DE60300681T2 - Dedifferenzierte, programmierbare stammzellen monozytären ursprungs, sowie deren herstellung und verwendung - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft adulte dedifferenzierte programmierbare Stammzellen abgeleitet von humanen Monozyten, sowie deren Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung von Körperzellen und Geweben. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um autologe humane Stammzellen, d.h. die monozytäre Ursprungszelle stammt von demjenigen Patienten, der mit der aus der Ursprungszelle hervorgegangen Stammzelle bzw. mit den aus dieser Stammzelle hervorgegangenen Körperzellen therapiert werden soll.
  • Im Stand der Technik werden als "Stammzellen" solche Zellen bezeichnet, welche (a) die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und (b) die Fähigkeit zur Bildung mindestens eines und vielfach zahlreicher spezialisierter Zelltypen durch ihr asymmetrisches Teilungsvermögen besitzen (vgl. Donovan, P. J., Gearhart, J., Nature 414: 92–97 (2001)). Als "pluripotent" werden Stammzellen bezeichnet, die sich in im wesentlichen alle denkbaren Zelltypen des menschlichen und tierischen Körpers differenzieren können. Derartige Stammzellen sind bisher nur aus embryonalem Gewebe bzw. aus embryonalem Karzinom (testikularem Tumor) erhältlich (vgl. Donovan, P. J., Gearhart, J., a.a.O.). Die Verwendung embryonaler Stammzellen wird in der Öffentlichkeit insbesondere in Deutschland umfangreich diskutiert und als außerordentlich problematisch betrachtet. Neben der mit embryonalen Stammzellen verbundenen ethischen und rechtlichen Problematik, stößt auch der therapeutische Einsatz derartiger Zellen auf Schwierigkeiten. Naturgemäß stammen embryonale Stammzellen von Spenderorganismen, die gegenüber den potentiellen Empfängern von aus diesen Zellen hervorgegangenen differenzierten Zellen oder Gewebe (nachfolgend als somatische Zielzellen oder Zielgewebe bezeichnet), heterolog sind. Es ist somit zu erwarten, daß derartige Zielzellen in den potentiellen Empfängern eine immunologische Sofortantwort im Sinne der Abstoßung auslösen werden.
  • Stammzellen lassen sich auch aus verschiedenen Geweben adulter, d.h. ausdifferenzierter Individuen isolieren. Derartige Stammzellen werden im Stand der Technik als "multipotente adulte Stammzellen" bezeichnet. Sie spielen im Körper eine Rolle bei der Geweberegeneration und bei der Homöostase. Der wesentliche Unterschied zwischen embryonalen pluripotenten Stammzellen und adulten multipotenten Stammzellen liegt in der Zahl der differenzierten Gewebe, die aus den jeweiligen Zellen gewonnen werden können. Ursache hierfür ist vermutlich, daß pluripotente Stammzellen aus Samenzellen oder aus Zellen hervorgehen, die Samen produzieren können, während adulte multipotente Stammzellen aus dem Körper oder dem Soma adulter Individuen stammen (vgl. Donovan, P. J., Gearhart, J., a.a.O., Seite 94), die zur Samenproduktion nicht in der Lage sind.
  • Die eigentliche Problematik bezüglich der Gewinnung und Verwendung adulter Stammzellen beruht jedoch auf dem seltenen Vorkommen dieser Zellen. So finden sich im Knochenmark Stammzellen nur im Verhältnis von 1:10.000; im peripheren Blut von 1:250.000 und in der Leber im Verhältnis von 1:100.000. Die Gewinnung derartiger Stammzellen ist somit sehr aufwendig und für den Patienten belastend. Darüber hinaus ist die Generierung großer Zellmengen, wie sie zur klinischen Therapie benötigt werden, mit vertretbarem Aufwand bisher kaum möglich.
  • Dem steht ein ständig wachsender Bedarf an Möglichkeiten zur Behandlung von zerstörtem Gewebe im Sinne des "tissue engineering" oder als zelluläre Therapie gegenüber, im Rahmen derer Haut-, Muskel-, Herzmuskel-, Leber-, Insel-, Nerven-, Neuronen-, Knochen-, Knorpel-, Endothel- und Fettzellen etc. zu ersetzen sind.
  • Entscheidend ist in diesem Zusammenhang die für die westliche Welt vorauszusehende Entwicklung des Alters- und Krankheitsprofils der Bevölkerung, die für die nächsten 10 Jahre eine drastische Wende auf dem Gesundheits- und Versorgungssektor der westeuropäischen Bevölkerung einschließlich USA und Kanada erwarten läßt. Allein für die Bundesrepublik Deutschland läßt die demografische Entwicklung bis zum Jahre 2015 einen Zuwachs der Bevölkerung in den Altersklasse von 45–64 Jahren um 21% und in der Gruppe der über 65-jährigen einen Zuwachs von 26% vermuten. Hieraus wird zwangsläufig eine Wandlung der Patientenstruktur und des behandlungsbedürftigen Krankheitsspektrums resultieren. Vorhersehbarerweise werden Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems (Hochdruck, Myocardinfarkt), Gefäßerkrankungen durch Arteriosklerose und Stoffwechselerkrankungen, metabolische Erkrankungen wie Diabetes mellitus, Leberstoffwechselerkrankungen, Nierenfunktionserkrankungen sowie durch altersbedingte Degeneration verursachte Erkrankungen des Knochen- und Knorpelgerüstes und degenerative Erkrankungen des Cerebrums durch neuronale und gliale Zellverluste zunehmen und innovative Behandlungskonzepte erforderlich machen.
  • Vor diesem Hintergrund erklären sich die immensen nationalen und internationalen Bemühungen an Forschung und Entwicklung beteiligter Fachleute, Stammzellen in die Hand zu bekommen, die sich in ausdifferenzierte gewebetypische Zellen (Leber, Knochen, Knorpel, Muskel, Haut etc.) programmieren lassen.
  • Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, adulte Stammzellen zur Verfügung zu stellen, deren Generierung keine ethischen und/oder rechtlichen Probleme verursacht, die schnell für den geplanten Therapieeinsatz in den hierfür erforderlichen Mengen und zu vertretbaren Herstellungskosten zur Verfügung stehen, und die beim Einsatz als "zelluläre Therapeutika" keine oder keine nennenswerten Nebenwirkungen im Sinne der zellulären Abstoßung und der Induktion von Tumoren, insbesondere von bösartigen Tumoren, in dem jeweiligen Patienten auslösen.
  • Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Herstellung von dedifferenzierten programmierbaren Zellen aus menschlichen Monozyten gelöst, die im Sinne der Erfindung nachfolgend als "Stammzellen" bezeichnet werden. Der Begriff "Dedifferenzierung" ist dem auf dem einschlägigen Gebiet tätigen Fachmann geläufig, vgl. beispielsweise Weissman I. L., Cell 100: 157–168, 4, (2000). Er bedeutet die Rückführung einer adulten, bereits spezialisierten (differenzierten) Körperzelle in den Status einer Stammzelle, d.h. einer Zelle, welche ihrerseits in eine Vielzahl von Zelltypen überführt (programmiert) werden kann. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Dedifferenzierung von Monozyten führt. Die auf diese Weise hergestellten Stammzellen lassen sich in zahlreiche verschiedene Zielzellen bzw. Zielgewebe umwandeln (programmieren), vgl. Beispiele. Die erfindungsgemäßen Stammzellen exprimieren neben dem für ausdifferenzierte Monozyten kennzeichnenden Oberflächenantigen CD14 mindestens einen, vorzugsweise zwei oder drei, der typischen Pluripotenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135. In besonders bevorzugter Weise exprimieren die erfindungsgemäß hergestellten Stammzellen sowohl das Oberflächenantigen CD14 als auch die vier Pluripotenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135; vgl. Beispiel 2, Tabelle 1. Vorzugsweise exprimieren die erfindungsgemäßen Stammzellen die membranassoziierten Monozyten-spezifischen Oberflächenantigene CD14 und mindestens einem Pluripotenzmarker, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CD117, CD123 und CD135. In besonders bevorzugter Weise, tragen die erfindungsgemäßen Stammzellen das CD14-Antigen in Kombination mit mindestens dem Pluripotenzmarker CD123 und/oder CD135 auf ihrer Oberfläche. Weniger als 3%, vorzugsweise weniger als 1% der erfindungsgemäßen Stammzellen exprimieren das CD34-Antigen. In am meisten bevorzugter Weise, exprimieren keine der erfindungsgemäßen Stammzellen das CD34-Antigen. Es werden damit erstmals adulte Stammzellen zur Verfügung gestellt, die innerhalb kurzer Zeit zu vorzugsweise autologen Geweben reprogrammierbar sind.
  • Die Generierung der erfindungsgemäßen Stammzellen ist für den Patienten völlig unbedenklich und – bei autologer Anwendung – mit einer Eigenblutspende vergleichbar. Die für die üblichen Therapieoptionen (s. oben) benötigte Menge an Stammzellen (108 bis 109 Zellen) kann innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach Blutabnahme kostengünstig bereitgestellt werden. Darüber hinaus erzeugt das für die Therapie vorgesehene Zellprodukt bei autologer Verwendung kein immunologisches Problem im Sinne der Zellabstoßung, da vorzugsweise Zellen und Empfänger genetisch identisch sind.
  • Die erfindungsgemäßen Stammzellen erwiesen. sich ferner im Tierversuch und in Kultur als risikolos bezüglich der Malignomentstehung, ein Ergebnis, welches aufgrund der monozytären Ursprungszelle, von der sich die erfindungsgemäßen Stammzellen ableiten, nicht anders zu erwarten ist.
  • Die wesentlichen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen humanen monozytären Ursprungs umfassen:
    • (a) Isolieren von Monozyten aus humanem Blut;
    • (b) Vermehren der Monozyten in einem geeigneten, Zell kulturmedium enthaltenden Kulturgefäß welches den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (nachfolgend als M-CSF bezeichnet) enthält und
    • (c) Kultivieren der Monozyten in Gegenwart von Interleukin 3 (IL-3);
    • (d) Gewinnen der humanen dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen, indem man die Zellen von dem Kulturmedium abtrennt.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens setzt man dem Zellkulturmedium in Stufe b) M-CSF und IL-3 gleichzeitig zu.
  • Es ist jedoch auch möglich, dem Zellkulturmedium in Stufe b) zunächst nur M-CSF zuzusetzen, um die Monozyten zu vermehren, und dem Zellkulturmedium nachfolgend IL-3 zuzusetzen.
  • Schließlich kann das Verfahren in Stufe b) auch auf solche Weise durchgeführt werden, daß man die Monozyten zunächst in einem nur M-CSF enthaltenden Zellkulturmedium vermehrt, dann das Medium von den Zellen abtrennt und anschließend ein zweites Zellkulturmedium verwendet, welches IL-3 enthält.
  • Vorzugsweise wird das Kulturmedium aus Stufe b) von dem am Boden des Kulturgefäßes haftenden Zellen abgetrennt und die humanen, dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen gewonnen, indem man die Zellen von dem Untergrund löst und isoliert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen ferner in Gegenwart einer Schwefelverbindung kultiviert. Die Kultivierung kann in einer gesonderten Verfahrensstufe erfolgen, die sich an die oben beschriebene Kultivierungsstufe b) anschließt. Sie kann jedoch auch in Stufe b) erfolgen, indem man dem Kulturmedium, vorzugsweise bereits zu Beginn der Kultivierung, ferner die Schwefelverbindung zusetzt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren führt überraschenderweise zur Dedifferenzierung der Monozyten, wobei die aus der Dedifferenzierung resultierenden adulten Stammzellen neben dem für ausdifferenzierte Monozyten typischen Oberflächenantigen CD14 auch mindestens einen oder mehrere, vorzugsweise sämtliche, der Pluripotenzmarker CD90, CD117, CD123 und CD135 exprimieren (vgl. Tabelle 1). Vorzugsweise exprimieren die erfindungsgemäßen Stammzellen das membranassoziierte Monozyten-spezifische Oberflächenantigen CD14 und mindestens einen Pluripotenzmarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CD117, CD123 und CD135. In besonders bevorzugter Weise tragen die erfindungsgemäßen Stammzellen das CD14-Antigen in Kombination mit mindestens dem Pluripotenzmarker CD123 und/oder CD135 auf ihrer Oberfläche. Weniger als 3%, vorzugsweise weniger als 1% der erfindungsgemäßen Stammzellen exprimieren das CD34-Antigen. In am meisten bevorzugter Weise exprimiert keine der erfindungsgemäßen Stammzellen das CD34-Antigen. Die Expression der jeweiligen Marker (Oberflächenantigene) kann mittels kommerziell erhältlicher Antikörper mit Spezifität gegenüber den jeweils zu ermittelnden Antigenen mit üblichen Immunnachweisverfahren nachgewiesen werden, vgl. Beispiel 2.
