CN1303205C - 肝细胞的长期培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种长期培养肝细胞的方法，其特征在于在15到30℃下，在培养基中保持新鲜肝细胞1到6天，接着在生理条件下培养。本发明的方法可以长期培养肝细胞而不会引起酶活性或酶诱导活性降低。而且，由于细胞可以在近似于室温的条件下保存1到6天，本发明的方法对于肝细胞分离后长途运输是很有用的。

Description

肝细胞的长期培养方法
技术领域
本发明涉及长期培养新鲜肝细胞并保持细胞的酶活性和酶诱导活性的方法。
背景技术
肝细胞不仅产生白蛋白，还产生药物代谢酶如那些属于细胞色素P450(CYP)家族的酶和血凝固-纤维蛋白溶解相关的酶如α1-抗胰蛋白酶。因此，新鲜肝细胞的培养产物被广泛用于测量这些酶的活性。
从肝脏收集的肝细胞通常保存在4℃或更低的冷藏环境中，以防止酶失活，此后，在用于进行各种试验之前将温度升至大约37℃并长期培养细胞。
近年来，由于人的肝细胞已经难以获得，就需要将已经获得的肝细胞长期保存或长途运输(如跨国运输)。为了满足这种需求，必须将新鲜肝细胞保存至少2天，同时不引起酶活性或酶诱导活性的任何损失。
然而，在不高于4℃的常规低温保存条件下，在2天或更长时间的保存期内，酶活性和酶诱导活性通常会降低30％到60％，因此妨碍了这种活性的正确测量。
因此，本发明的一个目的是提供一种长期培养肝细胞而不降低细胞的酶活性或酶诱导活性的方法。
发明内容
本发明人研究了能满意地长期培养新鲜肝细胞的条件并获得了下列发现。更确切地说，当肝细胞在大约37℃下保存时(这代表了生理条件)，与细胞在常规采用的低温(4℃)条件下保存相比，细胞的酶活性和酶诱导活性被保持在一定的较好的水平。然而，当细胞在室温下(即15到30℃之间)保存1到6天，然后再回到生理条件培养时，非常出乎意料的是，与在37℃下保存相比，甚至保持了更高的酶活性和酶诱导活性，活性被长期保持，当长途运输肝细胞时，生物学试验如药物代谢酶诱导试验得以准确进行。在这些发现的基础上完成了本发明。
因此，本发明提供了长期培养肝细胞的方法，其特征在于在15到30℃的培养基中保持新鲜肝细胞1到6天，接着在生理条件下培养。
附图简要说明
图1显示了在各种条件下保存48小时以后培养的猴肝细胞的尿素合成(也就是尿素生成)能力。
图2显示了在25℃保存48小时以后培养的猴肝细胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
图3显示了在25℃保存96小时以后培养的猴肝细胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
图4显示了在25℃保存48小时以后培养的猴肝细胞的CYP3A4诱导能力(RIF表示暴露于利福平，UT表示没有暴露于利福平)。
图5显示了在25℃保存48小时以后培养的人肝细胞的尿素合成(也就是尿素生成)能力。
图6显示了在25℃保存96小时以后培养的人肝细胞的尿素合成能力。
图7显示了在25℃保存144小时以后培养的人肝细胞的尿素合成能力。
图8显示了在25℃保存96小时以后培养的人肝细胞的白蛋白合成能力。
图9显示了在25℃保存96小时以后培养的人肝细胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
图10显示了在25℃保存48小时、96小时或144小时以后培养的人肝细胞的CYP3A4诱导能力(RIF表示暴露于利福平，UT表示没有暴露于利福平)。
发明的最佳实施方式
施用本发明方法的肝细胞是新鲜肝细胞，其从组织中取出后还没有经过传代培养。换句话说，它们是原代培养的肝细胞。肝细胞的例子包括那些从哺乳动物尤其从灵长类动物获得的肝细胞。尤其优选人肝细胞。
根据本发明，新鲜肝细胞必须在15到30℃的培养基中保持1到6天。当肝细胞保持在低于15℃例如4℃(这是通常的保存温度)的温度下时，肝细胞的酶活性和酶诱导活性降低。同样地，当肝细胞保持在高于30℃例如大约37℃(这是生理条件)的温度下时，和在15到30℃保存细胞的情况相比，肝细胞的酶活性和酶诱导活性降得更低。肝细胞保持的温度优选18到27℃，更优选20到25℃。
用在本发明中保持新鲜肝细胞的培养基可以是用于动物细胞的常规培养基。这种培养基的例子包括Lanford’s培养基、Wi1liam’s E(WME)培养基、Isom’s培养基、Leibovitz L15培养基、添加了聚乙二醇的Leibovitz L15培养基及其任意组合。尤其优选的培养基至少包含Lanford’s培养基。
加到保持新鲜肝细胞的培养基中的肝细胞数量是0.5×106到10×106细胞/mL，优选1×106到10×106细胞/mL。
肝细胞在15到30℃的保持时间是1到6天，优选2到6天。
肝细胞在15到30℃保持1到6天以后，细胞在生理条件下培养。优选地，在生理条件下的培养是在37±1℃的常规培养基中进行。如此处所用的，对于培养基没有特别限制，只要它能用于常规培养所用的动物细胞。优选地，培养基和保持上述新鲜肝细胞时所采用的培养基是一样的。特别优选使用至少包含Lanford’s培养基的培养基。
当肝细胞如上所述在生理条件下进行了持续培养时，细胞的酶活性和酶诱导活性经过较长时间，也就是说，经过1个月或更长时间也不会降低，因此，肝细胞可以用于酶活性或药物代谢的酶诱导活性的准确测量。可测量的酶活性的例子包括α1-抗胰蛋白酶活性、谷氨酰胺-S-转移酶(GST)、GOT、GPT的尿素生成和白蛋白合成能力。酶诱导活性的例子包括诱导属于CYP家族的酶，如CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E6和CYP3A4。
肝细胞尤其是人肝细胞的获得并不容易。尤其当从生物体获得肝细胞的位置远离进行试验的位置时，例如在跨越国界的情况下，肝细胞的运输通常需要2天或更多天。本发明的方法特别适合于长途运输细胞以后进行试验的情况。
实施例
下面将以实施例的形式更详细地描述本发明，这不应当看作是对本发明的限制。
A.材料和方法
(1)肝细胞的原代培养
从四个病人身上取出人肝。从年轻雄性猴子身上获得猴肝。
从用已知方法(Drug Metab.Dispos.18：595-606(1990)，Mol.Pharmacol.41：1047-1055(1992)，J.Pharmacol.Exp.Ther.269：384-392(1994))进行了肝叶切除术的肝脏收集人肝细胞并培养。用台盼蓝排除试验检查将进行平皿培养的细胞的活力，发现是80％到90％。在放在培养瓶(25cm2)中的覆盖有胶原I(5μm/cm2)的Isom’s培养基里接种肝细胞，以获得融合(12.4×104细胞/cm2)。所采用的培养基是Ham F12和William’s E的1∶1混合物，它是按照Proc.Nat.Acad.Sci.USA；81：6378-6382(1984)中的描述制备的。在细胞接种后头4个小时内加入5％小牛血清以促进细胞粘着。肝细胞平皿培养后4小时，去除添加了小牛血清的标准培养基，取而代之加入Lanford’s培养基。因此，在培养的第1天，更换了培养基，接着，在5％CO2、37℃的潮湿环境下保持肝细胞的培养产物3天或4天。按照这种方法，一旦确定了肝细胞培养体系，通过抽吸去除Lanford’s培养基。用5％CO2平衡的95％空气净化烧瓶内部，装入Lanford’s培养基(简写为“Lnf”)、添加了5％聚乙二醇的Leibovitz L15(Sigma化学品公司)培养基(简写为“L15+5％PEG”)或Isom’s培养基(37℃)。然后在冰冻条件或室温下保持烧瓶2、4或6天。接着，含肝细胞的烧瓶的培养基被再次更换为Lnf，并在37℃长期培养。为了评价培养基、温度和保存期对肝细胞活力和功能的影响，测试每次更换培养基后的24小时收集的细胞的代表细胞表型的几个参数。特别地，测试参数包括尿素合成能力(通过酶/光谱分析)和α1-抗胰蛋白酶或白蛋白合成能力(通过蛋白质印迹法)。以与最初值和对照组数据相比较的方式显示结果(对照：在试验期间于37℃下保持在Lnf中的那组)。此外，还研究了在细胞色素P450酶的诱导方面(利福平对CYP3A4的诱导)的细胞的反应。这种反应被认为是最好的表征了肝特异的表型是否得以保持的指数，由于它可以预期药物相互作用，因此，在药物开发中被用作评价因素。
(2)培养基组合物
所采用的培养基组合物示于表1、2和3中。
               表1
Lanford’s培养基(Lnf)
  0.5mg/mL   BSA
  1μM   氢化可的松
  10μg/mL   胰岛素
  50ng/mL   表皮生长因子(EGF)
  2μg/mL   胰高血糖素
  5μg/mL   亚麻酸
  0.1μM   乙酸硒
  2ng/mL   霍乱毒素
  20ng/mL   肝细胞生长因子
  5μg/mL   铁传递蛋白
  1μM   乙醇胺
  100ng/mL   催乳素
  100U/mL   青霉素
  100μg/mL   链霉素
  25μg/mL   两性霉素B
                  表2
L15+5％PEG
Leibovitz L15(Sigma化学品公司的产品)5％聚乙二醇
Leiboyitz L15   (mg/L)
无机盐
CaCl2   140
KCl   400
KH2PO4   60
MgCl2   94
MgSO4   8000
NaCl   190
Na2HPO4
其它成分
D(+)半乳糖   900
酚红   10
丙酮酸钠   550
氨基酸
L-丙氨酸   225
L-精氨酸   500
L-天冬酰胺   250
L-半胱氨酸   120
L-谷氨酰胺   300
甘氨酸   200
L-组氨酸   250
L-异亮氨酸   250
L-亮氨酸   125
L-赖氨酸   75
L-蛋氨酸   75
    L-苯丙氨酸   125
    L-丝氨酸   200
    L-苏氨酸   300
    L-色氨酸   20
    L-酪氨酸   300
    L-缬氨酸   100
    维生素
    D-泛酸钙   1
    氯化胆碱   1
    叶酸   1
    肌醇   2
    烟酰胺   1
    盐酸吡哆醇   1
    核黄素-5-磷酸盐2H2O   0.1
    一磷酸硫胺   1
             表3
Isom’s培养基
2.4mM 谷氨酰胺
0.1μM 地塞米松(DEX)
2μg/mL 胰岛素
50μg/mL 铁传递蛋白
3.6μM 亚麻酸
66.8μM 乙醇胺
0.4mM 丙酮酸钠
250μM 抗坏血酸
100U/mL 青霉素
100μg/mL 链霉素
25μg/mL 两性霉素B
0.5μM 氟康唑
(3)溶解产物的制备
使用离心机，用已知方法从培养的细胞制备溶解产物，并保存至使用的时候。用bicinchoninate法测量溶解产物的蛋白质浓度(Pierce化学品公司)。
(4)培养肝细胞的细胞外培养基中包含的血清蛋白的量
用人蛋白特异的抗体通过蛋白质印迹法(western blotting)测量细胞外培养基(5到20μL培养基)中包含的白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的量。从2个烧瓶(其中培养了细胞)中收集培养基样品。合并收集的样品，接着于11,000×g离心分离5分钟并在-80℃保存直到用于分析。
(5)培养的肝细胞中包含的CYPs的量
根据《肝脏病学》22：1143-1153(1995)中描述的方法，使用特异的多克隆或单克隆抗体，通过溶解产物的免疫印迹法(immunoblotting)对CYPs进行定量。加到每个凝胶中的标准品是含有遗传表达的CYP2C9、CYP2C19或CYP3A4(Gentest)的微粒体。
在转移到硝化纤维素膜上之前，对溶解产物进行电泳(SDS 10％聚丙烯酰胺凝胶)。用ECL(增强的化学荧光)(Amersham)展开样品点。根据LE程序进行扫描，根据NIH成像1.6/ppc程序进行质量分析计算CYP的相对含量。
(6)细胞外培养基中包含的培养肝细胞的尿素合成能力
用酶/光谱分析试剂盒(Sigma化学品公司)测量尿素合成能力。
B.结果
(1)保存温度对尿素合成能力的影响
在0℃或25℃下，在Lnf或L-15+5％PEG中保持猴肝细胞2天。接着在37℃下于Lnf中培养细胞。培养了1、2、3、8或11天后，猴肝细胞的尿素合成能力显示在图1中。从图1清楚的看到，和在37℃下于Lnf中保存后再培养的对照组细胞的尿素合成能力相比，在0℃下保存再被培养的细胞组的尿素合成能力在下列两种情况下都比较低；也就是说，细胞在Lnf中培养的情况和细胞在L-15+5％PEG中培养的情况。相反，发现在25℃保存后再在Lnf中培养的细胞组和在25℃保存后再在L-15+5％PEG中培养的细胞组都保持了较相应的对照组高的尿素合成能力。Lnf比L-15+5％PEG提供了更好的结果。
(2)α1-抗胰蛋白酶合成能力和CYP3A4诱导能力
在Lnf或L-15+5％PEG中，在25℃下保持猴肝细胞2天(48小时)或4天(96小时)。接着，在Lnf中，在37℃下培养细胞，测量细胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。结果显示在图2和3中。图2和3中显示的数据是相对于细胞从一开始就在37℃下保存和培养的试验中获得的数据相比的相对值。
图2和3清楚的显示，细胞在25℃下保存了2天或4天后再培养的情况与细胞从一开始就在37℃下保存和培养的情况相比，在培养期的第8到15天保持了较高的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
猴肝细胞在25℃下分别在Lnf中或L-15+5％PEG中保持了2天(48小时)。接着在Lnf中，在37℃下培养细胞，测量细胞的CYP3A4诱导能力。结果显示在图4中。图4还显示了细胞从一开始就在37℃下保存和培养的情况获得的相对值。
图4清楚的显示，细胞在25℃下保持了2天后再培养的情况与细胞从一开始就在37℃下保存和培养的情况(1.8倍)相比，在培养的第10到14天观察到了较强的CYP3A4诱导能力(2.3倍和2.4倍)。
(3)对尿素合成能力的影响(人肝细胞)
在25℃下，在Lnf或Isom中保存人肝细胞2、4或6天。接着在37℃下，在Lnf中培养细胞，测量细胞的尿素合成能力。结果显示在图5、6和7中。
图5、6和7清楚的显示，与细胞从一开始就在37℃下保存和培养的对照组相比，在25℃下，在Lnf或Isom中保存了2、4或6天后再被培养的细胞显示了较强的尿素合成能力。
(4)白蛋白合成能力和α1-抗胰蛋白酶合成能力(人肝细胞)
在25℃下，在Lnf或Isom中保存人肝细胞4天。接着在37℃下，在Lnf中培养细胞，测量白蛋白合成能力和α1-抗胰蛋白酶合成能力。结果显示在图8和9中。
图8和9清楚的显示，与细胞从一开始就在37℃下保存和培养的对照组相比，在25℃下保存了4天后再培养的细胞显示了较强的白蛋白合成能力和较强的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
(5)CYP3A4诱导能力(人肝细胞)
在25℃下，在Lnf中或L-15+5％PEG中保持人肝细胞2、4或6天。接着在37℃下，在Lnf中培养细胞，测量细胞的CYP3A4诱导能力。结果显示在图10中。
图10清楚的显示，与细胞从一开始就在37℃下保存和培养的对照组相比，在25℃下，在Lnf中或L-15+5％PEG中保存了2、4或6天后再培养的细胞显示了较强的CYP3A4诱导能力。
工业实用性
本发明的方法可以长期培养肝细胞而不会引起酶活性或酶诱导活性降低。而且，由于细胞可以在近似于室温的条件下保存1到6天，本发明的方法对于肝细胞分离后长途运输是很有用的。

Claims (2)

1.一种长期培养肝细胞的方法，其特征在于在25℃下，在至少含有Lanford′s培养基的培养基中保持新鲜肝细胞1到6天，接着在生理条件下培养，其中所述Lanford′s培养基是用于保持新鲜肝细胞的培养基。
2.根据权利要求1的长期培养肝细胞的方法，其中，在生理条件下培养是在37±1℃下，在至少含有Lanford’s培养基的培养基中进行的。
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