JP4456888B2 - 多機能性臓器細胞の培養用培地 - Google Patents

Description

本発明は、多機能臓器細胞の培養用培地に関する。さらに詳しくは多機能臓器細胞を本来の機能を維持したまま長時間培養することができる培地に関する。

これまで、肝細胞等の多機能臓器細胞を培養するための培地として、特殊な細胞培養用モジュール中で基礎培地にプロリン、ＥＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾン、亜セレン酸、リノール酸、硫酸銅及び硫酸亜鉛を加えた特殊な無血清培地が知られている（特許文献１）。また、副腎質ホルモン及びアミノ酸を使用しない通常の培地を用いて、骨髄細胞とともに共培養する方法が研究発表されている（非特許文献１及び２）。

特開２００１−１２８６６０号公報 化学工学会第３５回秋季大会要旨集L119、2002年、482頁、発表者：井嶋 博之、ヤドン ワン（Yadong Wang）、ロバート ランガー（Robert Langer） 第４０回日本人工臓器学会要旨集161、2002年、S-189頁、発表者：井嶋 博之，ヤドン ワン（Yadong Wang），ロバート ランガー（Robert Langer）

しかし、特許文献１の培地では、特殊な装置を使用しているのにもかかわらず肝細胞の機能発現能力を示すアンモニア分解速度が不十分であり、また、非特許文献１及び２の方法においては、骨髄細胞とともに共培養することによって１日目のアルブミン分泌速度は増加したことは報告されているものの、その後の実験においてアルブミン分泌速度は経日的に低下し、３日目ではほとんど分泌が見られなくなることが判った。
すなわち、本発明の目的は、多機能性臓器細胞を本来の機能を維持したまま長時間培養することができる培地を提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の培地が多機能臓器細胞の機能を長時間維持できることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の肝臓細胞及び骨髄細胞（Ｅ）の共培養用培地の特徴は、非動化した牛胎児血清とヒドロコルチゾン及びプロリンとを含有する点を要旨とする。

本発明の多機能性臓器細胞培養用培地は、多機能性臓器細胞を本来の機能（アンモニア代謝能及びアルブミン分泌能等）を維持したまま長時間培養することができる。また、本発明の多機能性臓器細胞培養用培地を用いれば、特殊な装置等を使用する必要がなく、通常の培養条件で、多機能性臓器細胞を極めて安定かつ簡便に長時間培養することができる。
従って、本発明の多機能性臓器細胞培養用培地は、薬物代謝シミュレーター、医薬品生産装置及びハイブリッド型人工肝臓等の実用化に大きく貢献できる。

多機能性臓器細胞（Ａ）とは、多機能性臓器から得られ、その臓器の機能（例えば、肝臓の場合のアンモニア代謝機能、膵臓の場合のインスリン分泌機能等）を有する細胞である。
多機能性臓器細胞（Ａ）としては、肝臓細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、脾臓細胞、卵巣細胞、精巣細胞、肺細胞、前立腺細胞及び乳腺細胞等が挙げられる。これらのうち、肝臓細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、脾臓細胞、卵巣細胞及び精巣細胞が好ましく、さらに好ましくは肝臓細胞、膵臓細胞及び腎臓細胞、特に好ましくは肝臓細胞である。

多機能性臓器細胞（Ａ）には、（１）生体中の正常な多機能性臓器から直接取り出されるもの（初代細胞）、（２）生体中の癌化した多機能性臓器から直接取り出されるもの（癌細胞）、及び（３）初代細胞から何代にも渡り継代できる細胞に形質転換させたもの（株化細胞）があり、これらのいずれも使用することができる。これらのうち、多機能性臓器本来の機能をそのまま有するという観点等から、（１）生体中の正常な多機能性臓器から直接取り出されるものが好ましい。
多機能性臓器細胞（Ａ）の入手方法としては特に制限はなく、細胞バンクや販売業者等から入手してもよいが、多機能性臓器本来の機能をそのまま有するという観点等から、生体中の正常な多機能性臓器からフレッシュな細胞を直接取り出す方法が好ましい。