  • Da die Zellen während des Vermehrungs- und Dedifferenzierungsprozeßes am Boden des jeweiligen Kulturgefäßes haften, ist es erforderlich, die Zellen nach Abschluß der Dedifferenzierung vom Kulturmedium aus Stufe b) abzutrennen und vom Untergrund zu lösen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Zellkulturüberstand vor dem Ablösen der am Untergrund haftenden Zellen verworfen und nachfolgend vorzugsweise eine Spülung der haftenden Zellen mit frischem Kulturmedium vorgenommen. Im Anschluß an die Spülung wird erneut frisches Kulturmedium auf die am Untergrund haftenden Zellen gegeben, und es folgt dann der Schritt der Ablösung der Zellen vom Untergrund (vgl. Beispiel 13).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen im Anschluß an Stufe c) und vor Stufe d) mit einem biologisch verträglichen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht. Das biologisch verträgliche organische Lösungsmittel kann ein Alkohol mit 1–4 Kohlenstoffatomen sein, wobei die Verwendung von Ethanol bevorzugt ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Zellen im Anschluß an Stufe c) und vor Stufe d) mit der Dampfphase des biologisch verträglichen organischen Lösungsmittels in Kontakt gebracht.
  • Die Ablösung kann im übrigen auch mechanisch erfolgen, bevorzugt ist jedoch eine enzymatische Ablösung beispielsweise mit Trypsin.
  • Die so erhaltenen, frei im Medium flottierenden dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen können entweder direkt dem Reprogrammierungsprozeß zugeführt werden oder aber für einige Tage im Kulturmedium gehalten werden, wobei in letzterem Falle dem Medium vorzugsweise ein Zytokin oder LIF („leucaemia inhibitory factor") zugesetzt wird, um vorzeitigen Verlust der Programmierbarkeit zu vermeiden (vgl. Donovan, P. J., Gearhart, J., a.a.O., Seite 94). Schließlich können die Zellen zum Zwecke der Lagerung ohne Verlust der Programmierbarkeit tiefgefroren werden.
  • Die erfindungsgemäßen Stammzellen unterscheiden sich von den bisher bekannten pluripotenten Stammzellen embryonalen Ursprungs und von den bekannten adulten Stammzellen aus unterschiedlichen Geweben dadurch, daß sie neben dem membranständigen monozytenspezifischen Oberflächenantigen CD14 mindestens einen Pluripotenzmarker aus der Gruppe bestehend aus CD90, CD117, CD123 und CD135 auf ihrer Oberfläche tragen.
  • Vorzugsweise exprimieren die erfindungsgemäßen Stammzellen das membranassoziierte Monozyten-spezifische Oberflächenantigen CD14 und mindestens einen Pluripotenzmarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CD117, CD123 und CD135. In besonders bevorzugter Weise tragen die erfindungsgemäßen Stammzellen das CD14-Antigen in Kombination mit mindestens dem Pluripotenzmarker CD123 und/oder CD135 auf ihrer Oberfläche. Weniger als 3%, vorzugsweise weniger als 1% der erfindungsgemäßen Stammzellen exprimieren das CD34-Antigen. In am meisten bevorzugter Weise exprimiert keine der erfindungsgemäßen Stammzellen das CD34-Antigen.
  • Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Stammzellen können zu beliebigen Körperzellen reprogrammiert werden. Verfahren zum Reprogrammieren von Stammzellen sind im Stand der Technik bekannt, vgl. beispielsweise Weissman I. L., Science 287: 1442–1446 (2000) und Insight Review Articles Nature 414: 92–131 (2001), sowie das Handbuch "Methods of Tissue Engineering", Hrsg. Atala, A., Lanza, R. P., Academic Press, ISBN 0-12-436636-8; Library of Congress Catalog Card No. 200188747.
  • Die durch Reprogrammierung der erfindungsgemäßen Stammzellen erhaltenen differenzierten, isolierten somatischen Zielzellen und/oder Zielgewebe tragen weiterhin den membranständigen Differenzierungsmarker CD14 der Monozyten. Ferner exprimieren weniger als 3%, vorzugsweise weniger als 1% dieser somatischen Zielzellen und/oder dieses Zielgewebes gemäß der Erfindung das CD34-Antigen. In am meisten bevorzugter Weise exprimieren keine dieser Zellen oder Gewebe das CD34-Antigen. Wie in Beispiel 11 gezeigt, exprimieren Hepatozyten, welche von den erfindungsgemäßen Stammzellen abgeleitet sind, den für Monozyten typischen Oberflächenmarker CD14, während sie gleichzeitig das für Hepatozyten charakteristische Protein Albumin produzieren. Die von den erfindungsgemäßen Stammzellen abgeleiteten Hepato zyten sind somit von natürlichen Hepatozyten unterscheidbar. In gleicher Weise wurde der membranständige Oberflächenmarker CD14 auf Insulin-produzierenden Zellen nachgewiesen, die von den erfindungsgemäßen Stammzellen abgeleitet waren (Beispiel 9).
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen zur in vitro-Herstellung von Zielzellen und Zielgewebe verwendet (vgl. Beispiele). Gegenstand der Erfindung sind somit auch differenzierte, isolierte Gewebezellen, die durch Differenzierung (Reprogrammierung) der erfindungsgemäßen Stammzellen erhalten wurden, und die das membranständige Oberflächenantigen CD14 tragen.
  • Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Stammzellen in vitro einfach und zuverlässig in gewünschte Zielzellen, wie beispielsweise Adipozyten (vgl. Beispiel 6), Neuronen und Gliazellen (vgl. Beispiel 3), Endothelzellen (vgl. Beispiel 5), Keratinozyten (vgl. Beispiel 8), Hepatozyten (vgl. Beispiel 7) und Inselzellen (Langerhans'sche Inseln, vgl. Beispiel 9) differenziert, indem man die Stammzellen in einem Medium wachsen läßt, welches den Überstand des Kulturmediums enthält, in dem die jeweiligen Zielzellen und/oder Fragmente derselben inkubiert wurden (vgl. Beispiele 6 bis 8). Dieser Überstand wird nachfolgend als "Zielzell-konditioniertes Medium" bezeichnet.
  • Zum Differenzieren (Reprogrammieren) der erfindungsgemäßen dedifferenzierten Stammzellen kann demgemäß so vorgegangen werden, daß man
    • a) Gewebe zerkleinert, welches die gewünschten Zielzellen enthält oder aus diesen besteht;
    • b) die Gewebezellen (Zielzellen) und/oder Fragmente derselben gewinnt;
    • c) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben in einem geeigneten Kulturmedium inkubiert;
    • d) den Überstand des Kulturmediums während und nach der Inkubation als Zielzell-konditioniertes Medium sammelt; und
    • e) zum Reprogrammieren/Differenzieren von dedifferenzierten Stammzellen in die gewünschten Zielzellen oder Zielgewebe die Stammzellen in Gegenwart des Zielzell-konditionierten Mediums wachsen läßt.
  • Als Kulturmedium können übliche Zellkulturmedien verwendet werden (vgl. Beispiele). Vorzugsweise enthalten die Medien Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor („epidermal growth factor").
  • Die Inkubation der Zielzellen und/oder Fragmente derselben ("Zellpellet") kann 5 bis 15, vorzugsweise 10 Tage lang erfolgen. Vorzugsweise wird der Überstand, d.h. das Zielzell-konditionierte Medium jeweils nach 2 bis 4 Tagen abgenommen und durch frisches Medium ersetzt. Die so gewonnenen Überstände können getrennt oder vereinigt steril filtriert und bei etwa –20°C gelagert oder direkt zum Programmieren von Stammzellen eingesetzt werden. Wie oben dargelegt, erfolgt die Programmierung der Stammzellen in die gewünschten Zielzellen dadurch, daß man Stammzellen in Gegenwart des mit den jeweiligen Zielzellen konditionierten Mediums wachsen läßt (vgl. Beispiele). Vorzugsweise enthält das Wachstumsmedium zusätzlich einen Zielzell-spezifischen Wachstumsfaktor, wie beispielsweise den "hepatocyte growth factor" oder den "keratinocyte growth factor" (vgl. Beispiele).
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen per se zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur in vivo-Herstellung von Zielzellen und Zielgewebe eingesetzt.
  • Derartige pharmazeutische Präparate können die erfindungsgemäßen Stammzellen suspendiert in einem physiologisch verträglichen Medium enthalten. Geeignete Medien sind beispielsweise PBS (phosphate buffered saline) oder physiologische Kochsalzlösung mit 20% humaner Albuminlösung und dergleichen.
  • Diese pharmazeutische Präparate enthalten vitale dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen gemäß der Erfindung, die den Oberflächenmarker CD14 und mindestens einen weiteren der multipotenten Stammzellmarkern CD90, CD117, CD123 und/oder CD135 auf ihrer Oberfläche aufweisen, in einer Menge von mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50%, vorzugsweise 60 oder 70%, in besonders bevorzugter Weise 80 oder 90% und in äußerst bevorzugter Weise 100%, bezogen auf die Gesamtzahl der in dem Präparat vorhandenen Zellen, sowie gegebenenfalls weitere pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe.
  • Stammzellzubereitungen können vitale dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen gemäß der Erfindung, die den Oberflächenmarker CD14 und mindestens einen weiteren der pluripotenten Stammzellmarker CD90, CD117, CD123 und/oder CD135 auf ihrer Oberfläche aufweisen, in einer Menge von mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 oder 59%, bevorzugt mindestens 60%, bezogen auf die Gesamtzahl der in dem Präparat vorhandenen Zellen enthalten, bevorzugt sind Zellsuspensionen in einem zellverträglichen Zellkultur- oder Transportmedium, wie z.B.
  • PBS oder RPMI etc., bzw. tiefgefrorene Zellzubereitungen in einem geeigneten Lagermedium, wie z.B. RPMI mit 50% humaner Albuminlösung und 10% DMSO.
  • Die Zahl der vitalen Zellen und somit auch ihr Anteil in den oben angeführten Zusammensetzungen kann durch Einsatz der "Trypan blue dye exclusion technique" mittels Trypanblau-Färbung optisch bestimmt werden, da sich vitale Zellen durch diese Färbung optisch von nicht-vitalen Zellen differenzieren lassen.
  • In der Regel wird es für die klinische Anwendung unerheblich sein, wenn ein Teil der in dem pharmazeutischen Präparat vorhandenen Zellen die erfindungsgemäßen Kriterien der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nicht erfüllt, solange eine ausreichende Zahl funktioneller Stammzellen vorhanden ist. Es ist jedoch auch möglich, nicht dedifferenzierte Zellen mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren anhand der für die erfindungsgemäßen dedifferenzierten Zellen typischen Oberflächenmarker in solchen Präparaten zu eliminieren, damit diese die gewünschten Zellen in im Wesentlichen reiner Form enthalten. Ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren ist das "Immuno magnetic bead sorting", vgl. Romani et al., J. Immunol. Methods 196: 137–151 (1996).
  • Stammzellen besitzen weiterhin die Fähigkeit, sich in vivo durch den direkten Kontakt mit dem Zellverband eines bestimmten Zelltyps spontan in Zellen dieses Typs zu differenzieren. Verfahren zur Gewebeherstellung unter Einsatz von re- oder umdifferenzierbaren Zellen ("tissue engineering") sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise wurde von Wang, X. et al. ("Liver repopulation and correction of metabolic liver disease by transplanted adult mouse pancreatic eells" Am. J. Pathol. 158 (2): 571–579 (2001)) gezeigt, daß sogar bestimmte adulte Zellen der Bauchspeicheldrüse der Maus in der Lage sind, sich in FAH (Fumaroylacetacetase-Hydrolase)-defizienten Mäusen zu Hepatozyten umzuwandeln, die den metabolischen Stoffwechseldefekt in diesen Tieren voll kompensieren können. Ein weiteres Beispiel sind die Untersuchungen von Lagasse et al., "Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo", Nature Medicine, 6 (11): 1229–1234 (2000). Die Autoren haben gezeigt, daß hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark in der Lage waren, sich nach in vivo-Transfer in FAH-defiziente Mäuse in Hepatozyten umzuwandeln, die dann den metabolischen Defekt kompensieren konnten; siehe auch den Übersichtsartikel von Grompe M., "Therapeutic Liver Repopulation for the Treatment of Metabolic Liver Diseases" Hum. Cell, 12: 171–180 (1999).
  • Besonders bevorzugte Applikationsformen für die in vivo-Differenzierung der erfindungsgemäßen dedifferenzierten Stammzellen sind Injektion, Infusion oder Implantation der Stammzellen in einen spezifischen Zellverband im Körper, um zu erreichen, daß die Stammzellen sich dort durch den direkten Kontakt mit dem Zellverband in Zellen dieses Zelltyps differenzieren. Für die Injektion oder die Infusion können die Zellen in PBS („phosphate buffered saline") verabreicht werden.
  • Bevorzugte Beispiele für in diesem Zusammenhang relevante Indikationen sind: Leberzirrhose, Pankreasinsuffizienz, akutes oder chronisches Nierenversagen, hormonelle Unterfunktionen, Herzinfarkt, Lungenembolie, Schlaganfall und Hautschäden.
  • Somit sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung die Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen zur Herstellung verschiedener pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung von Leberzirrhose, Pankreasinsuffizienz, akutes oder chronisches Nierenversagen, hormonelle Unterfunktionen, Herzinfarkt, Lungenembolie, Schlaganfall und Hautschäden.
