JPWO2003085100A1 - 肝細胞の長期間培養法 - Google Patents
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Abstract
新鮮肝細胞を培地中１５〜３０℃の温度に１〜６日間保持した後生理的条件で培養することを特徴とする肝細胞の長期間培養法。本発明方法によれば、肝細胞の酵素活性及び酵素誘導活性を失うことなく長期間培養できる。また、室温付近に１〜６日間保持できるので、肝細胞摘出後の長時間輸送する場合に特に有用である。
Description
技術分野
本発明は、新鮮肝細胞を各種酵素活性又は各種酵素誘導活性を失わずに長期間培養するための方法に関する。
背景技術
肝細胞は、アルブミンの他、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）ファミリーの各種薬物代謝酵素、α１−アンチトリプシン等の凝固線溶系酵素等を産生しているため、摘出された新鮮肝細胞の培養物は、これらの酵素活性測定用細胞として広く使用されている。
通常肝細胞は摘出後酵素の失活を防止する目的で４℃以下に冷却保存し、その後約３７℃に戻して長期間培養し、各種試験に用いられている。
近年、肝細胞の入手が困難になってきていることから、得られた肝細胞を長期間保存したり、長距離、例えば国際間輸送する必要が生じてきた。そのためには、新鮮肝細胞を少なくとも２日以上にわたり各種酵素活性又は酵素誘導活性を失わずに保存することが必要になってきた。
しかし、従来の４℃以下の低温保存方法では、２日以上保存すると、通常３０〜６０％の酵素あるいは酵素誘導活性が失活してしまい、正確な測定ができなかった。
従って、本発明の目的は、肝細胞を、酵素活性や酵素誘導活性を失わせることなく長期間培養する方法を提供することにある。
発明の開示
そこで本発明者は、新鮮肝細胞の長期間培養条件について種々検討したところ、従来の低温（４℃）保存に代えて生理的条件である約３７℃で保存しても肝細胞の酵素活性や酵素誘導活性はある程度保持されるが、全く意外にも１５〜３０℃の室温条件で１〜６日間保存した後、生理的条件に戻して培養すると、当該３７℃保存よりもさらに高い酵素活性や酵素誘導活性が保持され、長期間安定であり、長距離輸送した後も薬物代謝酵素誘導試験等が正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、新鮮肝細胞を培地中１５〜３０℃の温度に１〜６日間保持した後生理的条件で培養することを特徴とする肝細胞の長期間培養法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明方法に用いられる肝細胞は、摘出後継代培養を行っていない新鮮肝細胞であり、すなわち初代培養肝細胞である。肝細胞としては、哺乳類肝細胞、さらに霊長類肝細胞、特にヒト肝細胞が好ましい。
本発明においては、新鮮肝細胞を培地中で１５〜３０℃に１〜６日間保持することが必要である。１５℃未満、例えば従来の保存温度である４℃では肝細胞の酵素活性及び酵素誘導活性が低下する。また、３０℃を超える温度、例えば生理的条件である約３７℃でも肝細胞の酵素活性及び酵素誘導活性は１５〜３０℃保存の場合よりも低くなる。好ましい保持温度は１８〜２７℃であり、より好ましくは２０〜２５℃である。
本発明に用いられる新鮮肝細胞の培地は、通常の動物細胞用の培地であればよいが、ランフォード（Ｌａｎｆｏｒｄ）培地、ウイリアムズＥ（ＷＭＥ）培地、Ｉｓｏｍ培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５培地、ポリエチレングリコール添加Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５培地、及びこれらを組み合せた培地等が挙げられるが、少なくともランフォード培地を含む培地が特に好ましい。
新鮮肝細胞用の培地中の肝細胞の濃度は、０．５×１０６〜１０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ、特に１×１０６〜１０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬが好ましい。
１５〜３０℃に保持する期間は１〜６日間、特に２〜６日間が好ましい。
１５〜３０℃に１〜６日間保持した後、肝細胞は生理的条件で培養すればよい。生理的条件の培養としては、通常の培地中３７±１℃の培養が好ましい。ここで培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる培地であればよいが、前記新鮮肝細胞の培地と同じものが好ましく、特に少なくともランフォード培地を含む培地が好ましい。
このような生理的条件の培養を継続すれば、肝細胞は１ヶ月以上もの長期間に渡り、酵素活性及び酵素誘導活性が失われず、各種酵素活性の測定、薬物代謝酵素誘導活性の測定を正確に行うことができる。ここで、測定できる酵素活性としては、α１−アンチトリプシン活性、グルタミン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＧＯＴ、ＧＰＴ、尿素合成能、アルブミン合成能等が挙げられる。また酵素誘導活性としては、ＣＹＰファミリー、例えばＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｅ６、ＣＹＰ３Ａ４等が挙げられる。
肝細胞、特にヒト肝細胞の入手は困難であり、肝細胞の摘出場所と各種試験場所とが離れている場合、特にそれらの場所が国際間の場合、肝細胞の輸送には通常２日間以上必要である。本発明方法は、このような長距離輸送後に試験を行う場合に特に有用である。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
Ａ．材料及び方法
（１）肝細胞の初代培養
ヒト肝臓は、４名の患者から摘出されたものを用いた。サルの肝臓は、若い雄ザルの肝臓を用いた。
ヒト肝細胞を公知の方法（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．１８：５９５−６０６（１９９０）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０４７−１０５５（１９９２）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６９：３８４−３９２（１９９４））に従い、葉摘手術されたものを培養した。播種前の細胞の生存はトリパンブルー排除試験を用いて確認したところ、８０〜９０％であった。肝細胞は、コラーゲンＩ、（５μｇ／ｃｍ２）で被覆した組織培養フラスコ（２５ｃｍ２）中のＩｓｏｍ培地に、コンフルエント（１２．４×１０４個／ｃｍ２）になるように播種した。培地はＰｒｏｃ．Ｎａｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；８１：６３７８−６３８２（１９８４）記載のようにＨａｍ Ｆ１２及びウィリアムズＥの混合物（１：１）を用いた。細胞播種後最初の４時間は細胞の付着を目的として５％仔牛血清を添加した。肝細胞播種４時間後に仔牛血清添加標準培地を除去し、ランフォード培地を添加した。このように培養１日目に培地を変換した後、肝細胞培養物を湿度が高く、５％ＣＯ２、３７℃条件下に３又は４日間保持した。こうして肝細胞培養系を１度確立した時点でランフォード培地を吸引除去し、フラスコを５％ＣＯ２で平衡化した９５％空気と、ランフォード培地（「Ｌｎｆ」と略す）、５％ポリエチレングリコール添加Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５（シグマ社）培地（「Ｌ１５＋５％ＰＥＧ」と略す）、又はＩｓｏｍ培地（３７℃）で満たし、氷冷条件又は室温条件に２、４又は６日間保持した。その後、肝細胞含有フラスコを長期間培養のために３７℃でＬｎｆにもどした。肝細胞の生存及び機能に及ぼす、培地、温度及び保存期間の影響について、各培地変換後２４時間ごとに採取した細胞の種々の表現型、すなわち、尿素合成能（酵素／分光光学的分析による）、並びにα１−アンチトリプシン及びアルブミン合成能（ウェスタンブロットによる）を測定した。得られた結果は初期値及びコントロール群（試験期間中、Ｌｎｆ中３７℃に保持した群）と比較して示した。さらに、肝特異的表現型が維持されているか否かの最もよい指標であり、医薬品開発における薬物相互作用を予測する上で重要なチトクロームＰ４５０酵素の誘導に対する細胞の反応（リファンピシンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導）を検討した。
（２）培地組成
用いた培地の組成を表１、表２及び表３に示す。
（３）ライセートの調製
ライセートは、公知の方法で遠心分離により培養細胞から調製し保存した。蛋白濃度はビシンコニン酸法（ピエルス ケミカル社）で測定した。
（４）培養肝細胞の細胞外培地中の血清タンパクの定量化
細胞外培養培地（５〜２０μＬ培地）中のアルブミン及びα１−アンチトリプシンの定量化は、ヒト蛋白に対する特異抗体を用いたウェスタンブロット法を用いて行った。培地サンプルを２個のフラスコから採取し、混合し、１１０００×ｇで５分間遠心分離し、分析まで−８０℃で保存した。
（５）培養肝細胞中のＣＹＰの定量化
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２２：１１４３−１１５３（１９９５）に従い、特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用してライセートのイムノブロット法により定量化した。遺伝子発現したＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９又はＣＹＰ３Ａ４（ジェンテスト社）を含むミクロソームを各ゲルのスタンダードとして使用した。
ライセートはニトロセルロース膜に転写する前にＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ブロットはアマシャム社のＥＣＬ（エンハンスケミルミネセンス）を用いて展開した。ＣＹＰの相対量をアドブフォトショップＬＥプログラムでブロットのスキャニングし、ＮＩＨイメージ１．６／ｐｐｃプログラムを用いてイメージの定量分析して計算した。
（６）培養肝細胞の細胞外培地中の尿素合成能
尿素合成能はシグマ社の酵素／分光光学的アッセイキットにより測定した。
Ｂ．結果
（１）尿素合成能に対する保存温度条件の効果
サル肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中で２日間、０℃又は２５℃で保存した後、３７℃Ｌｎｆ培地で培養した後（１日後、２日後、３日後、８日後及び１１日後）のサル肝細胞の尿素合成能を図１に示す。図１から明らかなように、Ｌｎｆ培地中、３７℃で保存後培養したコントロール群に比べて、０℃保存後培養した群では、Ｌｎｆ及びＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地いずれの培地を用いた場合も尿素合成能は低下していた。これに対し、２５℃保存後培養した群ではコントロール群に比べＬｎｆ培地中でもＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中でも尿素合成能は高く維持されていた。Ｌ−１５＋５％ＰＥＧ培地に比べてＬｎｆ培地がより優れていた。
（２）α１−アンチトリプシン合成能及びＣＹＰ３Ａ４誘導能
サル肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２日間（４８時間）又は４日間（９６時間）、保存した後、Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のα１−アンチトリプシン合成能を図２及び図３に示す。図２及び図３は、最初から３７℃で保存、培養した場合のデータとの相対値で示す。
図２及び図３から明らかなように、２日又は４日間２５℃で保存後培養した場合には、最初から３７℃で保存・培養した場合に比べて、培養期間８〜１５日では、α１−アンチトリブシン合成能が高く維持されていた。
またサル肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２日間（４８時間）、保存した後、Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のＣＹＰ３Ａ４誘導能を図４に示す。図４には最初から３７℃で保存・培養した場合のデータの相対値も示す。
図４から明らかなように、２５℃で２日間保存した後培養した場合には、最初から３７℃で保存・培養した場合（１．８倍）に比べて、１０〜１４日培養後に強いＣＹＰ３Ａ４誘導能（２．３倍、２．４倍）を有していた。
（３）尿素合成能に対する効果（ヒト肝細胞）
ヒト肝細胞を、Ｌｎｆ又はＩｓｏｍ培地中２５℃で２、４又は６日間保存した後Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後の尿素合成能を図５、６及び７に示す。
図５、６及び７から明らかなように、最初から３７℃で保存・培養したコントロールに比べ、Ｌｎｆ培地及びＩｓｏｍ培地中２５℃で２、４又は６日間保存後培養した場合は、強い尿素合成能を有していた。
（４）アルブミン合成能及びα１−アンチトリプシン合成能（ヒト肝細胞）
ヒト肝細胞をＬｎｆ又はＩｓｏｍ培地中２５℃で４日間保存した後Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のアルブミン合成能及びα１−アンチトリプシン合成能を図８及び図９にそれぞれ示す。
図８及び図９から明からなように、最初から３７℃で保存・培養したコントロールに比べ、４日間２５℃で保存後培養した場合は、強いアルブミン合成能及びα１−アンチトリプシン合成能を有していた。
（５）ＣＹＰ３Ａ４誘導能（ヒト肝細胞）
ヒト肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２、４又は６日間保存した後、Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のＣＹＰ３Ａ４誘導能を図１０に示す。
図１０から明らかなように、最初から３７℃で保存・培養したコントロールに比べ、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２、４又は６日間保存後培養した場合は、強いＣＹＰ３Ａ４誘導能を有していた。
産業上の利用可能性
本発明方法によれば、肝細胞の酵素活性及び酵素誘導活性を失うことなく長期間培養できる。また、室温付近に１〜６日間保持できるので、肝細胞摘出後の長時間輸送する場合に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、各種条件にて４８時間保存して培養した後のサル肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図２は、２５℃４８時間保存して培養した後のサル肝細胞のα１−アンチトリプシン合成能を示す図である。
図３は、２５℃９６時間保存して培養した後のサル肝細胞のα１−アンチトリプシン合成能を示す図である。
図４は、２５℃４８時間保存して培養した後のサルの肝細胞のＣＹＰ３Ａ４誘導能を示す図である（ＲＩＦはリファンピシン暴露、ＵＴは未暴露）。
図５は、２５℃４８時間保存して培養した後のヒト肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図６は、２５℃９６時間保存して培養した後のヒト肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図７は、２５℃１４４時間保存して培養した後のヒト肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図８は、２５℃９６時間保存して培養した後のヒト肝細胞のアルブミン合成能を示す図である。
図９は、２５℃９６時間保存して培養した後のヒト肝細胞のα１−アンチトリプシン合成能を示す図である。
図１０は、２５℃４８、９６又は１４４時間保存して培養した後のヒト肝細胞のＣＹＰ３Ａ４誘導能を示す図である（ＲＩＦはリファンピシン暴露、ＵＴは未暴露）。
本発明は、新鮮肝細胞を各種酵素活性又は各種酵素誘導活性を失わずに長期間培養するための方法に関する。
背景技術
肝細胞は、アルブミンの他、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）ファミリーの各種薬物代謝酵素、α１−アンチトリプシン等の凝固線溶系酵素等を産生しているため、摘出された新鮮肝細胞の培養物は、これらの酵素活性測定用細胞として広く使用されている。
通常肝細胞は摘出後酵素の失活を防止する目的で４℃以下に冷却保存し、その後約３７℃に戻して長期間培養し、各種試験に用いられている。
近年、肝細胞の入手が困難になってきていることから、得られた肝細胞を長期間保存したり、長距離、例えば国際間輸送する必要が生じてきた。そのためには、新鮮肝細胞を少なくとも２日以上にわたり各種酵素活性又は酵素誘導活性を失わずに保存することが必要になってきた。
しかし、従来の４℃以下の低温保存方法では、２日以上保存すると、通常３０〜６０％の酵素あるいは酵素誘導活性が失活してしまい、正確な測定ができなかった。
従って、本発明の目的は、肝細胞を、酵素活性や酵素誘導活性を失わせることなく長期間培養する方法を提供することにある。
発明の開示
そこで本発明者は、新鮮肝細胞の長期間培養条件について種々検討したところ、従来の低温（４℃）保存に代えて生理的条件である約３７℃で保存しても肝細胞の酵素活性や酵素誘導活性はある程度保持されるが、全く意外にも１５〜３０℃の室温条件で１〜６日間保存した後、生理的条件に戻して培養すると、当該３７℃保存よりもさらに高い酵素活性や酵素誘導活性が保持され、長期間安定であり、長距離輸送した後も薬物代謝酵素誘導試験等が正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、新鮮肝細胞を培地中１５〜３０℃の温度に１〜６日間保持した後生理的条件で培養することを特徴とする肝細胞の長期間培養法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明方法に用いられる肝細胞は、摘出後継代培養を行っていない新鮮肝細胞であり、すなわち初代培養肝細胞である。肝細胞としては、哺乳類肝細胞、さらに霊長類肝細胞、特にヒト肝細胞が好ましい。
本発明においては、新鮮肝細胞を培地中で１５〜３０℃に１〜６日間保持することが必要である。１５℃未満、例えば従来の保存温度である４℃では肝細胞の酵素活性及び酵素誘導活性が低下する。また、３０℃を超える温度、例えば生理的条件である約３７℃でも肝細胞の酵素活性及び酵素誘導活性は１５〜３０℃保存の場合よりも低くなる。好ましい保持温度は１８〜２７℃であり、より好ましくは２０〜２５℃である。
本発明に用いられる新鮮肝細胞の培地は、通常の動物細胞用の培地であればよいが、ランフォード（Ｌａｎｆｏｒｄ）培地、ウイリアムズＥ（ＷＭＥ）培地、Ｉｓｏｍ培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５培地、ポリエチレングリコール添加Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５培地、及びこれらを組み合せた培地等が挙げられるが、少なくともランフォード培地を含む培地が特に好ましい。
新鮮肝細胞用の培地中の肝細胞の濃度は、０．５×１０６〜１０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ、特に１×１０６〜１０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬが好ましい。
１５〜３０℃に保持する期間は１〜６日間、特に２〜６日間が好ましい。
１５〜３０℃に１〜６日間保持した後、肝細胞は生理的条件で培養すればよい。生理的条件の培養としては、通常の培地中３７±１℃の培養が好ましい。ここで培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる培地であればよいが、前記新鮮肝細胞の培地と同じものが好ましく、特に少なくともランフォード培地を含む培地が好ましい。
このような生理的条件の培養を継続すれば、肝細胞は１ヶ月以上もの長期間に渡り、酵素活性及び酵素誘導活性が失われず、各種酵素活性の測定、薬物代謝酵素誘導活性の測定を正確に行うことができる。ここで、測定できる酵素活性としては、α１−アンチトリプシン活性、グルタミン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＧＯＴ、ＧＰＴ、尿素合成能、アルブミン合成能等が挙げられる。また酵素誘導活性としては、ＣＹＰファミリー、例えばＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｅ６、ＣＹＰ３Ａ４等が挙げられる。
肝細胞、特にヒト肝細胞の入手は困難であり、肝細胞の摘出場所と各種試験場所とが離れている場合、特にそれらの場所が国際間の場合、肝細胞の輸送には通常２日間以上必要である。本発明方法は、このような長距離輸送後に試験を行う場合に特に有用である。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
Ａ．材料及び方法
（１）肝細胞の初代培養
ヒト肝臓は、４名の患者から摘出されたものを用いた。サルの肝臓は、若い雄ザルの肝臓を用いた。
ヒト肝細胞を公知の方法（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．１８：５９５−６０６（１９９０）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０４７−１０５５（１９９２）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６９：３８４−３９２（１９９４））に従い、葉摘手術されたものを培養した。播種前の細胞の生存はトリパンブルー排除試験を用いて確認したところ、８０〜９０％であった。肝細胞は、コラーゲンＩ、（５μｇ／ｃｍ２）で被覆した組織培養フラスコ（２５ｃｍ２）中のＩｓｏｍ培地に、コンフルエント（１２．４×１０４個／ｃｍ２）になるように播種した。培地はＰｒｏｃ．Ｎａｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；８１：６３７８−６３８２（１９８４）記載のようにＨａｍ Ｆ１２及びウィリアムズＥの混合物（１：１）を用いた。細胞播種後最初の４時間は細胞の付着を目的として５％仔牛血清を添加した。肝細胞播種４時間後に仔牛血清添加標準培地を除去し、ランフォード培地を添加した。このように培養１日目に培地を変換した後、肝細胞培養物を湿度が高く、５％ＣＯ２、３７℃条件下に３又は４日間保持した。こうして肝細胞培養系を１度確立した時点でランフォード培地を吸引除去し、フラスコを５％ＣＯ２で平衡化した９５％空気と、ランフォード培地（「Ｌｎｆ」と略す）、５％ポリエチレングリコール添加Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ１５（シグマ社）培地（「Ｌ１５＋５％ＰＥＧ」と略す）、又はＩｓｏｍ培地（３７℃）で満たし、氷冷条件又は室温条件に２、４又は６日間保持した。その後、肝細胞含有フラスコを長期間培養のために３７℃でＬｎｆにもどした。肝細胞の生存及び機能に及ぼす、培地、温度及び保存期間の影響について、各培地変換後２４時間ごとに採取した細胞の種々の表現型、すなわち、尿素合成能（酵素／分光光学的分析による）、並びにα１−アンチトリプシン及びアルブミン合成能（ウェスタンブロットによる）を測定した。得られた結果は初期値及びコントロール群（試験期間中、Ｌｎｆ中３７℃に保持した群）と比較して示した。さらに、肝特異的表現型が維持されているか否かの最もよい指標であり、医薬品開発における薬物相互作用を予測する上で重要なチトクロームＰ４５０酵素の誘導に対する細胞の反応（リファンピシンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導）を検討した。
（２）培地組成
用いた培地の組成を表１、表２及び表３に示す。
ライセートは、公知の方法で遠心分離により培養細胞から調製し保存した。蛋白濃度はビシンコニン酸法（ピエルス ケミカル社）で測定した。
（４）培養肝細胞の細胞外培地中の血清タンパクの定量化
細胞外培養培地（５〜２０μＬ培地）中のアルブミン及びα１−アンチトリプシンの定量化は、ヒト蛋白に対する特異抗体を用いたウェスタンブロット法を用いて行った。培地サンプルを２個のフラスコから採取し、混合し、１１０００×ｇで５分間遠心分離し、分析まで−８０℃で保存した。
（５）培養肝細胞中のＣＹＰの定量化
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２２：１１４３−１１５３（１９９５）に従い、特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用してライセートのイムノブロット法により定量化した。遺伝子発現したＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９又はＣＹＰ３Ａ４（ジェンテスト社）を含むミクロソームを各ゲルのスタンダードとして使用した。
ライセートはニトロセルロース膜に転写する前にＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ブロットはアマシャム社のＥＣＬ（エンハンスケミルミネセンス）を用いて展開した。ＣＹＰの相対量をアドブフォトショップＬＥプログラムでブロットのスキャニングし、ＮＩＨイメージ１．６／ｐｐｃプログラムを用いてイメージの定量分析して計算した。
（６）培養肝細胞の細胞外培地中の尿素合成能
尿素合成能はシグマ社の酵素／分光光学的アッセイキットにより測定した。
Ｂ．結果
（１）尿素合成能に対する保存温度条件の効果
サル肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中で２日間、０℃又は２５℃で保存した後、３７℃Ｌｎｆ培地で培養した後（１日後、２日後、３日後、８日後及び１１日後）のサル肝細胞の尿素合成能を図１に示す。図１から明らかなように、Ｌｎｆ培地中、３７℃で保存後培養したコントロール群に比べて、０℃保存後培養した群では、Ｌｎｆ及びＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地いずれの培地を用いた場合も尿素合成能は低下していた。これに対し、２５℃保存後培養した群ではコントロール群に比べＬｎｆ培地中でもＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中でも尿素合成能は高く維持されていた。Ｌ−１５＋５％ＰＥＧ培地に比べてＬｎｆ培地がより優れていた。
（２）α１−アンチトリプシン合成能及びＣＹＰ３Ａ４誘導能
サル肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２日間（４８時間）又は４日間（９６時間）、保存した後、Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のα１−アンチトリプシン合成能を図２及び図３に示す。図２及び図３は、最初から３７℃で保存、培養した場合のデータとの相対値で示す。
図２及び図３から明らかなように、２日又は４日間２５℃で保存後培養した場合には、最初から３７℃で保存・培養した場合に比べて、培養期間８〜１５日では、α１−アンチトリブシン合成能が高く維持されていた。
またサル肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２日間（４８時間）、保存した後、Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のＣＹＰ３Ａ４誘導能を図４に示す。図４には最初から３７℃で保存・培養した場合のデータの相対値も示す。
図４から明らかなように、２５℃で２日間保存した後培養した場合には、最初から３７℃で保存・培養した場合（１．８倍）に比べて、１０〜１４日培養後に強いＣＹＰ３Ａ４誘導能（２．３倍、２．４倍）を有していた。
（３）尿素合成能に対する効果（ヒト肝細胞）
ヒト肝細胞を、Ｌｎｆ又はＩｓｏｍ培地中２５℃で２、４又は６日間保存した後Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後の尿素合成能を図５、６及び７に示す。
図５、６及び７から明らかなように、最初から３７℃で保存・培養したコントロールに比べ、Ｌｎｆ培地及びＩｓｏｍ培地中２５℃で２、４又は６日間保存後培養した場合は、強い尿素合成能を有していた。
（４）アルブミン合成能及びα１−アンチトリプシン合成能（ヒト肝細胞）
ヒト肝細胞をＬｎｆ又はＩｓｏｍ培地中２５℃で４日間保存した後Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のアルブミン合成能及びα１−アンチトリプシン合成能を図８及び図９にそれぞれ示す。
図８及び図９から明からなように、最初から３７℃で保存・培養したコントロールに比べ、４日間２５℃で保存後培養した場合は、強いアルブミン合成能及びα１−アンチトリプシン合成能を有していた。
（５）ＣＹＰ３Ａ４誘導能（ヒト肝細胞）
ヒト肝細胞を、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２、４又は６日間保存した後、Ｌｎｆ培地中３７℃で培養した後のＣＹＰ３Ａ４誘導能を図１０に示す。
図１０から明らかなように、最初から３７℃で保存・培養したコントロールに比べ、Ｌｎｆ又はＬ−１５＋５％ＰＥＧ培地中２５℃で２、４又は６日間保存後培養した場合は、強いＣＹＰ３Ａ４誘導能を有していた。
産業上の利用可能性
本発明方法によれば、肝細胞の酵素活性及び酵素誘導活性を失うことなく長期間培養できる。また、室温付近に１〜６日間保持できるので、肝細胞摘出後の長時間輸送する場合に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、各種条件にて４８時間保存して培養した後のサル肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図２は、２５℃４８時間保存して培養した後のサル肝細胞のα１−アンチトリプシン合成能を示す図である。
図３は、２５℃９６時間保存して培養した後のサル肝細胞のα１−アンチトリプシン合成能を示す図である。
図４は、２５℃４８時間保存して培養した後のサルの肝細胞のＣＹＰ３Ａ４誘導能を示す図である（ＲＩＦはリファンピシン暴露、ＵＴは未暴露）。
図５は、２５℃４８時間保存して培養した後のヒト肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図６は、２５℃９６時間保存して培養した後のヒト肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図７は、２５℃１４４時間保存して培養した後のヒト肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図８は、２５℃９６時間保存して培養した後のヒト肝細胞のアルブミン合成能を示す図である。
図９は、２５℃９６時間保存して培養した後のヒト肝細胞のα１−アンチトリプシン合成能を示す図である。
図１０は、２５℃４８、９６又は１４４時間保存して培養した後のヒト肝細胞のＣＹＰ３Ａ４誘導能を示す図である（ＲＩＦはリファンピシン暴露、ＵＴは未暴露）。
Claims (3)
- 新鮮肝細胞を培地中１５〜３０℃の温度に１〜６日間保持した後生理的条件で培養することを特徴とする肝細胞の長期間培養法。
- 新鮮肝細胞の培地が、少なくともランフォード培地を含む培地である請求項１記載の肝細胞の長期間培養法。
- 生理的条件の培養が、３７±１℃で、少なくともランフォード培地を含む培地中の培養である請求項１又は２記載の肝細胞の長期間培養法。
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