血清（Ｂ）としては、細胞培養に使用される血清であれば制限なく使用でき、牛胎児血清、ウマ胎児血清、ヒト胎児血清、仔ウシ血清、仔ウマ血清、及び成人ヒト血清等が挙げられる。これらのうち、牛胎児血清及びウマ胎児血清が好ましく、さらに好ましくは牛胎児血清である。
血清（Ｂ）としては、非働化処理をした血清が好ましい。非働化の方法としては、タンパク質を変性させずに血清中の補体（液体免疫）を不活性化できる方法であれば特に制限はなく、例えば、５６℃の温水中で３０分間加熱する方法が適用できる。

副腎質ホルモン（Ｃ）としては、細胞培養に使用される副腎ホルモンであれば制限なく使用でき、コルチゾン類（コルチゾン、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン及びリン酸ヒドロコルチゾン等）、プレドニゾロン類（プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロン及び酢酸ハロプレドン等）、メチルプレドニゾロン類（メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン及びコハク酸メチルプレドニゾロン等）、トリアムシノロン類（トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン及びトリアムシノロンアセトニド等）、デキサメタゾン（デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン及びパルミチ酸デキサメタゾン等）、ベタメゾン類（ベタメゾン及びリン酸ベタメゾン等）及びパラメタゾン類（酢酸パラメタゾン等）等が挙げられる。これらのうち、コルチゾン類が好ましく、さらに好ましくはヒドロコルチゾンである。

アミノ酸（Ｄ）としては、必須アミノ酸（Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸を含む）等が使用でき、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン等が挙げられる。これらのうち、Ｌ−アミノ酸が好ましく、さらに好ましくはプロリンである。

本発明の培地には、副腎ホルモン（Ｃ）及び／又はアミノ酸（Ｄ）を含有するが、好ましくは（Ｃ）及び（Ｄ）を含有することである。そして、本発明の培地には、基本培地が含まれる。
本発明の培地に含まれる基本培地としては公知のもの等が使用でき、例えば、ＤＭＥ培地、ＷＥ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地及びＲＰＭＩ培地等（朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地）、並びに市販の無血清培地［味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ１０３，同ＡＳＦ１０４，同ＡＳＦ３０１、ギブコ社製無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ，同ＶＰ−ＳＦＭ等］等、及びこれら混合物が挙げられる。これらの基本培地は、インビトロジェン社、味の素（株）及びギブコ社等から購入できる。これらのうち、ＤＭＥ培地及びＷＥ培地が好ましく、さらに好ましくはＤＭＥ培地である。

基本培地の含有量（容量％）は、培地の容量に基づいて、４５〜９９．９が好ましく、さらに好ましくは５５〜９９、特に好ましくは６５〜９５、最も好ましくは７０〜８５である。すなわち、基本培地の含有量（容量％）は、培地の容量に基づいて、４５以上が好ましく、さらに好ましくは５５以上、特に好ましくは６５以上、最も好ましくは７０以上であり、また、９９．９以下が好ましく、さらに好ましくは９９以下、特に好ましくは９５以下、最も好ましくは８５以下である。

血清（Ｂ）の含有量（容量％）は、培地の容量に基づいて、０．１〜５０が好ましく、さらに好ましくは１〜４０、特に好ましくは５〜３０、最も好ましくは１５〜２５である。すなわち、（Ｂ）の含有量（容量％）は、培地の容量に基づいて、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは５以上、最も好ましくは１５以上であり、また、５０以下が好ましく、さらに好ましくは４０以下、特に好ましくは３０以下、最も好ましくは２５以下である。

副腎質ホルモン（Ｃ）を含有する場合、（Ｃ）の含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．１〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５０、特に好ましくは１〜２０、最も好ましくは５〜１０である。すなわち、この場合、（Ｃ）の含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは０．５以上、特に好ましくは１以上、最も好ましくは５以上であり、また、１００以下が好ましく、さらに好ましくは５０以下、特に好ましくは２０以下、最も好ましくは１０以下である。

アミノ酸（Ｄ）を含有する場合、（Ｄ）の含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．１〜２０００が好ましく、さらに好ましくは２〜１０００、特に好ましくは２０〜２００、最も好ましくは５０〜１００である。すなわち、この場合、（Ｄ）の含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは２以上、特に好ましくは２０以上、最も好ましくは５０以上であり、また、２０００以下が好ましく、さらに好ましくは１０００以下、特に好ましくは２００以下、最も好ましくは１００以下である。

