ES2306505T3 - Linea celular clonica c3a exenta de suero y procedimientos de uso. - Google Patents

Abstract

Una línea celular clónica C3A derivada de una línea celular parental C3A, teniendo dicha línea celular un nº de registro de la ATTC de CRL-12461.

Description

Línea celular clónica C3A exenta de suero y procedimientos de uso.

1. Campo de la invención

Esta invención se refiere en general al campo de las líneas celulares, más específicas a una línea celular C3A exenta de suero que produce productos de células de mamífero, tales como polipéptidos recuperables obtenidos por procedimientos recombinantes.

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2. Antecedentes de la invención

El cultivo de células se usa ampliamente para la producción de varios productos biológicos recuperables que incluyen factores de crecimiento polipeptídicos, hormonas, enzimas, vacunas y proteínas. Estos productos biológicos son producidos en cultivo por líneas celulares normales, transformadas y genéticamente modificadas.

Cuando se retira una célula de su entorno natural, sin embargo, un medio artificial debe proporcionar todos los factores críticos necesarios para el crecimiento celular normal, la diferenciación y la expresión en la célula hospedadora. Por lo tanto, el medio de cultivo sintético debe suministrar factores críticos nutricionales, hormonales y estromales normalmente proporcionados in vivo. Además, el medio de cultivo no debe interferir con la producción o uso del producto biológico deseado. Dado que la función de muchos factores de cultivo celular sigue sin definir a nivel molecular, la mayoría de las líneas celulares usadas en la producción de productos biológicos se cultivan en medio de cultivo suplementado con suero animal que sirve como nutriente universal. El suero es un fluido muy complejo, que contiene al menos 500 componentes proteicos diferentes incluyendo hormonas, factores de crecimiento, proteínas transportadoras, oligoelementos y factores de unión y de difusión entre otros constituyentes. El suero animal, tal como el suero bovino fetal (SBF), puede representar hasta el 10% de un medio de cultivo típico. En la actualidad, las células C3A se cultivan en medio de cultivo tisular que contiene aproximadamente un 5% de SBF.

A pesar de que se emplea ampliamente, el suplemento con suero tiene muchas limitaciones, particularmente cuando se utiliza en la fabricación de productos de biotecnología (Barnes, 1987, Barnes y Sato, 1980, Broad, i.e., 1991, Jayme, 1991). El suero contiene altos niveles de numerosas proteínas que pueden interferir con polipéptidos expresados de forma heteróloga y por lo tanto debe separarse de los productos biológicos fabricados durante su cosecha. Adicionalmente, el aumento creciente del precio de suero comercial, la variación incontrolable en su calidad de lote y el requisito adicional de esterilización, se combinan para complicar el procedimiento de producción y para aumentar los costes de fabricación.

Además, el uso de suero puede presentar un peligro biológico potencial. El suero puede contener elementos citotóxicos ocultos que deben eliminarse antes de que cualquier producto biológico se pueda utilizar de forma segura antes de su fabricación. La administración estadounidense para alimentos y fármacos ha demostrado un serio recelo regulador en lo concerniente a la posible contaminación de productos biológicos recuperables de cultivos que contienen suero. Rossi y col., (Am. J, Vet. Res., 41:1680-1681 (1980)); Chu y col. (In vitro, 9:31-34 (1973)) y Nuttall y col., (Nature, 266:835-837 (1977)) afrontan un aspecto de este problema (viz. el potencial de contaminación vírica de cultivos celulares que contienen suero). Los contaminantes víricos pueden interacciona biológicamente con células de mamífero en cultivo, como mencionan Chu y col, o mediante reacciones clínicas extrañas a otros agentes, como observaron Nuttall y col.

Se han empleado una serie de técnicas para reducir la contaminación vírica de cultivos que contienen suero. Estas incluyen la búsqueda selectiva vigilante y la erradicación de virus contaminantes mediante cromatografía de afinidad. Por desgracia, no obstante, tal como han notificado Orr y col. (J. Clin, Microbial. 3:402-5 (1976)), es difícil asegurar la eliminación completa de todos lo agentes indeseables posibles que pueden existir en un cultivo celular contaminado. Recientemente ha surgido una nueva preocupación en lo que concierne a la adulteración por agentes de origen no vírico. Tales temores se han conformado posteriormente por la evidencia de la transmisión de enfermedades de tipo prión de animales a seres humanos (por ejemplo, trastornos neurodegenerativos como el de Creutzfeld-Jakob y más recientemente por una forma humana de la encefalopatía espongiforme bovina, Collinge, J., Hum. Mol. Genet. 6: 1699-1705; 1997). Estos desarrollos han provocado graves preocupaciones adicionales acerca del uso de sueros derivados de animales en el cultivo celular.

En consecuencia, hay un gran demanda para el desarrollo de líneas celulares que estén adaptadas para el crecimiento y el cultivo en medio que sea exento de suero. Galfre, patente de EE.UU. nº 4.350.683 describen una línea celular de melanoma de rata (CNCM I-078) útil en el desarrollo de hibridomas de rata que es supuestamente capaz de crecer en un medio exento de suero. En muchos cultivos exentos de suero, sin embargo, se notifica a menudo que el crecimiento celular es más lento en comparación con el crecimiento celular en cultivos suplementados con suero. Golde, patente de EE.UU. nº 4.438.032 describe una línea celular de linfoblastos T humanos (Mo) capaz de crecer en medio exento de suero, aunque su tasa de crecimiento es considerablemente más lenta que cuando las células se cultivan y se mantienen en un medio que contiene SBF al 20%. Además, se ha notificado que las líneas celulares exentas de suero sufren de una densidad celular disminuida, niveles de saturación menores y viabilidad reducida.

En consecuencia, existe una necesidad de crear líneas celulares exentas de suero que puedan crecer y prosperar cuando se mantengan en medio exento de suero (incluyendo medio "químicamente definido" que está exento de cualquier tipo de suero o suplemento de suero). Tales líneas celulares exentas de suero deberían mostrar también una viabilidad y tasas de crecimiento normales y ser capaces de expresar productos biológicos recuperables que estén exentos de contaminación biológica.

De acuerdo con esto, la presente invención ofrece una línea celular, derivada de forma clónica de una línea celular parental de hepatocitos C3A, que está adaptada para crecimiento y mantenimiento normal en medio exento de suero. Adicionalmente, la presente línea celular apoya la síntesis y expresión, en cultivo exento de suero, de valores sustanciales de productos biológicos recuperables de pureza razonablemente alta incluyendo polipéptidos y proteínas. Una ventaja de la línea celular C3A exenta de suero de la invención es que los productos biológicos cosechados a partir de cultivos que utilizan estas células tienen un riesgo considerablemente menor de albergar agentes infecciosos ocultos que los productos biológicos fabricados con suplementos que contienen suero. Otra ventaja es la probable facilitación de la aprobación reguladora de los productos biológicos derivados usando células de la invención debido a su riesgo reducido de contaminación. Una agencia reguladora, el departamento de agricultura de los Estados Unidos, es particularmente consciente de la introducción inadvertida de la fiebre aftosa en ganado de los Estados Unidos a través de la importación de productos biológicos producidos a partir de cultivos que contienen suero de ternera fetal. En consecuencia, la línea celular de la invención y procedimientos para su uso ofrecen ventajas sobre líneas celulares que se cultivan o mantienen en medio que contiene suero.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento y desarrollo de una línea celular exenta de suero derivada de una línea celular parental de hepatocitos C3A. La línea celular C3A exenta de suero se ha depositado como ACT CRL-12461 y está adaptada para el cultivo y clonada en medio exento de suero. Una ventaja sorprendente de las células C3A exentas de suero es que tienen una tasa de crecimiento mayor y un tiempo de duplicación más corto que las células de la línea celular C3A parental. La línea celular C3A exenta de suero apoya la producción de productos biológicos recuperables en cultivo exento de suero, disminuyendo con ello el riesgo de producir productos biológicos contaminados mediante la transmisión por suero.

En un primer aspecto, la línea celular C3A exenta de suero de la presente invención tiene un tiempo de duplicación significativamente más corto que el tiempo de duplicación de la línea celular C3A parental o una comparable.

En otro aspecto, las células de la línea celular C3A exenta de suero expresan un único o cualquier combinación de una pluralidad de productos biológicos recuperables en cultivo celular exento de suero.

En un aspecto adicional más, los productos recuperables producidos usando las células C3A exentas de suero son polipéptidos de mamífero tales como fetoproteína alfa (FPA), albúmina humana, antiquimiotripsina \alpha-1, antitripsina \alpha-1, antitrombina III, complemento C3, factor V y transferrina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para producir una línea celular C3A exenta de suero y un procedimiento para producir productos biológicos recuperables empleando células de la línea celular C3A exenta de suero.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento y un dispositivo para tratar a un sujeto del que se sospecha que tiene un trastorno, dolencia hepática, o función hepática comprometida empleando células de la línea celular C3A exenta de suero en un dispositivo hepático biológico artificial.

En otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la búsqueda selectiva de compuestos respecto a la actividad metabólica o para estudiar enfermedades entéricas usando células de la línea celular C3A exenta de suero.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos son ilustrativos de formas de realización de la invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención tal como está recogido en las reivindicaciones.

Las figs. 1a-1f son ilustraciones que muestran los resultados de inmunotransferencias de Western usando geles de PAGE con SDS al 10% para la detección de polipéptidos expresados a partir de células de la línea celular C3A exenta de suero cultivadas en medio exento de suero.

