲンゲルを用いた培養法
（特開平３−４７８０号公報）など、長期に肝細胞の機
能を維持する培養法が開発されて、応用への期待が高ま
っている。
【０００３】一方、栄養補給に重要な働きをなす培養液
は数多くの組成が公知であるが、肝細胞の培養に用いら
れているものはウィリアムスＥ培地、ダルベッコ改変イ
ーグル培地、ライホビッツＬ−１５培地等である。しか
しながら、これらの培養液も単独では１週間以内に細胞
が死滅してしまうので、長期の培養には必要に応じて牛
胎児や小牛の血清が１０％程度の濃度で加えられる。牛
胎児血清は、哺乳類由来の細胞の初代培養には欠かせな
いものであり、その含んでいる蛋白質やホルモン類の種
類や含有量もかなり解明されて来ているが、いまだ同定
されていない物質を含んでいる。また、血清中に含まれ
る蛋白質の多くは肝臓で生産されており、肝細胞の機能
を調べるに際し培養液中に加えた血清が邪魔になる場合
もある。さらに、血清は大型動物由来である場合が多
く、動物による個体差が血清の性質に強く影響してお
り、安定性の確保が困難である。
は数多くの組成が公知であるが、肝細胞の培養に用いら
れているものはウィリアムスＥ培地、ダルベッコ改変イ
ーグル培地、ライホビッツＬ−１５培地等である。しか
しながら、これらの培養液も単独では１週間以内に細胞
が死滅してしまうので、長期の培養には必要に応じて牛
胎児や小牛の血清が１０％程度の濃度で加えられる。牛
胎児血清は、哺乳類由来の細胞の初代培養には欠かせな
いものであり、その含んでいる蛋白質やホルモン類の種
類や含有量もかなり解明されて来ているが、いまだ同定
されていない物質を含んでいる。また、血清中に含まれ
る蛋白質の多くは肝臓で生産されており、肝細胞の機能
を調べるに際し培養液中に加えた血清が邪魔になる場合
もある。さらに、血清は大型動物由来である場合が多
く、動物による個体差が血清の性質に強く影響してお
り、安定性の確保が困難である。
【０００４】以上のことから、上記のような肝細胞の無
血清の培養液での培養が色々試みられてはいるが、いま
だ長期に安定な細胞の機能維持を可能とする培養液組成
は確立されていない状況にある。（「初代培養肝細胞実
験法」，学会出版センター，Ｐ２３９─２４３，１９８
７）
血清の培養液での培養が色々試みられてはいるが、いま
だ長期に安定な細胞の機能維持を可能とする培養液組成
は確立されていない状況にある。（「初代培養肝細胞実
験法」，学会出版センター，Ｐ２３９─２４３，１９８
７）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上のような技術的背
景を踏まえ、本発明者らは、上記のような問題を回避す
るために血清を含まない培養液を用いた場合でも培養肝
細胞の長期機能維持が可能な培養液組成と培養基材の検
討を行った結果、特定の物質を培養液中に添加し、かつ
タイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲルを培養基材
として用いることにより所期の目的を達成し得ることを
見い出し、本発明を完成するに至った。
景を踏まえ、本発明者らは、上記のような問題を回避す
るために血清を含まない培養液を用いた場合でも培養肝
細胞の長期機能維持が可能な培養液組成と培養基材の検
討を行った結果、特定の物質を培養液中に添加し、かつ
タイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲルを培養基材
として用いることにより所期の目的を達成し得ることを
見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、長期に安定な細胞の
機能維持を可能とする肝細胞の培養液組成を確立するこ
とを目的とするものである。また、本発明は、タイプＩ
コラーゲンを主成分とする固定ゲルを培養基材として用
いることを特徴とする肝細胞の長期培養法を提供するこ
とを目的とするものである。また、本発明は、培養肝細
胞の機能を高いレベルで安定かつ長期に維持することが
可能な肝細胞の新しい培養法を提供することを目的とす
るものである。さらに、本発明は、肝細胞の機能解析や
薬物代謝の研究に有用な肝細胞の培養法を提供すること
を目的とするものである。
機能維持を可能とする肝細胞の培養液組成を確立するこ
とを目的とするものである。また、本発明は、タイプＩ
コラーゲンを主成分とする固定ゲルを培養基材として用
いることを特徴とする肝細胞の長期培養法を提供するこ
とを目的とするものである。また、本発明は、培養肝細
胞の機能を高いレベルで安定かつ長期に維持することが