副腎質ホルモン（Ｃ）及びアミノ酸（Ｄ）を含有する場合、（Ｃ）及び（Ｄ）の含有重量比率（Ｃ／Ｄ）は、１／１０００〜１０／１が好ましく、さらに好ましくは１／１００〜１／１、特に好ましくは１／５０〜１／２、最も好ましくは１／２０〜１／５である。すなわち、この場合、（Ｃ）及び（Ｄ）の含有重量比率（Ｃ／Ｄ）は、１／１０００以上が好ましく、さらに好ましくは１／１００以上、特に好ましくは１／５０以上、最も好ましくは１／２０以上であり、また、１０／１以下が好ましく、さらに好ましくは１／１以下、特に好ましくは１／２以下、最も好ましくは１／５以下である。

本発明の培地には、基本培地、血清（Ｂ）、副腎質ホルモン（Ｃ）及び／又はアミノ酸（Ｄ）の他に、他の成分を添加することができる。
他の成分としては、細胞増殖因子、ホルモン、無機（塩）化合物、脂肪酸、抗生物質及び緩衝塩等が含まれる。
細胞増殖因子としては、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ及びＢＭＰ等（財団法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジニアリング（１９９９年）」４３〜５１頁に記載されているもの及び同文献に付記されている参考文献に記載されているもの）等が挙げられる。これらのうち、多機能性臓器細胞の機能発現の効果が高いという観点等から、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ及びＥＧＦが好ましく、さらに好ましくはＥＧＦである。
ホルモンとしては、インスリン及びトランスフェリン等が挙げられる。これらのうち、インスリンが好ましい。
無機（塩）化合物としては、金属化合物等が使用でき、銅化合物（硫酸銅等）、セレン化合物（亜セレン酸等）及び亜鉛化合物（硫酸亜鉛等）等が挙げられる。
脂肪酸としては、炭素数８〜１８の脂肪酸等が使用でき、リノール酸及びリノレイン酸等が挙げられる。
抗生物質としては、ペニシリン及びストレプトマイシン等が挙げられる。
緩衝塩としては、炭酸カルシウム、りん酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム及びＨＥＰＥＳ｛２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸｝等が挙げられる。

細胞増殖因子を含む場合、この含有量（μｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００１〜５００００が好ましく、さらに好ましくは１〜１０００、特に好ましくは１０〜１００である。すなわち、この場合、細胞増殖因子の含有量（μｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００１以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは１０以上であり、また５０，０００以下が好ましく、さらに好ましくは１，０００以下、特に好ましくは１００以下である。

ホルモンを含む場合、この含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００１〜５０００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜５００、特に好ましくは１〜５０である。すなわち、この場合、ホルモンの含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００１以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは１以上であり、また、５０００以下が好ましく、さらに好ましくは５００以下、特に好ましくは５０以下である。

無機（塩）化合物を含む場合、この含有量（μｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００００１〜５０００が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１００、特に好ましくは０．０１〜１０である。すなわち、この場合、無機塩の含有量（μｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００００１以上が好ましく、さらに好ましくは０．００１以上、特に好ましくは０．０１以上であり、また５，０００以下が好ましく、さらに好ましくは１００以下、特に好ましくは１０以下である。

脂肪酸を含む場合、この含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００１〜１００００が好ましく、さらに好ましくは１〜１０００、特に好ましくは１０〜１００である。すなわち、この場合、脂肪酸の含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００１以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは１０以上であり、また、１０，０００以下が好ましく、さらに好ましくは１，０００以下、特に好ましくは１００以下である。

抗生物質を含む場合、この含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．００１〜５００００が好ましく、さらに好ましくは１〜５０００、特に好ましくは１０〜５００である。すなわち、この場合、抗生物質の含有量（ｍｇ／Ｌ）は、培地の単位容量に基づいて、０．００１以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは１０以上であり、また、５０，０００以下が好ましく、さらに好ましくは５，０００以下、特に好ましくは５００以下である。

緩衝塩を含む場合、この含有量（ｇ／Ｌ）は、培地の容量に基づいて、０．０００１〜１００が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜２０、特に好ましくは０．１〜５である。すなわち、この場合、緩衝塩の含有量（ｇ／Ｌ）は、培地の単位容量に基づいて、０．０００１以上が好ましく、さらに好ましくは０．００１以上、特に好ましくは０．１以上であり、また、１００以下が好ましく、さらに好ましくは２０以下、特に好ましくは５以下である。

