JP2000245448A - 肝細胞培養方法 - Google Patents
肝細胞培養方法Info
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- JP2000245448A JP2000245448A JP11056258A JP5625899A JP2000245448A JP 2000245448 A JP2000245448 A JP 2000245448A JP 11056258 A JP11056258 A JP 11056258A JP 5625899 A JP5625899 A JP 5625899A JP 2000245448 A JP2000245448 A JP 2000245448A
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- culturing
- culture
- hepatocytes
- collagen
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、培養肝細胞の機能を安定かつ長期
に維持することが可能な肝細胞の新しい培養法を提供す
ることを目的とするものである。 【解決手段】 本発明は、テロペプチドを取り除いたタ
イプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲルを培養基材と
して用い、グリシンを含有しないあるいは５０ｍｇ／Ｌ
以下の濃度で含有することを特徴とするものである。さ
らに望ましくは培養液に血清が含まれていなく、グルカ
ゴン、インシュリン、上皮増殖因子、デキサメタゾン、
ジメチルスルホオキシド、ニコチン酸アミド、含セレン
化合物からなる群の少なくとも１つを培養液中に含むこ
とを特徴とする肝細胞培養法である。
に維持することが可能な肝細胞の新しい培養法を提供す
ることを目的とするものである。 【解決手段】 本発明は、テロペプチドを取り除いたタ
イプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲルを培養基材と
して用い、グリシンを含有しないあるいは５０ｍｇ／Ｌ
以下の濃度で含有することを特徴とするものである。さ
らに望ましくは培養液に血清が含まれていなく、グルカ
ゴン、インシュリン、上皮増殖因子、デキサメタゾン、
ジメチルスルホオキシド、ニコチン酸アミド、含セレン
化合物からなる群の少なくとも１つを培養液中に含むこ
とを特徴とする肝細胞培養法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肝細胞の長期培養
を可能とする培地に関するものであり、さらに詳しく
は、肝細胞の機能を長期にわたり高いレベルで維持する
ことの可能な培地であり、培養液のタンパク質やホルモ
ンの組成が明確であるので、肝細胞の機能解析や薬物代
謝の研究に有用な肝細胞培養方法に関するものである。
を可能とする培地に関するものであり、さらに詳しく
は、肝細胞の機能を長期にわたり高いレベルで維持する
ことの可能な培地であり、培養液のタンパク質やホルモ
ンの組成が明確であるので、肝細胞の機能解析や薬物代
謝の研究に有用な肝細胞培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】肝臓から分離した肝細胞の初代培養は肝
機能の研究や肝細胞の利用に有用である。特に最近は、
研究用あるいは産業用に、肝細胞を生体組織から単離し
て、この細胞（初代細胞）を接着した培養キットが各種
市販されるようになってきている。培養した肝細胞を製
品として市場に流通させるためには、製品の保存、輸送
の期間を経た後に消費者で研究、開発に使用している間
にも多くの細胞が生存し、しかもその本来の機能が保持
されていなければならない。しかしながら、従来の方法
では製品が消費者に届いてからの細胞の機能維持の期間
が短く、非常に扱いものであり、長期に肝細胞の機能を
維持する培養法が望まれていた。
機能の研究や肝細胞の利用に有用である。特に最近は、
研究用あるいは産業用に、肝細胞を生体組織から単離し
て、この細胞（初代細胞）を接着した培養キットが各種
市販されるようになってきている。培養した肝細胞を製
品として市場に流通させるためには、製品の保存、輸送
の期間を経た後に消費者で研究、開発に使用している間
にも多くの細胞が生存し、しかもその本来の機能が保持
されていなければならない。しかしながら、従来の方法
では製品が消費者に届いてからの細胞の機能維持の期間
が短く、非常に扱いものであり、長期に肝細胞の機能を
維持する培養法が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、培養肝細胞
の機能を安定かつ長期に維持することが可能な肝細胞の
新しい培養方法を提供するものである。
の機能を安定かつ長期に維持することが可能な肝細胞の
新しい培養方法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、テロペプチド
を取り除いたタイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲ
ルを培養基材として用い、グリシンを含有しないあるい
は５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で含有することを特徴とする
ものである。さらに望ましくは培養液に血清が含まれて
いなく、グルカゴン、インシュリン、上皮増殖因子、デ
キサメタゾン、ジメチルスルホオキシド、ニコチン酸ア
ミド、含セレン化合物からなる群の少なくとも１つを培
養液中に含むことを特徴とするものであり、これにより
培養肝細胞の機能維持効果が高められる。
を取り除いたタイプＩコラーゲンを主成分とする固定ゲ
ルを培養基材として用い、グリシンを含有しないあるい
は５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で含有することを特徴とする