La fig. 1a demuestra la detección del producto biológico antiquimiotripsina \alpha-1.

La fig. 1b demuestra la detección del producto biológico antitripsina \alpha-1.

La fig. 1c demuestra la detección del producto biológico antitrombina III.

La fig. 1d demuestra la detección del producto biológico complemento C3.

La fig. 1e demuestra la detección del producto biológico factor V.

La fig. 1f demuestra la detección del producto biológico trasferrina.

La fig. 2 es un gráfico que ilustra las tasas de crecimiento comparativas de células C3A exentas de suero y células parentales de la línea celular C3A.

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Descripción detallada

La presente invención proporciona una línea celular C3A de hepatocitos exenta de suero adecuada para su uso en la producción de productos biológicos recuperables en cultivo exento de suero. Las líneas celulares C3A exentas de suero de la presente invención derivan de una línea celular C3A parental conocida. El término "deriva", tal como se usa en el presente documento, significa que la línea celular está clonada a partir de una línea celular C3A parental conocida mediante un procedimiento de selección definido proporcionado en el presente documento. El término "clonada", "derivada clónicamente" o "línea celular clónica", tal como se usa en el presente documento, significa una población en propagación de células genéticamente idénticas de una línea celular específica que derivan de una única célula progenitora. La línea celular parental es una línea celular hepática similar a la línea celular descrita en la patente de EE.UU. nº 5.290.684. La línea celular C3A exenta de suero derivada clónicamente de la invención conserva la mayoría de las características de la línea parental C3A de hepatocitos humana con la excepción de que la línea celular que se reivindica en el presente documento se cultiva, se mantiene y expresa actividad biológica hepática específica en medio que está exento de suero. La línea celular exenta de suero de la invención y procedimientos de su uso imita tanto cualitativa como cuantitativamente a las células hepáticas o al hígado como órgano funcional. Las células C3A exentas de suero expresan niveles próximos a los normales de polipéptidos de varias rutas metabólicas centrales, incluyendo la ruta de la glucólisis, gluconeogénesis, glucogénesis y ureogénesis. Además, las células exentas de suero incluyen las siguientes características adicionales: sintetizan niveles próximos a los normales de albúmina y otras proteínas, contienen altos niveles de factores de transcripción específicos del hígado y exhiben las características de estructura y polaridad de los hepatocitos humanos normales.

Debe entenderse que esta invención no está limitada a los procedimientos, composiciones y líneas celulares particulares descritas en el presente documento, dado que tales procedimientos, composiciones y líneas celulares pueden, lógicamente, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el propósito únicamente de describir formas de realización particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que sólo está limitada por las reivindicaciones adjuntas.

Tal como se usa en el presente documento, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras como "un", "una" y "el", incluyen sus correspondientes homólogos plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta forma, por ejemplo, la referencia a "un organismo" incluye uno o más organismos diferentes, la referencia a "una célula" incluye una o más de tales células y la referencia a "un procedimiento" incluye referencias a etapas y procedimientos equivalentes conocidos para una persona experta habitual en la materia y así sucesivamente.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado como entiende normalmente una persona experta habitual en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas anteriormente se proporcionan meramente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe constituir una admisión de que la invención no se dirige a anteponerse a cualquier descripción de este tipo en virtud de su invención anterior. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan en su totalidad mediante referencia, incluyendo todas las figuras y dibujos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "exento de suero" significa un medio de cultivo formulado en ausencia de suero, y su significado incluye tanto las formulaciones de medios definidas como medios "exentos de suero" (que pueden estar suplementados de otra forma con proteínas), medios "exentos de proteínas" (sin suplemento de proteínas) y "definidos químicamente" (ultra puros o son constituyentes moleculares pequeños, péptidos o proteínas modificados genéticamente). Las proporciones de los componentes del medio exento de suero se pueden ajustar y optimizar para el uso particular para el que la línea celular de la invención será utilizada, incluyendo su uso en cualquier sistema de expresión de polipéptidos, su uso en un dispositivo hepático biológico artificial, o su uso en estudios metabólicos o entéricos que implican la función del órgano hepático o células de hepatocitos. Para potenciar las propiedades de cultivo celular del medio exento de suero usado con células de la invención, además de aditivos, el medio exento de suero se puede suplementar con otros componentes tales como ácidos grasos, aminoácidos o precursores de fosfolípidos. El medio exento de suero se puede adquirir comercialmente o crearse de nuevo en el laboratorio. Preferiblemente, el medio usado con células de la invención es medio exento de suero, y más preferiblemente, está suplementado con L-glutamina 2 mM. Incluso más preferiblemente, el medio exento de suero es la variedad comercialmente obtenible denominada JRH Bioscience ExCell 620 que está suplementado con L-glutamina 2 mM.

La línea celular C3A parental a partir de la cual se derivan clónicamente las células de la invención se describe en Gislason y col., Artificial Organs, Vol. 18, págs. 385-38 (1994), Miwa y col., Int. Jour. of Artificial Organs, Vol. 19, págs. 240-244 (1996) y Sussman y col. Hepatology, Vol. 16, págs. 60-65 (1992). Se ha depositado con el número de registro de la colección americana de cultivos tipo (ATCC, American Type Culture Collection), 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU. nº SD2078 y nº SD3283. Las células C3A derivadas clónicamente exentas de suero de la invención también se han depositado con la ATCC y tienen nº de registro CRL-12461. La línea celular C3A exenta de suero está exenta de contaminantes biológicos y no condenen ninguna secuencia genética de virus de la hepatitis B (VHB).

Los depósitos de la ATCC están hechos con arreglo al tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con el fin de procedimientos de patentes y las regulaciones que acoge (Tratado de Budapest). El tratado asegura el mantenimiento del cultivo viable durante 30 años a partir de la fecha de depósito. La línea celular C3A exenta de suero está disponible de la ATCC con arreglo a los términos del tratado de Budapest, el cual asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie de la línea celular al público tras la cesión de la patente de EE.UU. pertinente o después de la apertura a la consulta por el público de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o extranjera, lo que quiera que suceda antes. El tratado de Budapest asegura la disponibilidad de la línea celular a alguien determinado a quien el comisionado de EE.UU. de patentes y marcas comerciales asigne para ello según 35 USC \NAK 122 y las reglas del comisionado relativas a ello (incluyendo 37 CFR \NAK 1.14 con particular referencia a 886OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que la línea celular depositada muriese, se perdiese o fuese destruida cuando se cultivase en condiciones adecuadas, será reemplazada rápidamente con una muestra viable de la misma línea celular tras la notificación apropiada. La disponibilidad de una línea celular depositada no se debe considerar como una licencia para practicar la invención contraviniendo los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes en materia de patentes.

Los clones de células C3A exentas de suero son capaces de mantenerse, crecer y proliferar indefinidamente in vitro. Las líneas celulares C3A exentas de suero proliferan, se pueden subcultivar (es decir, pasar repetidamente a nuevos recipientes de cultivo) y crioconservarse a lo largo del tiempo (por ejemplo, conservarse en la fase de vapor de nitrógeno líquido con un crioconservante tal como dimetilsulfóxido al 10% o glicerol). Las células C3A exentas de suero se pueden mantener en cultivo a largo plazo como una línea celular que se asemeja a cultivos primarios.

En la mayoría de las ocasiones, las células de la invención se cultivan en cualquier recipiente, matraz, placa de cultivo tisular o dispositivo usado para cultivar células que proporcione una superficie adecuada para la fijación y la dispersión celular (por ejemplo, Culture of Hematopoietic Cells (Culture of Specialized Cells) R. I. Freshney y col., ed., I. Freshney, Wiley-Liss 1994, incorporado mediante referencia en el presente documento). Normalmente, un cultivo fundador es aquel en el que se retiran células de una solución madre parental C3A, se disponen en un recipiente de cultivo en una mezcla de medio que contiene suero y medio exento de suero y se pasa a continuación a estado exento de suero como se describe en detalle en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fijación" se refiere a la adherencia y dispersión celular sobre una superficie en un dispositivo de este tipo, en el que factores que promueven la fijación y la dispersión celular se ponen en contacto directamente con las células cultivadas. El crecimiento celular se mantiene directamente sobre superficies del recipiente de cultivo o sobre inserciones suplementarias tales como cartuchos o membranas dispuestas en el interior del recipiente. Las superficies de fijación y dispersión adecuadas se producen bien seleccionando inicialmente un material de superficie adecuad o tratando a continuación una superficie existente. Los tratamientos comunes son bien conocidos e incluyen el recubrimiento de superficies con composiciones que promueven la fijación y la dispersión. Tales composiciones también son bien conocidas e incluyen aminoácidos básicos tales como poliornitina y polilisina. Además, la superficie de fijación se puede recubrir o proporcionarse una proteína de matriz extracelular conocida o con composiciones o entornos artificiales que son funcionalmente equivalentes a una matriz extracelular in vitro. Tales entornos potencian el crecimiento, mantenimiento y expresión de productos biológicos recuperables de células C3A exentas de suero. Las composiciones de matriz celular típicas son bien conocidas e incluyen laminina, colágeno y fibronectina. En la técnica se conocen otras proteínas de matriz extracelular y entornos artificiales de matriz extracelular, que imitan una matriz extracelular in vivo (véase, por ejemplo, Sinthetic Biodegradable Polymers Scaffolds (Tissue Engineering) A. Atala y D.J. Mooney (eds.) Birkhauser, 1997).