本発明の多機能性臓器細胞培養用培地を用いた培養条件としては特に制限はなく、多機能性臓器細胞（Ａ）を培地中に分散させ、通常の細胞培養容器中で、二酸化炭素濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１時間〜１年間、必要に応じて１〜７日毎に培地交換しなら培養すること等が挙げられる。特に好ましい例としては、例えば、二酸化炭素濃度５体積％、３７℃の条件で、２〜３日毎に培地交換しながら１日〜１ヶ月間培養することである。

多機能性臓器細胞（Ａ）の播種細胞数（万個／Ｌ）としては、用いる培養基材の種類や（Ａ）の種類等によって異なるが、培地の容量に基づいて、０．１〜１０００が好ましく、さらに好ましくは１〜１００、特に好ましくは１０〜５０である。すなわち、培地の容量に基づいて、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは１以上、特に好ましくは１０以上であり、また、１，０００以下が好ましく、さらに好ましくは１００以下、特に好ましくは５０以下である。

細胞培養容器としては、通常の細胞培養容器等が使用でき、マルチウエルプレ−ト、ペトリ皿、組織培養用フラスコ、ロ−ラ−ボトル、スピナ−フラスコ、ジャ−ファ−メンタ−や、マイクロキャリヤ−及びホロ−ファイバ−等が用いられる。また、トランズウェルと呼ばれる半透膜によって仕切られた２つの培養表面を有し、２種類の細胞を直接接触させずに、同一の培地内で、培養できる細胞培養容器も使用できる。これらの培養容器の材質としては、細胞培養に使用できるものであればいずれも使用でき、例えば、プラスチック、ガラス、天然由来材料（デキストラン、セルロース等）及び無機材料（ヒドロキシアパタイト等）等が含まれる。また、これらの細胞培養容器の培地が触れる部分に、細胞接着因子剤がコーティングされたもの（市販の細胞接着因子コーティング容器等）等も使用できる。細胞接着因子剤としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、フィブロネクチン及びビトロネクチン等の天然のものの他、人工的に合成されたものが使用できる。人工的に合成されたものとしては、三洋化成工業（株）製プロネクチンＦ、同プロネクチンＦプラス及び同プロネクチンＬ、並びに宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ及び同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ等が挙げられる。

多機能性臓器細胞（Ａ）を培養するには、血清（Ｂ）と副腎質ホルモン（Ｃ）及び／又はアミノ酸（Ｄ）とを含有する培地中で多機能性臓器細胞（Ａ）を培養する工程を含むことが好ましく、（Ａ）の機能発現がより高くなるという観点等から、さらに好ましくはこの培養工程において、多機能性臓器細胞（Ａ）とともに、骨髄細胞（Ｅ）を共培養することである。

骨髄細胞（Ｅ）としては、骨髄液中に存在する細胞であれば特に制限無く使用でき、骨髄細胞易壁付着性画分、骨髄細胞難壁付着性画分及び骨髄細胞全画分等が挙げられる。これらのうち、骨髄細胞全画分が好ましい。
骨髄細胞（Ｅ）としては、（１）生体中の正常な骨髄から直接取り出されるもの（初代細胞）、及び（２）初代細胞から何代にも渡り継代できる細胞に形質転換させたもの（株化細胞）等があり、これらのいずれも使用することができる。これらのうち、多機能性臓器細胞の機能発現効果を高くでき得るという観点等から、（１）生体中の正常な骨髄から直接取り出されるものが好ましい。
骨髄細胞（Ｅ）の入手方法としては特に制限はなく、細胞バンクや販売業者等から入手してもよいが、多機能性臓器細胞の機能発現効果を高くでき得るという観点等から、生体中の正常な骨髄からフレッシュな細胞を直接取り出す方法が好ましい。