ものである。さらに望ましくは培養液に血清が含まれて
いなく、グルカゴン、インシュリン、上皮増殖因子、デ
キサメタゾン、ジメチルスルホオキシド、ニコチン酸ア
ミド、含セレン化合物からなる群の少なくとも１つを培
養液中に含むことを特徴とするものであり、これにより
培養肝細胞の機能維持効果が高められる。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明に使用される基本培地とし
ては、従来から知られている動物細胞培養用の血清を含
まない基本培地のいずれも用いることができる。例え
ば、イーグル最小必須培地、ダルベッコ変法イーグル培
地、イスコブ変法イーグル培地、Ｆ１２培地、ウィリア
ムズＥ培地等が挙げられる。これらの基本培地は複数種
を適当な割合で混合しても可能である。
ては、従来から知られている動物細胞培養用の血清を含
まない基本培地のいずれも用いることができる。例え
ば、イーグル最小必須培地、ダルベッコ変法イーグル培
地、イスコブ変法イーグル培地、Ｆ１２培地、ウィリア
ムズＥ培地等が挙げられる。これらの基本培地は複数種
を適当な割合で混合しても可能である。
【０００６】また本発明に使用される培養基材として
は、哺乳類由来のタイプＩコラーゲンのテロペプチド部
分をペプシンで消化したコラーゲン、もしくは還元剤存
在下で還元処理を行ったコラーゲンからなる固定化ゲル
を用いることができる。例えば、溶液を培養容器の底面
でゲル化させたもの、空洞状の物体に塗布しゲル化させ
たもの等が挙げられる。以下の実施例により本発明を具
体的に述べる。
は、哺乳類由来のタイプＩコラーゲンのテロペプチド部
分をペプシンで消化したコラーゲン、もしくは還元剤存
在下で還元処理を行ったコラーゲンからなる固定化ゲル
を用いることができる。例えば、溶液を培養容器の底面
でゲル化させたもの、空洞状の物体に塗布しゲル化させ
たもの等が挙げられる。以下の実施例により本発明を具
体的に述べる。
【０００７】
【実施例】（実施例）ペプシン処理によりテロペプチド
部分を取り除いた牛真皮由来タイプＩコラーゲンの０．
３％溶液（塩酸によりｐＨ３に調製）８溶に１０倍濃度
の培養液１溶とｐＨ調整用ＮａＯＨ、ＮａＨＣＯ3溶液
１溶をよく混合し、ｐＨ７の０．２４％のコラーゲン溶
液を調製した。以上の操作はコラーゲンの変性とゲル化
を防ぐため氷上で行った。調製した０．２４％のコラー
ゲン溶液をプラスチックの培養器の底面に厚さ２〜５ｍ
ｍになるように手早く敷き、３７℃雰囲気下でゲル化さ
せた。
部分を取り除いた牛真皮由来タイプＩコラーゲンの０．
３％溶液（塩酸によりｐＨ３に調製）８溶に１０倍濃度
の培養液１溶とｐＨ調整用ＮａＯＨ、ＮａＨＣＯ3溶液
１溶をよく混合し、ｐＨ７の０．２４％のコラーゲン溶
液を調製した。以上の操作はコラーゲンの変性とゲル化
を防ぐため氷上で行った。調製した０．２４％のコラー
ゲン溶液をプラスチックの培養器の底面に厚さ２〜５ｍ
ｍになるように手早く敷き、３７℃雰囲気下でゲル化さ
せた。
【０００８】一方、麻酔をかけ開腹したウィスターラッ
トの門脈よりコラゲナーゼ０．０５％を含むハンクス緩
衝液を肝臓内に灌流し、その後切り取った肝臓を培養液
を入れた容器内に取り出し、細切し、細胞濾過器で単細
胞に分散した。次いで、得られた細胞を低速遠心分離に
より肝細胞（肝実質細胞）のみに精製した。得られたラ
ット肝細胞は、インシュリン１０-7Ｍ、デキサメタゾン
１０-7Ｍ、Ｌ−プロリン３０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アスパラ
ギン一水和物２０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アラニン９０μｇ／
ｍｌ、ＨＥＰＥＳ４．８ｍｇ／ｍｌ、上皮細胞成長因子
１０ｎｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム１０-7Ｍ、ＤＭ
ＳＯ２％を含むＤＭＥＭ培地で２×１０5個／ｍｌの濃
度に分散し、上記コラーゲンゲルを固定した培養基材上
に播種し、３７℃、５％炭酸ガス９５％空気雰囲気下の
炭酸ガス培養装置内で培養し、上記ＤＭＥＭ培養液で隔
日培地交換を行った。
トの門脈よりコラゲナーゼ０．０５％を含むハンクス緩
衝液を肝臓内に灌流し、その後切り取った肝臓を培養液
を入れた容器内に取り出し、細切し、細胞濾過器で単細
胞に分散した。次いで、得られた細胞を低速遠心分離に
より肝細胞（肝実質細胞）のみに精製した。得られたラ
ット肝細胞は、インシュリン１０-7Ｍ、デキサメタゾン
１０-7Ｍ、Ｌ−プロリン３０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アスパラ
ギン一水和物２０μｇ／ｍｌ、Ｌ−アラニン９０μｇ／
ｍｌ、ＨＥＰＥＳ４．８ｍｇ／ｍｌ、上皮細胞成長因子
１０ｎｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム１０-7Ｍ、ＤＭ
ＳＯ２％を含むＤＭＥＭ培地で２×１０5個／ｍｌの濃
度に分散し、上記コラーゲンゲルを固定した培養基材上
に播種し、３７℃、５％炭酸ガス９５％空気雰囲気下の
炭酸ガス培養装置内で培養し、上記ＤＭＥＭ培養液で隔
日培地交換を行った。
【０００９】（比較例）培養液としてインシュリン１０
-7Ｍ、デキサメタゾン１０-7Ｍ、Ｌ−プロリン３０μｇ
／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ４．８ｍｇ／ｍｌ、上皮細胞成長因
子１０ｎｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム１０-7Ｍ、Ｄ
ＭＳＯ２％を含むＤＭＥＭ培地を用い、実施例と同様の
方法で培養基材を作製し、肝細胞を調製、播種し、培養
を実施した。比較例、実施例共に４週間培養実験を行
い、培養肝細胞が合成、分泌したアルブミン量を定期的
に測定した。その結果を図１に示す。図１に示されるよ
うに、タイプＩコラーゲンの固定ゲル上培養で、ＤＭＥ