  • Für die therapeutische Verwendung der aus den erfindungsgemäßen Stammzellen erhältlichen Zielzellen stehen zahlreiche Konzepte zur Verfügung (siehe oben Science 287: 1442–1446 (2000) und Nature 414: 92–131 (2001)).
  • Eine weiterhin bevorzugte Anwendung betrifft das Einspritzen der erfindungsgemäßen dedifferenzierten Stammzellen in das Bauchfell (Peritoneum), so daß diese sich dort durch den Einfluß der sie umgebenden Zellen in Peritonealzellen differenzieren. Diese Zellen können bei der Peritonealdialyse niereninsuffizienter Patienten durch ihre semipermeable Membran eine Nierenfunktion übernehmen und nierenpflichtige Stoffe ins Peritoneum abgeben, von wo diese über das Dialysat entfernt werden.
  • Gegenstand der Erfindung sind folglich auch die differenzierten, isolieren, somatischen Zielzellen und/oder Zielgewebe, die durch Reprogrammierung der Stammzellen erhalten werden und durch das membranständige Oberflächenantigen CD14 gekennzeichnet sind, wobei humane Monozyten ausgeschlossen sind. Diese somatischen Zielzellen und/oder Zielgewebe beinhalten bevorzugt Adipozyten, Neuronen und Gliazellen, Endothelzellen, Keratinozyten, Hepatozyten und Inselzellen.
  • Allerdings können die Zellen auch direkt in die zu rekonstituierenden Organe eingebracht werden. Das Einbringen kann über Matrixkonstruktionen erfolgen, die mit entsprechend differenzierten oder differenzierungsfähigen Zellen beschichtet werden. Die Matrixkonstruktionen sind in der Regel bioabbaubar, sodaß sie während des Verwachsens der neu eingebrachten Zellen mit den vorhandenen Zellen aus dem Körper verschwinden. In Betracht kommen unter diesem Gesichtspunkt beispielsweise zelluläre, vorzugsweise autologe Transplantate in Form von Inselzellen, Hepatozyten, Fettzellen, Hautzellen, Muskeln, Herzmuskeln, Nerven, Knochen, endokrinen Zellen etc. zur Restitution beispielsweise nach partieller chirurgischer Resektion eines Organs, zur Reparatur beispielsweise nach einem Trauma oder zur unterstützenden Anwendung, beispielsweise bei fehlender oder zu geringer Organfunktion.
  • Die erfindungsgemäßen Stammzellen und die aus ihnen hervorgegangenen Zielzellen können ferner zur Beschichtung von implantierbaren Materialien dienen, um die Biokompatibilität zu erhöhen. Gegenstand der Erfindung sind daher auch implantierbare Materialien, die mit den dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen oder den somatischen Zielzellen und/oder Zielgewebe beschichtet sind. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind diese implantierbaren Materialien Prothesen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind diese Prothesen Herzklappen, Gefäßprothesen, Knochen- und Gelenkprothesen.
  • Die implantierbaren Materialien können weiterhin künstliche und/oder biologische Trägermaterialien sein, welche die dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen oder die Zielzellen umfassen. Dabei können die Trägermaterialien Beutel oder Kammern zum Einbringen in den menschlichen Körper sein.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein derartiger Beutel, der Inselzellen enthält, die erfindungsgemäß differenzierte somatische Zellen sind, zur Herstellung eines pharmazeutischen Konstrukts für den Einsatz als künstliche Inselzellportkammer zur Versorgung mit Insulin verwendet.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Beutel oder eine Kammer, die Adipozyten enthält, die erfindungsgemäß differenzierte somatische Zellen sind, zur Herstellung eines künstlichen, mit Adipozyten gefüllten Polymers als pharmazeutisches Konstrukt zum Brustaufbau nach Operationen und bei weiteren Indikationen der plastischen und/oder kosmetischen Korrektur verwendet.
  • Weiter können semipermeable Portkammersysteme, bestückt mit endokrinen Zellen verschiedenster Provenienz, in vivo zur Behandlung endokriner, metabolischer oder hämostatischer Erkrankungen zum Einsatz kommen. Beispiele für derartige endokrine Zellen sind Zellen, die Thyroxin, Steroide, ADH, Aldosteron, Melatonin, Serotonin, Adrenalin, Noradrenalin, TSH, LH, FSH, Leptin, Cholezystokinin, Gastrin, Insulin, Glucagon, oder Gerinnungsfaktoren produzieren.
  • Gegenstand der Erfindung sind somit auch implantierbare Materialien, die semipermeable Portkammersysteme sind, welche differenzierte isolierte somatische Zielzellen enthalten. Diese semipermeablen Portkammersysteme werden in verschiedene Ausführungsformen der Erfindung zur Herstellung eines pharmazeutischen Konstrukts zur in vivo-Behandlung endokriner, metabolischer oder hämostatischer Erkrankungen verwendet.
  • Die aus den erfindungsgemäßen Stammzellen hervorgegangenen Zielzellen können darüber hinaus als Zellkulturen außerhalb des Körpers in Bioreaktoren eingesetzt werden, um beispielsweise Entgiftungsreaktionen durchzuführen. Diese Verwendungsform ist insbesondere bei akuten Zuständen relevant, beispielsweise bei akutem Leberversagen als Hepatozyten-Bioreaktor.
  • Die Herstellung der oben beschriebenen Konstrukte und die Durchführung der entsprechenden Therapieverfahren ist im Stand der Technik bereits vielfach beschrieben, vergleiche beispielsweise die Übersichtsartikel von Lalan, S., et al. "Tissue engineering and its potential impact on surgery" World J. Surg. 25: 1458–1466 (2001); Nasseri, B. A., et al. "Tissue engineering: an evolving 21st-century science to provide replacement for reconstruction and transplantation" Surgery 130: 781–784 (2001) und Fuchs, J. R., et al., "Tissue engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction" Ann. Thorac. Surg. 72: 577–591 (2001).
  • Schließlich wird durch die erfindungsgemäßen pluripotenten Stammzellen ein weites Feld für die transgene Modifikation und Therapie eröffnet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen per se oder die letztlich daraus differenzierten somatischen Zielzellen und/oder Zielgewebe mit einem oder mehreren Genen transfiziert. Auf diese Weise können ein oder mehrere Gene, die für die Aufrechterhaltung metabolischer Leistungen in bestimmten Organen, wie beispielsweise Leber oder Niere, erforderlich sind, wiederhergestellt bzw. unterstützt oder neu eingebracht werden. Beispielsweise können Stammzellen oder von diesen abgeleitete Hepatozyten mit dem FAH (Fumaroylacetacetat-Hydrolase)-Gen transfiziert werden. Im FAH-defizienten Mausmodell genügte die intrasplenische Injektion von 1000 FAH-positiven Spenderhepatozyten, um nach 6 bis 8 Wochen die Leber komplett zu repopularisieren und den zur Leberzirrhose führenden metabolischen Defekt voll zu kompensieren (vgl. Grompe, M., et al., Nat. Genet. 12: 266 ff. (1996)).
  • Entsprechend kann durch Transfektion der Stammzellen bzw. der jeweiligen aus den Stammzellen durch Programmierung hervorgegangenen Zielzellen (beispielsweise hämatopoetische Zellen, Hepatozyten, Ovarzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Neurone, Gliazellen, Knorpel- oder Knochenzellen, etc.) mit "Multi-Drug-Resistance-Genen" die erweiterte radikale Chemotherapie bei malignen Erkrankungen durch entsprechende hämatopoietische Rekonstitution ermöglicht werden oder Strahlenresistenz erzeugt werden.
  • Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen erläutert:
    Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren sind Monozyten aus Humanblut. Vorzugsweise handelt es sich um autologe Monozyten, d.h. Monozyten, die aus dem Blut desjenigen Patienten stammen, welcher mit den erfindungsgemäßen Stammzellen oder den aus diesen hergestellten Zielzellen therapiert werden soll.
  • Zur Gewinnung der Monozyten kann das Blut zunächst nach üblicher Behandlung mit einem Antikogakulanz auf bekannte Weise, vorzugsweise durch Zentrifugation, in Plasma sowie in weiße und rote Blutzellen getrennt werden. Nach der Zentrifugation findet sich das Plasma im Überstand; darunter liegt eine Schicht, welche die Gesamtheit der weißen Blutzellen enthält. Diese Schicht wird auch als "Buffy coat" bezeichnet. Darunter befindet sich die rote Blutzellen enthaltende Phase (Haematokrit).
  • Anschließend wird die "Buffy coat"-Schicht isoliert und zur Gewinnung der Monozyten beispielsweise durch Zentrifugieren nach bekannten Verfahren aufgetrennt. Gemäß einer bevorzugten Verfahrensvariante wird die "Buffy coat"-Schicht auf ein Lymphozytenseparationsmedium (z.B. Ficoll Hypaque) geschichtet und zentrifugiert. Durch weiteres Zentrifugieren und Spülen wird die Fraktion der Monozyten aus dem Blut gewonnen (vgl. Beispiel 1).
  • Beispiele für alternative Verfahren zur Gewinnung der Monozyten aus dem Vollblut sind das "Fluorescence-Activated Cell Sorting" (FACS), das "Immunomagnetic Bead Sorting" (vgl. Romani et al., J. Immunol. Methods 196: 137–151 (1996)) und "Magnetic-Activated Cell Sorting" (MACS) oder das sogenannte "Rosetting Verfahren" (vgl. Gmelig-Meyling, F., et al., "Simplified procedure for the separation of human T and non-T cells" Vox Sang. 33: 5–8 (1977)).
  • Erfindungsgemäß können Monozyten aus jeglichem isolierten humanen Blut gewonnen werden, wobei das Blut auch aus Organen wie der Milz, Lymphknoten oder Knochenmark stammen kann. Die Gewinnung aus Organen kommt vor allem dann in Betracht, wenn die Separation der Monozyten aus humanem Blut, z.B. bei Anämie oder Leukämie, nicht oder nicht in ausreichenden Mengen möglich ist, sowie bei allogener Verwendung, wenn im Rahmen einer Multiorganentnahme die Milz als Quelle zur Isolierung von Monozyten zur Verfügung steht.
  • Für die Herstellung einer ausreichenden Menge an erfindungsgemäßen Stammzellen ist es zunächst erforderlich, die Monozyten zu vermehren. Zu diesem Zweck können bekannte, für Monozyten geeignete Wachstumsmedien verwendet werden, wobei das Medium erfindungsgemäß M-CSF („macrophage colony stimulating factor") enthält. M-CSF (auch als CSF-1 bezeichnet) wird von Monozyten, Fibroblasten und endothelialen Zellen produziert. Die Konzentration von M-CSF in dem Kulturmedium kann 2 bis 20 μg/l Medium, vorzugsweise 4 bis 6 μg/l und in besonders bevorzugter Weise 5 μg/l betragen.
  • M-CSF bindet auf den Monozyten an den spezifischen c-Fms-Rezeptor (auch als CSF-1R bezeichnet), der sich ausschließlich auf der Oberfläche von Monozyten befindet und nur M-CSF bindet (Sherr C. J., et al., Cell 41 (3): 665–676 (1985)). Da die spezifische Interaktion zwischen M-CSF und dem Rezeptor die Teilung der Monozyten induziert, enthält das Medium, in dem die Monozyten kultiviert werden, M-CSF oder ein Analogon davon, das an den Rezeptor zu binden und diesen zu aktivieren vermag. Andere Wachstumsfaktoren wie GM-CSF (Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) und G-CSF (Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) sind ungeeignet, da sie durch fehlende Affinität zum c-Fms-Rezeptor nicht in der Lage sind, die Monozytenteilung zu induzieren.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird dem Zellkulturmedium in Stufe b) des Verfahrens M-CSF und IL-3 gleichzeitig zugegeben. Die Konzentration von IL-3 in dem Medium kann 0,2 bis 1 μg/l, vorzugsweise 0,3 bis 0,5 μg/l und in besonders bevorzugter Weise 0,4 μg IL-3/l betragen.
  • Es ist jedoch auch möglich, dem Zellkulturmedium in Stufe b) zunächst nur M-CSF und erst nachfolgend IL-3 zuzusetzen.
  • In einer weiteren Ausführungsform enthält das Kulturgefäß zunächst ein nur M-CSF enthaltendes Zellkulturmedium, das nach der Abtrennung von den Zellen anschließend durch ein zweites Zellkulturmedium ersetzt wird, welches IL-3 enthält.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen in Stufe b) des Verfahrens zusätzlich in Gegenwart einer Schwefelverbindung, z.B. einer Mercaptoverbindung, kultiviert, in der mindestens eine Kohlenwasserstoffgruppe an den Schwefel gebunden ist, wobei die Kohlenwasserstoffgruppe(n) mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert sein kann (können). Dabei sind Mercaptoverbindungen definiert als Verbindungen, die mindestens eine Mercaptogruppe (-SH) aufweisen, die an eine Kohlenwasserstoffgruppe gebunden ist. Durch die zusätzliche Verwendung einer derartigen Schwefelverbindung kann die Anzahl der durch Dedifferenzierung der monozytären Ursprungszellen gewonnenen Stammzellen gesteigert werden, die einen oder mehrere der Stammzellmarker CD90, CD117, CD123 und CD135 exprimieren.