可能な肝細胞の新しい培養法を提供することを目的とす
るものである。さらに、本発明は、肝細胞の機能解析や
薬物代謝の研究に有用な肝細胞の培養法を提供すること
を目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、肝細胞培養基
材としてタイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲル、
望ましくはテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲ
ンもしくは還元処理を施したタイプＩコラーゲンを主成
分とする固定ゲルを用い、かつ培養液中にアスコルビン
酸、望ましくはアスコルビン酸リン酸エステルを含む培
養液を用いることを特徴とするものである。さらに、培
養液中にグルカゴン、Ｌ−プロリン、インシュリン、上
皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ）、デキサメタゾン、ジメチルスルホ
キシド、ニコチン酸アミドの全部または一部を加えるこ
とを特徴とするものであり、それにより培養肝細胞の機
能維持効果が高められる。
材としてタイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲル、
望ましくはテロペプチドを取り除いたタイプＩコラーゲ
ンもしくは還元処理を施したタイプＩコラーゲンを主成
分とする固定ゲルを用い、かつ培養液中にアスコルビン
酸、望ましくはアスコルビン酸リン酸エステルを含む培
養液を用いることを特徴とするものである。さらに、培
養液中にグルカゴン、Ｌ−プロリン、インシュリン、上
皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ）、デキサメタゾン、ジメチルスルホ
キシド、ニコチン酸アミドの全部または一部を加えるこ
とを特徴とするものであり、それにより培養肝細胞の機
能維持効果が高められる。
【０００８】続いて、本発明の詳細を説明する。本発明
は、上記の如く、タイプＩコラーゲンを主成分とする固
定ゲルを培養基材として用いるが、タイプＩコラーゲン
としては、タイプＩコラーゲンを酸可溶化した形でその
まま用いることもできるが、テロペプチドを除いたコラ
ーゲン、あるいは還元処理を施したコラーゲンが好適な
ものとして使用される。すなわち、哺乳類由来のタイプ
Ｉコラーゲンのテロペプチド部分をペプシンで消化した
コラーゲン、もしくは還元剤存在下で還元処理を行った
コラーゲンからなる溶液を培養容器の底面でゲル化さ
せ、そのゲル上に哺乳動物から単離した肝細胞を接着さ
せ、細胞が十分に培養液からの栄養補給を行える様、上
記の培養液をコラーゲンゲルとゲル上の肝細胞が浸る程
度以上に加え、さらに、培養期間が長期にわたる場合
は、ゲル上の培養液を適時交換することにより継続的な
栄養補給が行える。この場合、上記培養基材は上記の如
く、固定ゲルの形で用いることが重要である。また、固
定ゲルの形であればその使用形態、培養容器等は如何な
るものであっても良く特に限定されるものではない。
は、上記の如く、タイプＩコラーゲンを主成分とする固
定ゲルを培養基材として用いるが、タイプＩコラーゲン
としては、タイプＩコラーゲンを酸可溶化した形でその
まま用いることもできるが、テロペプチドを除いたコラ
ーゲン、あるいは還元処理を施したコラーゲンが好適な
ものとして使用される。すなわち、哺乳類由来のタイプ
Ｉコラーゲンのテロペプチド部分をペプシンで消化した
コラーゲン、もしくは還元剤存在下で還元処理を行った
コラーゲンからなる溶液を培養容器の底面でゲル化さ
せ、そのゲル上に哺乳動物から単離した肝細胞を接着さ
せ、細胞が十分に培養液からの栄養補給を行える様、上
記の培養液をコラーゲンゲルとゲル上の肝細胞が浸る程
度以上に加え、さらに、培養期間が長期にわたる場合
は、ゲル上の培養液を適時交換することにより継続的な
栄養補給が行える。この場合、上記培養基材は上記の如
く、固定ゲルの形で用いることが重要である。また、固
定ゲルの形であればその使用形態、培養容器等は如何な
るものであっても良く特に限定されるものではない。
【０００９】培養液は、基本培養液としてアミノ酸、ビ
タミン類の含有量の多いライホビッツＬ−１５培地等の
従来より肝細胞培養用に用いられている培養液を用い、
インシュリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、デキサメタゾ
ン等の初代肝細胞の機能維持に有効なものとして一般的