Ｍを基本培地として用いた場合、培養４週間にわたって
定常的にアルブミンの分泌が行われた。
-7Ｍ、デキサメタゾン１０-7Ｍ、Ｌ−プロリン３０μｇ
／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ４．８ｍｇ／ｍｌ、上皮細胞成長因
子１０ｎｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム１０-7Ｍ、Ｄ
ＭＳＯ２％を含むＤＭＥＭ培地を用い、実施例と同様の
方法で培養基材を作製し、肝細胞を調製、播種し、培養
を実施した。比較例、実施例共に４週間培養実験を行
い、培養肝細胞が合成、分泌したアルブミン量を定期的
に測定した。その結果を図１に示す。図１に示されるよ
うに、タイプＩコラーゲンの固定ゲル上培養で、ＤＭＥ
Ｍを基本培地として用いた場合、培養４週間にわたって
定常的にアルブミンの分泌が行われた。
【００１０】
【発明の効果】以上供述したとおり、本発明は、テロペ
プチドを取り除いたタイプＩコラーゲンを主成分とする
固定ゲルを培養基材として用い、グリシンを含有しない
あるいは５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で含有することを特徴
とするものである。さらに望ましくは培養液に血清が含
まれていなく、グルカゴン、インシュリン、上皮増殖因
子、デキサメタゾン、ジメチルスルホオキシド、ニコチ
ン酸アミド、含セレン化合物からなる群の少なくとも１
つを培養液中に含むことを特徴とするものであり、これ
により培養肝細胞の機能維持効果が高められる。
プチドを取り除いたタイプＩコラーゲンを主成分とする
固定ゲルを培養基材として用い、グリシンを含有しない
あるいは５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で含有することを特徴
とするものである。さらに望ましくは培養液に血清が含
まれていなく、グルカゴン、インシュリン、上皮増殖因
子、デキサメタゾン、ジメチルスルホオキシド、ニコチ
ン酸アミド、含セレン化合物からなる群の少なくとも１
つを培養液中に含むことを特徴とするものであり、これ
により培養肝細胞の機能維持効果が高められる。
【図１】各培養液を用いて肝細胞培養した場合の培養肝
細胞のアルブミン分泌量を示す説明図である。
細胞のアルブミン分泌量を示す説明図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 テロペプチドを取り除いたタイプＩコラ
ーゲンを主成分とする固定ゲルを培養基材として用い、
グリシンを含有しないあるいは５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度
で含有することを特徴とする肝細胞培養方法。 - 【請求項２】 培養液に血清が含まれていない請求項１
記載の肝細胞培養方法。 - 【請求項３】 グルカゴン、インシュリン、上皮増殖因
子、デキサメタゾン、ジメチルスルホオキシド、ニコチ
ン酸アミド、含セレン化合物からなる群の少なくとも１
つを培養液中に含む請求項１又は２記載の肝細胞培養方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11056258A JP2000245448A (ja) | 1999-03-03 | 1999-03-03 | 肝細胞培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11056258A JP2000245448A (ja) | 1999-03-03 | 1999-03-03 | 肝細胞培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000245448A true JP2000245448A (ja) | 2000-09-12 |
Family
ID=13022069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11056258A Pending JP2000245448A (ja) | 1999-03-03 | 1999-03-03 | 肝細胞培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000245448A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303205C (zh) * | 2002-04-04 | 2007-03-07 | 第一化学药品株式会社 | 肝细胞的长期培养方法 |
| WO2021065849A1 (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | 富士フイルム株式会社 | 肝細胞を培養するための培地、肝細胞の製造方法および肝細胞 |
-
1999
- 1999-03-03 JP JP11056258A patent/JP2000245448A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303205C (zh) * | 2002-04-04 | 2007-03-07 | 第一化学药品株式会社 | 肝细胞的长期培养方法 |
| WO2021065849A1 (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | 富士フイルム株式会社 | 肝細胞を培養するための培地、肝細胞の製造方法および肝細胞 |
| JPWO2021065849A1 (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | ||
| JP7354270B2 (ja) | 2019-09-30 | 2023-10-02 | 富士フイルム株式会社 | 肝細胞を培養するための培地、肝細胞の製造方法および肝細胞 |
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