骨髄細胞（Ｅ）を播種する場合、この播種細胞数（万個／ｍＬ）としては、用いる培養基材の種類や多機能性臓器細胞（Ａ）の種類等によって異なるが、培地の容量に基づいて、０．５〜５００００が好ましく、さらに好ましくは５〜５０００、特に好ましくは５０〜２５００である。すなわち、この場合、（Ｅ）の播種細胞数（万個／ｍＬ）は、培地の容量に基づいて、０．５以上が好ましく、さらに好ましくは５以上、特に好ましくは５０以上であり、また、５０，０００以下が好ましく、さらに好ましくは５，０００以下、特に好ましくは２，５００以下である。

骨髄細胞（Ｅ）を共培養する場合、多機能性臓器細胞（Ａ）と骨髄細胞（Ｅ）との播種細胞数比率｛（Ａ）／（Ｅ）｝は、１／１０，０００〜１０／１が好ましく、さらに好ましくは１／１，０００〜１／１、特に好ましくは１／１００〜１／２、最も好ましくは１／２０〜１／５である。すなわち、この場合、播種細胞数比率｛（Ａ）／（Ｅ）｝は、１／１０，０００以上が好ましく、さらに好ましくは１／１，０００以上、特に好ましくは１／１００以上、最も好ましくは１／２０以上であり、また、１０／１以下が好ましく、さらに好ましくは１／１以下、特に好ましくは１／２以下、最も好ましくは１／５以下である。

共培養の方法としては、（１）細胞培養容器に骨髄細胞（Ｅ）を播種し、数日間培養させて、細胞培養容器の細胞培養面上に骨髄細胞を付着増殖させた後、その上に多機能性臓器細胞（Ａ）を播種して培養する方法、及び（２）（Ａ）と（Ｅ）とを同時に播種して培養する方法等が含まれる。これらのうち、簡単に（Ａ）の細胞培養が開始できるという観点等から、（Ａ）と（Ｅ）とを同時に播種して培養する方法が好ましい。なお、トランズウェル等を用いて、（Ａ）と（Ｅ）とを直接接触させずに培養することもできる。

本発明の多機能性臓器細胞培養用培地は、多機能性臓器細胞をその本来の機能を維持したまま増殖させることができるものであり、この培地を用いて培養される多機能性臓器細胞は、次の（１）〜（３）の用途等に適用できるほか、創薬学や再生医学等の細胞を使用する研究等に有用に使用できる。
（１）従来、動物実験でしか行えなかった薬物の代謝速度の測定や代謝機構を判定（創薬研究分野）するための薬物代謝シミュレーション。例えば、初代肝臓細胞を骨髄細胞（Ｅ）と共培養させた状態で、培地に薬物を加え培養することにより、培地中の薬物や代謝産物の濃度を測定し、薬物がどのように変化するかが求めることができため、生体内の薬物代謝がシミュレートできる。

（２）多機能性臓器細胞（Ａ）が産生するサイトカインやホルモンの生産。例えば、初代膵ランゲルハンス島細胞を骨髄細胞と共培養させた状態で、培地中にグルコースを添加することにより、多機能性臓器細胞が培地中にインスリンを産生する。このインスリンの回収・単離により、医薬品が生産できる。

（３）一時的又は半永久的に肝臓の機能を代替させるハイブリッド型人工肝臓（肝臓細胞を利用）、一時的又は半永久的にインスリンを分泌させるハイブリッド型人工膵臓（膵臓細胞を利用）、及び一時的又は半永久的に血液を透析させるハイブリッド型人工透析器（腎臓細胞を利用）。例えば、骨髄細胞（Ｅ）と共培養させた初代肝臓細胞、初代膵臓ランゲルハンス島細胞又は初代腎臓細胞の存在下に、血液を循環させることにより、それぞれ、ハイブリッド型人工肝臓、ハイブリッド型人工膵臓又はハイブリッド型人工腎臓として使用できる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の記載において、実施例１及び１３は、それぞれ参考例１及び２である。
＜実施例１＞
インビトロジェン社製ＧｉｂｃｏＤＭＥ培地粉末；１０．０ｇ／Ｌ，和光純薬工業社製ヒドロコルチゾン；７．５ｍｇ／Ｌ，和光純薬工業社製Ｌ−プロリン；６０ｍｇ／Ｌ，フナコシ社製EGF；５０μg／Ｌ，シグマ社製インシュリン；１０ｍｇ／Ｌ，和光純薬工業社製硫酸銅５水和物；０．１μモル／Ｌ，和光純薬工業社製亜セレン酸；３μｇ／Ｌ，和光純薬工業社製硫酸亜鉛７水和物；５０pモル／Ｌ，シグマ社製リノール酸；５０ｍｇ／Ｌ
，シグマ社製ペニシリン；５８．５ｍｇ／Ｌ，明治製菓社製ストレプトマイシン；１００ｍｇ／Ｌ，和光純薬工業社製炭酸水素ナトリウム；１．０５ｇ／Ｌ，同仁化学社製ＨＥＰＥＳ；１．１９ｇ／Ｌを含有するように、滅菌済みイオン交換水を用いて無血清培地を調製した。次いで、この無血清培地８０体積部と、インビトロジェン社製牛胎児血清を５６℃の温浴中３０分間加熱して得られた非働化牛胎児血清２０体積部とを混合して本発明の多機能性臓器細胞培養用培地（１）を得た。