  • Vorzugsweise ist/sind die funktionelle(n) Gruppe(n) Hydroxyl- und/oder Amingruppen. In besonders bevorzugter Weise ist die Schwefelverbindung 2-Mercaptoethanol. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Schwefelverbindung Dimethylsulfoxid (DMSO).
  • Die Menge der verwendeten Schwefelverbindung kann von etwa 4 bis etwa 200 μmol/l bezogen auf den Schwefel betragen. Bevorzugt sind etwa 100 μmol/l.
  • Bei Verwendung von 2-Mercaptoethanol sollte das Kulturmedium etwa 3 μl bis etwa 13 μl, vorzugsweise etwa 7 μl 2-Mercaptoethanol/l enthalten.
  • Die Behandlung mit IL-3 und gegebenenfalls der Schwefelverbindung kann gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Vermehrung der Monozyten durch die Kultivierung mit M-CSF erfolgen, wobei die gleichzeitige Vermehrung und Behandlung mit IL-3 und gegebenenfalls einer Schwefelverbindung bevorzugt ist. Vermehrung und Dedifferenzierung sollten zusammengenommen nicht mehr als 10 Tage in Anspruch nehmen, wobei die Behandlung mit IL-3 und gegebenenfalls mit der Schwefelverbindung mindestens 3 und maximal 10 Tage, vorzugsweise 6 Tage lang durchgeführt werden sollte.
  • Erfindungsgemäß beträgt somit bei der Kultivierung der Monozyten in einem Kulturmedium, welches gleichzeitig M-CSF, IL-3 und bevorzugt eine Mercaptoverbindung enthält, die Kultivierungsdauer bis zum Ablösen der Zellen von dem Boden des Kulturgefäßes mindestens 3 und maximal 10 Tage, vorzugsweise 5 bis 8 Tage und in besonders bevorzugter Weise 6 Tage.
  • Wird in einer bevorzugten Ausführungsform das erfindungsgemäße Verfahren auf eine solche Weise durchgeführt, daß die Monozyten in Stufe b) zunächst in einem nur M-CSF enthaltenden Medium vermehrt werden, so kann die Vermehrung in einem derartigen Kulturmedium über einem Zeitraum von mindestens 2, vorzugsweise 3 und besonders bevorzugt 4 Tagen bei einer Maximaldauer von 7 Tagen erfolgen, und eine anschließende Kultivierung in Gegenwart von IL-3 und gegebenenfalls einer Mercaptoverbindung weitere 3 Tage lang durchgeführt werden. Vorzugsweise wird in einem solchen Falle die Kultivierung in einem nur M-CSF enthaltenden Medium jedoch nur maximal 4 Tage betragen, und sich danach eine Kultivierung in Gegenwart von IL-3 und gegebenenfalls einer Mercaptoverbindung über einen Zeitraum von 3, 4, 5 oder 6 Tagen anschließen.
  • Für die gemeinsame Durchführung der Vermehrung und Dedifferenzierung, wie in den Beispielen 2 und 13 beschrieben, werden die Monozyten nach Isolierung in ein Medium überführt, welches sowohl M-CSF, als auch das IL-3 sowie vorzugsweise die Schwefelverbindung, insbesondere Mercaptoethanol oder DMSO, enthält.
  • Aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften haften die Monozyten und die während des Verfahrensablaufs aus diesen hervorgehenden Stammzellen am Boden des jeweiligen Kulturgefäßes. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wird das Kulturmedium im Anschluß an Stufe c) von den am Boden des Kulturgefäßes haftenden Zellen abgetrennt und verworfen. Vorzugsweise schließt sich eine Spülung der am Boden haftenden Zellen mit Kulturmedium an, und die Zellen werden sodann mit frischem Kulturmedium bedeckt (vgl. Beispiel 13).
  • Als Kulturmedium kann in dieser Stufe sowohl das oben beschriebene Vermehrungs- und Dedifferenzierungsmedium eingesetzt werden, als auch ein übliches Zellkulturmedium, beispielsweise RPMI.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Zellen im Anschluß an Stufe c) und vor Stufe d) mit einem biologisch verträglichen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, um die Zahl der am Ende des Verfahrens frei im Medium flottierenden Stammzellen zu erhöhen. Die Menge des Lösungsmittels kann 10 μl bis 1 ml betragen. Vorzugsweise handelt es sich um einen Alkohol mit 1–4 Kohlenstoffatomen, wobei die Zugabe von Ethanol besonders bevorzugt ist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen mit der Dampfphase des zuvor definierten biologisch verträglichen organischen Lösungsmittels, vorzugsweise mit Ethanoldampf, in Kontakt gebracht (vgl. Beispiel 2). Die Einwirkzeit des organischen Lösungsmittels, in besonders bevorzugter Weise des Ethanoldampfes, sollte 4–12 Stunden, vorzugsweise 8–10 Stunden betragen.
  • Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in Kulturgefäßen durchgeführt, deren Oberfläche zuvor mit foetalem Kälberserum (FCS) beschichtet wurde (vgl. Beispiel 2). Alternativ kann auch humanes AB-Serum männlicher Spender verwendet werden. Die Beschichtung mit FCS kann dadurch erfolgen, daß man die Oberfläche der Kulturgefäße vor Ingebrauchnahme mit FCS bedeckt, und nach einer Einwirkungszeit von einigen Stunden, insbesondere 2 bis 12 Stunden, und in besonders bevorzugter Weise 7 Stunden, das nicht an der Oberfläche haftende FCS auf geeignete Weise entfernt.
  • Wird im Anschluß an Stufe c), gegebenenfalls nach Austausch des Kulturmediums, eine Behandlung mit organischem Lösungsmittel durchgeführt, so lösen die Zellen sich bereits in dieser Verfahrensstufe in gewissem Umfang vom Boden. Die (weitere) Ablösung kann auf mechanische Weise, beispielsweise mit einem feinen Zellschaber, Spatel oder einer Pipettenspitze erfolgen (vgl. Beispiel 13).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die vollständige Ablösung durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym, beispielsweise mit Trypsin (vgl. Beispiel 2). Die Trypsin-Lösung (0,1 bis 0,025 g/l, vorzugsweise 0,05 g/l) kann 2–10 Min. lang bei 35°C bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C, in Gegenwart von CO2 auf die Zellen einwirken.
  • Die Trypsinaktivität wird sodann auf übliche Weise blockiert und die nun frei flottierenden dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen können auf übliche Weise beispielsweise durch Zentrifugieren gewonnen und in einer Ausführungsform im Anschluß an Stufe d) in einem geeigneten Zellkulturmedium suspendiert werden. Sie stehen nunmehr, suspendiert in einem geeigneten Medium, beispielsweise in RPMI 1640 oder DMEM, für die sofortige Differenzierung in die gewünschten Zielzellen zur Verfügung. Sie können jedoch auch einige Tage lang in dem Medium gehalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Medium ein Zytokin oder LIF-Faktor („leucaemia inhibitory factor"), vgl. Nature 414: 94 (2001, Donovan, P. J., Gearhart, J., a.a.O.), wenn die Zellen länger als etwa 48 Stunden als dedifferenzierte programmierbare Stammzellen in Kultur gehalten werden sollen. In einem derartige Faktoren enthaltenden Medium können die Stammzellen mindestens 10 Tage lang als dedifferenzierte programmierbare Stammzellen gehalten werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen für eine längere Lagerung in einem flüssigen Medium suspendiert und anschließend tiefgefroren. Protokolle zum Tiefgefrieren lebender Zellen sind im Stand der Technik bekannt, vgl. Griffith M., et al. "Epithelial Cell Culture, Cornea, in Methods of Tissue Engineering", Atala A., Lanza R. P., Academic Press 2002, Kap. 4, Seiten 131 bis 140. Ein bevorzugtes Suspensionsmedium zum Tiefgefrieren der erfindungsgemäßen Stammzellen ist FCS enthaltendes DMEM, vgl. Beispiel 2.
  • Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter erläutert und beschrieben.
  • Soweit nicht innerhalb der Beispiele definiert, ist die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Substanzen, nachfolgend angegeben:
  • 1. Penicillin/Streptomycin-Lösung:
    • 10.000 Einheiten Penicillin als Natriumsalz von Penicillin G und 1000 μg Streptomycin als Streptomycinsulfat je ml physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%).
  • 2. Trypsin-EDTA
    • 0,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA (4 Na)/l
  • 3. Insulin
    • human, rekombinant hergestellt in E.coli, etwa 28 Einheiten/mg
  • 4. RPMI 1640 (1×, flüssig (11875) enthält L-Glutamin
    • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Media 1640 sind angereicherte Formulierungen, mit weitreichender Anwendbarkeit für Säugerzellen.
      Figure 00270001
      Referenz: Moore G. E., et al., J.A.M.A. 199: 519 (1967)
  • 5. PBS (Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung) vgl. J. Exp. Med. 98: 167 (1954):
    Figure 00280001
  • 6. 2-Mercaptoethanol
    • Qualität zur Synthese; Gehalt > 98%, Dichte 1,115 bis 1,116, vgl. z.B. Momo J., et al., J. Am. Chem. Soc. 73: 4961 (1951).
  • 7. Ficoll-Hypaque:
    • Lymphozyten-Separationsmedium (Saccharose/Epichlorhydrin-Copolymerisat Mg 400.000; Dichte 1,077, eingestellt mit Natriumdiatrizoat).
  • 8. Retinsäure:
    • Vitamin A-Säure (C20H28O2), 300 μl in 1.5 ml PBS entsprechend 1 mM. Als Medium zum Programmieren von Neuronen und Gliazellen 150 μl auf 10 ml Medium (entsprechend 10–6 M) verwenden.
  • 9. DMEM
    • (Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (high glucose) vgl. Dulbecco, R. et al., Virology 8: 396 (1959); Smith, J. D. et al., Virology 12: 158 (1960); Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6: 2 (1993))
  • 10. L-Glutamin
    • flüssig: 29,2 mg/ml
  • 11. Collagenase Typ II:
    • Vgl. Rodbell, M. et al., J. Biol. Chem. 239: 375 (1964).
  • 12. Interleukin-3 (IL-3):
    • Rekombinantes humanes IL-3 aus E. coli (Yang Y. C. et al., Cell 47: 10 (1986); enthält das 133 Aminosäure-Reste umfassende reife IL-3 und die 134 Aminosäure-Reste umfassende Methionyl-Form im Verhältnis von etwa 1:2; berechnete Mol-Masse etwa 17.5 kD; spezifische Aktivität 1 × 103 U/μg; (R&D Katalog Nr. 203-IL)
  • 13. Macrophage-colony stimulating factor (M-CSF)
    • Rekombinantes humanes M-CSF aus E. coli; enthält als Monomer (18,5 Kd) 135 Aminosäure-Reste einschließlich des N-terminalen Methionins; liegt als Homodimer mit einer Molmasse von 37 Kd vor; (SIGMA Katalog Nr. M 6518)
  • 14. Antikörper:
    • Die in den Beispielen verwendeten Antikörper gegen die Antigene CD14, CD31, CD90, CD117, CD123, CD135 sind kommerziell erhältlich. Sie wurden aus den folgenden Quellen bezogen: CD14: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD14, Monocyte, Clone TÜK4, Code No. M 0825, Lot 036 Edition 02.02.01; CD31: PharMingen International, Monoclonal Mouse Anti-Rat CD31 (PECAM-1), Clone TLD-3A12, Katalog No. 22711D, 0.5 mg; CD90: Biozol Diagnostica, Serotec, Mouse Anti-Human CDw90, Clone No. F15-42-1, MCAP90, Batch No. 0699; CD117: DAKO, Monoclonal Mouse Anti-Human CD117, c-kit, Clone No. 104D2, Code No. M 7140, Lot 016, Edition 04.05.00; CD123: Research Diagnostics Inc., Mouse Anti-human CD123 antibodies, Clone 9F5, Katalog No. RDI-CD123-9F5; CD135: Serotec, Mouse Anti-Human CD135, MCA1843, Clone No. BV10A4H2.
  • Beispiel 1
  • Abtrennen von Monozyten aus Gesamtblut
  • Zur Vermeidung der Blutgerinnung und zum Füttern der Zellen wurden 450 ml Vollblut in einem 3-Kammerbeutel-Set mit 63 ml einer Stabilisator-Lösung vermischt, die je Liter H2O 3,27 g Zitronensäure, 26,3 g Trinatriumcitrat, 25,5 g Dextrose und 22,22 g Natriumdihydroxyphosphat enthielt. Der pH-Wert der Lösung betrug 5,6–5,8.
  • Es erfolgte anschließend eine »scharfe Zentrifugation« dieses Gemisches zur Blutkomponententrennung mit 4000 rpm über 7 min bei 20°C. Hieraus resultierte eine 3-Schichtung der korpuskulären und nicht-korpuskulären Bestandteile. Durch Einsetzen des Beutelsets in eine dafür vorgesehene Preßmaschine wurden dann die Erythrozyten in den unteren Beutel, das Plasma in den oberen Beutel gepreßt und der sogenannte "Buffy-coat" verblieb im mittleren Beutel und enthielt ca. 50 ml Volumen.
  • Die Menge von 50 ml frisch gewonnenem "Buffy-coat" wurde nun in jeweils 2 Portionen á 25 ml geteilt und damit jeweils 25 ml Ficoll-Hypaque-Separationsmedium überschichtet, welches zuvor in zwei 50 ml Falconröhrchen gefüllt worden war.
  • Dieser Ansatz wurde 30 Min, lang mit 2500 rpm ungebremst zentrifugiert. Im "Buffy coat" noch vorhandene Erythrozyten und tote Zellen lagen danach unterhalb der Ficoll-Phase während die weißen Blutzellen einschließlich der Monozyten als weiße Interphase auf dem Ficoll separiert sind.
  • Anschließend wurde die weiße Interphase der Monozyten vorsichtig abpipettiert und mit 10 ml phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gemischt.
  • Danach wurde dieser Ansatz dreimal 10 Min. lang mit 1800 rpm gebremst zentrifugiert, wobei der Überstand nach jeder Zentrifugation abpipettiert und mit frischem PBS aufgefüllt wurde.
  • Das am Boden des Zentrifugationsgefäßes (Falconröhrchen) gesammelte Zellsediment enthielt die mononukleäre Zellfraktion, d.h. die Monozyten.
  • Beispiel 2
  • Vermehrung und Dedifferenzierung der Monozyten
  • Die Kultivierung und Vermehrung der Monozyten einerseits und die Dedifferenzierung der Zellen andererseits erfolgte in einem Schritt in Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:
  • Figure 00320001
  • Das Nährmedium enthielt ferner 2,5 μg/500 ml M-CSF und 0,2 μg/500 ml Interleukin 3 (IL-3).
  • Die in Beispiel 1 isolierten Monozyten wurden in 5 Kammern einer 6-Kammer-Rundlochplatte (30 mm Durchmesser pro Loch) in einer Menge von jeweils etwa 105 Zellen je Kammer übertragen und mit jeweils 2 ml des oben angegebenen Nährmediums aufgefüllt. Die 6-Lochplatte war zuvor mit reinem, inaktivierten FCS gefüllt und das FCS nach etwa 7 Stunden abgegossen worden, um auf diese Weise eine FCS-beschichtete Platte zu erhalten. Die Bestimmung der Zellzahl für die exakte Dosierung je Loch erfolgte nach bekannten Verfahren, vgl. Hay R. J., "Cell Quantification and Characterisation" in Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Kapitel 4, Seiten 55–84.
  • Die 6-Lochplatte wurde mit dem zugehörigen Deckel abgedeckt und 6 Tage lang in einem Brutschrank bei 37°C gehalten. Die Zellen setzten sich nach 24 Stunden am Boden der Kammern ab. An jedem zweiten Tag wurde der Überstand abpipettiert und die Kammern der 6-Lochplatte mit jeweils 2 ml frischem Nährmedium wieder aufgefüllt.
  • Am 6. Tag wurden 2 ml 70%iges Ethanol in die frei gebliebene 6. Kammer der 6-Lochplatte gefüllt, die Platte wurde wiederum verschlossen und weitere 10 Stunden lang bei 37°C im Brutschrank gehalten.
  • Nachfolgend wurden jeweils 1 ml einer 1:10 mit PBS verdünnten Trypsinlösung in jede der Zellen enthaltenden Kammern der Rundlochplatte pipettiert. Die geschlossene Rundlochplatte wurde 5 Min. lang bei 37°C unter 5% CO2 im Brutschrank gehalten.
  • Die Trypsinaktivität wurde danach durch Zugabe von jeweils 2 ml RPMI 1640 Medium zu den Rundlöchern geblockt. Der gesamte Überstand der jeweiligen Kammern (1 ml Trypsin + 2 ml Medium) wurde abpipettiert, in einem 15 ml Falconröhrchen vereinigt und 10 Min. lang mit 1800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde nachfolgend verworfen und der Niederschlag mit frischem RPMI 1640 Medium (2 ml/105 Zellen) versetzt.
  • Diese Zellsuspension konnte direkt zur Differenzierung in verschiedene Zielzellen verwendet werden.
  • Alternativ wurden die Zellen nach Zentrifugation und Verwerfen des Trypsin enthaltenden Überstandes mit DMSO/FCS als Einfriermedium versetzt und in einer Konzentration von 106/ml tiefgefroren.
  • Das Einfriermedium enthielt 95% FCS und 5% DMSO. Jeweils etwa 106 Zellen wurden in 1 ml des Mediums aufgenommen und in folgenden Stufen abgekühlt:
    30 Min. auf Eis;
    2 Stunden bei –20°C im vorgekühlten Styroporkasten;
    24 Stunden bei –80°C in Styropor;
    Lagerung in Röhrchen in Flüssigstickstoff (N2) bei –180°C.
  • Zur immunhistochemischen Phänotypisierung der nach obigem Verfahren generierten Zellpopulation dedifferenzierter programmierbarer Stammzellen monozytären Ursprungs wurden jeweils 105 Zellen abgenommen und als Cytospin-Präparat auf Objektträgern zur weiteren histochemischen Anfärbung fixiert (Watson, P. "A slide centrifuge; an apparatus for concentrating cells in suspension on a microscope slide." J. Lab. Clin. Med., 68: 494–501 (1966)). Hiernach konnten die Zellen durch die von Cordell, J. L., et al., (Literatur s.u.) beschriebene Technik mit APAAP-Rot-Komplex gefärbt werden. Die Verdünnung des zugesetzten Primärantikörpers erfolgte, soweit nicht anderes angegeben, in der Verdünnung 1:100 mit PBS, wobei jeweils 200 μl dieser Antikörperkonzentration eingesetzt wurden. Als Primärantikörper wurden monoklonale Antikörper gegen die in Tabelle 1 gelisteten Zellantigenepitope eingesetzt. 6 zeigt gefärbte Cytospinpräparate und den entsprechenden Nachweis der Stammzellmarker CD90, CD117, CD123 und CD135.
  • Literatur zur Färbetechnik:
    • Cordell J. L., et al. "Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes)." J. Histochem. Cytochem. 32: 219–229 (1984).
  • Literatur zu den Markern:
    • CD14 Ferrero E., Goyert S. M. "Nucleotide sequence of the gene encodinig the monocyte differentiation antigen, CD14" Nucleic Acids Res. 16: 4173–4173 (1988).
    • CD31 Newman P. J., Berndt M. C., Gorski J., White J. C. II, Lyman S., Paddock C., Muller W. R. "PECAM-1(CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily" Science 247: 1219–1222 (1990).
    • CD90 Seki T., Spurr N., Obata F., Goyert S., Goodfellow P., Silver J. "The human thy-1 gene: structure and chromosomal location" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6657–6661 (1985).
    • CD117 Yarden Y., Kuang W.-J., Yang-Feng T., Coussels L., Munemitsu S., Dull T. J., Chen E., Schlessinger J., Francke U., Ullrich A. "Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand." EMBO J. 6: 3341–3351 (1987).
    • CD123 Kitamura T., Sato N., Arai K., Miyajima A. "Expression cloning of the human IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors." Cell 66: 165–1174 (1991).
    • CD 135 Small D., Levenstein M., Kim E., Carow C., Amn S., Rockwell P., Witte L. Burrow C., Ratajazak M. Z., Gewirtz A. M., Civin C. I. "STK-1, the human honolog of Flk-2/Flt-3; is selectively expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the proliferation of early progenitor/stem cells." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 459–463 (1994).
  • Tabelle 1 Antigenexpression der erfindungsgemäßen Stammzellen
    Figure 00360001
  • Die angegebene Graduierung entspricht der ermittelten Antigenpositivität, die sich ab Tag 4 bis Tag 9 nach Kultivierung der Monozyten in den entsprechend spezifizierten Medien zeigt und erfolgte durch mikroskopischen Vergleich der jeweiligen Cytospin-Färbungen mit der negativen Kontrolle (beobachtete Färbung ohne Primärantikörper).
    • +
    deutliche Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikörper;
    ++
    starke Farbreaktion der Zellen mit dem Primärantikörper.
  • Es wurden nur Cytospinpräparate evaluiert, die mehr als 70% vitale Zellen mit typischer Stammzellmorphologie (vgl. 6) aufwiesen. Weniger als 1% dieser Zellen exprimieren das CD34-Antigen.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Neuronen und Gliazellen aus adulten Stammzellen
  • Die Herstellung von Neuronen und Gliazellen erfolgte in Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm. Zur Vorbereitung der Petrischalen wurden in jede Schale 5 ml reines inaktiviertes foetales Kälberserum (FCS) gefüllt, so daß der Boden bedeckt war. Nach 7 Std. wurde der nicht an dem Boden der Petrischale haftende Anteil des FCS abpipettiert. Etwa 106 der gemäß Beispiel 2 hergestellten Zellen wurden in eine der vorbereiteten Petrischalen gegeben und es wurden 10 ml Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hinzugefügt:
  • Figure 00370001
  • Das Nährmedium enthielt ferner Retinsäure in einer Menge von 1 × 10–6 M/500 ml.
  • Die Reprogrammierung/Differenzierung der eingesetzten Stammzellen in Neurone und Gliazellen erfolgte innerhalb von 10 Tagen, wobei das Medium im Abstand von etwa 3 Tagen gewechselt wurde. Die Zellen waren nach diesem Zeitraum zum größten Teil adhärent am Boden der Kammer und konnten analog, wie zuvor für die Stammzellen beschrieben, durch kurzzeitige Trypsinierung vom Plattenboden gelöst werden.
  • Beispiel 4
  • Nachweis von neuronalen Vorläuferzellen, Neuronen und Gliazellen
  • Zur späteren immunohistochemischen Charakterisierung der durch die dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen induzierten Zielzellen wurden die aus Monozyten generierten Stammzellen (105 Zellen/Deckelglas) auf Deckelgläschen (20 mm × 20 mm), die auf den Boden der 6-Lochplatten (30 mm Durchmesser pro Kammer) plaziert wurden, aufgetragen und mit dem Nährmedium (2 ml) pro Lochplatte kultiviert. Nach Ausdifferenzierung der jeweiligen Zielzellen wurden diese wie folgt fixiert: Nach Abnahme des Nährmediums (Überstand) erfolgte die Fixierung der gezüchteten Zielzellen durch Zugabe von 2 ml Methanol, welches 10 Minuten lang einwirkte. Danach erfolgte das Abpipettieren des Ethanols und die Lochplatten wurden zweimalig mit PBS (jeweils 2 ml) gewaschen. Hiernach konnten die Zellen durch die von Cordell, J. L., et al., "Immunoenzymatic labeling monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes)." J. Histochem. Cytochem. 32: 219–229 (1994) beschriebene Technik mit APAAP-Rot-Komplex gefärbt werden. Die Verdünnung des zugesetzten Primärantikörpers erfolgte, soweit nicht anderes spezifiziert, in der Verdünnung 1:100 mit PBS; wobei jeweils 200 μl dieser Antikörperkonzentration in jedes. der 6 Rundlöcher pipettiert wurde.
  • Neuronale Vorläuferzellen wurden durch Färbung der Zellen mit dem Antikörper gegen das S100-Antigen nachgewiesen, vgl. mittleres Bild der 1 (×200).
  • Gliazellen, wie zum Beispiel Astrozyten, wurden durch Detektion von GFAP („glial fibrillary associated protein") (Primärantikörper 1:200 mit PBS verdünnt) nachgewiesen, linkes Bild der 1, ×200.
  • Die Trennung von Neuronen und Gliazellen erfolgte durch spezifische Antikörper gegen MAP2 (Neurone) oder GFAP (Gliazellen), mittels MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) nach dem Verfahren, wie es beispielsweise in Carmiol S., "Cell Isolation and Selection" Methos of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Kapitel 2, Seiten 19–35 beschrieben ist.
  • Die mittels Anfärbung sichtbar gemachten Zelltypen sind in 1 gezeigt.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von Endothelzellen aus dedifferenzierten programmierbaren adulten Stammzellen monozytären Ursprungs
  • Zur Züchtung von Endothelzellen wurde als Matrix Matrigel® (Beckton und Dickinson, Heidelberg, DE) verwendet. Dabei handelt es sich um eine Matrix aus Fibronektin, Laminin und den Collagenen I und IV.
  • Die gefrorene Matrix wurde über einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C im Kühlschrank langsam aufgetaut. Dabei änderte sich die Zustandsform, d.h. die ursprünglich feste Matrix wurde schwammig/flüssig. Sie wurde in diesem Zustand in eine 48-Lochplatte (10 mm Durchmesser je Kammer) in solcher Weise aufgetragen, daß der Boden der jeweiligen Kammern bedeckt war.
  • Nach dem Auftragen wurde die Platte 30 Min. lang bei Raumtemperatur gehalten, bis sich das Gel auf dem Boden als adhärente Schicht verfestigt hatte.
  • Anschließend wurden etwa 1 × 102 Zellen je Kammer mit Zusatz des Nährmediums (wie in Beispiel 2 beschrieben) auf Matrigel® inkubiert.
  • Nach 4–5 Tagen zeigten sich die ersten tubulären Zellstränge, die sich nach 6–8 Tagen in dreidimensionale Zellnetzwerke entwickelten. Auf den Zellen konnten die Endothelmarker CD31 und Faktor VIII mit den jeweils spezifischen Primärantikörpern (200 μl, jeweils 1:100 mit PBS verdünnt) nachgewiesen werden.
  • In einem alternativen Verfahren wurde die verflüssigte Matrix auf eine Gefäßprothese aufgetragen und diese anschließend mit den dedifferenzierten programmierbaren adulten Stammzellen gemäß Beispiel 2 beschichtet. Nach etwa 6 Tagen war ein Endothelrasen zu erkennen, der die Prothese zirkulär auskleidete.
  • Die durch Färbung mit entsprechenden Endothel-spezifischen Antikörpern (s.o.) sichtbar gemachten Endothelzellen sind in 2 gezeigt. Im mittleren Bild sind die Zellen nach 5 Tagen Inkubation auf Matrigel® dargestellt. Erste tubuläre Stränge verbinden einzelne Zellaggregate. Die dunkelbraun markierten Zellen exprimieren CD31-Antigen (×200 mit Gelbfilter). Nach 8 Tagen kommt es zunehmend zur Bildung von dreidimensionalen Netzwerkstrukturen (anti-CD31-Antigen-Färbung, ×200 mit Gelbfilter). Nach 12 Tagen bilden die neudifferenzierten CD31+-Zellen, die auf Matrigel® gezüchtet wurden, eine Gefäßähnliche dreidimensionale Röhre mit mehrschichtigen Wandstrukturen aus, die bereits morphologisch an ein Gefäß erinnert. Man erkennt, daß nunmehr nahezu alle Zellen das CD31-Antigen exprimieren (CD31-Färbung, ×400, Blaufilter), rechte Abbildung.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von Fettzellen (Adipozyten)
  • A: Für die Programmierung/Differenzierung der adulten Stammzellen gemäß Beispiel 2 in Fettzellen wurde zunächst ein konditioniertes Medium generiert. Hierzu wurden 20 g eines autologen Fettgewebes, d.h. von Fettgewebe der gleichen Spenderperson, aus deren Blut auch die Monozyten stammten, wie folgt aufgearbeitet:
    Zunächst wurde das Fettgewebe in einer Petrischale zerkleinert und die zerkleinerten Gewebebrocken wurden durch ein Sieb (Durchmesser der Löcher 100 μm) passiert.
  • Die so erhaltene Suspension wurde anschließend in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm überführt und 10 ml DMEM-Medium mit einem Gehalt an 30 mg Collagenase Typ II hinzugefügt. Zur Einwirkung der Collagenase auf die Fettzellen wurde der Ansatz etwa 60 Min. lang bei Raumtemperatur (22°C ± 2°C) stehen gelassen.
  • Anschließend wurde das Gemisch in 50 ml Falconröhrchen überführt und die Röhrchen wurden 10 Min. lang mit 1800 rpm zentrifugiert.
  • Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das aus Adipozyten und Vorläuferzellen bestehende Zellpellet in 8 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und in Petrischalen (Durchmesser 100 mm) 10 Tage lang bei 37°C im Brutschrank inkubiert:
  • Figure 00420001
  • Die Insulinlösung enthielt 18 mg Insulin (Sigma 1-0259) gelöst in 2 ml Essigwasser (bestehend aus 40 ml H2O und 0,4 ml Eisessig). Die Lösung wird mit Essigwasser im Verhältnis 1:10 verdünnt.
  • Während der 10 Tage dauernden Inkubation bildete sich das Fettzell-konditionierte Medium (FCCM) als Überstand. Der Überstand wurde nach jeweils 2 bis 4 Tagen durch frisches Nährmedium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonnene FCCM wurde steril filtriert und bei –20°C gelagert. Anschließend wurden 10 ml des oben beschriebenen FCCM mit etwa 106 Stammzellen gemäß Beispiel 2 in eine Petrischale (Durchmesser 100 mm) gegeben. Die ersten Fettvakuolen enthaltenden Vorläuferzellen wurden nach 4 Tagen sichtbar (3A). Nach 6 Tagen erschienen vereinzelte, mit Sudan-Rot anfärbbare Adipozyten (3B und C). Nach 10 Tagen kam es zur typischen Aggregation und Clusterbildung dieser Zellen, die in diesem Stadium bereits makroskopisch als Fettgewebe erkennbar wurden (3D).
  • Die durch Anfärben sichtbar gemachten Fettzellen in den 3A-3D unterscheiden sich damit ganz wesentlich von den Kontrollen 3E und 3F: 3E zeigt die monozytären Ursprungszellen, die im Nährmedium (wie in Beispiel 2 angegeben) für 6 Tage gezüchtet wurden, jedoch ohne Zusatz von IL-3 und 2-Mercaptoethanol zu dem Nährmedium. Hiernach erfolgte die Zugabe des FCCM. Diese Zellen waren nicht in der Lage, in Fettzellen zu differenzieren. Abb. F. zeigt Zellen, die 6 Tage lang mit komplettem Medium (gemäß Beispiel 2) kultiviert wurden, und die dann, statt mit FCCM mit Nährmedium (gemäß Beispiel 2) für weitere 6 Tage behandelt wurden. Das FCCM enthält also Komponenten, die als Signalgeber für die Differenzierung in Fettzellen benötigt werden.
  • Das Färben der Zellen mit Sudan-Rot in 3A, B, C und D erfolgte nach der von Patrick Jr., C. W., et al. "Epithelial Cell Culture: Breast", in Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Kapitel 4, Seiten 141–149 beschriebenen Technik.
  • B: Zusätzlich zur Phänotypisierung der Fettzellen durch Färbung mit Sudan-Rot erfolgte eine molekularbiologische Charakterisierung der Fettzellen auf mRNA-Ebene, um zu überprüfen, ob das genetische Programm der Fettzelle nach entsprechender Programmierung mit dem eingesetzten Fettzellkonditionierenden Medium eine entsprechende Alteration erfährt und typische, für Fettzellen beschriebene messenger-Ribonukleinsäure (mRNA)-Transkripte in den aus programmierbaren Monozyten programmierten Fettzellen nachweisbar sind. Zwei für den Fettzellstoffwechsel typische mRNA-Sequenzen wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus isolierten RNA-Proben von dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs und, in einem parallelen Versuchsansatz, aus den programmierten Fettzellen amplifiziert, nämlich "peroxisome proliferative activated receptor gamma" (PPARG)-mRNA, (Tontonoz, P., et al. "Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor." Cell 79: 1147–1156 (1994), Genbank Zugangscodenummer; NM_005037) und "leptin (obesity homolog, mouse)"-mRNA, (Zhang Y., et al. "Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue." Nature 372: 425–432 (1994), Genbank, Zugangscodenummer: NM_000320).
  • Die hierfür notwendige RNA-Isolierung, die reverse Transkriptionsmethodik und die Bedingungen der PCR-Amplifikation der gewünschten mRNA-Sequenzen wurden, wie im Stand der Technik detailliert beschrieben, durchgeführt, s. hierzu Ungefroren H., et al., "Human pancreatic adenocarcinomas express Fas und Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis", Cancer Res. 58: 1741–1749 (1998).
  • Zu diesem Zweck wurden die jeweiligen zur PCR-Amplifikation hergestellten Primer so ausgewählt, daß die "forward"- und "reverse"-Primer an mRNA Sequenzen binden, deren homologe Bereiche im chromosomalen Gen in zwei verschiedenen Exons liegen und durch ein großes Intron voneinander getrennt sind. Hierdurch konnte sichergestellt werden, daß das erhaltene Amplifikationsfragment von der in der Zelle enthaltenen mRNA und nicht von der in der chromosomalen DNA vorhandenen Sequenz stammt. Im Einzelnen wurde für PPAR-γ und für Leptin folgende Primersequenzen ausgewählt:
    PPAR-γ: "forward-primer"; 265–288 (korrespondierende Gensequenz in Exon 1), "reverse-primer": 487–465 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 487–265 bp = 223 bp, siehe 3G. Wie ferner aus 3G ersichtlich, sind Spuren an transkribierter PPAR-γ-spezifischer mRNA bereits in der programmierbaren Stammzelle und in der Tumorzelllinie HL-60 (einer humanen promyeloischen Leukäme-Zelllinie) nachweisbar, allerdings mit signifikant geringerer Signalbande als in der Fettzelle selbst. Dagegen läßt sich das Fettzell-spezifische Protein Leptin nur in den aus der programmierbaren Stammzellen abgeleiteten Fettzellen auf mRNA-Ebene durch reverse-Transkriptase-PCR nachweisen.
  • Die zur Kontrolle eingesetzten programmierbaren Stammzellen (progr. Stammzelle) und die humanen Tumorzelllinien HL-60, Panc-1 und WI-38 transkribieren kein Leptin. Als Negativkontrollen wurden alle Ansätze ohne Zusatz der reversen Transkriptase (Fettzelle/-RT) und H2O-Proben simultan mitbestimmt. Durch Nachweis des GAPDH-"house-keeping"-Gens in den Positivkontrollen ist sichergestellt, daß die jeweiligen PCR-Amplifizierungsschritte in den Einzelansätzen ordnungsgemäß durchgeführt wurden.
  • Beispiel 7
  • Herstellung von Leberzellen (Hepatozyten)
  • A: Für die Programmierung der dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs gemäß Beispiel 2 in Leberzellen wurde zunächst ein konditioniertes Medium generiert. Hierzu wurden 40 g humanes Lebergewebe wie folgt aufgearbeitet:
    Zunächst wurde das Lebergewebe mehrmals in PBS gespült, um es weitestgehend von Erythrozyten zu befreien. Anschließend wurde das Gewebe in einer Petrischale zerkleinert und mit einer Dissoziationslösung etwa 45 Min. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Dissoziationslösung bestand aus 40 ml PBS (phosphate buffered saline), 10 ml einer 1:10 mit PBS verdünnten Trypsinlösung und 30 mg Collagenase Typ II (Rodbel M., et al. J. Biol. Chem. 239: 375 (1964)). Nach 45-minütiger Inkubation wurden die Gewebebrocken durch ein Sieb (s. Beispiel 6) passiert.
  • Anschließend wurde das Gemisch in 50 ml Falconröhrchen überführt, bis auf 50 ml mit PBS aufgefüllt und 10 Min. lang mit 1800 rpm zentrifugiert.
  • Nach Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das die Leberzellen enthaltende Zellpellet wurde erneut mit 50 ml PBS gewaschen und zentrifugiert. Der so entstandene Überstand wurde wiederum verworfen und das Zellpellet in 25 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und in Zellkulturflaschen (250 ml Volumen) 10 Tage lang bei 37°C im Brutschrank inkubiert:
  • Leberzell-Wachstumsmedium ("livercell growth medium", LCGM)
    Figure 00460001
  • Das Nährmedium enthielt zusätzlich 5 μg (10 ng/ml) "epidermal growth factor" (Pascall, I. C. et al., J. Mol. Endocrinol. 12: 313 (1994)). Die Zusammensetzung der Insulinlösung wurde in Bsp. 6 beschrieben.
  • Während der 10 Tage dauernden Inkubation bildete sich das Leberzell-konditionierte Medium (LCCM) als Überstand. Der Überstand wurde nach jeweils 2 bis 4 Tagen durch frisches Nährmedium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonnene LCCM wurde steril filtriert (Filter mit 0,2 μm Porengröße) und bei –20°C gelagert.
  • 1 × 106 dedifferenzierte Stammzellen wurden dann mit 10 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung in einer Petrischale (∅ 100 mm) oder einer Kulturflasche kultiviert.
  • Leberzell-Differenzierungsmedium ("livercell differentiation medium", LCDM)
    Figure 00470001
  • "hepatocyte growth factor" (Kobayashi, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 7 (1996)) wurde in der Konzentration 40 ng/ml eingesetzt. Nach einigen Tagen konnten morphologische Veränderungen zu flachen, polygonalen mono- oder diploiden Zellen beobachtet werden (4A). Nach 10–12 Tagen konnten aus dedifferenzierten Stammzellen entstandene Hepatozyten durch einen immunhistochemischen Nachweis des leberspezifischen Antigens "Alpha-Fetoprotein" identifiziert werden (Jacobsen, G. K. et al., Am. J. Surg. Pathol. 5: 257–66 (1981)), wie auf den 4B und 4C gezeigt.
  • B: Zusätzlich zur Phänotypisierung der Hepatozyten durch immunhistochemischen Nachweis des Alpha-Fetoproteins erfolgte eine molekularbiologische Charakterisierung der Hepatozyten auf mRNA-Ebene, um zu überprüfen, ob das genetische Programm der Stammzellen nach entsprechender Programmierung mit dem eingesetzten Leberzell-konditionierenten Medium eine entsprechende Alteration erfährt und als typisch für Leberzellen beschriebene messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) in den aus den erfindungsgemäßen Stammzellen hervorgegangenen Hepatozyten nachweisbar sind. Zu diesem Zweck wurde das Vorhandensein von fünf verschiedenen, für Hepatozyten typischen mRNA-Sequenzen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in isolierten RNA-Proben aus dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs und, in einem parallelen Versuchsansatz, aus den durch Programmieren der Stammzellen erhaltenen Leberzellen untersucht. Im einzelnen handelte es sich um "Homos sapiens albumin"-mRNA (Lawn, R. M., et al. "The sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E.coli." Nucleic Acids Res. 9: 6103–6114, (1981), Genbank Zugangscodenummer: NM-000477), "alpha-fetoprotein"-mRNA (Morinaga T., et al. "Primary structures of human alphafetoprotein and its mRNA." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4604–4608 (1983), Genbank Zugangscodenummer: V01514), "Human carbamyl phosphate synthetase I"-mRNA (Haraguchi, Y., et al. "Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamyl phosphate synthetase I: molecular analysis of hyperammonemia" Gene 107: 335–340 (1991), Genbank Zugangscodenummer D90282), "Homo sapiens coagulation factor II" (Thrombin, F2)-mRNA (Degen, S. J. et al. "Characterization of the complementary deoxyribonucleic acid and gene coding for human prothrombin" Biochemistry 22: 2087–2097 (1983), Genbank Zugangscodenummer NM-000506), "Homo sapiens coagulation factor VII" (serum prothrombin conversion accelerator, F7)-mRNA (NCBI Annotation Project. Direct Submission, 06-Feb-2002, National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA, Genbank Zugangscodenummer XM-027508).
  • Die hierfür notwendige RNA-Isolierung, die reverse Transkriptionsmethodik und die Bedingungen der PCR-Amplifikation der gewünschten mRNA-Sequenzen wurden wie im Stand der Technik detailliert beschrieben durchgeführt, siehe hierzu Ungefroren H., et al,, "Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis" Cancer Res. 58: 1741–1749 (1998).
  • Die jeweiligen Primer zur PCR-Amplifikation wurden so ausgewählt, daß die "forward"- und "reverse"-Primer an mRNA-Sequenzen binden, deren homologe Bereiche im chromosomalen Gen in zwei verschiedenen Exons liegen und durch ein großes Intron voneinander getrennt sind. Auf diese Weise konnte sichergestellt werden, daß das erhaltene Amplifikationsfragment von der in der Zelle enthaltenen mRNA und nicht von der in der chromosomalen DNA vorhandenen Sequenz stammt.
  • Es wurden die nachfolgend angegebenen Primersequenzen ausgewählt; die Ergebnisse der jeweiligen PCR-Analysen sind in 4D wiedergegeben. Die erfindungsgemäßen dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen sind dort als "progr. Stammzelle" und die durch Programmieren von diesen abgeleiteten Hepatozyten als "progr. Hepatozyt" bezeichnet.
    • – Alpha-Fetoprotein: "forward-primer": 1458–1478 (korrespondierende Gensequenz in Exon 1), "reverse-primer": 1758–1735 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 1758–1458 bp = 391 bp, siehe 4D.
  • Wie 4 zeigt, läßt sich die programmierbare Stammzelle (progr. Stammzelle), in der selbst keine spezifischen mRNA-Transkripte für Alpha-Fetoprotein nachweisbar sind, in einen Hepatozyten programmieren (progr. Hepatozyt), der dieses mRNA-Transkript enthält (positive Bande mit dem Molekulargewicht von 301 bp). Hieraus erklärt sich auch die immunhistochemische Nachweisbarkeit des Alpha-Fetoproteins, wie auf den 4B und 4C gezeigt. Die Positivkontrollen, namentlich humanes Lebergewebe und die Lebertumorzelllinie HepG2 transkribieren ebenfalls Alpha-Fetoprotein-spezifische mRNA, wie die Banden von 301 bp bestätigen.
    • – Albumin: "forward-primer": 1450–1473 (korrespondierende Gensequenz in Exon 1), "reverse-primer": 1868–1844 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergab sich ein Amplifikationsfragment von 1868–1450 bp = 419 bp, siehe 4D.
  • 4D zeigt Spuren von transkribierter Albuminspezifischer mRNA bereits in der programmierbaren Stammzelle, während die durch Programmieren der Stammzellen erhaltenen Hepatozyten und normales Lebergewebe sowie die Tumorzelllinie HepG2, beide wurden als Positivkontrolle verwendet, die mRNA stark exprimieren, wie durch deutliche Banden erkennbar ist.
    • – Carbamyolphosphatase-Synthetase I: "forward-primer": 3135–3157 (korrespondierende Gensequenz in Exon 1), "reverseprimer": 4635–4613 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 4635 – 3135 = 1500 bp, siehe 4D.
  • Die Carbamoylphosphat Synthetase I stellt ein für den Hepatozyten spezifisches Enzym dar, welches eine wichtige Rolle bei der Metabolisierung von Harnstoff im sogenannten Harnstoffzyklus übernimmt. Diese Entgiftungsfunktion wird durch funktionsfähige Hepatozyten gewährleistet. Wie 4D belegt, lassen sich sowohl in den aus programmierbaren Stammzellen generierten Hepatozyten als auch in den Positivkontrollen (humanes Lebergewebe und die HepG2-Tumorzelllinie) die spezifischen mRNA-Banden (1500 bp) für Carbamoylphosphat-Synthetase I nachweisen. Die etwas schwächere Expression der mRNA-Bande für die programmierten Hepatozyten (progr. Hepatozyt) erklärt sich durch das fehlende Substratangebot in der Kulturschale.
    • – Gerinnungssfaktor II: "forward-primer": 1458–1481 (korrespondierende Gensequenz in Exon 1), "reverse-primer": 1901–1877 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 1901 – 1458 = 444 bp, siehe 4D.
  • Dieses ebenfalls Hepatozyten-spezifische Protein läßt sich lediglich in dem programmierten Hepatozyten (progr. Hepatozyt) und in der Positivkontrolle aus humanem Lebergewebe auf mRNA-Ebene durch Bandenexpression bei 444 bp nachweisen, wogegen die programmierbare Stammzelle (progr. Stammzelle) diese Bande nicht zeigt, d.h. das Gen wird dort nicht, wie in 4D zu sehen ist, transkribiert.
    • – Gerinnungsfaktor VII: "forward-primer": 725–747 (korrespondierende Gensequenz in Exon 1), "reverse-primer": 1289–1268 (korrespondierende Gensequenz in Exon 2), damit ergibt sich ein Amplifikationsfragment von 1289 – 725 = 565 bp, siehe 4D.
  • Ebenso wie der Gerinnungsfaktor II wird auch dieses Protein lediglich in programmierten Hepatozyten (progr. Hepatozyt) und in der Positivkontrolle (humanes Lebergewebe) transkribiert (siehe Banden bei 656 bp), wenn auch schwächer als der Gerinnungsfaktor II. Weder die programmierbare Stammzelle noch die Negativkontrolle (H2O) zeigen diese spezifische mRNA-Bande.
    • – Glyzerinaldehyd-dehydrogenase: Dieses auch als "house-keeping gene" bezeichnete Gen läßt sich in jeder eukaryotischen Zelle nachweisen und dient als Kontrolle einer in allen Proben ordnungsgemäß durchgeführten PCR-Amplifikation, die parallel mitbestimmt wird und durch Zugabe einer definierten Menge an RNA aus den jeweiligen Zellproben zustande kommt.
    • – Als Negativkontrollen wurde in allen Ansätzen H2O-Proben simultan mitbestimmt. Wenn das H2O nicht mit RNA verunreinigt ist, entsteht während der PCR kein Amplifikat und es ist keine Bande nachweisbar (dient damit als Gegenkontrolle).
  • Beispiel 8
  • Herstellung von Hautzellen (Keratinozyten)
  • Für die Programmierung der dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs gemäß Beispiel 2 in Hautzellen wurde zunächst ein konditioniertes Medium generiert. Hierzu wurde 1–2 cm2 humane Vollhaut wie folgt aufgearbeitet:
    Das Hautmaterial wurde zunächst unter sterilen Bedingungen von der Subcutis befreit. Das Gewebe wurde nun insgesamt 10× mit PBS in einem sterilen Behälter durch kräftiges Schütteln gewaschen. Nach der 2. Waschung wurde das Gewebe nochmals von demarkierten Bindegewebsresten befreit.
  • Danach wurde das Hautmaterial in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm gegeben, dort mit 3 ml einer 1:10 mit PBS verdünnten Trypsinlösung versetzt und in kleine Stücke (etwa 0,5 bis 1 mm3) geschnitten. Danach wurden dem Gemisch erneut 3 ml der 1:100 mit PBS verdünnten Trypsinlösung zugesetzt und die Mischung wurde bei 37°C 60 Minuten lang unter intermittierendem Schütteln inkubiert.
  • Danach ließ man die größeren Partikel sedimentieren und der die Keratinozyten enthaltende Überstand wurde abgegossen und mit 800 rpm 5 min. lang zentrifugiert. Der nun entstandene Überstand wurde abpipettiert und das Zellpellet in 3 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung aufgenommen und in Petrischalen (∅ 100 mm) 15 Tage lang im Brutschrank bei 37°C inkubiert.
  • Keratinocyten-Wachstumsmedium ("keratinocyte growth medium", KGM)
    Figure 00530001
  • Das Nährmedium enthielt 5 μg "epidermal growth factor" (genaue Spezifizierung siehe Beispiel 7) und 5 mg Hydrocortison (Ref. Merck Index: 12, 4828).
  • Während der 15 Tage dauernden Inkubation bildet sich das Keratinozytenzell-konditionierte Medium KCCM als Überstand. Der Überstand wurde nach jeweils 2–4 Tagen durch frisches Nährmedium ersetzt. Das jeweils beim Mediumwechsel gewonnene KCCM wurde steril filtriert und bei –20°C gelagert.
  • 1 × 106 dedifferenzierte Stammzellen wurden dann mit 10 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung in einer Petrischale (∅ 100 mm) oder einer Kulturflasche kultiviert.
  • Keratinozyten-Differenzierungsmedium ("keratinocyte differentiation medium", KDM)
    Figure 00530002
  • "keratinocyte growth factor" wurde in einer Konzentration von 25 ng/ml eingesetzt, wie beschrieben von Finch et al., Gastroenterology 110: 441 (1996).
  • Nach einigen Tagen konnte eine morphologische Veränderung der Zellen beobachtet werden. Nach 6 Tagen ließen sich die keratinozyten-spezifischen Antigene, Cytokeratin 5 und 6, die beide von dem verwendeten Primärantikörper gebunden werden, (Exp. Cell. Res. 162: 114 (1986)) nachweisen (5A). Nach 10 Tagen erfolgte bereits in Kultur eine Zelladhärenz der deutlich größeren Einzelzellen, die einen sichtbaren Zellgewebeverband konfluierender Zellen erkennen ließen (5B).
  • Beispiel 9
  • Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen aus differenzierten programmierten Stammzellen
  • Die Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen erfolgte in Kulturflaschen mit einem Volumen von etwa 250 ml und flachen Wänden (T75-Zellkulturflaschen). Etwa 5 × 106 der gemäß Beispiel 13 hergestellten Zellen wurden in etwa 5 ml des nachfolgend angegebenen Kulturmediums (Differenzierungsmedium für Insulin-produzierende Zellen) suspendiert und nach Einbringen in die Flaschen mit weiteren 15 ml Kulturmedium versetzt. Für die Differenzierung der Zellen wurden die Flaschen liegend im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
  • Kulturmedium (modifiziert nach Rameya V. K. et al., Nature Medicine, 6 (3), 278–282 (2000)):
  • Figure 00550001
  • Das Nährmedium enthielt ferner den Epidermalen Wachstumsfaktor ("epidermal growth factor") in einer Menge von 10 ng/ml und den Hepatozyten-Wachstumsfaktor ("hepatocyte growth factor") in einer Menge von 20 ng/ml.
  • Die Zellen haften innerhalb der ersten Stunde am Boden des Kulturgefäßes. Die Differenzierung der Stammzellen wurde anhand der Insulinproduktion verfolgt. Zu diesem Zweck wurde das Kulturmedium im Abstand von etwa 2 bis 3 Tagen gewechselt, der Zellüberstand jeweils gesammelt und bei –20°C eingefroren. Die am Boden der Kulturflasche haftenden Zellen konnten, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch Trypsinierung vom Untergrund gelöst werden.
  • Der Insulingehalt des zu den verschiedenen Zeitpunkten gesammelten Überstands wurde mittels ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent-assay) gegen humanes Insulin gemessen (Bruhn H. D., Fölsch U. R. (Hrsg.), Lehrbuch der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik Pathobiochemie (1999), Seite 189) und mit dem Mediumleerwert verglichen. Die in 8 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Zellen das Maximum der Insulinproduktion nach 14 Tagen in Kultur erreicht haben. Die im Verlaufe der Differenzierung von den behandelten Zellen produzierten Insulinmengen stiegen nach 14 Tagen bis auf 3 μU/ml, während in dem Kontrollmedium kein humanes Insulin detektierbar war. Die Balken in 8 repräsentieren Dreifachbestimmungen aus jeweils drei unabhängigen Einzelexperimenten.
  • Neben einer Bestimmung der Insulinproduktion in den erfindungsgemäß zu Insulin-produzierenden Zellen differenzierten, deprogrammierten Stammzellen wurde der Anteil an Insulin-produzierenden Zellen bestimmt, der auch drei Wochen nach Durchführung der Dedifferenzierung noch das Monozyten-spezifische Oberflächenantigen CD14 exprimiert. Es zeigte sich, daß bei einem großen Teil (ca. 30 bis 40%) dieser Zellen auch drei Wochen nach der Dedifferenzierung noch das Monozyten-spezifische Oberflächenantigen CD14 nachweisbar war.
  • Beispiel 10
  • Alternative Methode zur Herstellung von Hepathozyten aus dedifferenzierten programmierbaren Stammzellen
  • Alternativ zu der Verwendung von Hepatozyten-konditioniertem Medium (LCCM), wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde die Differenzierung der Stammzellen in Hepatozyten durch das nachfolgend angegebenen Nährmedium (Ha) induziert. Die Herstellung von Hepatozyten aus Stammzellen erfolgte wiederum in Kulturflaschen mit einem Volumen von etwa 250 ml und flachen Wänden (T75-Zellkulturflaschen). Etwa 5 × 106 der gemäß Beispiel 13 hergestellten Zellen wurden in etwa 5 ml des nachfolgend angegebenen, verbesserten Kulturmediums (Ha, Differenzierungsmedium für Hepatozyten) suspendiert und nach Einbringen in die Flaschen mit weiteren 15 ml Kulturmedium versetzt. Für die Differenzierung der Zellen wurden die Flaschen liegend im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
  • Differenzierungsmedium für Hepatozyten (Ha) (modifiziert nach Schwarz et al., "Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells", J. Clin. Invest. 10 (109), 1291–1302 (2002)):
  • Figure 00570001
  • Das Nährmedium enthielt ferner den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 ("fibroblast growth factor-4", FGF-4) in einer Menge von 3 ng/ml.
  • Die Zellen haften innerhalb der ersten Stunde am Boden des Kulturgefäßes. Die Differenzierung der Stammzellen wurde anhand der Albuminproduktion verfolgt. Zu diesem Zweck wurde das Kulturmedium im Abstand von etwa 2 bis 3 Tagen gewechselt, der Zellüberstand jeweils gesammelt und bei –20°C eingefroren. Die am Boden der Kulturflasche haftenden Zellen konnten, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch Trypsinierung vom Untergrund gelöst werden.
  • Der Albumingehalt des zu den verschiedenen Zeitpunkten gesammelten Überstands wurde mittels ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent-assay) gegen humanes Albumin (gemäß Protokoll der Firma Bethyl Laboratories Inc. und nach Schwarz et al. a.a.O.) gemessen und mit dem Mediumleerwert verglichen. Die in 9 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Albuminproduktion der Zellen im Zeitraum von 14 bis 28 Tagen in Kultur in etwa konstant blieb. Die Messungen wurden an den Tagen 0 (Mediumleerwert), 14, 21, 28 und 30 bezogen auf den Zeitpunkt der Zugabe des Ha-Mediums durchgeführt. Die jeweils ermittelten Werte betrugen ca. 5 ng/ml, 450 ng/ml, 425 ng/ml, 440 ng/ml und 165 ng/ml. Die Balken in 9 repräsentieren Dreifachbestimmungen aus jeweils drei unabhängigen Einzelexperimenten.
  • Beispiel 11
  • Nachweis der Koexpression von Albumin und des Monozyten-spezifischen Antigens CD14 in aus dedifferenzierten Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten
  • Der Nachweis der Koexpression von Albumin und des Monozyten-spezifischen Antigens CD14 in aus dedifferenzierten Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten erfolgte einerseits durch Doppelfärbung (A) und andererseits durch FACS-Analyse (B).
  • A) Zu Hepatozyten differenzierte erfindungsgemäße Stammzellen gemäß Beispiel 10 wurden auf Deckgläsern in einer 6-Lochplatte kultiviert und wie in Beispiel 4 beschrieben mit Methanol fixiert. Nachfolgend wurde eine Doppelfärbung durchgeführt, um die gleichzeitige Expression des Antigens CD14 (Phänotypmarker von Monozyten) einerseits und von Albumin (leberspezifischer Marker) andererseits nachzuweisen.
  • Hierzu wurden die Zellen zunächst wie in Beispiel 4 beschrieben mit einem Primärantikörper gegen humanes Albumin (Meerschweinchen gegen humanes Albumin) in einer Verdünnung von 1:50 in PBS inkubiert. Nach einem Waschschritt wurden die Zellen dann mit einem Sekundärantikörper Maus anti-Ratte, welcher den Meerschweinchen-Antikörper bindet, ebenfalls in einer Verdünnung von 1:50 in PBS 45 Minuten lang inkubiert. Nachfolgend wurde der Färbeprozeß gemäß Beispiel 4 nach der Methode von Cordell J. L., et al. (a.a.O.) mit dem APAAP-Rot-Komplex durchgeführt.
  • Für den zweiten Färbeschritt wurden die Zellen sodann mit dem Primärantikörper Maus anti-human-CD14 inkubiert, und nach einem Waschschritt gemäß Beispiel 4 mit dem ABC Streptavidin KIT von Vectastain (Vector) nach der Methode von Hsu, S. M., et al. "The use of antiavidin antibody and avidin-biotinperoxidase complex in immunoperoxidase technics" Am. J. Clin. Pathol. 75 (6): 816–821 (1981) mit dem DAB-Complex (braun) (Vector Laboratories) gefärbt.
  • Abschließend erfolgte die Kerngegenfärbung mit Hämalaun wie in Beispiel 4 beschrieben sowie die Eindeckelung in Kaiser's Glyceringelatine.
  • Die Ergebnisse sind in 10 wiedergegeben. Die Abbildung zeigt die Expression des Antigens CD14 als braune Färbung, welche einhergehend mit der morphologischen Umwandlung der Zellen in Hepatozyten langsam abnimmt, während die Albuminexpression als rote Färbung mit zunehmender Reifung der Hepatozyten ansteigt. Bild Nr. 4 in 10 zeigt die Zellen nach dreiwöchiger Stimulation mit dem Hepatozyten-konditionierten Medium.
  • B) Parallel zur Doppelmarkierung wurden die zu Hepatozyten differenzierten erfindungsgemäßen Stammzellen einer FACS ("Fluorescence-activated cell sorting")-Analyse unterzogen.
  • Die zu Hepatozyten differenzierten erfindungsgemäßen Stammzellen gemäß Beispiel 10 wurden zunächst durch mechanische Ablösung der Zellen mit einem Zellschaber aus der Kulturflasche geerntet. Die Zellen wurden vorsichtig mit PBS aus der Flasche gespült und zwei Mal in jeweils 10 ml PBS-Lösung gewaschen. Dazu wurden die Zellsuspensionen in der PBS-Lösung in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen gefüllt und mit 1600 Umdrehungen pro Minute sedimentiert. Das resultierende Zellsediment wurde so mit PBS verdünnt, daß genau 1 × 105 Zellen in 100 μl PBS vorlagen.
  • Zu dieser Zellsuspension wurden dann jeweils 10 μl FITC-markierter anti-CD14-Antikörper (BD Pharmingen) oder FITC-markierter anti-Albumin-Antikörper (Beckmann) und FITC-markierter unspezifischer IgG1-Maus-anti-human-Antikörper gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 20 min wurden die Zellen zwei Mal in 500 μl PBS resuspendiert und jeweils für 5 Minuten mit 1600 Umdrehungen sedimentiert und dann letztlich in 200 μl PS aufgenommen. Nach Resuspension der Zellen wurde Fluoreszenz mit einem BD FACScalibur flow cytometer der Firma BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) gemessen (vgl. Bruhn H. D., Fölsch U. R. (Hrsg.), Lehrbuch der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik Pathobiochemie, 395–403 (1999) und Holzer U. et al., "Differential antigen sensitivity and costimulatory requirements in human Th1 and Th2 antigen-specific CD4(+) cells with similar TCR avidity" J. Immunol. 170 (3): 1218–1223 (2003)). Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm WinMDI der Firma Microsoft in Anlehnung an Marquez M. G., et al. "Flow cytometric analysis of intestinal intraepithelial lymphocytes in a model of immunodeficiency in Wistar rats." Cytometry 41 (2): 115–122 (2000).
  • Die Ergebnisse der FACS-Analyse sind in 11 wiedergegeben. Die Abbildung zeigt die Expression des CD14- (obere Reihe) und des Albumin-Antigens (untere Reihe) an, die in dedifferenzierten Monozyten (linke Spalte) und in den zu Hepatozyten differenzierten erfindungsgemäßen Stammzellen (rechte Spalte) gemessen wurde. In dedifferenzierten Monozyten konnte eine starke Expression des von CD14, jedoch keine von Albumin nachgewiesen werden, während in den sich aus dedifferenzierten Monozyten entwickelten Hepatozyten eine schwächere Expression des CD14 und eine sehr starke Expression des Albumin nachweisbar war.
  • Beispiel 12
  • In vivo Anwendung dedifferenzierter programmierter Stammzellen monozytären Ursprungs
  • Zur Abklärung, inwieweit die programmierbaren Stammzellen in vivo nach Injektion über die Pfortader in die Leber eines genetisch identischen Empfängertieres durch die im Leberorgan vorhandenen Signalgeber eine spezifische Differenzierung erfahren, wurden Leberorgane weiblicher LEW-Ratten zunächst mit Retrorsin behandelt, um die in der Leber vorhandenen Hepatozyten (Leberparenchymzellen) in ihrer Proliferationsaktivität zu hemmen (Ref. Lacone, E., et al. "Long-term, neartotal liver replacement by transplantation of isolated hepatocytes in rats treated with retrorsine" Am. J. Path. 153: 319–329 (1998)).
  • Zu diesem Zweck erhielten die LEW-Ratten 30 mg des Pyrrolizidin-Alkaloids Retrorsin, intraperitoneal zweimalig, innerhalb von 14 Tagen gespritzt. Anschließend erfolgte eine 80% Resektion der so vorbehandelten Lebern gefolgt von der Gabe von 5 × 105 der programmierbaren Stammzellen in 1 ml PBS in die Pfortader der verbliebenen Restleber. Die Stammzellen waren wie in Beispiel 2 beschrieben aus Monozyten männlicher LEW-Ratten gewonnen worden. 5 Tage nach Gabe der Stammzellen erfolgte eine Stanzbiopsie der Leber zur histologischen Beurteilung der Leber und zum Nachweis der aus den Stammzellen differenzierten Zelltypen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit Y-Chromosom spezifischen Sonden, wie ausführlich in Hoebee, B. et al. "Isolation of rat chromosome-specific paint probes by bivariate flow sorting followed by degenerate oligonucleotide primed-PCR." Cytogenet Cell Genet 66: 277–282 (1994) beschrieben.
  • 7A zeigt die aus den männlichen LEW-Stammzellen abgeleiteten Y-Chromosom-positiven (rote Punkte im Zellkern) Hepatozyten am 5. Tage nach intraportaler Injektion in Retrorsin-vorbehandelte 80%-resezierte Leberorgane weiblicher Empfängertiere. Die selektive Entnahme der gleichen Leber am Tag 25 nach Stammzellinjektion zeigt die Differenzierung der Stammzellen in Hepatozyten, Endothelzellen und Gallengangsepithelien (7B). Zu diesem Zeitpunkt hat die Lebergröße bereits wieder Normalgröße erreicht und > 90% der Zellen weisen ein Y-Chromosom auf. Hieraus kann gefolgert werden, daß die injizierten syngenen programmierbaren Stammzellen monozytären Ursprungs in der Lage sind, in vivo eine komplette Wiederherstellung des Leberorgans mit normaler metabolischer Funktion zu bewerkstelligen. 7C zeigt hierzu die Überlebenskurven nach Kaplan-Meier (n = 4 pro Gruppe), Stammzellbehandelter versus unbehandelter Empfängerratten nach Retrorsingabe und 80% Leberresektion.
  • Die Funktionsparameter Bilirubin und Ammoniak (NH3) belegen die volle metabolische Funktion der Langzeit-überlebenden Stammzell-behandelten Tiere (7D und 7E).
  • Beispiel 13
  • Vermehrung und Dedifferenzierung der Monozyten in Zellkulturflaschen
  • Eine Kultivierung und Vermehrung der Monozyten einerseits und die Dedifferenzierung der Zellen andererseits in größerem Maßstab erfolgte in Kulturflaschen im gleichen Nährmedium, das auch für die Kultivierung in Lochplatten verwendet wurde (siehe Beispiel 2). Das Nährmedium enthielt 2,5 μg/500 ml M-CSF und 0,2 μg/500 ml Interleukin 3 (IL-3).
  • