DE69936306T2

DE69936306T2 - C3a serumfreie klonale zell-linie sowie deren anwendungen

Info

Publication number: DE69936306T2
Application number: DE69936306T
Authority: DE
Inventors: Dennis San Diego TRIGLIA; Anthony Solana Beach PURCHIO
Original assignee: Hepatix Inc La Jolla; Hepatix Inc
Current assignee: Vital Therapies Inc
Priority date: 1998-02-11
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2019-02-11
Also published as: US8715954B2; ATE364711T1; AU2667199A; EP1104993A4; EP1104993A1; US20020012654A1; DE69936306D1; EP1104993B1; ES2306505T3; HK1038471A1; US7390651B2; WO1999040793A1; AU761988B2; US20040166562A1; US20090035805A1; CA2320255A1; US6653105B2

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Zelllinien, genauer gesagt eine serumfreie C3A-Zelllinie, die Säugerzell-Produkte produziert, wie z.B. isolierbare Polypeptide, die durch rekombinante Verfahren gewonnen werden.
2. Hintergrund der Erfindung
Zellkultur wird weit verbreitet zur Produktion von verschiedenen isolierbaren Bioprodukten eingesetzt, einschließlich Polypeptid-Wachstumsfaktoren, Hormonen, Enzymen, Impfstoffen und Proteinen. Diese Bioprodukte werden in Kultur von normalen, transformierten und gentechnologisch hergestellten Zelllinien produziert.
Wenn eine Zelle aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt wird, muss ein künstliches Medium jedoch alle entscheidenden Faktoren zur Verfügung stellen, die für das normale Zellwachstum, die Differenzierung und die Wirtszellexpression erforderlich sind. Demnach muss das synthetische Kulturmedium entscheidende Nährstoff-, Hormon- und Stroms-Faktoren liefern, die normalerweise in vivo zur Verfügung stehen. Darüber hinaus sollte das Kulturmedium die Produktion oder die Verwendung des gewünschten Bioprodukts nicht stören. Da die Funktion von vielen Zellkulturfaktoren auf der molekularen Ebene noch nicht geklärt ist, werden die meisten Zelllinien, die für die Produktion von biologischen Stoffen eingesetzt werden, in Kulturmedien gezüchtet, die mit Tierserum ergänzt sind, das als ein universeller Nährstoff dient. Serum ist eine sehr komplexe Flüssigkeit, die unter anderen Bestandteilen mindestens 500 verschiedene Proteinbestandteile enthält, einschließlich Hormone, Wachstumsfaktoren, Trägerproteine, Spurenelemente und Bindungs- und Ausbreitungsfaktoren. Tierserum wie z.B. fötales Rinderserum (FBS) kann bis zu 10% eines typischen Kulturmediums ausmachen. Derzeit züchtet man C3A-Zellen in Gewebekulturmedium, das ungefähr 5% FBS enthält.
Obwohl sie weit verbreitet eingesetzt wird, hat die Ergänzung mit Serum viele Limitierungen, besonders wenn sie bei der Herstellung von biotechnologischen Produkten verwendet wird (Barnes, 1987; Barnes & Sato, 1980; Broad, i.e., 1991; Jayme, 1991). Serum enthält große Mengen zahlreicher Proteine, welche heterolog exprimierte Polypeptide stören können und es muss anschließend von hergestellten Bioprodukten während deren Ernte getrennt werden. Hinzu kommt, dass der zunehmende Preisanstieg von im Handel erhältlichem Serum, die unkontrollierbare Streubreite in der Qualität von dessen Batches und das zusätzliche Erfordernis, dieses zu sterilisieren, zusammen den Produktionsprozess erschweren und die Herstellungskosten aufblähen.
Des Weiteren kann die Verwendung von Serum eine potenzielle Biogefährdung darstellen. Serum kann verborgene cytotoxische Elemente enthalten, die entfernt werden müssen, bevor irgendein biologisches Produkt nach der Herstellung sicher angewendet werden kann. Die Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten hat im Hinblick auf die mögliche Kontaminierung von isolierbaren Bioprodukten aus Kulturen, die Serum enthalten, ernsthafte regulatorische Befürchtungen geäußert. Rossi et al. (Am. J. Vet. Res. 41: 1680-1681 (1980); Chu et al., (In vitro 9: 31-34 (1973)); sowie Nuttall et al. (Nature 266: 835-837 (1977)) sprechen einen Punkt dieses Problems an (nämlich die Möglichkeit einer Kontamination von serumhaltigen Zellkulturen mit Viren). Wie von Chu et al. angemerkt worden ist, können kontaminierende Viren mit Säugerzellen in Kultur biologisch interagieren, oder durch unklare klinische Reaktionen mit anderen Agenzien, wie von Nuttall et al., beobachtet worden ist.
Man hat eine Reihe von Methoden eingesetzt, um die Kontamination von serumhaltigen Kulturen mit Viren zu verringern. Diese umfassen aufmerksames Screening und vollständige Beseitigung von kontaminierenden Viren durch Affinitäts-Chromatographie. Wie von Orr et al. (J. Cain. Microbial. 3: 402-5 (1976)) berichtet worden ist, ist es jedoch leider schwierig, eine vollständige Beseitigung von allen möglichen unerwünschten Agenzien zu gewährleisten, die in einer kontaminierten Zellkultur vorliegen können. Vor kurzem sind weitere Befürchtungen aufgekommen, was die Verfälschung mit Agenzien anbelangt, die nicht viralen Ursprungs sind. Solche Befürchtungen haben sich daraufhin durch den Nachweis der Übertragung von Prion-artigen Krankheiten von Tieren auf Menschen bewahrheitet (z.B. neuro degenerative Störungen wie z.B. Creutzfeldt-Jakob und in jüngster Vergangenheit durch eine menschliche Form des Rinderwahns; Collinge, J. Hum. Mol. Genet. 6: 1699-1705 (1997)). Diese Entwicklungen haben weitere ernste Befürchtungen bezüglich der Verwendung von aus Tieren stammenden Seren bei der Zellkultur geweckt.
Demzufolge gibt es ein großes Interesse an der Entwicklung von Zelllinien, die an Wachstum und Kultur in serumfreiem Medium angepasst sind. Galfre, U.S. Patent Nr. 4,350,683 , beschreibt eine Rattenmyelomzelllinie (CNCM J-078), die für die Entwicklung von Ratten-Ratten-Hybridomen nützlich ist, die angeblich in der Lage ist, in serumfreiem Medium zu wachsen. In vielen serumfreien Kulturen wird es jedoch häufig berichtet, dass das Zellwachstum im Vergleich zu dem Zellwachstum in mit Serum ergänzten Kulturen langsamer ist. Golde, U.S. Patent Nr. 4,438,032 , beschreibt eine menschliche T-Lymphoblasten-Zelllinie (Mo), die in der Lage ist, in serumfreiem Medium zu wachsen, obwohl deren Wachstumsrate deutlich langsamer ist als wenn man die Zellen in Medium züchtet und hält, das 20% FBS enthält. Darüber hinaus ist es auch berichtet worden, dass serumfreie Zelllinien an einer verminderten Zelldichte, geringeren Sättigungsspiegeln und verminderter Lebensfähigkeit kranken.
Es gibt demzufolge einen Bedarf, serumfreie Zelllinien zu schaffen, die wachsen und gedeihen können, wenn sie in serumfreiem Medium gehalten werden (einschließlich „chemisch definiertem" Medium, das keinerlei Serum oder Serumergänzung enthält). Solche serumfreien Zelllinien sollten auch normale Lebensfähigkeit, Wachstumsraten zeigen und in der Lage sein, isolierbare Bioprodukte zu exprimieren, die keine biologische Kontamination enthalten.
Dementsprechend bietet die vorliegende Erfindung eine Zelllinie – klonal von einer parentalen C3A-Hepatocyten-Zelllinie abgeleitet – die an normales Wachstum und Haltung in serumfreiem Medium angepasst ist. Außerdem eignet sich die vorliegende Zelllinie für die Synthese und Expression in serumfreier Kultur von beträchtlichen Titern isolierbarer Bioprodukte in einer einigermaßen hohen Reinheit, einschließlich von Polypeptiden und Proteinen. Ein Vorteil der serumfreien C3A-Zelllinie der Erfindung besteht darin, dass Bioprodukte, die von Kulturen geerntet werden, die diese Zellen verwenden, ein wesentlich geringeres Risiko aufweisen, verborgene infektiöse Agenzien zu beherbergen als Bioprodukte, die mit serum haltigen Ergänzungsstoffen hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist die wahrscheinlich erleichterte regulatorische Zulassung von Bioprodukten, die mit Hilfe der Zellen der Erfindung erlangt wurden, auf Grund des verminderten Kontaminationsrisikos. Eine Zulassungsbehörde, das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten, ist besonders besorgt über die ungewollte Einführung der Maul und Klauenseuche in den Viehbestand der Vereinigten Staaten durch den Import von kontaminierten Bioprodukten, die aus Kulturen hergestellt worden sind, die fötales Kälberserum enthalten. Infolgedessen bieten die Zelllinie der Erfindung und die Methoden ihrer Anwendung Vorteile gegenüber Zelllinien, die in serumhaltigem Medium wachsen gelassen oder gehalten werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung und Entwicklung einer serumfreien Zelllinie, die von einer parentalen C3A-Hepatocyten-Zelllinie abgeleitet ist. Die serumfreie C3A-Zelllinie ist unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL-12461 hinterlegt worden und ist an das Wachstum in einem serumfreien Medium angepasst und darin kloniert worden. Ein überraschender Vorteil der serumfreien C3A-Zellen besteht darin, dass sie eine höhere Wachstumsrate und eine kürzere Verdopplungszeit aufweisen als Zellen der parentalen C3A-Linie. Die serumfreie C3A-Zelllinie eignet sich für die Produktion von isolierbaren Bioprodukten in serumfreier Kultur, wodurch das Risiko vermindert wird, durch Serumübertragung kontaminierte Bioprodukte zu erzeugen.
In einer ersten Ausführungsform hat die serumfreie C3A-Zelllinie der vorliegenden Erfindung eine Verdopplungszeit, welche signifikant geringer ist als die Verdopplungszeit der parentalen oder einer vergleichbaren C3A-Zelllinie.
In einer weiteren Ausführungsform exprimieren Zellen der serumfreien C3A-Zelllinie ein einzelnes oder eine Kombination aus einer Mehrzahl von isolierbaren Bioprodukten in serumfreier Kultur.
In noch einer weiteren Ausführungsform sind die isolierbaren Bioprodukte, die mit den serumfreien C3A-Zellen hergestellt werden, Säuger-Polypeptide wie z.B.
Alpha-fötales Protein (AFP), menschliches Albumin, α-1-Antichymotrypsin, α-1-Antitrypsin, Antithrombin III, Komplement C3, Faktor V und Transferrin.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer serumfreiem C3A-Zelllinie bereitgestellt sowie ein Verfahren zur Herstellung von isolierbaren Bioprodukten, wobei Zellen der serumfreien C3A-Zelllinie verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitgestellt, um ein Individuum zu behandeln, das im Verdacht steht, eine Lebererkrankung, Leberstörungen oder eingeschränkte Leberfunktion zu haben, wobei Zellen der serumfreien C3A-Zelllinie in einer bio-artifiziellen Lebervorrichtung eingesetzt werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf metabolische Aktivität oder zum Studium von enterischen Erkrankungen bereitgestellt, wobei Zellen der serumfreien C3A-Zelllinie ver wendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen stellen die Ausführungsformen der Erfindung dar und sollen nicht den Schutzbereich der Erfindung einschränken, wie er durch die Ansprüche umfasst ist.
Die 1a–1f sind Abbildungen, die die Ergebnisse von Western-Blots zeigen, wobei 10% SDS-PAGE-Gele für den Nachweis von isolierbaren Polypeptiden verwendet werden, die von Zellen der serumfreien C3A-Zelllinie exprimiert werden, die in serumfreiem Medium gezüchtet worden sind.
1a zeigt den Nachweis des isolierbaren Bioprodukts α-1-Antichymotrypsin.
1b zeigt den Nachweis des isolierbaren Bioprodukts α-1-Antitrypsin.
1c zeigt den Nachweis des isolierbaren Bioprodukts Antithrombin III.
1d zeigt den Nachweis des isolierbaren Bioprodukts Komplement C3.
1e zeigt den Nachweis des isolierbaren Bioprodukts Faktor V.
1f zeigt den Nachweis des isolierbaren Bioprodukts Transferrin.
2 ist ein Diagramm, das den Vergleich der Wachstumsraten von serumfreien C3A-Zellen und Zellen der parentalen C3A-Zelllinie darstellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine serumfreie C3A-Hepatocyten-Zelllinie bereit, die für die Verwendung bei der Herstellung von isolierbaren Bioprodukten in serumfreier Kultur geeignet ist. Die serumfreien C3A-Zelllinien der vorliegenden Erfindung sind von einer bekannten parentalen C3A-Zelllinie abgeleitet. Der Begriff „abgeleitet" wie hierin verwendet bedeutet, dass die Zelllinie durch ein hierin bereitgestelltes Selektionsverfahren aus einer bekannten parentalen C3A-Zelllinie kloniert worden ist. Der Begriff „kloniert", „klonal abgeleitet" oder „klonale Zelllinie" wie hierin verwendet bedeutet eine sich vermehrende Population von genetisch identischen Zellen von einer spezifischen Zelllinie, die von einer einzelnen Vorläuferzelle abgeleitet worden sind. Die parentale Zelllinie ist eine Leberzelllinie, welche der in U.S. Patent Nr. 5,290,684 beschriebenen Zelllinie ähnlich ist. Die klonal abgeleitete serumfreie C3A-Zelllinie der Erfindung bewahrt die meisten Eigenschaften der parentalen menschlichen Hepatocyten-Linie C3A mit der Ausnahme, dass die nun beanspruchte Zelllinie in serumfreiem Medium gezüchtet, gehalten wird und Leberspezifische biologische Aktivität exprimiert. Die serumfreie Zelllinie der Erfindung und die Verfahren ihrer Verwendung ahmen sowohl qualitativ als auch quantitativ Leberzellen oder die Leber als funktionierendes Organ nach. Serumfreie C3A-Zellen exprimieren annähernd normale Mengen von Polypeptiden aus mehreren zentralen metabolischen Reaktionswegen, einschließlich Reaktionswegen für Glycolyse, Gluconeogenese, Glycogenese und Ureogenese. Außerdem schließen die serumfreien Zellen die folgenden zusätzlichen Eigenschaften ein: sie synthetisieren annähernd normale Mengen von Albumin und anderen Proteinen, sie enthalten große Mengen von Leber-spezifischen Transkriptionsfaktoren und sie zeigen die Struktur- und die Polaritätseigenschaften von normalen menschlichen Hepatocyten.
Es sollte selbstverständlich sein, dass diese Erfindung nicht auf die jeweiligen hierin beschriebenen Verfahren, Zusammensetzungen und Zelllinien beschränkt ist, da solche Verfahren, Zusammensetzungen und Zelllinien natürlich variieren können. Es sollte ebenfalls selbstverständlich sein, dass die hierin verwendete Terminologie nur der Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen dient und nicht dazu gedacht ist, den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung einzuschränken, welcher nur durch die Ansprüche im Anhang beschränkt ist.
Wie hierin verwendet, was die Ansprüche im Anhang einschließt, umfassen die Singularformen von Worten wie z.B. „ein", „eine" und „der/die/das" deren entsprechende Pluralangaben, sofern der Kontext nicht eindeutig anderes bestimmt. So umfasst zum Beispiel der Verweis auf „einen Organismus" einen oder mehrere verschiedene Organismen, der Verweis auf „eine Zelle" schließt eine oder mehrere solcher Zellen ein und der Verweis auf „ein Verfahren" schließt einen Bezug auf gleichwertige Schritte und Verfahren ein, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, und so weiter.
Soweit nicht anders angegeben, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann des Gebiets verstanden werden, zu dem die Erfindung gehört. Obwohl bei der Anwendung oder dem Test der vorliegenden Erfindung Verfahren und Materialien eingesetzt werden können, die den hierin beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, werden geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Alle vorstehenden diskutierten Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen werden nur auf Grund ihrer Offenbarung vor dem Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hierin soll als ein Anerkenntnis interpretiert werden, dass die Erfindung nicht berechtigt ist, einer beliebigen solchen Offenbarung auf Grund ihrer vorherigen Erfindung voranzugehen. Alle hierin erwähnten Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen sind hierin unter Bezugnahme in ihrer Gänze aufgenommen, einschließlich aller Figuren und Zeichnungen.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „serumfrei" ein Kulturmedium, das ohne Serum formuliert worden ist, und seine Bedeutung umfasst sowohl die Medienformulierungen, die als „serumfreie" Medien definiert werden (die ansonsten mit Protein ergänzt sein können), „Protein-freie" (keine Ergänzung mit Protein) als auch „chemisch definierte" Medien (ultrarein mit oder ohne niedermolekulare Bestandteile, gentechnologisch konstruierte Peptide oder Proteine). Die Verhältnisse der Komponenten des serumfreien Mediums kann für die jeweilige Verwendung, für welche die Zelllinie der Erfindung eingesetzt werden wird, angepasst und optimiert werden, einschließlich ihrer Verwendung in irgendeinem Polypeptid-Expressionssystem, ihrer Verwendung in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung oder ihrer Verwendung in metabolischen oder enterischen Studien, welche die Funktion des Leberorgans oder von Hepatocytenzellen einbeziehen. Um die Zellzüchtungseigenschaften des mit Zellen der Erfindung verwendeten serumfreien Mediums zu verbessern, kann das serumfreie Medium, außer mit Zusatzstoffen auch mit anderen Komponenten wie z.B. Fettsäuren, Aminosäuren oder Phospholipid-Vorläufern ergänzt werden. Serumfreies Medium kann käuflich erworben oder de novo im Labor hergestellt werden. Bevorzugt ist Medium, das mit den Zellen der Erfindung verwendet wird, serumfrei, und stärker bevorzugt ist es mit 2 mM L-Glutamin ergänzt. Noch stärker bevorzugt ist das serumfreie Medium die im Handel erhältliche Sorte, die als JRH BioScience ExCell 620 bezeichnet wird, die mit 2 mM L-Glutamin ergänzt ist.
Die parentale C3A-Zelllinie, von welcher die Zellen der Erfindung klonal abgeleitet sind, ist in Gislason et al., Artificial Organs, Bd. 18, S. 385-389 (1994); Miwa et al., Int. Jour. of Artificial Organs, Bd. 19, S. 240-244 (1996) und Sussman et al., Hepatology, Bd. 16, S. 60-65 (1992) beschrieben. Sie ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA unter den ATCC-Hinterlegungsnummern SD 2078 und SD 3283 hinterlegt worden. Die klonal abgeleiteten serumfreien C3A-Zellen der Erfindung sind ebenfalls bei der ATCC hinterlegt worden und haben die Hinterlegungsnummer CRL-12461. Die serumfreie C3A-Zelllinie ist frei von biologischen Kontaminanten und enthält keinerlei genetische Sequenzen von Hepatitis B – Virus (HBV).
ATCC-Hinterlegungen sind nach den Vorschriften des Budapester Vertrags zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren und den Bestimmungen hierunter hinterlegt (Budapester Vertrag). Der Vertrag gewährleistet die Erhaltung lebensfähiger Kulturen für 30 Jahre nach dem Datum der Hinterlegung. Die serumfreie C3A-Zelllinie ist von der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags verfügbar, welche nach Erteilung des entsprechenden US-Patents oder nach der Offenlegung einer beliebigen US- oder fremden Patentanmeldung, was auch immer früher eintrifft, die dauerhafte und unbegrenzte Verfügbarkeit von Nachkommen der Zelllinie für die Öffentlichkeit gewährleisten. Der Budapester Vertrag gewährleistet die Verfügbarkeit der Zelllinie für jemand, der von dem Bevollmächtigten des US-Patent- und Markenamts nach 35 USC §122 und den hierfür geltenden Vorschriften des Bevollmächtigten dazu berechtigt ist (einschließlich 37 CFR §1.14 unter speziellem Bezug auf 886 OG 638).
Der Rechtsinhaber der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass für den Fall, dass die hinterlegte Zelllinie absterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, wenn sie unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, sie nach ordnungsgemäßer Benachrichtigung umgehend mit einer lebensfähigen Probe derselben Zelllinie ersetzt werden wird. Die Verfügbarkeit einer hinterlegten Zelllinie soll nicht als eine Lizenz ausgelegt werden, die Erfindung unter Zuwiderhandlung der Rechte auszuführen, die von der Behörde von irgendeiner Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen gewährt worden sind.
Klone von serumfreien C3A-Zellen sind zu unbegrenzter Haltung, Wachstum und Vermehrung in vivo in der Lage. Kontinuierliche serumfreie C3A-Zelllinien vermehren sich, können subkultiviert werden (d.h. wiederholt in neue Kulturgefäße passagiert werden), und für einen Zeitraum kryokonserviert werden (d.h. in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff mit einem Kältekonservierungsmittel wie z.B. 10% Dimethylsulfoxid oder Glycerin gelagert werden). Serumfreie C3A-Zellen können als eine Zelllinie in Langzeitkultur gehalten werden, welche den Primärkulturen sehr ähnelt.
Die Zellen der Erfindung werden größtenteils in einem beliebigen für die Züchtung von Zellen verwendeten Behälter, Flasche, Gewebekulturschale oder Vorrichtung gezüchtet, die eine geeignete Oberfläche für die Anhaftung von Zellen und Ausbreitung bereit stellen (z.B. Culture of Hematopoetic Cells (Culture of Specialized Cells), R. I. Freshney et al., Hrsg., I. Freshney, Wiley-Liss 1994; hierin unter Bezugnahme aufgenommen). Normalerweise handelt es sich bei einer Ausgangskultur um eine, in der Zellen von einem vorliegenden Bestand von parentalen C3A entfernt werden, in einem Gemisch aus serumhaltigen und serumfreien Medium in ein Kulturgefäß platziert und anschließend wie hierin ausführlich beschrieben bis zum serumfreien Status passagiert wird.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Anhaftung" auf die Adhärenz von Zellen und die Ausbreitung auf einer Oberfläche in einer solchen Vorrichtung, wobei Faktoren, die die Anhaftung von Zellen und die Ausbreitung fördern, die gezüchteten Zellen direkt kontaktieren. Das Zellwachstum wird direkt auf der den Oberflächen des Kulturgefäßes oder auf ergänzenden Einsätzen aufrechterhalten, wie z.B. Kassetten oder Membranen, die innerhalb des Gefäßes angebracht sind. Geeignete Anhaftungs- und Ausbreitungsoberflächen werden hergestellt, indem man entweder anfänglich ein geeignetes Oberflächenmaterial auswählt oder indem man anschließend eine vorliegende Oberfläche behandelt. Übliche Behandlungen sind wohlbekannt und umfassen die Beschichtung von Oberflächen mit Zusammensetzungen, welche Anhaftung und Ausbreitung fördern. Solche Zusammensetzungen sind ebenfalls wohlbekannt und schließen polybasische Aminosäuren wie z.B. Polyornithin und Polylysin ein. Des Weiteren kann die Anhaftungsoberfläche mit einem bekannten extrazellulären Matrixprotein beschichtet oder ausgerüstet sein oder mit Zusammensetzungen oder artifiziellen Umgebungen, die einer extrazellulären Matriv in vivo gleichwertig sind. Solche Umgebungen verstärken das serumfreie Wachstum von C3A-Zellen, deren Haltung und die Expression von isolierbaren Bioprodukten. Typische Zell-Matrix-Zusammensetzungen sind wohlbekannt und schließen Laminin, Kollagen und Fibronectin ein. Andere extrazelluläre Matrixproteine oder künstliche extrazelluläre Matrix- Umgebungen, die eine in vivo extrazelluläre Matrix nachahmen, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds (Tissue Engineering) A. Atala und D.J. Mooney (Hrsg.), Birkhauser, 1997).
Nach dem Erreichen der Konfluenz nehmen die serumfreien Zellen einen erwachsenen Phänotyp an, bei dem sich die Zellteilung drastisch verlangsamt, und sie entwickeln histologische Merkmale normaler menschlicher Leberzellen. Bei Konfluenz exprimieren serumfreie C3A-Zellen auch beträchtliche Mengen von menschlichem Alpha-fötalem Protein (AFP), menschlichem Albumin, α-1-Antichymotrypsin, α-1-Antitrypsin, Antithrombin III, Komplement C3, Faktor V und Transferrin und anderen Serumproteinen bei einer einigermaßen hohen Reinheit. Der Begriff „Konfluenz" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Dichte von gezüchteten Zellen, bei der die Zellen einander berühren, wobei sie den Großteil der oder die ganzen zum Wachstum zur Verfügung stehenden Oberflächen bedecken. Während des präkonfluenten Wachstums verhalten sich ausgewählte Zellen wie sich regenerierende Hepatocyten und zeigen entsprechende Muster der Regulation der Genexpression. Serumfreie C3A-Zellen haben eine schnelle Verdopplungszeit, welche wesentlich geringer ist als die Verdopplungszeit der Zellen der parentalen nicht serumfreien C3A-Linie. Der Begriff „Verdopplungszeit" wie hierin verwendet bezieht sich auf die Zeit, die Zellen in einer Zellkultur brauchen, um ihre Zahl zu verdoppeln. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Verdopplungszeit der serumfreien C3A-Zelllinie im Bereich von etwa weniger als 50% bis etwa weniger als 70% der Verdopplungszeit der parentalen C3A-Zelllinie in serumfreiem Medium. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform liegt die Verdopplungszeit der serumfreien C3A-Zelllinie im Bereich von etwa weniger als 60% bis etwa weniger als 70% der Verdopplungszeit der parentalen C3A-Zelllinie in serumfreiem Medium.
Serumfreie C3A-Zellen zeigen auch Leber-spezifische biologische Aktivität und synthetisieren Serumproteine, Isoenzyme, Gerinnungsfaktoren und dergleichen. Dementsprechend werden die Zellen in serumfreiem Medium als in vitro-biologische Fabriken genutzt, die im Wesentlichen reine isolierbare Bioprodukte exprimieren, einschließlich Moleküle aus natürlichen Quellen, Serumproteine, Impfstoffe und rekombinante Polypeptide wie z.B. Antikörper, Wachstumsfaktoren, Mitglieder der Blutkaskade, Cytokine und morphogene Proteine. Bevorzugt umfassen isolierbare Bioprodukte, die von Zellen der Erfindung produziert werden, ein einzelnes oder eine beliebige Kombination aus einer Mehrzahl von isolierbaren Polypeptiden. Stärker bevorzugt ist das isolierbare Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Alpha-fötales Protein (AFP), menschliches Albumin, α-1-Antichymotrypsin, α-1-Antitrypsin, Antithrombin III, Komplement C3, Faktor V und Transferrin. Bioprodukte, die von Zellen der serumfreien C3A-Zelllinie exprimiert werden, werden während der Ernte wegen des Fehlens von störenden Proteinen relativ leicht aus dem Kulturmedium isoliert. Außerdem vermindert die Verwendung von Zellen der vorliegenden Erfindung beträchtlich das Risiko einer Kontamination der Zelllinie oder des Bioprodukts durch Organismen oder Agenzien, die üblicherweise im Serum zu finden sind. Mit dem Begriff „Ernten" oder „isolierbar" ist das Züchten der Zellen der Erfindung in serumfreiem Medium gemeint, um ein gewünschtes Bioprodukt zu exprimieren, und dann die Wiedergewinnung oder das Zurückerlangen des Bioprodukts aus dem serumfreien Kulturmedium in einem im Wesentlichen reinen Zustand, wobei eine beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Methode verwendet wird (z.B. Culture of Hematopoetic Cells (Culture of Specialized Cells), R. I. Freshney et al., Hrsg., I. Freshney, Wiley-Liss 1994; Large Scale Cell Culture Technology, B.K. Lydersen, Hrsg., John Wiley & Sons, 1993). In einer Ausführungsform wird die Überstandsflüssigkeit aus der Zellkultur gewonnen und die isolierbaren Bioprodukte werden isoliert und aufgereinigt. In einer anderen Ausführungsform kann man die Zellen auf einer semipermeablen Membran oder Oberfläche wachsen lassen, welche die Diffusion von isolierbaren Bioprodukten, wie z.B. Proteinen, durch die Membran oder die Oberfläche hindurch erlauben, wo sie anschließend durch Isolierung und erhebliche Aufreinigung geerntet werden. Der Begriff „im Wesentlichen rein" oder „im Wesentlichen aufgereinigt" wie hierin verwendet bezieht sich ein beliebiges isolierbares Bioprodukt, das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist.
In einer Ausführungsform wird ein im Wesentlichen reines isolierbares Polypeptid aus einer serumfreien C3A-Zellkultur üblicherweise eine einzelne Hauptbande auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel ergeben. Die Reinheit eines beliebigen isolierbaren Polypeptids kann auch durch aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse bestimmt werden. Im Wesentlichen reine isolierbare Polypeptide umfassen funktionelle Fragmente des Polypeptids, so lange dessen biologische Aktivität erhalten bleibt. Außerdem sind andere rekombinante Modifikationen, zum Beispiel durch Ort-spezifische Mutagenese einer beliebigen cDNA eines isolierbaren Polypeptids umfasst. Ein „rekombinantes" isolierbares Polypeptid bezieht sich auf ein isolierbares Polypeptid, das mit Hilfe einer beliebigen bekannten rekombinanten molekularbiologischen Methode hergestellt worden ist (z.B. Zelltransfektion mit einem exogenen Nucleinsäuresequenzkonstrukt). Eine „codierende Sequenz" einer Nucleinsäure oder eine „Nucleotidsequenz", die ein bestimmtes isolierbares Polypeptid wie hierin verwendet „codiert", ist eine endogene oder exogene Nucleinsäuresequenz, die transkribiert und in ein isolierbares Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Nucleinsäuresequenz gebracht wird.
Die Erfindung schließt Verfahren ein, die serumfreie Zellen der Erfindung verwenden, um eine beliebige gentechnologisch konstruierte heterologe eukaryontische Nucleinsäuresequenz zu exprimieren, die ein isolierbares Polypeptid oder ein funktionelles Fragment davon codiert, indem eine beliebige rekombinante Methode wie vorstehend beschrieben benutzt wird. Verfahren zur Expression von heterologen eukaryontischen Nucleinsäuresequenzen, die ein entsprechend heterologes Polypeptid codieren, sind wohlbekannt. Der Begriff „heterologe Nucleinsäure" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine beliebige regulatorische oder strukturelle genetische Nucleinsäuresequenz oder Material, das nicht ursprünglich in der serumfreien C3A-Zelle der Erfindung enthalten ist, in die sie/es eingeführt (z.B. transfiziert) wird. Nucleinsäuresequenzen umfassen DNA-, cDNA- und RNA-Sequenzen, die Poly peptide oder funktionelle Fragmente davon in einer geeigneten funktionierenden Anordnung mit einem beliebigen bekannten Expressionsvektor codieren. Der Begriff „exprimierend" oder „Expression" wie hierin verwendet bezieht sich auf die vollständigen Nutzung der Information in einer Nucleinsäuresequenz via Transkription und Translation, welche zur Erzeugung einer entsprechenden Polypeptidsequenz führt, die durch ihre codierende Nucleinsäuresequenz bestimmt ist. Die Genexpression wird an mehreren Stellen in der Abfolge von Schritten kontrolliert, beginnend mit der Initiation der Transkription und gipfelnd in der Synthese eines funktionierenden Polypeptids. Transfektion einer heterologen Nucleinsäure wird mit Hilfe eines beliebigen herkömmlichen Verfahrens erreicht, einschließlich der Verwendung von viralen Vektoren (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laborstory, Gluzman, Hrsg., 1982), rekombinanten Retroviren, chemischen (Calciumphosphat-Copräzipitation) oder physikalischen Methoden, einschließlich mechanischer Prozeduren (z.B. Mikroinjektion, ballistische Transfektion) oder Liposomen. Genetisches Material (z.B. eine Nucleinsäuresequenz) wird mit Hilfe einer beliebigen von einer Vielzahl von Prozeduren in einen Vektor eingesetzt. Im Allgemeinen wird die Nucleinsäuresequenz in eine geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle(n) eingesetzt. Alle derartigen Prozeduren und beliebige andere werden als innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung angesehen und innerhalb der Fähigkeit eines beliebigen Durchschnittsfachmanns. Beispiele für solche Vektoren umfassen chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen (z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitet sind, virale DNA wie z.B. Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudorabies). Es kann ein beliebiger anderer Vektor benutzt werden, solange er innerhalb der Zellen der Erfindung repliziert und funktioniert.
Andere virale Vektoren, die in Erwägung gezogen werden, dafür benutzt zu werden, heterologes genetisches Material in eine serumfreie C3A-Zelle der Erfindung zu übertragen, umfassen Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vaccinia oder ein RNA-Virus wie z.B. ein Retrovirus. Beispiele für retrovirale Vektoren, in denen ein einzelnes fremdes Gen eingesetzt ist, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Moloney-Mausleukämievirus (MoMuLV), Harvey-Maussarkomvirus (HaMuSV), Maus-Mammatumorvirus (MuMTV), Gibbonaffen-Leukämievirus (GaLV) und Rous-Sarkomvirus (RSV). Eine Reihe von zusätzlichen retroviralen Vektoren kann mehrere Gene einbauen. Erwähnenswert sind menschliche auf Lentivirusbasierende Vektoren, die eine Langzeitexpression von Transgenen in Leber- und Muskelzellen zeigen (Kafri, T. et al., Nature Genetics 17(3): 314 (1997); hierin unter Bezugnahme aufgenommen). Alle diese Vektoren können ein Gen übertragen oder für einen Selektionsmarker einbauen, so dass transfizierte Zellen identifiziert und erzeugt werden.
Da retrovirale Vektoren defekt sind, benötigen sie Hilfe, um infektiöse Vektorpartikel zu produzieren. Diese Hilfe wird bereitgestellt, indem Helferzellinien verwendet werden, die Plasmide enthalten, die alle Strukturgene des Retrovirus (gag, env und pol-Gene) unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen innerhalb des Long Terminal Repeat (LTR) codieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die es dem Verpackungsmechanismus ermöglicht, ein RNA-Transkript zur Verpackung zu erkennen. Helferzelllinien, die Deletionen des Verpackungssignals aufweisen, umfassen zum Beispiel, sind aber nicht beschränkt auf Ψ2, PA317, PA12, CRIP, CRP-4 und CRE. Diese Zelllinien erzeugen leere Virionen, da kein Genom verpackt wird. Wenn ein retroviraler Vektor in solche Zellen eingeführt wird, in dem das Verpackungssignal intakt ist, aber die Strukturgene durch andere Gene von Interesse ersetzt worden sind, wird der Vektor verpackt und das Vektorvirion wird hergestellt. Vektorvirionen, die mit dieser Methode hergestellt werden, können dann dazu verwendet werden, eine Zelllinie zu infizieren, um große Mengen von chimären retroviralen Virionen zu produzieren.
Die Zelllinie der vorliegenden Erfindung hat den eindeutigen Vorteil gegenüber früher beschriebenen Hepatocyten-Zelllinien, dass deren Zellen gut differenziert sind und in serumfreiem Medium gezüchtet werden können. Demzufolge besitzen serumfreie C3A-Zellen konstitutive Leber-spezifische biologische Aktivität und sie behalten diese nach Erreichen der Konfluenz. Der Begriff „konstitutiv" wie hierin verwendet bezieht sich auf die Tatsache, dass serumfreie C3A-Zellen normalerweise Leber-spezifische biologische Aktivität besitzen ohne irgendeine besondere Art von Induktion zu benötigen. Der Begriff „Leber-spezifische biologische Aktivität" wie hierin verwendet bezieht sich auf physiologische/biochemische Reaktionen, die spezifisch in normalen Hepatocyten ablaufen. Zellen der vorliegenden Erfindung besitzen auch diese Leber-spezifischen physiologischen/biochemischen Reaktionen, exprimieren diese und erhalten sie aufrecht. Des Weiteren sind hiermit durch den Gebrauch des Begriffs „Leber-spezifische biologische Aktivität" die Synthese und die Sekretion von Protein- und niedermolekularen Produkten eingeschlossen, die in normalen Hepatocyten zu beobachten sind. Des Weiteren erhalten die Zellen der Erfindung die Expression von Leber-spezifischen biologischen Funktionen in Mengen aufrecht, die hoch genug sind um einem Individuum zu helfen, das im Verdacht steht, eine Lebererkrankung aufzuweisen oder an einem Leberversagen oder einer Störung zu leiden, die durch eingeschränkte Leberfunktion verursacht oder verschlimmert worden ist.
Normale Hepatocyten führen mehrere exakt abgestimmte Funktionen aus, die für das Funktionieren der Leber und die Homöostase des Organismus entscheidend sind. Hepatocyten kombinieren Reaktionswege für die gleichzeitige Synthese und den Abbau von Kohlenhydraten, Lipiden, Aminosäuren, Proteinen, Nucleinsäuren und Coenzymen. „Leber-spezifische" biologische Schlüsselfunktionen umfassen (1) Gluconeogenese; (2) Glycogensynthese, -lagerung und -abbau; (3) Synthese von Serumproteinen einschließlich Albumin, Hämopexin, Ceruloplasmin, die Blutgerinnungsfaktoren (einschließlich der Faktoren V, VII, X, Prothrombin und Fibrinogen), cyl-Antitrypsin, Antithrombin III und AFP; (4) Konjugation von Gallensäuren; (5) Umwandlung von Häm zu Gallenpigmenten; (6) Synthese von Lipoproteinen; (7) Lagerung und Metabolismus von Vitaminen; (8) Cholesterinsynthese; (9) Ammoniak-Metabolismus, einschließlich der Harnstoff-Synthese und der Glutamin-Synthese; (10) Metabolismus von Aminosäuren, einschließlich der metabolischen Umwandlung und Wiederverwertung von aromatischen Aminosäuren; und (11) Entgiftung und Metabolismus von Medikamenten.
Da die Leber 20% des Sauerstoffverbrauchs des Körpers ausmacht, benötigen Kulturen, die Zellen der vorliegenden Erfindung verwenden, eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff, um die hohe Leber-spezifische biologische Aktivität aufrecht zu erhalten. Die konstante Umwälzung von mit Sauerstoff angereichertem Medium erfüllt die metabolischen Bedürfnisse der Zellen (Wolfle, D. et al., Eur: J. Biochem 151: 299-303 (1985)). Eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff stimuliert auch das Wachstum und Differenzierungsfunktionen. Die entscheidende Rolle von Sauerstoff beim Metabolismus der Leber ist in der Literatur, die sich mit der isolierten perfundierten Rattenleber (IPRL) befasst, gut dokumentiert, aber dessen Rolle ist in der Literatur, die sich mit Zellkultur befasst, weitgehend ignoriert worden. Zum Beispiel sind herkömmliche Kulturen von HepG2/C3- oder HepG2/C3A-Zellen oft Sauerstoff- und daher Energie-limitiert. Falls zusätzliche Sauerstofftransportkapazität beim Züchten oder Verwenden der Zellen der Erfindung erforderlich ist, wird der Einsatz von roten Blutkörperchen oder gelöstem Hämoglobin bereitgestellt, wie für perfundierte Organe beschrieben (Gores, G.J. et al., Hepatology 6: 511-517 (1986)).
Um festzustellen, ob serumfreie C3A-Zellen die korrekte Leber-spezifische metabolische Aktivität exprimieren und aufrecht erhalten, sollten die metabolischen Funktionen der Zellen getestet werden, einschließlich des Testens ihrer Sauerstoffabhängigkeit, ihrer Fähigkeit, Glucose und Harnstoff zu synthetisieren, ihrer Fähigkeit, Bilirubin aufzunehmen und zu konjugieren und ihrer Fähigkeit, Gerinnungsfaktoren zu produzieren. Die Durchführung von Tests wird besonders empfohlen, wenn die serumfreien C3A-Zellen in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung verwendet werden sollen.
Die Abhängigkeit von Sauerstoff wird getestet, indem die Wachstumsrate der serumfreien Zellen in Kultur untersucht wird, welche kontinuierlich mit steigenden Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff perfundiert wird (d.h. über einen Bereich von gelöstem Sauerstoff von etwa 4% bis etwa 20%). Bevorzugt wird die zelluläre Wachstumsrate entweder in serumfreiem Medium untersucht, welches hohe Konzentrationen von Glucose enthält, oder in serumfreiem Medium, welches Glucose-frei ist (mit Lactat und Aminosäuren als der einzigen Kohlenstoffquelle). Andere Indikatoren der metabolischen Aktivität sind der Gesamtverbrauch von Sauerstoff, die Energieladung, der Redoxstatus und das Verhältnis von Glucose- zu Sauerstoffverbrauch. Bevorzugt sollten diese Tests wie vorstehend beschrieben auch bei unterschiedlichen Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff durchgeführt werden.
Da die Glucose- und Harnstoff-Synthese die Hauptmethode für das Entfernen von überschüssigen Aminosäuren und Ammoniak aus dem Blut darstellen, sollten die Zellen der Erfindung auf ihre Fähigkeit getestet werden, beide zu synthetisieren, insbesondere wenn die Zellen der Erfindung dazu eingesetzt werden, um Leberspezifische Funktionen auszuführen. Verfahren zum Testen der Glucose- und Harnstoff-Synthese sind wohlbekannt (Kerscher et al., in Methods of Enzymatic Analysis, H.U. Bergmeyer, Hrsg, aktuelle Ausg., Verlag Chemie, Weinheim, Bd. VII, S. 59-67 (1983)).
Die Produktion verschiedener Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren, einschließlich Prothrombin, Faktoren VII, IX und X sowie. Antithrombin III lässt sich ebenfalls leicht mit allgemein bekannten Methoden bestimmen, einschließlich unter anderem Methoden wie z.B. Festphasen-Radioimmunassay (Kelly et al., In vitro Cell Dev. Biol. 25: 217-222 (1987) sowie Methoden, bei denen im Handel erhältliche Antikörper (DAKO, Inc.) eingesetzt werden.
Wenn man Zellen der Erfindung auf einer Membran oder in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung wachsen lässt, stellen sie ein nützliches in vitro-Modell zum Studium aller menschlichen Leberfunktionen bereit, einschließlich aber nicht beschränkt auf das Funktionieren des ganzen Organs, zelluläres, metabolisches und molekulares Funktionieren. Die Zellen sind auch nützlich für Studien von: (1) Metabolismus, (2) Toxikologie von Medikamenten oder anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen, (3) enterischer Krankheit, (4) Leber-spezifischer Genexpression oder Genregulation und (5) Gentransportmethoden (z.B. Gentransport zu Hepatocyten mit einem Asialoglycoprotein-Rezeptor; Wu et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 107: 2211-7(1995)).
Die Zellen der Erfindung haben Vorteile gegenüber anderen Systemen wie z.B. dem der isolierten perfundierten Rattenleber (IPRL). Da sie eine permanente Kultur ist, ermöglicht die serumfreie Zelllinie die Durchführung von gründlichen experimentellen Langzeit-Studien. Einzelschichtkulturen mit den serumfreien Zellen der Erfindung werden normalerweise für mehrere Monate aufrecht erhalten, und eine mit diesen Zellen hergestellte bio-artifizielle Leber-Vorrichtung funktioniert über eine längere Zeit hinweg normal (z.B. acht Wochen), wie es anhand der Albuminproduktion und der Glucoseverwertung bestimmt wurde. Darüber hinaus spiegeln Einsätze, die gezüchtete Zellen der Erfindung enthalten, den Metabolismus der menschlichen Leber präziser wider als isolierte perfundierte Lebern von anderen Spezies. Somit werden die klinischen Wirkungen verschiedener Medikamente, Verbindungen oder Metabolite in einem besonders effektiven in vitro-Modell getestet, wenn Zellen der Erfindung eingesetzt werden.
Zum Beispiel werden in einer bestimmten Ausführungsform Studien des Metabolismus und der Toxikologie von Kokain wie z.B. der hydrolytische Metabolismus von Kokain in Benzoylecgonin, Ecgoninmethylester und Ecgonin wie von Falk et al. (J. Pharmacol. Toxicol. Methods 33: 2 113-20 (1995)) beschrieben, und Studien des Metabolismus von Antikrebsmitteln wie z.B. Crisnatol, wie von Patel et al. (Biochem. Pharmacol. 42: 2 337-46 (1991)) beschrieben, in einem solchen in vitro-Modell durchgeführt, indem man Zellen der Erfindung verwendet. Weitere metabolische, pharmakologische oder toxikologische Studien, die andere xenobiotische Verbindungen oder Krankheitserreger beinhalten, werden ebenfalls erwogen und sind innerhalb der Maße und Grenzen der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
In einer anderen Ausführungsform werden serumfreie C3A-Zellen der Erfindung zum Screenen von metabolischen Verbindungen oder Nebenprodukten eingesetzt, indem Verbindungen identifiziert werden, welche diese beeinflussen. Dieses Verfahren umfasst Inkubieren von Verbindungen, die im Verdacht stehen, die Leber- oder Hepatocyten-Funktion bei serumfreien C3A-Zellen zu beeinträchtigen, unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Interaktion der Komponenten zu ermöglichen, und dann anschließend Messen der Wirkung, welche die im Verdacht stehende Zusammensetzung auf Zellen der Erfindung hat. Das Eintreten einer biologischen Reaktion wird mit Hilfe von Standardmethoden überwacht. Zum Beispiel werden viele biologische Reaktionen identifiziert, indem man den Expressionsspiegel bestimmter Gene in der serumfreien C3A-Zelle im Anschluss an eine Inkubation verwendet. Solche Gene können Early Response – Gene wie z.B. fos, myc oder jun einschließen (Greenberg, Met. und Ziff, E., Nature 311: 433 (1984); Hrsg. Burck et al., in Oncogenes, 1998, Springer Verlag, New York). Es sind andere Gene bekannt, die für solche Studien nützlich sind. Methoden, welche die Wirkung von solchen Zusammensetzungen messen, schließen Northern Blot – Analyse von RNA (Transkription), SDS-PAGE – Analyse von Protein (Translation), die Aufnahme von [³H]-Thymidin (DNA-Synthese) und Reaktivität gegenüber Antikörpern (sowohl intrazellulär als auch extrazellulär) ein.
Wie vorstehend beschrieben, exprimieren Zellen der vorliegenden Erfindung „Leber-spezifische biologische Aktivität", einschließlich der Fähigkeit, Ammoniak- und Aminosäuren-Metabolismus, Entgiftung und Produktion von Polypeptiden auszuführen, besonders von Polypeptiden wie z.B. Gerinnungsfaktoren. Das Ausführen Leber-spezifischer Funktionen ist besonders wichtig, wenn die vorliegenden Zellen in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung verwendet werden. Eine solche Vorrichtung wird dazu verwendet, ein Subjekt zu behandeln, das eine Lebererkrankung, eine Leber-bedingte Störung oder eingeschränkte Leberfunktion hat oder zu haben im Verdacht steht, die entweder von einer Krankheit oder von einer Verletzung herrühren (z.B. einem fulminanten Nierenversagen (FHF), auf eine Lebertransplantation wartend oder nach einer Leberabstoßung auf eine Retransplantation einer Leber wartend). Der Begriff „behandeln" oder „Behandlung" wie hierin verwendet umfasst Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von Blut, die mit den serumfreien Zellen der Erfindung für eine Zeit in Kontakt gewesen ist, die ausreichend ist, um das Blut zu reinigen, bevor es dem Individuum zurückgegeben wird. Der Begriff „säubern" oder „reinigen" wie hierin verwendet bedeutet Entfernen von ungewollten und unerwünschten Molekülen aus dem Blut des Individuums. Darüber hinaus umfasst der Begriff „säubern" oder „reinigen" ferner die Freisetzung von erwünschten Molekülen aus den Zellen der Erfindung in das Blut, bevor es dem Individuum zurückgegeben wird. Der Begriff „therapeutisch wirksam" wie hierin verwendet schließt die Fähigkeit ein, die Auswirkungen einer Leberstörung oder einer eingeschränkten Leberfunktion in einem Individuum, das auf die Behandlung mit Zellen der Erfindung anspricht, zu verbessern. Der Begriff „verbessern" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Mildern der Erkrankung des ansprechenden Individuums. Bei dem Individuum der Behandlung handelt es sich bevorzugt um einen Menschen, es ist jedoch vorgesehen, dass jedes Tier mit einer Leberstörung, Lebererkrankung oder einer eingeschränkten Leberfunktion mit serumfreien C3A Zellen behandelt wird.
Fulminantes Leberversagen ist eine schwere hepatozelluläre Funktionsstörung, die im Allgemeinen durch eine virale Hepatitis, Reaktionen auf Medikamente oder eine Vergiftung verursacht wird, bei der typischerweise innerhalb von acht Wochen nach dem Beginn von Symptomen eine Encephalopathie auftritt (Bernau, J. et al., Sem. Liv. Dis. 6: 97-106 (1986); Yanda, R.J., West. J. Med. 149: 586-591 (1988); Katelaris, P.H. et al., Med. Clinics N. Amer. 73: 955-970 (1989)). Eine Behandlung von FHF oder einer anderen Lebererkrankung beinhaltet Züchten von Zellen der Erfindung in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung und Reinigen des Bluts eines Individuums. Die Spiegel von Leber-spezifischer biologischer Aktivität, die wirksam sind, ein Individuum, das an FHF, Nierenversagen oder eingeschränkter Leberfunktion leidet, zu behandeln oder zu verbessern, sind solche, die normale oder annähernd normale Spiegel von Serumproteinen, Gerinnungsfaktoren, Aminosäuren und anderen Metaboliten zur Folge haben, die normalerweise in der Leber produziert oder von ihr metabolisiert werden. Diese verschiedenen Moleküle und metabolischen Produkte und ihre physiologischen sowie pathologischen Konzentrationsbereiche oder Spiegel sind wohlbekannt und sind in Braunwald, E. et al., Hrsg. Harrison's Principles of Internal Medicine, aktuelle Ausg., McGraw-Hill, New York, N.Y. ausgeführt, was hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist.
Die Leber-spezifischen Eigenschaften der serumfreien C3A-Zelllinie machen sie besonders nützlich in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung, indem sie die Probleme anderer Zellen bewältigt, die in solchen Vorrichtungen eingesetzt werden. Serumfreie C3A-Zellen sind permanent in der Lage, lebenswichtige Funktionen der Leber zu reproduzieren, und gut differenziert. Wenn sie in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung eingesetzt werden, sind die Zellen in der Lage, Leber-spezifische biologische Aktivitäten in einer Menge zu exprimieren, die wirksam ist, einem Individuum bei einem Nierenversagen oder einer eingeschränkten Leberfunktion über lange Zeiträume hinweg zu helfen. Somit stellen die serumfreien C3A Zellen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereit, die Leberfunktion zu unterstützen. Dies stellt genügend Zeit zur Verfügung, dass eine Regeneration der Leber eintreten kann ebenso wie es eine bessere Umgebung für eine Regeneration der Leber bereitstellt, indem es im Kreislauf befindliche Toxine entfernt. Darüber hinaus werden Individuen, bei denen sich die Lebern nicht regenerieren, am Leben gehalten, während sie auf eine Transplantation warten. Das Verfahren der Verwendung von serumfreien C3A-Zellen in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung stellt auch ein Mittel bereit, das es den Individuen ermöglicht, sich nach einem Leberversagen vor der Transplantation einer ersten Leber zu erholen. Auch bei denjenigen Individuen, die zweite Nottransplantate benötigen, ermöglicht die Verfügbarkeit einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung diesen sich zu erholen, bevor sie sich einer zweiten größeren Operation unterziehen.
Sofern erforderlich werden die serumfreien C3A-Zellen genetisch modifiziert, so dass sie eine heterologe Nucleinsäuresequenz (wie hierin beschrieben) enthalten, deren Expression und anschließendes Funktionieren besonders vorteilhaft für ein Individuum wäre, das eine Leberstörung aufweist oder an einer eingeschränkten Leberfunktion leidet. Membranen oder Kapillaren einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung erlauben die Reinigung von Blut, indem sie den Übertritt von gelösten toxischen Stoffen aus dem Blut zu in der Vorrichtung gezüchteten Zellen erlauben (z.B. diffundieren gelöste molekulare Spezies wie z.B. Bilirubin durch die Membran und werden aufgenommen und metabolisiert) ebenso wie sie die Diffusion von lebenswichtigen Metaboliten aus in der Vorrichtung gezüchteten Zellen in das Blut gestatten, welches an das Individuum zurückgegeben wird, das sich einer Behandlung unterzieht. Die selektiv permeable oder semipermeable Eigenschaft der Membran einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung stellt auch eine mechanische Barriere gegenüber Komponenten des Immunsystems aus dem Blut eines Individuums bereit, das die Vorrichtung benutzt. Die Membran oder die Kapillare weist üblicherweise einen Molekulargewichtsausschluss von etwa 20.000 Dalton bis zu etwa 80.000 Dalton auf, im Allgemeinen etwa 30.000 Dalton bis etwa 50.000 Dalton. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Membran jedoch Poren von etwa 0,1 μm bis etwa 0,3 μm im Durchmesser, üblicherweise etwa 0,2 μm. Eine Porengröße in diesem Durchmesserbereich schließt zelluläre Elemente aus, während sie es Proteinen und Protein-Komplexen erlaubt, zu passieren und so einen Mangel an Serumproteinen eines Individuums, das an einer Lebererkrankung leidet, verbessert.
Solche Vorrichtungen, deren Verfahren, Verwendung und Wirkmechanismen sind einem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt. Es wird in Betracht gezogen, dass eine beliebige solche Vorrichtung – von denen mehrere Bauweisen in der Literatur diskutiert sind – die in der Lage ist, lebende Zellen in Kultur zu halten, mit den Zellen der Erfindung verwendet wird. Bio-artifizielle Leber-Vorrichtungen sind beispielsweise von Viles et al. ( U.S. Patent Nr. 4,675,002 und 4,853,324 ); Jauregin ( GB 2,221,857A ); Wolf et al. (International J. of Artificial Organs 2: 97-103 (1979); Wolf et al. (International J. of Artificial Organs 1: 45-51 (1978); und Ehrlich et al. (In Vitro 14: 443-450 (1978)) beschrieben, die alle hierin unter Bezugnahme aufgenommen sind. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die bio-artifizielle Leber-Vorrichtung einen Hohlfasereinsatz oder einen ähnlichen Perfusionsapparat ein, der wie vorstehend beschrieben über eine Membran oder eine Kapillare verfügt.
In einer anderen Ausführungsform kann auch ein Bioreaktor, wie z.B. ein Hohlfaser-Bioreaktor als eine bio-artifizielle Leber-Vorrichtung verwendet werden, indem er den Zellen der Erfindung erlaubt, als eine perfundierte Leber zu fungieren. Bioreaktoren, die Einsätze oder andere ähnliche Perfusionsvorrichtungen benutzen, die in der Lage sind, hohe Zellzahlen zu generieren, können Leber-spezifische bio logische Aktivität ersetzen oder die präzise Beurteilung des Metabolismus der menschlichen Leber ermöglichen (wie vorstehend diskutiert). Hohlfasereinsätze sind Zweikammereinheiten, welche die dreidimensionalen Eigenschaften normaler Organe reproduzieren (Knazek, R.H., Feder. Proc. 33: 1978-1981 (1974); Kultur, K. et al., Biotechnol. Bioeng. 23: 79-95 (1983), welche hierin unter Bezugnahme aufgenommen sind). Kultur- oder Wachstumsmedium wird durch den Kapillarraum zirkulieren gelassen und die Zellen der Erfindung – die nach dem Aussäen in dem extrakapillären Raum gewachsen sind – werden mit einem konstanten Zufluss von frischem Medium versorgt (Tharakan, J.P. et al., Biotechnol. Bioeng. 28: 1605-1611 (1986). Üblicherweise werden 1400 cm² große Einsätze mit einer effektiven Zahl von Zellen angeimpft (z.B. ungefähr 1 × 10⁹ Zellen) und in etwa 14 bis etwa 21 Tagen bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Solche Hohlfaser-Kultursysteme sind wohlbekannt (z.B. Heifetz et al., BioTechniques 7: 192-199 (1989); Donofrio, D. Amer. Biotech. Lab. Sept. 1989, Veröffentlichung #940; hierin unter Bezugnahme aufgenommen) und im Handel erhältlich (z.B. die Anchomet-Serie).
Auf Hohlfaser basierende Systeme bieten mehrere Vorteile, wenn sie in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung verwendet werden. Die Einsätze fördern das Wachstum von Kulturen mit einer sehr hohen Dichte. Basierend auf dem extrakapillären Volumen werden 15 bis 20 g Zellen in einer 1400 cm² großen Einheit wachsen gelassen und 100 g Zellen werden in einer 7000 cm² großen Einheit wachsen gelassen. Diese Menge an Zellmasse ist in der Lage, Leberunterstützung für ein Individuum bereitzustellen, das an Leberversagen leidet. Auch sind Zellen, die in Einsätzen gewachsen sind, polarisiert und ihr Wachstum kommt einer normalen Leberstruktur nahe. Die Zellen erhalten Nährstoffe aus dem Kapillarraum und sezernieren Abfallprodukte in den extrakapillären Raum. Dieser extrakapilläre Raum wird perfundiert, um die Ansammlung toxischer Produkte zu verhindern. Der kontinuierliche Fluss von Medien und der Inline-Oxygenator stellen eine konstantere Versorgung mit Sauerstoff und Energie zur Verfügung.
Größtenteils beabsichtigt man, die bio-artifiziellen Leber-Vorrichtungen mit den Zellen der Erfindung zu verwenden, in erster Linie um Blut aufzubereiten, indem man sie außerhalb des Körpers an ein Subjekt anschließt (z.B. typischerweise eine Flüssigkeitsverbindung von der Vorrichtung zu der Blutversorgung des Subjekts herstellt, normalerweise zwischen einer Arterie und einer Vene). Eine solche Anordnung ist besonders nützlich, um eine temporäre Leberunterstützung für Subjekte zur Verfügung zu stellen, die an einer Leberstörung (z.B. FHF) leiden. Alternativ wird die Zelllinie innerhalb des Körpers als eine bio-artifizielle Leber oder als eine bio-artifizielle Leberunterstützung eingesetzt. Wenn sie auf diese Weise verwendet werden, werden die Zellen der Erfindung für eine interne Anwendung eingekapselt oder in Hohlfaserkapillarmembranen wachsen gelassen. Üblicherweise heften sich die Zellen beim Wachsen an den Träger an. Es können jedoch Bindungsstoffe bereitgestellt werden, um die Zellen an einen Träger anhaften zu lassen ( GB 2,221,857A ). Zellen der Erfindung sind in Biomaterial wie z.B. Alginat-Polylysin-Membranen eingekapselt, wie von Cai et al. gelehrt (Artificial Organs 12: 388-393); Sun et al. (Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, Bd. XXXII: 39-41 (1986); O'Shea et al. (Biochimica Biophysica Acta 804: 133-136 (1984); Sun et al. (J. Controlled Release 2: 137-141 (1985); und U.S. Patent Nr. 4,391,909 , von denen alle hierin unter Bezugnahme aufgenommen sind.
Die verkapselten Zellen und Vehikel-Kapseln werden dann intraperitoneal in das Individuum injiziert.
Außerdem können die Zellen der Erfindung in einem synthetischen Leberartigen Gewebe verwendet werden, das Fibroblasten und C3A-Hepatocyten der Erfindung umfasst. Normalerweise nimmt eine Cokultur von Fibroblasten und Hepatocyten nicht automatisch die Anordnung an, die normalerweise in der Leber zu finden ist, und weil die zwei Zelltypen dann schlecht miteinander kommunizieren, sind die Hepatocyten häufig funktionell ineffizient. Toner et al. (Herbst-Treffen der Materials Research Association, 1.-5. Dezember 1997; Nature 39: 128 (1988) beschreiben jedoch das Bedrucken eines Substrats (z.B. eines Borosilikat-Wafers) mit Hilfe von photolithographischen Standardtechniken der Mikroelektroniktechnologie mit gemusterten Filmen von Kollagen, das die Zelladhäsion fördert. Hepatocyten der Erfindung können dann auf solchen Oberflächen gezüchtet werden, wobei sie nur an den mit Kollagen beschichteten Regionen anhaften. Fibroblasten werden dann auf den blanken Oberflächenregionen aufgebracht, was ein inniges Gemisch der zwei Zelltypen in einem wiederkehrenden Muster erzeugt, was jedes beliebige Verhältnis von Zelltypen auf der Oberfläche erlaubt, was eine Anpassung an jeden beliebigen physiologischen Wert erlaubt. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann jede(s) beliebige Muster, Größe, Form und Nummerndichte abgeleitet und in einem solchen artifiziellen Lebergewebe auf Bestellung konstruiert werden.
Ohne dies weiter auszuführen, ist es anzunehmen, dass ein Durchschnittsfachmann unter Verwendung der vorangehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollem Ausmaß nutzen kann. Die folgenden Beispiele sind ausschließlich zum Zweck der Veranschaulichung aufgeführt, wie die Zellen oder Zelllinien der vorliegenden Erfindung herzustellen und zu verwenden sind, und sind nicht dazu gedacht, noch sollten sie dahingehend ausgelegt werden, den Schutzbereich dessen zu beschränken, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten. Soweit nachstehend nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsanteile, Molekulargewicht ist das gewichtsgemittelte Molekulargewicht, Temperatur ist in Grad Celsius und Druck ist atmosphärisch oder annähernd atmosphärisch.
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG EINES SERUMFREIEN C3A-KLONS
Sieben im Handel erhältliche serumfreie Formulierungen und eine maßgeschneiderte serumfreie Formulierung (Hepatix Inc.) wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, das gleich bleibende Wachstum von C3A-Zellen während der Passagierung zum Serum-unabhängigen Status zu unterstützen:

(1) JRH Biosciences' ExCell 620 – Medium (Produkt #14620-79P), ergänzt mit 2 mM Glutamin;
(2) Gibco's Hepatozyme-SFM (Katalognummer #17705-021), ergänzt mit L-Glutamin
(3) Gibco's Aim V Medium (Katalognummer #12055-091);
(4) HyClone's HyQ-CCM4 Medium (Katalognummer #SH30106.02);
(5) Irvine Scientific's 15293 Medium (Katalognummer #99269);
(6) Clonetic's Hepatocyte Maintenance Medium (Katalognummer # CC-3197), ergänzt mit Insulin und Dexamethason;
(7) BioWhittaker Hepatocyten-Medium-Prototyp (Ref ~ 97-0454), ergänzt mit Glucagon, Insulin, Dexamethason, Natriumselenit, Trijodthyronin (T3) und Linolsäure/Rinderserumalbumin (Hepatix-Ergänzungsstoffe); und
(8) eine serumfreie Hepatix-Medienformulierung, bestehend aus 25% Waymouth MAB 87/3 Medium (Gibco Katalognummer #86-4124EL) und 75% Minimum Essential Medium (Gibco Katalognummer #41500-018), ergänzt mit Glucagon, Insulin, Dexamethason, Natriumselenit, Trijodthyronin und Linolsäure/Rinderserumalbumin.

Ein konfluentes Fläschchen von C3A-Zellen wurde mit Trypsin behandelt, dann durch Zugabe von serumhaltigem Komplettmedium (5% Rinderkälberserum) (Hepatix Inc. MM Medium von HyClone, Katalognummer #SH3A323.01) neutralisiert. Die Zellen wurden anschließend in Aliquots von 5 × 10⁶ lebensfähigen Zellen aufgeteilt und wieder für 5 Minuten bei 25°C zentrifugiert (100 UpM). Jedes Pellet, das durch die Prozedur erzeugt worden war, wurde in einem 50:50-Gemisch eines serumhaltigen Hepatix MM-Mediums und eines der acht serumfreien Medien resuspendiert, die vorstehend aufgeführt sind. Die Zellkulturen wurden für eine Woche (drei Fütterungen im gleichen Abstand) in dem jeweils entsprechenden 50:50 Mediengemisch wachsen gelassen und gehalten.
Bei Konfluenz wurden die Zellen wieder mit Trypsin behandelt, gesplittet (im Verhältnis 1:8) und wie beschrieben in Kulturmedium überführt, außer dass der serumhaltige Teil des Mediums reduziert wurde (z.B. von 50% auf ein 25:75 Gemisch von serumhaltigem und serumfreiem Medium). Die Zellen wurden wie vorstehend gefüttert und gehalten.
Während der dritten Zellpassage in gemischtem serumhaltigen und serumfreien Medium, wurden die Zellen von jeder Kultur geerntet und in ein serumfreies Medium überführt (eines der acht serumfreien Medien, die vorstehend aufgeführt sind). Die Zellen wurden vier Mal unter den vorstehend beschriebenen Kulturbedingungen passagiert. Zellen in den serumfreien Medien Gibco's Hepatocyme-SFM und HyClone's HyQ-CCM4 (Nr. 2 und 4) zeigten eine abgerundetes Erscheinungsbild, das dem Verlust an Oberflächenhaftung zugeschrieben wurde.
BEISPIEL 2
VERGLEICH DER WACHSTUMSRATEN DES C3A-KLONS IN VERSCHIEDENEN SERUMFREIEN MEDIEN
Nach vier Passagen in 100% serumfreiem Medium wurde eine vergleichende Analyse der Wachstumsraten an Zellen von jeder der acht Kulturen durchgeführt. Die Wachstumsrate wurde mit dem Promega MTS Assay-System im Medium Nr. 1, 3 bzw. 5 getestet (JRH Biosciences' ExCell 620, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin; Gibco's Aim V bzw. Irvine Scientific's IS293). Das gleichmäßigste Wachstum wurde bei Zellen bestimmt, die in Medium Nr. 1 (JRH Biosciences' ExCell 620) gehalten worden waren. Folglich wurde dieses Medium anschließend verwendet, um klonale Isolate von serumfreien Zellen herzustellen.
BEISPIEL 3
ERZEUGUNG VON KLONALEN C3A-ZELLKOLONIEN
Klone wurden durch Grenzverdünnung in einer Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt (2,5 Zellen pro Vertiefung in serumfreiem JRH Biosciences' ExCell 620 Medium (JRH-SFM)). Unter Verwendung dieser Strategie wurden 12 getrennte Klone angesetzt, geerntet, expandiert und anschließend kryokonserviert. Von den zwölf klonalen Isolaten wurde ein Klon (als 2.5B1 bezeichnet) für die weitere Entwicklung ausgewählt.
Der Klon 2.5B1 bei Passage Null (P0) wurde 21 Tage nach dem Ausplattieren geerntet. Er wurde für 4 Tage (P1) neu ausplattiert (Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen), mit Trypsin behandelt und zur Expansion in JRH-SFM (Nr. 1) in eine T25-Flasche ausgesät (P2). Zwölf Tage später wurde er geerntet, für 2 Tage in eine andere T25-Flasche neu ausplattiert (P3), anschließend in eine T75-Flasche (P4) gesplittet (1:3), dann ungefähr alle sieben Tage gesplittet (1:8), mit Fütterungen mit JRH-SFM drei Mal pro Woche. Die klonale Kultur 2.5B1 wurde 14 Mal erfolgreich passagiert, mit über 30 Verdopplungen der Population seit P2.
BEISPIEL 4
CHARAKTERISIERUNG DER KLONALEN C3A-ZELLKOLONIEN

Eine Charakterisierung der klonalen serumfreien Kolonie 2.5B1 maß die Sezernierungsraten der zwei menschlichen Proteine (d.h. menschliches Alphafötales Protein (AFP) und menschliches Albumin), die in den Zellen des Klons exprimiert werden. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Daten zeigen, dass ungefähr 27,5 × 10⁶ Zellen, die von dem Klon 2.5B1 erzeugt worden waren, im Durchschnitt 390 μg Albumin und 96 μg AFP in einem Zeitraum von 24 Stunden produzieren (n = 6). TABELLE 1

PASSAGE NUMMER	GEERNTETE GESAMTZELLEN (X 10E6)	TAGE IN KULTUR	GESAMTVERDOPPLUNGEN DER POPULATION SEIT P2	% LEBENSFÄHIGKEIT (TRYPANBLAU)	GESAMT ALBUMIN (μg)	GES. AFCP (μg)
P4	40.10	6	2.85	95	485	120
P5	26.08	7	5.15	95	342	69
P6	17.58	7	7.65	87	389	98
P7	29.00	7	11.16	95	416	103
P9	23.28	7	16.98	96	395	90
P10	28.96	7	20.35	95	310	93
AVG	27.550	7	-	94	390	96

Eine weitere Charakterisierung der Proteinexpression von diesen Zellen mit Hilfe von Western Blot – Techniken zeigte, dass diese serumfreien C3A-Zellen bei Passage 11 (P11) auch die folgenden isolierbaren Polypeptide exprimieren: (1) alpha-1-Antichymotrypsin, (2) alpha-1-Antitrypsin, (3) Antithrombin III, (4) Komplement C3, (5) Faktor V und (6) Transferrin (1; Western Blot mit 10% SDS-PAGE-Gelen).
BEISPIEL 5
VERGLEICH DER WACHSTUMSRATE DER KLONALEN C3A-ZELLE MIT DER WACHSTUMSRATE DER PARENTALEN C3A-ZELLE
Um festzustellen, ob die Passagierung und die klonale Ableitung der parentalen C3A-Zellen auf Serumunabhängigkeit deren Lebensfähigkeit oder deren Wachstums- und Haltungsfähigkeit beeinträchtigte, wurde die Wachstumsrate der serumfreien 2.5B1-Zellen mit der Wachstumsrate von Zellen von der parentalen C3A-Linie verglichen, wobei JRH-SFM-Medium verwendet wurde. Die Ergebnisse (2) zeigen, dass serumfreie 2.5B1-Zellen eine höhere Wachstumsrate und eine signifikant niedrigere Verdopplungszeit aufweisen als die parentalen C3A-Zellen. Die Daten zeigen eine Verdopplungszeit von ungefähr 24 Stunden für Zellen des Klons 2.5B1 an, wohingegen die Verdopplungszeit für die Zellen der parentalen C3A-Zelllinie ungefähr 35 Stunden betrug. Somit ist die Verdopplungszeit der Zellen der Erfindung in serumfreiem Medium geringer als etwa 70% der Verdopplungszeit von Zellen der entsprechenden C3A-Zelllinie in serumfreiem Medium.
BEISPIEL 6
SERUMFREIE KOLONIEN DES C3A-ZELLKLONS ZEIGEN EIN NORMALES
WACHSTUMSPROFIL

Die Normalität und die Lebensfähigkeit des serumfreien Klons 2.5B1 wurde gezeigt, indem dessen Wachstumsprofil untersucht wurde. Zellen von dem Klon 2.5B1 wurden wie vorstehend beschrieben auf einen Althin-Einsatz (Unisyn CP-3000) ausgesät und für neun Tage wachsen gelassen. Die Ergebnisse (Tabelle 2) weisen auf ein normales Wachstums- und metabolisches Profil hin. TABELLE 2

DATUM DER PROBE	ALBUMINPRODUKTION [mg/Tag]	GLUCOSEVERBRAUCH [g/Tag]
Tag 1	3.2	0.3
^Tag ²	17	0.96
Tag 3	41	2.3
Tag 4	92	4.1
Tag 5	172	7.1
Tag 6	256	9.0
Tag 7	540	12.4
Tag 8	600	14.0
Tag 9	602	15.0

BEISPIEL 7
BESTIMMUNG DES METABOLISMUS IN KOLONIEN VON SERUMFREIEN C3A-ZELLEN
Um die Machbarkeit der Verwendung der serumfreien C3A Zellen (Klon 2.5B1) als Surrogat-Hepatocyten zu testen, lassen sich mehrere entscheidende erforderliche metabolische Prozesse ohne weiteres bestimmen. Man kann in Experimenten messen, ob die Zellen unter Gewebekultur-Standardbedingungen aerob oder anaerob metabolisieren.
In anfänglichen Bestimmungen wird die Glucose-Verwertung in einfachen Einzelschichten gemessen, um die Glucose-Konzentration zu bestimmen (z.B. über einen Zeitraum von 24 Stunden hinweg). Die Glucose-Verwertung wird entweder unter Standardbedingungen untersucht oder in vorher mit Sauerstoff angereicherten Medien. Um festzustellen, ob die Verwertung überschüssiger Glucose auf das Versagen der Zellen zurückzuführen ist, Pyruvat durch den Citronensäure-Zyklus zu leiten, werden ähnliche Experimente in Gegenwart von Nitropropionsäure (NOP) durchgeführt. NOP ist ein Übergangsstadium-Analogon von Succinat, das die Succinat-Dehydrogenase irreversibel inaktiviert, was die Nutzung des Citronensäure-Zyklus verhindert (Alston, T.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 3767-3771 (1977)). Die Zugabe von NOP ist unter hypoxischen Bedingungen unwirksam, da der Citronensäure-Zyklus nicht aktiv ist. In mit Sauerstoff angereicherten Kulturen verschiebt NOP jedoch die Glucose-Verwertungskurve so, dass sie einer hypoxischen Kurve ähnelt. Eine entscheidende Variable beim Testen der metabolischen Aktivität der Zellen ist es zu gewährleisten, dass der metabolische Pfad nicht durch Sauerstoff limitiert und damit Enerige-limitiert ist. Das Ausmaß, in dem in Kultur gehaltene Zellen durch Sauerstoff limitiert sein können, ist weitgehend unerkannt. Die Synthese von Glucose und Harnstoff aus Lactat wird in T-Flaschen in Abwesenheit von zugesetztem Sauerstoff getestet.
BEISPIEL 8
BESTIMMUNG DER GLUCONEOGENESE-AKTIVITÄT IN SERUMFREIEN C3A-ZELLEN**

** Die Experimente, über die in den restlichen Beispielen berichtet wird, werden in luftdichten Gefäßen durchgeführt, die eine Atmosphäre von 95% O₂ + 5% CO₂ aufweisen und serumfreies Medium enthalten, das mit der gleichen atmosphärischen Gemisch begast ist.

Die Synthese von Glucose aus Lactat oder Aminosäuren ist eine wesentliche Leber-spezifische metabolische Funktion. Ölsäure stimuliert die Glucose-Produktion, da Fettsäuren Energie für den Prozess bereitstellen, während Lactat den Kohlenstoff liefert. Die Glucosesyntheseraten werden gemessen, um zu bestimmen, ob die Rate der Glucose-Synthese in serumfreien C3A-Zellen ähnlich der Rate der Glucose-Synthese in perfundierter Rattenleber oder in isolierten Rattenhepatocyten ist (Krebs, H.A. et al., S. 269-291 (1976)). Die Bestimmung dieser Rate ist ein Maß für den Energiefluss durch einen gesamten Leber-spezifischen Reaktionspfad, nicht nur eine Messung auf der Ebene eines einzelnen Enzyms. Ein solches Maß gibt an, ob wichtige gluconeogene Enzyme, Pyruvatcarboxylase, Phosphoenolpyruvatcarboxykinase und Fructosediphosphatase in serumfreien C3A-Zellen ausreichend exprimiert und entsprechend reguliert sind.
BEISPIEL 9
BESTIMMUNG DER GLYCOGENSYNTHESE UNTER VERWENDUNG VON SERUMFREIEN C3A-ZELLEN
Newgard et al. (Biol. Chem. 258: 8046-8052 (1983)) verwendeten eine Doppelmarkierungstechnik, die den prozentualen Anteil der verabreichten Glucose quantifizierte, die vor der Ablagerung als Glycogen zuerst den glycolytischen Reaktionspfad durchlief, um zu zeigen, dass die Verabreichung von Glucose an ausgehungerte Ratten zuerst einen Abbau zu Pyruvat zur Folge hatte und dann anschließend die Re-Synthese zu Glycogen, und nicht, wie erwartet, zur direkten Re-Synthese von Glycogen. In Anbetracht dieser Befunde stellt sich weiterhin die Frage nach der Lage des Ausgangspunkts des Glucose-Metabolismus unter solchen Bedingungen (Glucose kann zuerst durch ein peripheres Gewebe wie z.B. Muskel verwertet und dann als Lactat zur Leber zurückgeschickt werden, um zu Glucose-6-phosphat und Glycogen synthetisiert zu werden, oder alternativ könnte Glucose von unterschiedlichen metabolischen Zonen innerhalb der Leber unterschiedlich verwertet werden).
Um die Lage des Ausgangspunkts des Glucose-Metabolismus unter solchen Bedingungen zu bestimmen, können ähnliche Doppelmarkierungsstudien wie die von Newgard et al. mit serumfreien C3A-Zellen der Erfindung durchgeführt werden. Solche Studien zeigen, ob die Leber in der Lage ist, alle diese metabolischen Umwandlungen auszuführen. Wenn ¹⁴C-Glucose und ³H-Wasser gleichzeitig mit einer großen Menge von unmarkiertem Zucker verabreicht wird, kann der Großteil der Glucose erst durch Glycolyse abgebaut und dann zu Glycogen wieder aufgebaut werden, was durch die Menge von ³H angezeigt wird, die im Glycogen zu finden ist. Glucose, die die Glycolyse durchläuft und dann resynthetisiert wird, wird viel mehr ³H inkorporieren als Glucose, die direkt verwertet wird. Wenn markierte Glucose und ³H-Wasser für unterschiedliche Zeitdauer nach dem anfänglichen Bolus von Glucose verabreicht werden, werden abnehmende Mengen von Kohlenhydrat die Glycolyse durchlaufen, bevor es zu einer Einlagerung in Glycogen kommt, was durch eine abnehmende Menge von ³H relativ zu ¹⁴C angezeigt wird. Solche Ergebnisse würden darauf hinweisen, dass Glycolyse und Gluconeogenese gleichzeitig aktiv sind, aber dass es mit der Zugabe von Glucose ein allmähliches Umschalten zur direkten Synthese von Glycogen gibt.
BEISPIEL 10
BESTIMMUNG DES STICKSTOFF-METABOLISMUS UNTER VERWENDUNG VON SERUMFREIEN C3A ZELLEN
Die Leber ist das Hauptorgan für die Ausscheidung von Ammoniak und anderen Stickstoff enthaltenden Verbindungen, und ein Stickstoff-Ungleichgewicht ist eines der ernsteren metabolischen Probleme, mit denen ein Individuum konfrontiert ist, das an einer Leberstörung leidet. Daher wird die Fähigkeit von C3A Zellen bestimmt, Leberfunktionen auszuführen, indem man ihre Fähigkeit misst, Harnstoff aus Lactat und Ammoniumchlorid zu synthetisieren. Die so erhaltene Rate der Harnstoffsynthese wird mit Raten verglichen, die anhand von Messungen mit perfundierten Rattenlebern und isolierten Hepatocyten ermittelt wurden (Krebs, H.A. et al., S. 269-291 (1976)).
Bei einem Test des Stickstoff-Metabolismus werden serumfreie C3A-Zellen mit einer Serumprobe von einem Patienten inkubiert, der an einer Leberstörung (z.B. FHF) leidet. HeLa- oder HepaSK-Zellen können dann als eine Kontrolle für die Fähig keit eingesetzt werden, Stickstoffverbindungen zu metabolisieren. FHF-Serum enthält normalerweise erhöhte Spiegel von Ammoniak und Aminosäuren, besonders Phenylalanin und Ornithin. Eine Behandlung dieses Serums mit 0,5 g serumfreien C3A-Zellen für 3 Stunden misst die Fähigkeit, Ammoniak wieder unter normale Spiegel zu bringen, Harnstoff zu erhöhen und Aminosäurespiegel zu senken. Der Abbau von Phenylalanin (über Tyrosin unter der Einwirkung von Phenylalaninhydroxylase) kann während einer solchen Behandlung dramatisch abnehmen. Phenylalaninhydroxylase ist abhängig von Tetrahydrobiopterinreduktase, um das Coenzym für die Reaktion zu liefern.
Dieser Test misst auch den Fluss durch einen Leber-spezifischen Reaktionspfad indem er anzeigt, dass serumfreie C3A-Zellen den Metabolismus normaler Hepatocyten erreichen können.
BEISPIEL 11
BESTIMMUNG DES WACHSTUMS VON SERUMFREIEN C3A-ZELLEN IN HOHLFASER-EINSATZEN
Hohlfaser-Vorrichtungen für die Zellkultur sind in erster Linie für das Wachstum von Hybridomen bei der Produktion monoclonaler Antikörper eingesetzt worden (Heifetz, A.H. et al., BioTechniques 7: 192-199 (1989)). Da diese Vorrichtungen mit einem Inline-Oxygenierungssystem ausgestattet sind, ist zu erwarten, dass serumfreie C3A-Zellen besser arbeiten, wenn man sie in der Hohlfaser-Vorrichtung (z.B. einem Amicon FloqPath 1400 – Einsatz) statt in statischer Kultur wachsen lässt. Hohlfaser-Vorrichtungen haben einen zusätzlichen Vorteil, dass sie die dreidimensionale Architektur der normalen Leber nachahmen.
Glucoseverwertung und Albuminproduktion werden täglich überwacht. Der Einsatz wird mit ungefähr 1 × 10⁹ Zellen angeimpft. Da es derzeit keine Methode gibt, um die Zahl der Zellen genau zu messen, die in einem Einsatz angesiedelt sind, nachdem die Albuminproduktion abklingt, während die Kultur aufrecht erhalten wird, muss eine Schätzung durchgeführt werden (unter der Annahme, dass der extrakapilläre Raum der Vorrichtung vollständig belegt ist (= 20 ml), errechnet sich die Maximalzahl der Zellen von ungefähr 20 × 10⁹ oder 20 g dem Gewicht nach).
Unter normalen Kulturbedingungen in T-Flaschen oder Platten mit mehreren Vertiefungen (die wie vorstehend diskutiert Sauerstoff-limitiert sein können) können serumfreie C3A-Zellen in einer konfluenten Kultur etwa 390 μg Albumin/24 Stunden produzieren. Serumfreie C3A-Zellen, die man wie vorstehend beschrieben in einem Hohlfaser-Einsatz wachsen lässt, können diese Menge übertreffen. Die vorhergesagte Steigerung der Ausbeute von Albumin ist den physiologischen Kulturbedingungen zuzuschreiben, die Leber-ähnlicher sind, wenn man eine Hohlfaser-Vorrichtung verwendet.
BEISPIEL 12
EIN TIERMODELL FÜR DIE BEHANDLUNG EINES INDIVIDUUMS, DAS EINE LEBERSTÖRUNG ODER EINE EINGESCHRÄNKTE LEBERFUNKTION AUFWEIST, UNTER VERWENDUNG VON SERUMFREIEN C3A ZELLEN IN EINER BIO-ARTIFIZIELLEN LEBER-VORRICHTUNG
Serumfreie C3A-Zellen können in einem Tiermodell eingesetzt werden, das prädiktiv für menschliche Individuen ist, die wegen einer Leberstörung oder einer Lebererkrankung behandelt werden, wobei eine ähnliche Methodik zum Einsatz kommt. Man lässt die serumfreien Zellen wie vorstehend beschrieben in Hohlfaser-Einsätzen oder anderen bio-artifiziellen Leber-Vorrichtungen auf hohe Dichten wachsen. Dies gestattet es den Zellen, ähnlich wie eine perfundierte Leber zu funktionieren. Eine bio-artifizielle Leber-Vorrichtung, die auf diese Weise unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird in Experimenten eingesetzt, die Individuen nachbilden, die an einer schweren Leberstörung (zb FHF) leiden. Leberstörungen werden in Tieren nachgestellt, denen man eine subletale Dosis Acetaminophen injiziert hat, und die Parameter der Leberfunktion werden während des ganzen Behandlungsplans überwacht.
Unter sterilen Bedingungen und unter Vollnarkose wird in einem Tier (z.B. in einem Hund) ein Shunt zwischen der Halsschlagader und der inneren Halsvene hergestellt. Es wird ein Einschnitt entlang der vorderen Grenze des Sternocleidomastoideus gemacht und die Halsschlagader und die innere Halsvene werden freigelegt. Beide Gefäße werden auf der Höhe des Kieferwinkels ligiert und es wird ein Shunt zwischen den beiden Gefäßen hergestellt. Es werden silastische Dialyse-Katheter eingenäht, durch den Einschnitt nach außen geführt, und die Wunde wird mit 4/0-Seide verschlossen. Die Tiere werden beobachtet, bis sie sich von der Narkose erholen und anschließend sechs Stunden später untersucht. Schmerz wird über wacht und nach 6 Stunden wird nach Bedarf Acetaminophen (100 mg/kg) verabreicht. Die Nähte werden nach einer Woche entfernt und die Dialyse wird erst begonnen, wenn sich der Shunt vollständig entwickelt hat. Der Anschluss einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung wird hergestellt, indem man den Einsatz über Dialyse-Katheter an die afferenten und efferenten Enden des Shunts anschließt. Die Wunde bleibt während der ganzen Zeit mit chrirurgischem Pflaster abgedeckt, um eine Verletzung an der Shunt-Stelle zu vermeiden. Injektionen von Acetaminophen (750 mg/kg bei der ersten Dosis, 200 mg/kg für die zwei weiteren) werden von einer subkutanen Injektion mit 1% Xylocain begleitet, um eine lokale Schmerzreaktion zu vermeiden. Die Schädigung der Leber in der Gruppe, die eine subletale Dosis erhält, verursacht keine schweren Symptome, wohingegen die Gruppe, die die letale Dosis erhält, Anorexie, Erbrechen und Durchfall im präkomatösen Zustand durchmacht. Nach dem Modell von Francavilla et al. (Gastroenterology 96: 470-478 (1989)) werden den Kontrolltieren (Tiere, die eine Leberdialyse erhalten, sind asymptomatisch) keine weiteren Medikamente verabreicht. Eine bio-artifizielle Leber-Vorrichtung, die in Kultur gehaltene Zellen der Erfindung enthält, wird dann dazu verwendet, Toxine zu entfernen, Bilirubin zu konjugieren, ein normales Aminosäureprofil wieder herzustellen und Serumproteine und Gerinnungsfaktoren zu ersetzen. Eine solche Behandlung verhindert den Tod des Tiers.
Die bio-artifizielle Leber-Vorrichtung wird auch dazu eingesetzt, Leberfunktionen in hepatischen Hunden zu unterstützen, denen eine lethale Dosis von Acetaminophen gegeben wurde. Die Hunde wurden durch zeitweilige extrakorporale Leberdialyse am Leben gehalten.
Die vorangehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um einen Durchschnittsfachmann in die Lage zu versetzen, die Erfindung auszuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzbereich nicht durch die hinterlegte Zelllinie beschränkt sein, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Veranschaulichung einer Ausführungsform der Erfindung gedacht ist, und beliebige Zelllinien, die funktionell gleichwertig sind, sind innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung. Die Hinterlegung des Materials stellt keine Anerkenntnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzureichend ist, die Ausführung von einer beliebigen Ausführungsform der Erfindung zu ermöglichen, einschließlich der bestmöglichen Ausführungsform davon, noch ist sie als Beschränkung des Schutzbereichs der Ansprüche auf die spezielle Abbildung zu interpretieren, die sie darstellt. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denen, die hierin gezeigt und beschrieben sind, aus der vorangehenden Beschreibung offensichtlich werden und fallen in den Schutzbereich der Ansprüche im Anhang.

Claims

C3A klonale Zelllinie abgeleitet von einer parentalen C3A Zelllinie, wobei die Zelllinie die ATTC Hinterlegungsnummer CRL-12461 hat.
Klonale Zelllinie nach Anspruch 1, wobei die Zelllinie eine Verdopplungszeit in serumfreiem Medium hat, welche signifikant geringer als die Verdopplungszeit der parentalen Zelllinie in dem serumfreien Medium ist.
Klonale Zelllinie nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verdopplungszeit der klonalen Zelllinie in serumfreiem Medium weniger als etwa 70% der Verdopplungszeit der parentalen C3A Zelllinie in serumfreiem Medium ist oder im Bereich von weniger als etwa 50% bis weniger als etwa 70% der Verdopplungszeit der parentalen C3A Zelllinie in serumfreiem Medium ist.
Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen der in serumfreiem Medium gezüchteten Zelllinie ein einziges isolierbares Polypeptid oder eine beliebige Kombination einer Mehrzahl von isolierbaren Polypeptiden exprimieren.
Zelllinie nach Anspruch 4, wobei die Zellen ein einziges isolierbares Polypeptid oder eine beliebige Kombination einer Mehrzahl von isolierbaren Polypeptiden exprimieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Alpha fötalem Protein (AFP), humanem Albumin, α-1-Antichymotrypsin, α-1-Antitrypsin, Antithrombin III, Komplement C3, Faktor V und Transferrin.
Verfahren zur Herstellung eines einzelnen isolierbaren Polypeptids oder einer beliebigen Kombination einer Mehrzahl von isolierbaren Polypeptiden, umfassend: (a) Züchten der Zellen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in serumfreiem Medium; (b) Expression der Polypeptide von diesen Zellen; und (c) Gewinnen der Polypeptide aus der Kultur zur Herstellung eines isolierbaren Polypeptides.
Verfahren zur Herstellung der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend: (a) sequenzielle Züchtung von Zellen einer parentalen C3A Zelllinie in einer Serie von Medien, welche zunehmend absteigende Konzentrationen von Serum aufweisen, wobei das letzte Medium in der Serie serumfrei ist; (b) Erzeugen einer klonalen Zellkolonie aus den Zellen aus dem letzten Medium der Serie aus (a) in serumfreiem Medium; und (c) Vermehren der Kolonie in serumfreiem Medium zur Herstellung einer serumfreien Zelllinie.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine der Serien von Medien, welche zunehmend absteigende Konzentrationen von Serum in den sequenziellen Kulturserien aufweist, ein Verhältnis zwischen serumhaltigem und serumfreiem Medium von etwa 50:50 oder etwa 25:75 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das serumfreie Medium JRH Bioscience EXCell 620 Medium, ergänzt durch 2 mM L-Glutamin, ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das serumfreie Medium Gibco's Aim V Medium ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das serumfreie Medium Irvine Scientific's IS293 Medium ist.
Bio-artifizielle Leber-Vorrichtung, umfassend einen Apparat, welcher Zellen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält, wobei die Zellen in serumfreiem Medium auf einer Oberfläche in der Vorrichtung gezüchtet werden und zwar in einer Menge und mit einer leberspezifischen biologischen Aktivität in einer Höhe, welche ausreichend ist, um ein Subjekt zu stärken, welches eine Lebererkrankung oder eingeschränkte Leberfunktion hat.
Verfahren zur Herstellung einer bio-artifiziellen Vorrichtung, umfassend das Bereitstellung von Zellen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5 auf einer Oberfläche in der Vorrichtung und Züchten der Vorrichtung in serumfreiem Medium.
Verfahren zur Verwendung von Zellen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung, umfassend das Bereitstellen von Zellen auf einer Oberfläche in der Vorrichtung und Züchten der Zellen in der Vorrichtung in serumfreiem Medium.
Verfahren zur Herstellung von Protein, umfassend: (a) Züchten von Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in serumfreiem Medium zur Expression eines einzelnen isolierbaren Polypeptides oder einer beliebigen Kombination einer Mehrzahl von isolierbaren Polypeptiden; und (b) Gewinnen des Polypeptides/der Polypeptide zur Herstellung von Protein.
Verfahren zum Screenen auf metabolisch aktive Verbindungen, umfassend: (a) Bereitstellung einer Verbindung für Zellen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zellen in serumfreiem Medium gezüchtet werden; und (b) Analyse der Zellen auf die Anwesenheit von Stoffwechselprodukten der Verbindung zum Screenen auf metabolische Aktivität.
Verfahren zum Studium von enterischen Erkrankungen, umfassend: (a) Bereitstellung eines bakteriellen Organismus für Zellen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zellen in serumfreiem Medium gezüchtet werden; und (b) Nutzung der Zellen aus (a) zur experimentellen Verwendung zum Studium von enterischen Erkrankungen.
In vitro Verfahren zur Reinigung von Blut eines Subjektes, welches eingeschränkte Leberfunktion hat, umfassend: (a) Bereitstellung von Zellen der Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für eine Oberfläche in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung, wobei die Zellen in einer Menge und mit einer leberspezifischen biologischen Aktivität zur Verfügung gestellt werden, welche hoch genug ist, um das Subjekt mit der eingeschränkten Leberfunktion zu stärken; (b) Züchten der Zellen in der Vorrichtung in serumfreiem Medium; und (c) Passage von Blut des Subjektes, um mit den Zellen in Kontakt zu treten, wobei das Inkontaktbringen zur Entfernung von Molekülen im Blut führt, die in die Vorrichtung eintreten und zur Abgabe von Molekülen aus den Zellen in Blut führt, das aus der Vorrichtung austritt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Subjekt ein Mensch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Verwendung einer Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Lebererkrankungen, Leberstörungen oder eingeschränkter Leberfunktion.
Verwendung einer Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welche auf einer Oberfläche in einer bio-artifiziellen Leber-Vorrichtung zur Verfügung gestellt wird, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Lebererkrankungen, Leberstörungen oder eingeschränkter Leberfunktion.