Una vez alcanzada la confluencia, las células exentas de suero asumen un fenotipo adulto en el que la división celular se ralentiza drásticamente y desarrollan características histológicas de células hepáticas humanas normales. También en el momento de la confluencia, las células C3A exentas de suero expresan y sintetizan niveles sustanciales de proteína fetal alfa humana (AFP), albúmina humana, antiquimiotripsina \alpha-1, antitripsina \alpha-1, antitrombina III, complemento C3, factor V. transferrina y otras proteínas séricas con una pureza razonablemente alta. El término "confluencia", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una densidad de células cultivadas en la que las células contactan unas con otras cubriendo la mayoría de todas las superficies disponibles para el crecimiento. Durante el crecimiento previo a la confluencia, las células seleccionadas se comportan como hepatocitos en regeneración que demuestran patrones correspondientes de regulación de la expresión génica. Las células C3a exentas de suero tienen un tiempo de duplicación rápido que es sustancialmente menor que el tiempo de duplicación de células de la línea celular C3a parental no exenta de suero. El término "tiempo de duplicación", tal como se usa en el presente documento, se refiere al tiempo que tardan las células en un cultivo celular en duplicarse en número. En una forma de realización preferida, el tiempo de duplicación de la línea celular C3A exenta de suero está en el intervalo de aproximadamente menos del 50% a aproximadamente menos del 70% del tiempo de duplicación en medio exento de suero de la línea celular C3A parental. En una forma de realización más preferida, el tiempo de duplicación de la línea celular C3A exenta de suero está en el intervalo de aproximadamente menos del 60% a aproximadamente menos del 70% del tiempo de duplicación en medio exento de suero de la línea celular C3A parental.

Las células C3A exentas de suero también exhiben actividad biológica hepática específica, sintetizando proteínas séricas, isoenzima, factores de coagulación y similares. De acuerdo con esto, las células se utilizan en medio exento de suero como fábricas biológicas in vitro que expresan productos biológicos recuperables sustancialmente puros incluyendo moléculas de fuente natural, proteínas séricas, vacunas y polipéptidos recombinantes tales como anticuerpos, factores de crecimiento, miembros de la cascada sanguínea, citocinas y proteínas morfogénicas. Preferiblemente, los productos biológicos recuperables producidos por las células de la invención incluyen un único o cualquier combinación de una pluralidad de polipéptidos recuperables. Más preferiblemente, el polipéptido cosechable se selecciona del grupo constituido por fetoproteína alfa (FPA), albúmina humana, antiquimiotripsina \alpha-1, antitripsina \alpha-1, antitrombina III, complemento C3, factor V y transferrina. Los productos biológicos expresados por las células de la línea celular C3A exenta de suero se aíslan de forma relativamente fácil durante la cosecha, dada la ausencia de proteínas que interfieren del medio de cultivo. Además, el uso de células de la presente invención reduce considerablemente el riesgo de contaminación de la línea celular o el producto biológico por organismos o agentes que se encuentran normalmente en el suero. Por el término "cosechar" o "cosechable" se quiere decir cultivar células de la invención en medio exento de suero para expresar un producto biológico deseado y posteriormente recobrar o recuperar el producto biológico en un estado sustancialmente puro a partir del medio exento de suero usando cualquier procedimiento de recuperación conocido en la técnica (por ejemplo, Culture of Hematopoietic Cells (Culture of specialized Cells) R. I. Freshney y col., ed. I. Freshney, Wiley Liss, 1994; Large Scale Cell Culture Technology, B.K. Lydersen ed., John Wiley & Sons 1993). En una forma de rea, el fluido sonbrenadante se recupera a partir del cultivo celular y los productos biológicos se aíslan y se purifican. En otra forma de realización, las células se pueden cultivar sobre una membrana semipermeable o superficie que permita la difusión de productos biológicos recuperables, tales como proteínas a través de la membrana o superficie donde se cosechan a continuación mediante aislamiento y consiguiente purificación. El término "sustancialmente puro" o "sustancialmente purificado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier producto biológico cosechable que está sustancialmente exento de otras proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que se asocia naturalmente.

En una forma de realización, un polipéptido cosechable sustancialmente puro de un cultivo celular C3A exento de suero dará normalmente una única banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. La pureza de cualquier polipéptido cosechable se puede determinar también mediante análisis de la secuencia de aminoácidos amino terminal. Los polipéptidos recuperables sustancialmente puros incluyen fragmentos funcionales del polipéptido, siempre que se conserve su actividad biológica. Además, se incluyen otras modificaciones recombinantes, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio de ADNc de cualquier polipéptido cosechable. Un polipéptido cosechable "recombinante" se refiere a un polipéptido cosechable producido usando cualquier técnica biológica molecular recombinante (por ejemplo, transfección celular con una construcción de secuencia de ácido nucleico exógeno). Una secuencia "codificante" de un ácido nucleico o una "secuencia de nucleótidos que codifica" un polipéptido cosechable particular, tal como se usa en el presente documento, es una secuencia de ácido nucleico endógeno o exógeno que se transcribe y se traduce en un polipéptido cosechable cuando se dispone bajo el control de una secuencia reguladora de ácido nucleico apropiada.

La invención incluye procedimientos que usan células exentas de suero de la invención para expresar cualquier secuencia de ácido nucleico heterólogo eucariota modificado genéticamente que codifica un polipéptido coseschable o fragmento funcional del mismo empleando cualquier técnica recombinantes como se ha descrito anteriormente. Los procedimientos para expresar secuencias de ácidos nucleicos eucariotas heterólogos que codifican un polipéptido heterólogo correspondiente son bien conocidos. El término "ácido nucleido heterólogo" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier secuencia o material de ácido nucleico reguladora o estructural que no es propia de la célula C3A exenta de suero de la invención a la que se le introduce (por ejemplo, transfectada). Las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias de ADN, ADNc, y ARN que codifican polipéptidos o fragmentos funcionales de los mismos en disposición funcional que se puede trabajar con cualquier vector de expresión conocido. El término "expresar" o "expresión", tal como se usa en el presente documento se refiere al uso completo de la información e una secuencia de ácido nucleico a través de la transcripción y la traducción que conduce a la producción de una secuencia polipeptídica correspondiente que está determinada por su secuencia de ácido nucleico codificante. La expresión génica está controlada en varios puntos en la sucesión de etapas que comienza con el inicio de la transcripción y termina con la síntesis de un polipéptido funcional. La transfección de un ácido nucleico heterólogo se lleva a cabo mediante cualquier procedimiento convencional, incluyendo el uso de vectores víricos (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor, Gluzman ed., 1982), retrovirus recombinantes, procedimientos químicos (coprecipitación con fosfato de calcio) o físicos, incluyendo procedimientos mecánicos (por ejemplo, microinyección, transfección mediante proyectiles) o liposomas. El material genético (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico) se inserta en un vector mediante cualquiera de una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ácido nucleico se inserta en un sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s). Todos los procedimientos de este tipo y cualquier otro están contemplados en el alcance de la invención y en la capacidad de cualquier persona experta habitual en la materia. Los ejemplos de tales vectores incluyen secuencias cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas de ADN (por ejemplo, derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN vírico tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y seudorrabia). Se puede usar cualquier otro vector no obstante, siempre que sea replicable y funcional en el interior de las células de la invención.

Otros vectores víricos contemplados para su utilización para transferir material genético heterólogo en una célula C3A exenta de suero de la invención incluyen adenovirus, virus adenoasociados, herpes virus, vaccinia, o un virus con ARN tal como un retrovirus. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que se inserta un único gen ajeno incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Molones (MoMuLV), virus de sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV), virus de leucemia de gibón (GaLV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Una serie de vectores retrovirales pueden incorporar múltiples genes. Son de destacar vectores humanos basados en lentivirus que demuestran la expresión a largo plazo de transgenes en células hepáticas y musculares (Kafri T. y col., Nature Genetics 17(3):314, 19997, incorporado en el presente documento mediante referencia). Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador selecionable de forma que las células transfectadas se identifiquen y se generen.

Dado que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren ayuda para producir partículas de vectores infecciosas. Esta ayuda se proporciona usando líneas de células auxiliares que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus (genes gag, env y pol) bajo el control de secuencias reguladoras dentro de la repetición terminal larga (LTR). Estos plásmidos carecen de una secuencia de nucleótidos que permite que el mecanismo de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para la encapsidación. Las líneas de células auxiliares, que tienen deleciones de la señal de empaquetamiento incluyen, pero no se limitan a \Psi2, PA317, PA12, CRIP, CRP-4 y CRE, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, dado que no hay genoma empaquetado. Si se introduce un vector retroviral en tales células, en el que la señal de empaquetamiento está intacta pero los genes estructurales se han sustituido por otros genes de interés, el vector se empaqueta y se produce el virión del vector. Los virioines de vectores producidos mediante este procedimiento se pueden usar entonces para infectar una línea celular para producir grandes cantidades de viriles retrovirales quiméricos.

La línea celular de la presente invención tiene la ventaja distintiva frente a líneas celulares de hepatocitos previamente descritas de que sus células están bien diferenciadas y se pueden cultivar en medio exento de suero. Como consecuencia, las células C3A exentas de suero poseen actividad biológica hepática específica constitutiva y la conservan después de haber alcanzado la confluencia. El término "constitutiva" tal como se usa en el presente documento se refiere al hecho de que las células C3A exentas de suero poseen normalmente actividad biológica hepática específica sin requerir ninguna forma particular de inducción. El término "actividad biológica hepática específica" tal como se usa en el presente documento se refiere a reacciones fisiológicas/bioquímicas que tienen lugar específicamente en hepatocitos normales. Las células de la presente invención también poseen, expresan y mantienen estas reacciones fisiológicas/bioquímicas hepáticas específicas. Además, al usar "actividad biológica hepática específica" en el presente documento se incluye la síntesis y secreción de proteína y productos de bajo peso molecular que se ven en hepatocitos normales. Adicionalmente, las células de la invención mantienen la expresión de funciones biológicas específicas hepáticas a niveles suficientes para mantener a un sujeto del que se sospecha que tiene una dolencia hepática o en fallo hepático o que sufre un trastorno provocado o exacerbado por una función hepática comprometida.

Los hepatocitos normales realizan múltiples funciones cuidadosamente ajustadas críticas para el funcionamiento hepático y la homeostasis del organismo. Los hepatocitos combinan rutas para la síntesis y degradación simultáneas de carbohidratos, lípidos, aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y coenzimas. Las funciones "hepáticas específicas" clave incluyen: (1) gluconeogénesis, (2) síntesis, almacenamiento y degradación de glucógeno, (3) síntesis de proteínas séricas incluyendo albúmina, hemopexina, ceruloplasmina, los factores de coagulación sanguíneos (incluyendo los factores V, VII, X, protrombina y fibrinógeno), cyl-antitripsina, antitrombina III y AFP, (4) conjugación de ácidos biliares, (5) conversión de hemo a pigmentos biliares, (6) síntesis de lipoproteínas, (7) almacenamiento y metabolismo de vitaminas, (8) síntesis de colesterol, (9) metabolismo del amoniaco, incluyendo la síntesis de urea y la síntesis de glutamina, (10) metabolismo de aminoácidos, incluyendo la conversión metabólica y la reutilización de aminoácidos aromático y (11) detoxificación y metabolismo de fármacos.

Dado que el 20% del consumo corporal de oxígeno se debe al hígado, los cultivos que usan células de la presente invención requieren una adecuada oxigenación para mantener una actividad biológica hepática específica de alto nivel. La circulación constante de medio oxigenado cubre las necesidades metabólicas de las células (Wofle, D. y col., Eur. J. Biochem. 151:299-303 (1985)). Un suministro adecuado de oxígeno también estimula las funciones de crecimiento y diferenciación. El crítico papel del oxígeno en el metabolismo hepático está bien documentado en la bibliografía dedicada al hígado de rata aislado prefundido (IPRL), pero su papel ha sido ignorado en gran medida en la bibliografía dedicada al cultivo celular. Por ejemplo, los cultivos convencionales de células HepG2/C3 o HepG2/C3A a menudo son limitados en oxígeno y por lo tanto en energía. Se requiere una capacidad de transporte de oxígeno adicional en el cultivo o uso de células de la invención, se proporciona el uso de glóbulos rojos o hemoglobina disuelta, como se ha descrito para órganos prefundidos (Gores, G.J. y col., Hepatology 6:511-517, 1986).

Para determinar si las células C3A exentas de suero están expresando y manteniendo una actividad metabólica hepática específica apropiada, se deben ensayar las funciones metabólicas de las células, incluyendo un ensayo de su dependencia de oxígeno, su capacidad para sintetizar glucosa y urea, su capacidad para captar y conjugar bilirrubina y su capacidad para producir factores de coagulación. Se recomienda especialmente el ensayo cuando las células C3A exentas de suero se van a usar en un dispositivo hepático bio-artificial.

La dependencia del oxígeno se ensaya examinando la tasa de crecimiento de las células exentas de suero en un cultivo que está prefundido continuamente con concentraciones crecientes de oxígeno disuelto (es decir, sobre intervalos de oxígeno disuelto desde aproximadamente 4% a aproximadamente 20%). Preferiblemente, la tasa de crecimiento celular se examina en medio exento de suero que contiene altas concentraciones de glucosa o en medio exento de suero que está exento de glucosa (con lactato y aminoácidos como única fuente de carbono). Otros indicadores de la actividad metabólica son el consumo de oxígeno total, la carga energética, el estado redox y la relación de glucosa a consumo de oxígeno. Preferiblemente, estos ensayos también deberían llevarse a cabo a diferentes concentraciones de oxígeno disuelto como se ha descrito anteriormente.

Dado que la síntesis de glucosa y de urea son los principales medios de eliminar los aminoácidos en exceso y el amoniaco de la sangre, las células de la invención se deberían ensayar respecto a su capacidad de sintetizar ambas, especialmente cuando las células de la invención se usan para realizar funciones específicas hepáticas. Los procedimientos par ensayar la síntesis de glucosa y de urea son bien conocidos (Kershcer y col., en Methods of Enzymatic Análisis, H.U. Bergmyer, ed. Current ed., Verlag Chemie, Weinheim, Vol. VII, págs. 59-67; 1983).

La producción de varios factores de coagulación dependientes de vitamina K, incluyendo protrombina, factores VII, IX y X, así como antitrombina III también se determinan fácilmente usando procedimientos habitualmente conocidos que incluyen, entre otros, procedimientos tales como radioinmunoensayo en fase sólida (Nelly y col., In vitro Cell Dev. Biol. 25:217-222 (1987)) y procedimientos que usan anticuerpos obtenidos comercialmente (DAKO inc.).

Cuando se cultivan células de la invención sobre una membrana o en un dispositivo hepático bio-artificial, proporcionan un útil modelo in vitro para estudiar todas las funciones hepáticas humanas, incluyendo, pero sin restringirse al funcionamiento del órgano completo, celular, metabólico y molecular. Las células también son útiles para estudios de: (1) metabolismo, (2) toxicología de fármacos u otras composiciones farmacológicas, (3) enfermedad entérica, (4) expresión génica o regulación génica específicas del hígado y (5) técnicas de suministro de genes (por ejemplo, suministro de genes a hepatocitos usando un receptor de asialoglucoproteína, Wu y col., Procedimiento. Assoc. Am. Physicians 107:2 211-7 1995).

Las células de la invención presentan ventajas sobre otros sistemas, tales como la del hígado de rata aislado prefundido (IPRL). Al ser un cultivo permanente, la línea celular exenta de suero permite llevar a cabo estudios rigurosos a largo plazo. Los cultivos monocapa que usan células exentas de suero de la invención normalmente se mantienen durante varios meses y un dispositivo hepático bio-artificial preparado con estas células funciona normalmente a lo largo de un periodo prolongado (por ejemplo, ocho semanas), como se determina mediante la producción de albúmina y la utilización de glucosa. Además, los cartuchos que contienen células cultivadas de la invención reflejan el metabolismo hepático humano de forma más precisa que los hígados aislados prefundidos de otras especies. Por lo tanto, los efectos clínicos de varios fármacos, compuestos o metabolitos se evalúan en un modelo in vitro particularmente efectivo cuando se usan células de la invención.

Por ejemplo, en una forma de realización particular, se llevan a cabo estudios sobre el metabolismo y la toxicología de la cocaína tales como el metabolismo hidrolítico de la cocaína en benzoilecgonina, éster metílico de ecgonina y ecgonina, como describieron Falk y col. (J. Pharmacol. Toxicol. Methods 33:2 113-20, 1995) y estudios del metabolismo de agentes anticancerosos tales como crisnatol como describieron Patel y col. (Biochem. Pharmacol. 42:2 337-46, 1991) en un modelo in vitro de este tipo empleando células de la invención. También se contemplan estudios metabólicos, farmacológicos o toxicológicos adicionales que implican otros compuestos xenobióticos o agentes patológicos y se engloban dentro de las metas y límites de la presente invención. En otra forma de la invención se usan células C3a exentas de suero de la invención para la búsqueda selectiva de compuestos metabólicos o productos secundarios, identificando composiciones que les afectan. Este procedimiento comprende incubar las composiciones de las que se sospecha que afectan a la función hepática o a los hepatocitos con células C3A exentas de suero en condiciones suficientes para permitir que interactúen los componentes, después medir a continuación el efecto que la composición sospechosa tiene sobre las células de la invención. La aparición de una respuesta biológica se monitoriza usando técnicas convencionales. Por ejemplo, muchas respuestas biológicas se identifican usando el nivel de expresión de ciertos genes en la célula C3A exenta de suero después de la incubación. Tales genes pueden incluir genes de respuesta temprana tales como fos, myc o jun (Greenberg, Met y Ziff, E. Nature, 311:433,1984, eds. Burck y col. en Oncogenes, 1988, Springer-Verlag, Nueva York). Se conocen otros genes útiles para estudios de este tipo. Las técnicas que miden el efecto de tales composiciones incluyen el análisis por inmunotransferencia de Northern de ARN (transcripción), análisis de SDS-PAGE de proteínas (traducción), captación de timidina tritiada (síntesis de ADN) y reactividad de anticuerpos (tanto intracelular como extracelular).