に知られている成分、および従来のガラス、及びプラス
チック培養器を用いた肝細胞の単層培養の実験で肝機能
維持に有効とされているジメチルスルホキシド（Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２．３
２５２−３２５６，１９８５）、ニコチン酸アミド、グ
ルカゴン等の成分、さらに、肝細胞におけるコラーゲン
合成に必須のアミノ酸であるＬ−プロリンと細胞外マト
リックスの合成に欠かせないアスコルビン酸（特開昭６
４−１０９８３号公報）を加えたものが好適なものとし
て用いられるが、上記各成分の内、少なくともアスコル
ビン酸を添加物の一部として含む培養液を用いることが
重要である。
タミン類の含有量の多いライホビッツＬ−１５培地等の
従来より肝細胞培養用に用いられている培養液を用い、
インシュリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、デキサメタゾ
ン等の初代肝細胞の機能維持に有効なものとして一般的
に知られている成分、および従来のガラス、及びプラス
チック培養器を用いた肝細胞の単層培養の実験で肝機能
維持に有効とされているジメチルスルホキシド（Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２．３
２５２−３２５６，１９８５）、ニコチン酸アミド、グ
ルカゴン等の成分、さらに、肝細胞におけるコラーゲン
合成に必須のアミノ酸であるＬ−プロリンと細胞外マト
リックスの合成に欠かせないアスコルビン酸（特開昭６
４−１０９８３号公報）を加えたものが好適なものとし
て用いられるが、上記各成分の内、少なくともアスコル
ビン酸を添加物の一部として含む培養液を用いることが
重要である。
【００１０】すなわち、本発明者らが検討したところに
よれば、上記の培養液への添加物の内、アスコルビン酸
の効果が特に大きく、アスコルビン酸を添加物の一部と
して含む培養液を用いることにより、１か月以上の安定
的な肝細胞の機能維持が可能になることが分かった。も
ちろん、この培養液に血清を加えても肝細胞機能維持の
効果は減じない。但し、アスコルビン酸は水溶液中では
不安定なため、培養液中に溶かした状態で保存すること
は難しく、培養液交換の間隔が３日以上になると機能維
持効果が低下する現象が観察されたが、溶液状態でもよ
り長期に安定なアスコルビン酸リン酸エステルの形で培
養液に加えることにより、培養肝細胞は高いレベルの機
能を安定的に維持できる様になった。
よれば、上記の培養液への添加物の内、アスコルビン酸
の効果が特に大きく、アスコルビン酸を添加物の一部と
して含む培養液を用いることにより、１か月以上の安定
的な肝細胞の機能維持が可能になることが分かった。も
ちろん、この培養液に血清を加えても肝細胞機能維持の
効果は減じない。但し、アスコルビン酸は水溶液中では
不安定なため、培養液中に溶かした状態で保存すること
は難しく、培養液交換の間隔が３日以上になると機能維
持効果が低下する現象が観察されたが、溶液状態でもよ
り長期に安定なアスコルビン酸リン酸エステルの形で培
養液に加えることにより、培養肝細胞は高いレベルの機
能を安定的に維持できる様になった。
【００１１】また、タイプＩコラーゲンをコートした培
養シャーレで肝細胞を培養した場合は、アスコルビン酸
を含む培養液を用いても肝細胞の機能を維持できなかっ
た。さらに、タイプＩコラーゲンを用いる場合でも、ペ
プシン消化もしくは還元処理を施していないコラーゲン
（希酸で溶かし出し滅菌しただけのコラーゲン）から調
製したゲルを用いた場合は、培養肝細胞の機能は、従来
のものと比較すると、より高いレベルで細胞機能は維持
されるが、ペプシン消化もしくは還元処理を施したコラ
ーゲンから調製したゲルを用いた場合と比較すると、そ
のレベルはそれほど高くなく、それほど長期の維持はで
きなかった。
養シャーレで肝細胞を培養した場合は、アスコルビン酸
を含む培養液を用いても肝細胞の機能を維持できなかっ
た。さらに、タイプＩコラーゲンを用いる場合でも、ペ
プシン消化もしくは還元処理を施していないコラーゲン
（希酸で溶かし出し滅菌しただけのコラーゲン）から調
製したゲルを用いた場合は、培養肝細胞の機能は、従来
のものと比較すると、より高いレベルで細胞機能は維持
されるが、ペプシン消化もしくは還元処理を施したコラ
ーゲンから調製したゲルを用いた場合と比較すると、そ
のレベルはそれほど高くなく、それほど長期の維持はで
きなかった。
【００１２】以上のように、本発明は、培養基材として
タイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲルを用い、か
つアスコルビン酸を添加物の一部として含む培養液を用
いることを特徴とするものであり、さらに、タイプＩコ
ラーゲンがテロペプチドを除いたコラーゲン、あるいは
還元処理を施したコラーゲンであることを好ましい態様
とするものであり、本発明者らの検討したところによれ
ば、上記の如く、かかる構成を採用することによっては
じめて本発明の所期の目的が達成されることが分かっ
た。
タイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲルを用い、か
つアスコルビン酸を添加物の一部として含む培養液を用
いることを特徴とするものであり、さらに、タイプＩコ
ラーゲンがテロペプチドを除いたコラーゲン、あるいは
還元処理を施したコラーゲンであることを好ましい態様
とするものであり、本発明者らの検討したところによれ
ば、上記の如く、かかる構成を採用することによっては
じめて本発明の所期の目的が達成されることが分かっ
た。
【００１３】
【実施例】以下の実施例により本発明を具体的に述べる
が、本発明はこの実施例により何ら限定されるものでは
ない。 実施例１ ペプシン処理によりテロペプチド部分を取り除いた豚皮
由来タイプＩコラーゲンおよび酸抽出の豚皮由来タイプ
Ｉコラーゲンの０．３％溶液（塩酸によりｐＨ３に調
整）各々８溶に１０倍濃度の培養液１溶とｐＨ調整用Ｎ
ａＯＨ、ＮａＨＣＯ3 溶液１溶を良く混合し、ｐＨ７の
０．２４％コラーゲン溶液を調製した。以上の操作はコ
ラーゲンの変性とゲル化を防ぐため氷上で行った。調製
した０．２４％のコラーゲン溶液をプラスチックの培養
器の底面に厚さ２〜５ｍｍになるように手早く敷き、３
７℃雰囲気下でゲル化させた。
が、本発明はこの実施例により何ら限定されるものでは
ない。 実施例１ ペプシン処理によりテロペプチド部分を取り除いた豚皮
由来タイプＩコラーゲンおよび酸抽出の豚皮由来タイプ
Ｉコラーゲンの０．３％溶液（塩酸によりｐＨ３に調
整）各々８溶に１０倍濃度の培養液１溶とｐＨ調整用Ｎ
ａＯＨ、ＮａＨＣＯ3 溶液１溶を良く混合し、ｐＨ７の
０．２４％コラーゲン溶液を調製した。以上の操作はコ
ラーゲンの変性とゲル化を防ぐため氷上で行った。調製
した０．２４％のコラーゲン溶液をプラスチックの培養
器の底面に厚さ２〜５ｍｍになるように手早く敷き、３
７℃雰囲気下でゲル化させた。
【００１４】一方、麻酔をかけ開腹したウィスターラッ
トの門脈よりコラーゲナーゼ０．０５％を含むハンクス
緩衝液を肝臓内に還流し、その後切り取った肝臓を培養
液を入れた容器内に取り出し、細切し、細胞濾過器で単
細胞に分散した。次いで、得られた細胞を低速遠心分離
により肝細胞（肝実質細胞）のみに精製した。
トの門脈よりコラーゲナーゼ０．０５％を含むハンクス
緩衝液を肝臓内に還流し、その後切り取った肝臓を培養
液を入れた容器内に取り出し、細切し、細胞濾過器で単
細胞に分散した。次いで、得られた細胞を低速遠心分離
により肝細胞（肝実質細胞）のみに精製した。
【００１５】得られたラット肝細胞は、２×１０5 細胞
／ｍｌの濃度で、上記コラーゲンゲルを固定した培養基
材上、および対照区としてタイプＩコラーゲンをコート
した培養シャーレ上にまき、３７℃、５％炭酸ガス９５
％空気雰囲気下の炭酸ガス培養装置内で３日間、１０％
牛胎児血清、インシュリン１×１０-7Ｍ、デキサメタゾ
ン１×１０-7Ｍ、Ｌ−プロリン３０μｇ／ｍｌ、上皮細
胞増殖因子１０ｎｇ／ｍｌ、ジメチルスルホキシド２％
を含むライホビッツＬ−１５培地で培養して細胞を基材
に接着させた後、新しい培養液と交換した。
／ｍｌの濃度で、上記コラーゲンゲルを固定した培養基
材上、および対照区としてタイプＩコラーゲンをコート
した培養シャーレ上にまき、３７℃、５％炭酸ガス９５
％空気雰囲気下の炭酸ガス培養装置内で３日間、１０％
牛胎児血清、インシュリン１×１０-7Ｍ、デキサメタゾ
ン１×１０-7Ｍ、Ｌ−プロリン３０μｇ／ｍｌ、上皮細
胞増殖因子１０ｎｇ／ｍｌ、ジメチルスルホキシド２％
を含むライホビッツＬ−１５培地で培養して細胞を基材
に接着させた後、新しい培養液と交換した。
【００１６】交換した培養液は、Ｌ−１５培地にインシ
ュリン２×１０-7Ｍ、デキサメタゾン２×１０-7Ｍ、Ｌ
−プロリン６０μｇ／ｍｌ、上皮増殖因子２０ｎｇ／ｍ
ｌ、グルカゴン７μｇ／ｍｌ、ジメチルスルホキシド２
％を添加したものを基本培地とし、さらに、アスコルビ
ン酸リン酸エステル０．２ｍＭを加えたものと加えない
もの、また、その各々に１０％牛胎児血清を加えたもの
と加えないものを用いた。定期的に培養液を交換し、サ
ンプリングし、培養肝細胞が合成、分泌したアルブミン
量を定期的に測定した。その結果を図１に示す。
ュリン２×１０-7Ｍ、デキサメタゾン２×１０-7Ｍ、Ｌ
−プロリン６０μｇ／ｍｌ、上皮増殖因子２０ｎｇ／ｍ
ｌ、グルカゴン７μｇ／ｍｌ、ジメチルスルホキシド２
％を添加したものを基本培地とし、さらに、アスコルビ
ン酸リン酸エステル０．２ｍＭを加えたものと加えない
もの、また、その各々に１０％牛胎児血清を加えたもの
と加えないものを用いた。定期的に培養液を交換し、サ
ンプリングし、培養肝細胞が合成、分泌したアルブミン
量を定期的に測定した。その結果を図１に示す。
【００１７】図１に示されるように、タイプＩコラーゲ
ンの固定ゲル上培養で、アスコルビン酸リン酸エステル
を含む無血清培地を用いた場合、牛胎児血清１０％存在
と同等またはそれ以上の高いレベルの機能を３０日以上
の長期にわたって維持した。なお、交換培養液中の添加
物の内、ジメチルスルホキシドを抜いて、ニコチン酸ア
ミド１０ｍＭを添加した培養液を交換培養液として用い
ても、ほぼ同じ結果が得られた。また、交換培養液中の
アスコルビン酸リン酸エステル以外の添加成分の一部も
しくは全部を抜いた場合、およびライホビッツＬ−１５
培地の替わりにウィリアムスＥ培地を用いた場合は、ア
ルブミン分泌量の値は低下したが、傾向は図１と同じで
あり、タイプＩコラーゲンおよびアスコルビン酸リン酸
エステルが肝機能の保持に有効であった。なお、上記実
施例において、タイプＩコラーゲンを還元処理したコラ
ーゲンの固定ゲルを用いて同様に実施した結果、ほぼ同
様の結果が得られた。
ンの固定ゲル上培養で、アスコルビン酸リン酸エステル
を含む無血清培地を用いた場合、牛胎児血清１０％存在
と同等またはそれ以上の高いレベルの機能を３０日以上
の長期にわたって維持した。なお、交換培養液中の添加
物の内、ジメチルスルホキシドを抜いて、ニコチン酸ア
ミド１０ｍＭを添加した培養液を交換培養液として用い
ても、ほぼ同じ結果が得られた。また、交換培養液中の
アスコルビン酸リン酸エステル以外の添加成分の一部も
しくは全部を抜いた場合、およびライホビッツＬ−１５
培地の替わりにウィリアムスＥ培地を用いた場合は、ア
ルブミン分泌量の値は低下したが、傾向は図１と同じで
あり、タイプＩコラーゲンおよびアスコルビン酸リン酸
エステルが肝機能の保持に有効であった。なお、上記実
施例において、タイプＩコラーゲンを還元処理したコラ
ーゲンの固定ゲルを用いて同様に実施した結果、ほぼ同
様の結果が得られた。
【００１８】
【発明の効果】以上詳述したとおり、本発明は、肝細胞
の培養基材としてタイプＩコラーゲンを主成分とする固
定ゲル、望ましくはテロペプチドを取り除いたタイプＩ
コラーゲン、もしくは還元処理を施したタイプＩコラー
ゲンを主成分とする固定ゲルを用い、かつ培養液中にア
スコルビン酸、望ましくはアスコルビン酸リン酸エステ
ルを含む培養液を用いることを特徴とするものであり、
さらに、培養液中にグルカゴン、Ｌ−プロリン、インシ
ュリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、デキサメタゾン、ジ
メチルスルホキシド、ニコチン酸アミドの全部または一
部を加えることを好ましい態様とするものであり、本発
明によれば、次のような効果が奏される。 （１）長期に安定な肝細胞の機能維持を可能とする培養
液組成を確立することができる。 （２）培養肝細胞の機能を高いレベルで安定かつ長期に
維持することができる。 （３）培養液の蛋白質やホルモンの組成を明確化し得る
ので、肝細胞の機能解析や薬物代謝の研究に有用であ
る。
の培養基材としてタイプＩコラーゲンを主成分とする固
定ゲル、望ましくはテロペプチドを取り除いたタイプＩ
コラーゲン、もしくは還元処理を施したタイプＩコラー
ゲンを主成分とする固定ゲルを用い、かつ培養液中にア
スコルビン酸、望ましくはアスコルビン酸リン酸エステ
ルを含む培養液を用いることを特徴とするものであり、
さらに、培養液中にグルカゴン、Ｌ−プロリン、インシ
ュリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、デキサメタゾン、ジ
メチルスルホキシド、ニコチン酸アミドの全部または一
部を加えることを好ましい態様とするものであり、本発
明によれば、次のような効果が奏される。 （１）長期に安定な肝細胞の機能維持を可能とする培養
液組成を確立することができる。 （２）培養肝細胞の機能を高いレベルで安定かつ長期に
維持することができる。 （３）培養液の蛋白質やホルモンの組成を明確化し得る
ので、肝細胞の機能解析や薬物代謝の研究に有用であ
る。
【図１】各種培養液を用いて肝細胞を培養した場合の培
養肝細胞のアルブミン分泌量を示す説明図である。
養肝細胞のアルブミン分泌量を示す説明図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 タイプＩコラーゲンを主成分とする固定
ゲルを培養基材として用い、かつアスコルビン酸を添加
物の一部として含む培養液を用いることを特徴とする肝
細胞培養法。 - 【請求項２】 培養基材に用いるタイプＩコラーゲンが
テロペプチドを除いたコラーゲン、あるいは還元処理を
施したコラーゲンであることを特徴とする請求項１記載
の肝細胞培養法。 - 【請求項３】 添加するアスコルビン酸はアスコルビン
酸リン酸エステルを含むことを特徴とする請求項１又は
請求項２記載の肝細胞培養法。 - 【請求項４】 アスコルビン酸以外に、グルカゴン、Ｌ
−プロリン、インシュリン、上皮増殖因子、デキサメタ
ゾン、ジメチルスルホキシド、ニコチン酸アミドからな
る群の少なくとも１つを培養液中に含むことを特徴とす
る請求項１、請求項２又は請求項３記載の肝細胞培養
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6099150A JPH07274952A (ja) | 1994-04-14 | 1994-04-14 | 肝細胞の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6099150A JPH07274952A (ja) | 1994-04-14 | 1994-04-14 | 肝細胞の培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07274952A true JPH07274952A (ja) | 1995-10-24 |
Family
ID=14239666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6099150A Pending JPH07274952A (ja) | 1994-04-14 | 1994-04-14 | 肝細胞の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07274952A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010079602A1 (ja) * | 2009-01-08 | 2010-07-15 | 株式会社日立製作所 | 動物肝細胞の培養方法 |
| JPWO2011096593A1 (ja) * | 2010-02-05 | 2013-06-13 | 公益財団法人先端医療振興財団 | 角膜内皮細胞の培養方法、移植用角膜内皮細胞シートの製造方法および角膜内皮細胞培養キット |
| CN110923192A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-03-27 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种成熟肝细胞的长期体外培养方法 |
-
1994
- 1994-04-14 JP JP6099150A patent/JPH07274952A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2010079602A1 (ja) * | 2009-01-08 | 2010-07-15 | 株式会社日立製作所 | 動物肝細胞の培養方法 |
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| CN110923192A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-03-27 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种成熟肝细胞的长期体外培养方法 |
| CN110923192B (zh) * | 2019-11-27 | 2022-03-08 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种成熟肝细胞的长期体外培养方法 |
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