次に７週齢のウィスター系雄性ラットから２段階コラゲナーゼ灌流法により初代ラット肝細胞を含む肝細胞を取り出し、多機能性臓器細胞培養用培地（１）に懸濁させて肝細胞縣濁培地（１）（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ）を得た。この肝細胞懸濁培地を、１２穴の細胞培養プレートに、全液量０．８ｍｌ／穴、肝細胞数２０万個／穴となるように播種し、３７℃、５体積％二酸化炭素雰囲気のインキュベーター内で、肝細胞の単独培養を行った。細胞播種４時間後、１日後、及び以降２日毎に培地交換を行った。
細胞播種後３、７、１４及び２１日目に、アンモニア代謝能｛細胞百万個・１時間当りに換算したアンモニア代謝速度（μモル／百万個／日）｝及びアルブミン分泌能｛細胞百万個・１日当りに換算したアルブミン分泌速度（μｇ／百万個／日）｝を測定することによって、肝細胞の機能発現を評価した。なお、アンモニア代謝能は、アンモニアテストワコーキット（和光純薬工業製）を用いて１ｍＭ−ＮＨ⁴Ｃｌ添加培地で６時間培養を行った際のアンモニア濃度変化量を、推奨処方の方法で求めた。また、アルブミン分泌能は、ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｔｅｃｔｏｒ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ＨＲＰ，ＡＢＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて培地中のアルブミン濃度を求めることにより得た（以下同様）。アンモニア代謝能の測定結果を表１に、アルブミン分泌能の測定結果を表２にそれぞれ示す。

＜実施例２＞
７週齢のウィスター系雄性ラット１匹のラット大腿骨から得られた全ての骨髄細胞懸濁液を、実施例１の肝細胞懸濁培地に加え、肝細胞／骨髄細胞縣濁培地（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ、骨髄細胞濃度；２２５万個／ｍｌ）を得た。これを１２穴の細胞培養プレートに、全液量０．８ｍｌ／穴、肝細胞数２０万個／穴となるように播種した。骨髄細胞の播種数は１８０万個／穴であった。３７℃、５体積％二酸化炭素雰囲気のインキュベーター内で培養を開始し、１時間後の培地交換時に、培地上清を全て除去することで、骨髄細胞のうち、難壁付着性画分を除き、骨髄細胞として、骨髄細胞易壁付着性画分のみを肝細胞と共培養させた。その後は実施例１と同様にして、細胞培養を行い、細胞播種後３、７、１４及び２１日目に、アンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定し、これらの測定結果を表１及び２に示した。

＜実施例３＞
各培地交換時に、回収した培地上清から遠心分離によって骨髄細胞（難付着性画分）を回収し、新しく加える培地とともに細胞培養系に戻すことによって、全画分の骨髄細胞を肝細胞と共培養させること以外は実施例２と同様にして、共培養をさせた。その後は実施例１と同様にして、細胞培養を行い、細胞播種後３、７、１４及び２１日目に、アンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定しこれらの測定結果を表１及び２に示した。