Tal como se ha descrito anteriormente, las células de la presente invención expresan "actividad biológica hepática específica" incluyendo la capacidad de realizar el metabolismo de amoniaco y aminoácidos, detoxificación y producción de polipéptidos, especialmente de polipéptidos tales como factores de coagulación. El hecho de realizar funciones hepáticas específicas es particularmente importante cuando las presentes células se usan en un dispositivo hepático bio-artificial. Un dispositivo de este tipo se usa para tratar a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene una dolencia hepática, un trastorno relacionado con el hígado o función hepática comprometida resultante de una enfermedad o un traumatismo (por ejemplo, fallo hepático fulminante (FHF) a la espera de un trasplante de hígado o después de rechazar un hígado y a la espera de un trasplante hepático). El término "tratar" o "tratamiento", tal como se usa en el presente documento, comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de sangre que ha estado en contacto con células exentas de suero de la invención durante un periodo suficiente para limpiar la sangre antes de devolverla al sujeto. El término "limpiar" o "limpia", tal como se usa en el presente documento, significa la eliminación de moléculas no deseadas o no deseables de la sangre del sujeto. Además, el término "limpiar" o "limpia" incluye además la liberación de moléculas deseadas a partir de células de la invención a la sangre antes de devolverla al sujeto. El término "terapéuticamente eficaz", tal como se usa en el presente documento, incluye la capacidad de mejorar los efectos de un trastorno hepático o función hepática comprometida en un sujeto que responde al tratamiento usando células de la invención. El término "mejorar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a mitigar la dolencia del sujeto que responde al tratamiento. EL sujeto del tratamiento es preferiblemente un ser humano, no obstante, se contempla que se trate cualquier animal con un trastorno hepático, dolencia hepática o función hepática comprometida usando células C3A exentas de suero.

El fallo hepático fulminante es una disfunción hepatocelular normalmente provocada por hepatitis vírica, reacciones a fármacos o envenenamiento, en la que aparece normalmente encefalopatía en el transcurso de ocho semanas desde la aparición de los síntomas (Bernau, J. y col, Sem. Liv. Dispositivo. 6:97-106 (1986), Yanda R. J. West. J. Med. 149-586-591 (1988), Katelaris, P. H. y col, Med. Clinics N. AMER. 73:955-970 (1989)). El tratamiento del FHF u otra dolencia hepática implica el cultivo de células de la invención en un dispositivo hepático bio-artificial y la limpieza de la sangre de un sujeto. Los niveles de actividad biológica hepática específica eficaces para tratar o mejorar a un sujeto que sufre FHF, fallo hepático o función hepática comprometida son aquellos que dan como resultado niveles normales o próximos a los normales de proteínas séricas, factores de coagulación, aminoácidos y otros metabolitos que produce o metaboliza normalmente el hígado. Estas varias moléculas y productos metabólicos y los intervalos fisiológicos así como patológicos de sus concentraciones o niveles son bien conocidos y se detallan en Braunwald, E. y col. eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, Current Ed. McGraw Hill Nueva York, N.Y., incorporado mediante referencia en el presente documento.

Las propiedades hepáticas específicas de la línea celular C3A exenta de suero la hacen particularmente útil en un dispositivo hepático bio-artificial superando los problemas de otras células usadas en tales dispositivos. Las células C3A exentas de suero son permanentes, capaces de copiar las funciones biológicas vitales del hígado y bien diferenciadas. Cuando se usan en un dispositivo hepático bio-artificial, las células son capaces de expresar actividades biológicas hepáticas específicas a un nivel eficaz para mantener a un sujeto con fallo hepático o función hepática comprometida durante largos periodos. Por lo tanto, las células C3a exentas de suero de la presente invención proporcionan un procedimiento para mantener la función hepática. Esto proporciona el tiempo suficiente para que se produzca la regeneración del hígado, así como también proporciona un mejor entorno para la regeneración del hígado eliminando toxinas circulantes. Además, en aquellos sujetos cuyos hígados no son capaces de regenerarse, se mantienen con vida mientras que esperan el trasplante. El procedimiento de usar células C3A exentas de suero en un dispositivo hepático bio-artificial también proporciona un medio para permitir la recuperación de sujetos después de un fallo hepático antes del trasplante de un primer hígado. También, en aquellos sujetos que requieren segundos trasplantes de emergencia, la disponibilidad de un dispositivo hepático bio-artificial les permite recuperarse entes de ser sometidos a una segunda operación quirúrgica importante.

Cuando se requiere, las células C3A exentas de suero se manipulan genéticamente para contener una secuencia de ácido nucleico heterólogo (como se ha descrito en el presente documento) cuya expresión y posterior funcionamiento serán particularmente beneficiosos para un sujeto que tiene un trastorno hepático o que sufre de función hepática comprometida. Las membranas o capilares de un dispositivo hepático bio-artificial permiten la limpieza de la sangre al permitir el paso de solutos tóxicos de la sangre a las células cultivadas en el dispositivo (por ejemplo, especies moleculares disueltas tales como bilirrubina difunden a través de la membrana y son captadas y metabolizadas) así como al permitir la difusión de metabolitos vitales desde las células cultivadas en el dispositivo a la sangre que vuelve al sujeto sometido al tratamiento. El carácter selectivamente permeable o semipermeable de la membrana de un dispositivo hepático bio-artificial proporciona también una barrera mecánica a componentes del sistema inmune de la sangre de un sujeto que usa el dispositivo. Normalmente, la membrana o capilar presenta un límite de exclusión de peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons a aproximadamente 80.000 daltons, generalmente aproximadamente 30.000 a aproximadamente 50.000. En una forma de realización preferida, no obstante, la membrana tiene poros de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 0,3 \mum de diámetro, normalmente de aproximadamente 0,2 \mum. Un tamaño de diámetro de poro en este intervalo excluye elementos celulares a la vez que permite que pasen proteínas y complejos proteicos a su través, mejorando de esta forma deficiencias de proteínas séricas de un sujeto que sufre una dolencia hepática.

Tales dispositivos, sus procedimientos, uso y mecanismos de acción son habitualmente conocidos para una persona experta habitual en la materia. Cualquier dispositivo de este tipo - varios diseños de los cuales están descritos en la bibliografía - que sea capaz de cultivar células vivas se contempla que se use con células de la invención. Por ejemplo, se describen dispositivos biológicos hepáticos artificiales en Viles y col (patentes de EE.UU nº 4.675.002 y 4.853.324), Jaureguin (documento GB 2.221.857A), Wolf y col (International J. of Artificial Organs 2:97-103, 1979), Wolf y col. (International J. of Artificial Organs 1:45-51, 1978) y Ehrlich y col (In Vitro 14:443-450, 1978), todos los cuales se incorporan en el presente documento mediante referencia. En una forma d realización preferida, el dispositivo hepático bio-artificial incluye un cartucho de fibra hueca o aparato de perfusión similar que tiene una membrana o capilar como se ha mencionado anteriormente.

En otra forma de realización, se puede utilizar también un biorreactor, tal como un biorreactor de fibra hueca como un dispositivo hepático bio-artificial permitiendo que las células de la invención funcionen como un hígado prefundido. Los biorreactores que emplean cartuchos o dispositivos de perfusión similares capaces de cultivar grandes números de células, pueden reemplazar la actividad biológica hepática específica o permitir la evaluación precisa del metabolismo hepático humano (como se ha mencionado anteriormente). Los cartuchos de fibra hueca son unidades de dos cámaras que reproducen las características tridimensionales de órganos normales (Knazek, R. H. Feder. Proc. 33:1978-1981 (1974), Ku K. y col. Biotechnol. Bioeng. 23:79-95 (1983), incorporados en el presente documento mediante referencia). El medio de cultivo o de crecimiento se hace circular a través del espacio capilar y a las células de la invención - cultivadas en el espacio extracapilar después de su siembra - se les suministra un flujo de entrada de medio fresco constante (Tharakan J. P. y col, Biotechnol. Bioeng. 28:1605-1611 (1986). Normalmente, se inoculan cartuchos de 1400 cm^{2} con un número efectivo de células (por ejemplo, aproximadamente 1 x 10^{9} células) y se cultivan hasta la confluencia en aproximadamente 14 a aproximadamente 21 días. Tales sistemas de cultivo de fibra hueca son bien conocidos (por ejemplo, Heifetz y col. BioTechniques 7:199, 1989, Donofrio D., AMER. Biotech. Lab Sept. 1989, publicación nº 940, incorporada mediante referencia en el presente documento) y disponibles comercialmente (por ejemplo, la serie Anchornet).

Los sistemas basados en fibra hueca ofrecen varias ventajas cuando se usan en un dispositivo hepático bio-artificial. Los cartuchos apoyan el crecimiento de cultivos de muy alta densidad. Basándose en el volumen extracapilar, se cultivan 15 a 20 g de células en una unidad de 1400 cm^{2} y 100 g de células en una unidad de 7000 cm^{2}. Esta cantidad de masa celular es capaz de proporcionar apoyo hepático a un sujeto que sufre fallo hepático. También, las células cultivadas en cartuchos están polarizadas y su crecimiento se aproxima a la estructura del hígado normal. Las células reciben nutrientes desde el espacio capilar y secretan productos de desecho en el espacio extracapilar. El espacio extracapilar se perfunde para prevenir la acumulación de productos tóxicos. El flujo continuo de medio y el oxigenador en línea proporciona un suministro de oxígeno y energía más constante.

En la mayoría de las ocasiones, los dispositivos biológicos hepáticos artificiales que se contempla que se usen con las células de la invención procesan sangre principalmente adjuntándose a un sujeto en el exterior del cuerpo (por ejemplo, normalmente estableciendo una comunicación fluídica desde el dispositivo hasta el suministro de sangre del sujeto normalmente entre una arteria y una vena). Una disposición de este tipo es particularmente útil para proporcionar un apoyo hepático temporal para sujetos que sufren un trastorno hepático (por ejemplo, FHF). Como alternativa, la línea celular usada en el interior del cuerpo como un hígado biológico artificial o como un apoyo hepático biológico artificial. Cuando se usan de esta forma, las células de la invención se encapsulan o se cultivan en membranas capilares de fibra hueca para su uso interno. Normalmente, las células se fijan al soporte cuando crecen. No obstante, se pueden proporcionar materiales de fijación, como pensaron Cai y col (Artificial Organs 12:338-393), Sun y col (Trans Am. Soc. Artif. Intern. Organs. Vol. XXXII: 39-41), O'Shea y col. (Biochimica Biophysica Acta 804:133-136, 1984), Sun y col. (J. Controlled release 2:137-141, 1985) y patente de EE.UU. nº 4.391.909, todos los cuales se incorporan en el presente documento mediante referencia.

Las células encapsuladas y cápsulas de vehículo se inyectan entonces por vía intraperitoneal al sujeto.

Adicionalmente, las células de la invención se pueden usar en un tejido similar a hepático sintético que comprenda fibroblastos y hepatocitos C3a de la invención. Normalmente, el cocultivo de fibroblastos y hepatocitos no adopta automáticamente la disposición que se encuentra normalmente en el hígado, y dado que los dos tipos de células se comunican mal entonces, los hepatocitos son a menudo funcionalmente ineficaces. No obstante, Toner y col, (Fall Meeting of the Materials Research Association, 1-5 de diciembre de 1997, Nature, 39:128, 1988) describen la impression de un sustrato (por ejemplo, torta de borosilicato) usando técnicas fotolitográficas convencionales de tecnología microelectrónica con películas con patrones de colágeno, lo cual promueve la adhesión celular. Los hepatocitos de la invención se pueden cultivar entonces sobre superficies de este tipo, adhiriéndose únicamente a las regiones recubiertas de colágeno. A continuación se introducen los fibroblastos sobre las regiones de superficie desnuda, produciendo una mezcla íntima de los dos tipos de células en un patrón periódico que permite cualquier proporción de tipos celulares, permitiendo el ajuste a cualquier valor fisiológico. Usando esta técnica se puede deducir cualquier patrón, tamaño, forma y densidad numérica y manipular pata ordenarlos en un tejido hepático artificial de este tipo.

Sin mayor elaboración, se cree que una persona experta habitual en la materia puede, usando la descripción anterior, utilizar la presente descripción en su mayor amplitud. Los siguientes ejemplos se mencionan únicamente para el propósito de ilustrar, para preparar y usar las células o líneas celulares de la presente invención y no se pretende, ni se debe considerar que limiten el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A no ser que se indique lo contrario a continuación, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peo molecular medio en peso, las temperaturas están en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Ejemplo 1 Generación de un clon C3A exento de suero

Se ensayaron siete formulaciones comerciales exentas de suero y una formulación exenta de suero a medida (Hepatix Inc.) respecto a su capacidad de mantener el crecimiento consistente de células C3A durante el paso al estado independiente de suero:

(1) medio ExCell 620 de JRH Biosciences (producto nº 14620-79P) suplementado con L-glutamina 2 mM

(2) hepatozyme-SFM de Gibco (nº de catálogo 17705-021) suplementado con L-glutamina

(3) medio Aim V de Gibco (catálogo nº 12055-091)

(4) medio HyQ-CCM 4 de HyClone (nº de catálogo SH30106.02)

(5) medio IS293 de Irvine Scientific (nº de catálogo 99269)

(6) medio de mantenimiento para hepatocitos de Clonetics (nº de catálogo CC-3197) suplementado con insulina y dexametasona

(7) medio para hepatocitos prototipo de BioWhittaker (ref \sim 97-0454) suplementado con glucagón, insulina, dexametasona, selenita de sodio, triyodotironina (T3) y ácido linoleico / albúmina de suero bovino (suplementos Hepatix) y

(8) una formulación de medio exenta de suero de Hepatix consistente en 25% de medio Waymouth MAB 67/3 (catálogo de Gibco nº 86-5124 EL) y 75% de medio mínimo esencial (catálogo de Gibco nº 41500-018), suplementado con glucagón, insulina, dexametasona, selenita de sodio, triyodotironina (T3) y ácido linoleico / albúmina de suero bovino.

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Se tripsinizó un matraz confluente de células C3A, a continuación se neutralizó añadiendo medio completo que contenía suero (suero bovino fetal al 5%) (medio MM de Hepatix Inc. de HyClone, nº de catálogo SH3A323.01). Las células se dispusieron después en alícuotas a 5 x 10^{6} células viables por alícuota y se volvieron a centrifugar (1000 rpm) durante 5 minutos a 25ºC. Cada pella generada mediante el procedimiento se resuspendió en una mezcla al 50:50 de medio Hepatix MM que contenía suero y uno de los ocho medios exentos de suero enumerados anteriormente. Se dejaron crecer los cultivos celulares y se mantuvieron durante una semana (tres alimentaciones igualmente espaciadas) con la mezcla de medio 50:50 correspondiente apropiada.

En la confluencia, las células se volvieron a tripsinizar, se dividieron (relación 1:8) y se transfirieron en medio de cultivo tal como se ha descrito salvo porque se redujo la porción que contenía suero del medio (por ejemplo, del 50% a mezcla al 25:75, con contenido en suero:exento de suero). Las células se alimentaron y se mantuvieron como anteriormente.

Durante el tercer paso en la mezcla de medio con contenido en suero y medio exento de suero se cosecharon células de cada cultivo y se transfirieron a un medio exento de suero (uno de los ocho medios exentos de suero enumerados anteriormente). Las células se pasaron cuatro veces en las condiciones de cultivo descritas anteriores. Las células en medio Hepatozyme-SFM de Gibco y HyQ-CCM exentos de suero (n^{os} 2 y 4) exhibían un aspecto redondeado que se atribuyó a una pérdida de adherencia a la superficie.

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Ejemplo 2 Tasas comparativas de crecimiento de un clon C3A en diferentes medios exentos de suero

Después de cuatro pasos en medio 100% exento de suero, se llevó a cabo un análisis de tasa de crecimiento en células de cada uno de los ochos cultivos. Se evaluó la tasa de crecimiento usando el sistema de ensayo Promega MTS en los medios nº 1, 3 y 5 (respectivamente, ExCell 620 de JRH de Biosciences suplementado con L-glutamina 2 mM, Aim V de Gibco e IS293 de Irving Scientific). Se determinó que el crecimiento más consistente era el de células mantenidas en medio nº 1 (ExCell 620 de JHR Biosciences). En cnsecuencia, este medio se empleó a continuación para producir aislados clónicos de las células exentas de suero.

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Ejemplo 3 Generación de colonias celulares clónicas de C3A

Se generaron clones mediante dilución limitante (2,5 células por pocillo en medio exento de suero ExCell 620 de JHR Biosciences (JRH-SFM)) en una placa de 96 pocillos. Usando esta estrategia se iniciaron, cosecharon, expandieron y crioconservaron después doce clones separados. De los doce aislados clónicos, se escogió un clon (designado como 2.5B1) para su posterior desarrollo.

El clon 2.5B1 en el paso 0 (P0) se cosechó 21 días después de disponerlo en placas. Se volvió a disponer en placas (placa de cultivo tisular de 96 pocillos) durante 4 días (P1), se tripsinizó y se sembró en un matraz T25 (P2) para su expansión en JRH-SFM (nº 1). Doce días después se cosechó, se volvió a disponer en placas en otro matraz T25 (P3) durante 2 días, se dividió a continuación (1:3) en un matraz T75 (P4), se dividió después (1:8) aproximadamente cada siete días con tres alimentaciones semanales de JRH-SFM. El cultivo clónico de 2.5B1 se pasó con éxito 14 veces con más de 30 duplicaciones poblacionales desde P2.

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Ejemplo 4 Caracterización de colonias celulares clónicas de C3A

Una caracterización de la colonia clónica exenta de suero 2.5B1 midió las tasas de secreción de dos proteínas humanas (es decir, fetoproteína alfa humana (AFP) y albúmina humana) que se expresan en células del clon. Los resultados de la medición se ilustran en la tabla 1. Los datos demuestran que aproximadamente 27,5 x 10^{6} células generadas a partir del clon 2.5B1 produjeron una media de 390 \mug de albúmina y 96 \mug de AFP en un periodo de 24 horas (n = 6).

TABLA 1

1

La caracterización adicional de la expresión de proteínas de estas células usando técnicas de inmunotransferencia de Western demostró que en el paso 11 (P11), las células C3a exentas de suero expresan los siguientes polipéptidos recuperables: (1) antiquimiotripsina alfa-1, (2) antitripsina alfa-1, (3) antitrombina III, (4) complemento C3, (5) factor V y (6) transferrina (Fig. 1, inmunotransferencia de Western con geles PAGE con SDS al 10%).