＜実施例４＞
インビトロジェン社製ＧｉｂｃｏＤＭＥ培地粉末；１０．０ｇ／Ｌ，和光純薬工業社製ヒドロコルチゾン；７．５ｍｇ／Ｌ，和光純薬工業社製Ｌ−プロリン；６０ｍｇ／Ｌ，フナコシ社製EGF；５０μg／Ｌ，シグマ社製インシュリン；１０ｍｇ／Ｌ，和光純薬工業社製硫酸銅５水和物；０．１μモル／Ｌ，和光純薬工業社製亜セレン酸；３μｇ／Ｌ，和光純薬工業社製硫酸亜鉛７水和物；５０pモル／Ｌ，シグマ社製リノール酸；５０ｍｇ／Ｌ，シグマ社製ペニシリン；５８．５ｍｇ／Ｌ，明治製菓社製ストレプトマイシン；１００ｍｇ／Ｌ，和光純薬工業社製炭酸水素ナトリウム；１．０５ｇ／Ｌ，同仁化学社製ＨＥＰＥＳ；１．１９ｇ／Ｌを含有するように、滅菌済みイオン交換水を用いて無血清培地を調製した。次いで、この無血清培地９５体積部と、インビトロジェン社製牛胎児血清を５６℃の温浴中３０分間加熱して得られた非働化牛胎児血清５体積部とを混合して本発明の多機能性臓器細胞培養用培地（２）（非働化牛胎児血清濃度５％）を得た。
次に６週齢のウィスター系雄性ラットから２段階コラゲナーゼ灌流法により初代ラット肝細胞を含む肝細胞を取り出し、また同一固体のラット大腿骨から得られた骨髄細胞懸濁液を取り出し、多機能性臓器細胞培養用培地（２）に加え、肝細胞／骨髄細胞縣濁培地（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ、骨髄細胞濃度；２５０万個／ｍｌ）を得た。これを１２穴の細胞培養プレートに、０．８ｍｌ／穴（肝細胞数２０万個／穴）で播種した。３７℃、５体積％二酸化炭素雰囲気のインキュベーター内で培養を開始した。細胞播種４時間後、１日後、及び以降２日毎に培地交換（培地交換時の細胞培養プレートの室温放置時間：１時間）を行った。
細胞播種後７日目に、アルブミン分泌能２｛１穴・１日当りに換算したアルブミン分泌速度（μｇ／穴／日）｝を測定することによって、肝細胞の機能発現を評価した。アルブミン分泌能２の測定結果を表３に示す。なおアルブミンは、ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｔｅｃｔｏｒ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ＨＲＰ，ＡＢＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて測定した（以下同様）。

＜実施例５＞
実施例４で得た無血清培地を９０体積部とし、非働化牛胎児血清を１０体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地（３）（非働化牛胎児血清濃度１０％）とする以外は、実施例４と同様にした。アルブミン分泌能２の測定結果を表３に示す。

＜実施例６＞
実施例４で得た無血清培地を８５体積部とし、非働化牛胎児血清を１５体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地（４）（非働化牛胎児血清濃度１５％）とする以外は、実施例４と同様にした。アルブミン分泌能２の測定結果を表３に示す。

＜実施例７＞
実施例４で得た無血清培地を８０体積部とし、非働化牛胎児血清を２０体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地（５）（非働化牛胎児血清濃度２０％）とする以外は、実施例４と同様にした。アルブミン分泌能２の測定結果を表３に示す。

＜実施例８＞
実施例４で得た無血清培地を５０体積部とし、非働化牛胎児血清を５０体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地（６）（非働化牛胎児血清濃度５０％）とする以外は、実施例４と同様にした。アルブミン分泌能２の測定結果を表３に示す。

＜実施例９＞
６週齢のウィスター系雄性ラットから２段階コラゲナーゼ灌流法により初代ラット肝細胞を含む肝細胞を取り出し、また同一固体のラット大腿骨から得られた骨髄細胞懸濁液を取り出し、多機能性臓器細胞培養用培地（５）（非働化牛胎児血清濃度２０％）に、肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率が１／２０（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ、骨髄細胞濃度；５００万個／ｍｌ）になるように各細胞を加えた。これを１２穴の細胞培養プレートに、全液量０．８ｍｌ／穴、肝細胞数２０万個／穴となるように播種した。骨髄細胞の播種数は２００万個／穴であった。３７℃、５体積％二酸化炭素雰囲気のインキュベーター内で培養を開始した。細胞播種４時間後、１日後、及び以降２日毎に培地交換（培地交換時の細胞培養プレートの室温放置時間：３０分間）を行った。
細胞播種後７日目に、アルブミン分泌能２｛１穴・１日当りに換算したアルブミン分泌速度（μｇ／穴／日）｝を測定することによって、肝細胞の機能発現を評価した。アルブミン分泌能２の測定結果を表４に示す。

＜実施例１０＞
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を１／１０（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ、骨髄細胞濃度；２５０万個／ｍｌ）とする以外は、実施例９と同様にして培養した。アルブミン分泌能２の測定結果を表４に示す。

＜実施例１１＞
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を１／５（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ、骨髄細胞濃度；１２５万個／ｍｌ）とする以外は、実施例９と同様にして培養した。アルブミン分泌能２の測定結果を表４に示す。

＜実施例１２＞
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を１／１（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ、骨髄細胞濃度；２５万個／ｍｌ）とする以外は、実施例９と同様にして培養した。アルブミン分泌能２の測定結果を表４に示す。

＜実施例１３＞
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を１／０（肝細胞濃度；２５万個／ｍｌ、骨髄細胞濃度；０万個／ｍｌ）とする以外は、実施例９と同様にして培養した。アルブミン分泌能２の測定結果を表４に示す。

＜比較例１＞
非働化牛胎児血清を使用しないこと以外は実施例１と同様にして比較用培地（２）を得た。そして、この培地（２）を用いて、実施例１と同様にして、肝細胞の単独培養を行い、細胞播種後３、７及び１４日目にアンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定した。これらの測定結果を表１及び２に示した。

＜比較例２＞
ヒドロコルチゾン及びＬ−プロリンを使用しないこと以外は実施例１と同様にして比較用培地（３）を得た。そして、この培地（３）を用いて、実施例１と同様にして、肝細胞の単独培養を行い、細胞播種後３、７及び１４日目にアンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定した。これらの測定結果を表１及び２に示した。

＜比較例３＞
多機能性臓器細胞培養用培地（１）に換えて比較用培地（３）を使用すること以外は実施例３と同様に肝細胞と骨髄細胞の共培養を行い、細胞播種後３、７及び１４日目にアンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定した。これらの測定結果を表１及び２に示た。

＜比較例４＞
非働化牛胎児血清を使用しないこと以外は実施例４と同様にして比較用培地（４）を得た。そして、この培地（４）を用いて、実施例４と同様にして、肝細胞の単独培養を行い、アルブミン分泌能２を測定した。これらの測定結果を表３に示した。

表１に及び表２に示すように、実施例１と比較して、比較例１及び２では、７日目以降、アンモニア代謝能及びアルブミン分泌能は低下し、１４日目ではこれらの機能発現は殆ど見られない。すなわち、本発明の多機能性臓器細胞培養用培地｛血清（非働化牛胎児血清）、副腎質ホルモン（ヒドロコルチゾン）及びアミノ酸（Ｌ−プロリン）｝を使用した場合のみが、細胞の機能発現が維持できることを示している。また、実施例１と実施例２及び３との比較において、骨髄細胞と共培養することによって、機能発現はさらに高められ、特に全画分の骨髄細胞を肝細胞と共培養した実施例３では２１日目でも細胞の機能発現が高く維持できていることが判る。

表３に示すように、非働化牛胎児血清を含有させることでアルブミン分泌能が格段に上がることが判る。また非働化牛胎児血清の含有量は培地の容量に基づいて２０容量％で十分であることが判る。

表４に示すように、骨髄細胞を混合させた方がアルブミン分泌能がさらに良好となることが判る。さらに肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率は１／１０が良いことが判る。

Claims (4)

1. 非動化した牛胎児血清とヒドロコルチゾン及びプロリンとを含有することを特徴とする肝臓細胞及び骨髄細胞（Ｅ）の共培養用培地。
2. 非動化した牛胎児血清とヒドロコルチゾン及びプロリンとを含有する培地中で肝臓細胞を培養する工程を含み、肝臓細胞を培養する工程において、骨髄細胞（Ｅ）を共培養することを特徴とする肝臓細胞の培養方法。
3. 骨髄細胞（Ｅ）が、骨髄細胞全画分である請求項２に記載の培養方法。
4. 肝臓細胞と骨髄細胞（Ｅ）との播種細胞数比率｛（Ａ）／（Ｅ）｝が、１／１００〜１／２である請求項２又は３に記載の培養方法。