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Ejemplo 5 Comparación de la tasa de crecimiento de células C3A clónicas con la tasa de crecimiento de células C3A parentales

Para determinar si el paso y la derivación clónica de las células C3A parentales a la independencia de suero comprometía su viabilidad o su capacidad para crecer y mantenerse, se comparó la tasa de crecimiento de las células 2.5B1 exentas de suero con la tasa de crecimiento de células de la línea C3A parental usando medio JRH-SFM. Los resultados (Fig. 2) demuestran que las células 2.5B1 tienen una tasa de crecimiento mayor y un tiempo de duplicación significativamente más corto que las células C3A parentales. Los datos indican un tiempo de duplicación de aproximadamente 24 horas para las células del clon 2.5B1 mientras que el tiempo de duplicación de la línea celular C3A parental era de aproximadamente 35 horas. Por lo tanto, el tiempo de duplicación de las células de la invención en medio exento de suero es menos de aproximadamente 70% del tiempo de duplicación en medio exento de suero de células de la línea celular C3A correspondiente.

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Ejemplo 6 Las colonias de células clónicas C3A exentas de suero exhiben un perfil de crecimiento normal

Se demostró la normalidad y la viabilidad del clon 2.5B1 examinando su perfil de crecimiento. Se sembraron células del clon 2.5B1 sobre un cartucho Althin (unisyn CP-3000) como se ha descrito anteriormente y se cultivaron durante nueve días. Los resultados (tabla 2) indican un crecimiento y un perfil metabólico normales.

TABLA 2

2

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Ejemplo 7 Determinación del metabolismo en colonias de células C3A exentas de suero

Para evaluar la viabilidad de usar las células C3A exentas de suero (clon 2.5B) como sustituto de hepatocitos, se determinan fácilmente varios procesos metabólicos críticos requeridos. Los experimentos pueden medie si las células metabolizan aeróbica o aneróbicamente en condiciones de cultivo celular convencionales.

Las determinaciones iniciales miden la utilización de glucosa en monocapas simples para determinar la concentración de glucosa (por ejemplo, a lo largo de un periodo de 24 horas). Se examina la utilización de glucosa en condiciones normales o en medios previamente oxigenados. Para determinar si un exceso de utilización de glucosa se debe a que las células no pueden metabolizar piruvato a través del ciclo del ácido cítrico, se llevan a cabo experimentos similares en presencia de ácido nitropropiónico (NOP). NOP es un estado de transición análogo al succinato que inactiva de forma irreversible la succinato deshidrogenasa, impidiendo la utilización del ciclo del ácido cítrico (Alston, T.A. y col, Procedimiento. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:3767-3771 (1977)). La adición de NOP es ineficaz en condiciones de hipoxia dado que el ciclo del ácido cítrico no está activo. En cultivos oxigenados, no obstante, NOP cambia la curva de utilización de glucosa haciendo que se parezca a una curva hipóxica. Una variable fundamental a la hora de evaluar la actividad metabólica de las células es asegurar que la ruta metabólica no está limitada en oxígeno, y con ello limitada en energía. El grado en el que las células cultivadas puedan estar limitadas en oxígeno no se aprecia ampliamente. La síntesis de glucosa y urea a partir de lactato se ensayan en matraces en forma de T en ausencia de oxígeno añadido.

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Ejemplo 8 Determinación de la actividad de gluconeogénesis en células C3A exentas de suero^{*}

La síntesis de glucosa a partir de lactato o aminoácidos es una función metabólica principal específica hepática. El ácido oleico estimula la producción de glucosa dado que los ácidos grasos suministran energía para el proceso mientras que el lactato suministra el carbono. Las tasas de síntesis de glucosa se miden para determinar si la tasa de síntesis de glucosa en células C3a exentas de suero es similar a la tasa de síntesis de glucosa en un hígado de rata prefundido o en hepatocitos de rata aislados (Krebs, H.A. y col, págs. 269-291 (1976)). La determinación de esta tasa es una medida del flujo de energía a través de una ruta enteramente específica del hígado, no simplemente una medida a nivel de una única enzima. Una medida de este tipo indica si se expresan adecuadamente y se regulan apropiadamente enzimas críticas gluconeogénicas, piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa y fructosa difosfatasa en células C3A exentas de suero.

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Ejemplo 9 Determinación de la síntesis de glucógeno usando células C3A exentas de suero

Newgard y col (Biol. Cehm 258:8046-8052 (1983)) usaron una técnica de marcado doble, cuantificando el porcentaje de la glucosa administrada que pasaba en primer lugar a través de la ruta glucolítica antes de su deposición como glucógeno para demostrar que la administración de glucosa a ratas en ayunas daba como resultado primero una degradación a piruvato y luego posteriormente en la síntesis de nuevo a glucógeno, no como se esperaba en la síntesis de nuevo a glucógeno directamente. Teniendo en cuenta estos descubrimientos, sigue existiendo la cuestión relativa a la localización del sitio inicial del metabolismo de la glucosa en tales condiciones (la glucosa puede utilizarse en primer lugar por un tejido periférico tal como el músculo y luego enviarse de nuevo al hígado en forma de lactato para que se sintetice en gluocosa-6-fosfato y glucógeno, o, como alternativa, la glucosa se puede utilizar de forma diferencial por diferentes zonas metabólicas en el interior del hígado).

Para determinar la localización del sitio inicial del metabolismo de la glucosa en tales condiciones, se pueden llevar a cabo estudios de marcado doble similares a los de Newgard y col. usando células C3A exentas de suero de la invención. Tales estudios demuestran si el hígado es capaz de realizar todas estas interconversiones metabólicas. Cuando se administran simultáneamente ^{14}C-glucosa y ^{3}H-agua con una gran cantidad de azúcar no marcada, la mayoría de esta glucosa se puede degradar en primer lugar mediante la glucolisis y luego sintetizarse de nuevo en glucógeno, indicado por la cantidad de ^{3}H encontrada en el glucógeno. La glucosa que ha pasado a través de la glucolisis y se ha vuelto a sintetizar tendrá mucho más ^{3}H incorporado que la glucosa que se utiliza directamente. Cuando se administran glucosa marcada y ^{3}H-agua durante periodos de tiempo variables después del bolo inicial de glucosa, pasan cantidades decrecientes del carbohidrato a través de la glucolisis antes de su deposición en glucógeno, indicado por una cantidad en disminución de ^{3}H en relación a ^{14}C. tales resultados indicarían que la glucolisis y la gluconeogénesis están activas simultáneamente, pero, con la adición de glucosa hay un cambio gradual hacia la síntesis directa de glucógeno.

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Ejemplo 10 Determinación del metabolismo del nitrógeno usando células C3A exentas de suero

El hígado es el principal órgano para la eliminación de amoniaco y otros compuestos que contienen nitrógeno, y el desequilibrio de nitrógeno es uno de los problemas metabólicos más graves a los que se enfrenta un sujeto que sufre un trastorno hepático. Por lo tanto, la capacidad de las células C3A exentas de suero de llevar a cabo funciones hepáticas se determina midiendo su capacidad de sintetizar urea a partir de lactacto y cloruro de amonio. La tasa de síntesis de urea resultante se compara con tasas establecidas de medidas usando hígados de rata prefundidos y hepatocitos aislados (Krebs, H.A. y col., págs. 269-291 (1976)).

Un ensayo del metabolismo del nitrógeno incuba células C3A exentas de suero con una muestra de suero de un paciente que sufre un trastorno hepático (por ejemplo, FHF). Se pueden usar entonces células HeLa o HepaSK como control para la capacidad de metabolizar compuestos de nitrógeno. El suero de FHF contiene normalmente niveles elevados de amoniaco y aminoácidos, notablemente fenilalanina y ornitina. El tratamiento de este suero con 0,5 g de células C3A exentas de suero durante 3 horas mide la capacidad de devolver el amonio niveles por debajo de los normales, aumentar la urea y reducir los niveles de aminoácidos. La degradación de fenilalanina (a través de tirosina bajo la acción de fenilalanina hidroxilasa) puede descender drásticamente ajo un tratamiento de este tipo. La fenilalanina hidroxilasa es dependiente de la tetrahidrobiopterina reductasa para suministrar coenzima para la reacción.

Este ensayo también mide el flujo a través de una ruta específica del hígado indicando que las células C3A exentas de suero pueden lograr un metabolismo de hepatocitos normales.

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Ejemplo 11 Determinación del crecimiento de células C3A exentas de suero en cartuchos de fibra hueca

Los dispositivos de fibra hueca para el cultivo celular se han usado principalmente para el cultivo de hibridomas en la producción de anticuerpos monoclonales (Heifetz, A.H. y col., Bio Techniques 7:192-199 (1989)). Dado que estos dispositivos están equipados con un sistema de oxigenación en línea, se espera que las células C3A exentas de suero rendirán mejor cuando se cultiven en el dispositivo de fibra hueca (por ejemplo, un cartucho Amicon FloPath 1400) que en cultivo estático. Los dispositivos de fibra hueca tienen una ventaja adicional de imitar la arquitectura tridimensional del hígado normal.

La utilización de glucosa y la producción de albúmina se monitorizan diariamente. El cartucho se inocula con aproximadamente 1 x 10^{9} células. Dado que actualmente no existe ningún procedimiento para evaluar de forma precisa el número de células que residen en un cartucho después que los niveles de producción descienden mientras se mantiene el cultivo, se debe realizar una estimación (asumiendo que el especio extracapilar del dispositivo está completamente ocupado (\approx 20 ml), el número máximo de células se calcula a aproximadamente 20 x 10^{9}, o 20 g en peso).

En condiciones de cultivo normales en matraces T o placas de múltiples pocillos (que pueden estar limitadas en oxígeno como se ha discutido anteriormente), las células C3A exentas de suero pueden producir aproximadamente 390 \mug de albúmina/24 horas en un cultivo en confluencia. Las células C3A exentas de suero cultivadas en un cartucho de fibra hueca como se ha descrito anteriormente pueden superar esta cantidad. El aumento predicho en el rendimiento de albúmina se atribuye a las condiciones de cultivo fisiológicas más similares a las hepáticas usando un dispositivo de fibra hueca.

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Ejemplo 12 Un modelo animal para el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno hepático o función hepática comprometida usando células C3A exentas de suero en un dispositivo hepático bio-artificial

Las células C3A exentas de suero se pueden usar en un modelo animal predictivo de sujetos humanos tratados para un trastorno o dolencia hepática usando metodología similar. Las células exentas de suero se cultivan a altas densidades en cartuchos de fibra hueca u otro dispositivo hepático bio-artificial, como se ha descrito anteriormente. Esto permite que las células funcionen de forma similar a un hígado humano prefundido. En los experimentos que imitan a sujetos que sufren un trastorno hepático grave (por ejemplo, FHF) se usa un dispositivo hepático bio-artificial preparado de esta forma usando procedimientos descritos en el presente documento. Los trastornos hepáticos se modelizan en animales a los que se les ha inyectado una dosis subletal de acetaminofeno y se monitorizan los parámetros de la función hepática a lo largo del régimen de tratamiento.

En condiciones estériles y anestesia general, se crea una comunicación entre la arteria carótida y la vena yugular interna en un animal (por ejemplo un perro). Se realiza una incisión a lo largo del borde anterior del esternocleidomastoideo y se exponen la arteria carótida y la vena yugular interna. Se ligan ambos vasos al nivel del ángulo mandibular y se practica una comunicación entre los dos vasos. Se suturan en su sitio catéteres silásticos de diálisis, se sacan a través de la incisión y se cierra la herida con seda 4/0. Se observa a los animales hasta su recuperación de la anestesia y a continuación se les examina seis horas más tarde. Se monitoriza el dolor y se administra acetaminofeno (100 mg/kg) a 6 horas por necesidad. Las suturas se retiran después de una semana y no se inicia la diálisis hasta que no haya madurado la comunicación. Se adjunta un dispositivo hepático bio-artificial adjuntando el cartucho a las ramas aferentes y eferentes de la comunicación por medio de catéteres de diálisis. La herida permanece cubierta con cinta quirúrgica en todo momento para evitar daños en el sitio de la comunicación. Las inyecciones de acetaminofeno (750 mg/k para la primera dosis, 200 mg/k para las dos segundas) están acompañadas de una inyección subcutánea de xilocaína al 1% para evitar una reacción local dolorosa. La insuficiencia hepática en el grupo que recibe una dosis subletal no causa síntomas graves, mientras que el grupo que recibe la dosis letal experimenta anorexia, vómitos y diarrea en el estado precomatoso. Según el modelo de Francavilla, A. y col. (Gastroenterology 96:470-478, 1989), no se administran fármacos adicionales a los animales de control (los animales que reciben diálisis hepática son asintomáticos). Posteriormente se usa un dispositivo hepático bio-artificial que contiene células de la invención cultivadas para eliminar toxinas, conjugar bilirrubina, restituir un perfil de aminoácidos normal y reemplazar proteínas séricas y factores de coagulación. Tal tratamiento evita la muerte del animal.

El dispositivo hepático bio-artificial también se usa para apoyar las funciones hepáticas en un perro hepático al que se la ha administrado una dosis letal de acetoaminofeno. Los perros se mantienen con vida mediante diálisis hepática extracorpórea intermitente.

Se considera que la memoria descriptiva anteriormente escrita es suficiente para permitir a una persona experta habitual en la materia practicar la invención. La presente invención no debe limitarse en su alcance por la línea celular depositada, dado que la forma de realización depositada está concebida como una mera ilustración de un aspecto de la invención y cualquier línea celular que sea funcionalmente equivalente se encuentra dentro del alcance de esta invención. El depósito de material no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en el presente documento no sea adecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma ni se debe considerar que limita el alcance de las reivindicaciones a la ilustración específica que se representa. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en el presente documento se harán evidentes a partir de la anterior descripción, y entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (22)

1. Una línea celular clónica C3A derivada de una línea celular parental C3A, teniendo dicha línea celular un nº de registro de la ATTC de CRL-12461.

2. La línea celular clónica de la reivindicación 1, en la que dicha línea celular clónica tiene un tiempo de duplicación en medio exento de suero significativamente menor que el tiempo de duplicación de dicha línea parental en dicho medio exento de suero.

3. La línea celular clónica de la reivindicación 1 ó 2, en la que el tiempo de duplicación en medio exento de suero de dicha línea celular clónica es menor que aproximadamente el 70% del tiempo de duplicación en medio exento de suero de dicha línea celular parental C3A o está en el intervalo de menos de aproximadamente el 50% a menos de aproximadamente el 70% del tiempo de duplicación en medio exento de suero de dicha línea celular parental C3A.

4. La línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que células de dicha línea celular cultivadas en medio exento de suero expresan un único o cualquier combinación de una pluralidad de polipéptidos recuperables.

5. La línea celular de la reivindicación 4, en la que dichas células expresan un único o cualquier combinación de una pluralidad de polipéptidos recuperables seleccionados del grupo constituido por: proteína fetal alfa (AFP), albúmina humana, antiquimiotripsina \alpha-1, antitripsina \alpha-1, antitrombina III, complemento C3, factor V y transferrina.

6. Un procedimiento para producir un único o cualquier combinación de una pluralidad de polipéptidos recuperables que comprende

(a) cultivar células de la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en medio exento de suero

(b) expresar dicho/s polipéptido/s a partir de dichas células; y

(c) recuperar dicho/s polipéptido/s a partir de dicho cultivo para producir un polipéptido cosechable.

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7. Un procedimiento para producir la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:

(a) cultivar secuencialmente células de una línea celular parental C3A en una serie de medios que tienen una concentración de suero gradualmente descendiente, siendo el medio final en dicha serie exento de suero,

(b) generar una colonia celular clónica de dichas células a partir de dicho medio final en dicha serie de (a) en medio exento de suero; y

(c) propagar dicha colonia en medio exento de suero para producir una línea celular exenta de suero.

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8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que una de dichas series de medios que tienen una concentración gradualmente descendiente de suero en dicha serie de cultivos secuencial tiene una proporción de medio que contiene suero y medio exento de suero de aproximadamente 50:50 o de aproximadamente 25:75.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el medio exento JRH EXCell 620 suplementado con L-glutamina 2 mM.

10. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el medio exento de suero es medio Aim V de Gibco.

11. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el medio exento de suero es medio IS293 de Irvine Scientific.

12. Un dispositivo hepático bio-artificial que comprende un aparato que contiene células de la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células se cultivan en medio exento de suero sobre una superficie en dicho dispositivo en una cantidad y teniendo actividad biológica hepática específica a un nivel suficiente para mantener a un sujeto que tiene un trastorno hepático o función hepática comprometida.

13. Un procedimiento para fabricar un dispositivo biológico artificial, que comprende proporcionar células de la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 a una superficie en dicho dispositivo y cultivar dicho dispositivo en medio exento de suero.

14. Un procedimiento para usar células de la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un dispositivo hepático bio-artificial, que comprende proporcionar dichas células a una superficie en dicho dispositivo y cultivar dichas células en dicho dispositivo en medio exento de suero.

15. Un procedimiento para producir proteína que comprende:

(a) cultivar células de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en medio exento de suero para expresar un único o cualquier combinación de una pluralidad de polipéptidos recuperables y

(b) recuperar dicho/s polipéptido/s para producir proteína.

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16. Un procedimiento para la búsqueda de compuestos respecto a su actividad metabólica que comprende:

(a) proporcionar un compuesto a células de la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que dichas células se cultivan en medio exento de suero; y

(b) analizar dichas células respecto a la presencia de metabolitos de dicho compuesto para buscar la actividad metabólica.

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17. Un procedimiento para estudiar enfermedad entérica que comprende:

(a) proporcionar un organismo bacteriano a células de la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células se cultivan en medio exento de suero, y

(b) emplear dichas células de (a) para uso experimental para estudiar enfermedad entérica.

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18. Un procedimiento in vitro para limpiar la sangre de un sujeto que tiene función hepática comprometida que comprende:

(a) proporcionar células de la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 a una superficie en un dispositivo hepático bio-artificial, en el que dichas células se proporcionan en una cantidad y teniendo actividad biológica hepática específica a un nivel suficiente para mantener a dicho sujeto que tiene función hepática comprometida,

(b) cultivar dichas ecos en dicho dispositivo en medio exento de suero, y

(c) pasar sangre de dicho sujeto para que contacte con dichas células, en el que dicho paso da como resultado la eliminación de moléculas de origen sanguíneo que entran en dicho dispositivo y la liberación de moléculas a partir de dichas células en la sangre que sale de dicho dispositivo.

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19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicho sujeto es un ser humano.

20. Una composición farmacéutica que comprende la línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

21. Uso de una línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar trastorno hepático, dolencia hepática o función hepática comprometida.

22. Uso de una línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 proporcionada sobre una superficie en un dispositivo hepático bio-artificial para la preparación de una composición farmacéutica para tratar trastorno hepático, dolencia hepática o función hepática comprometida.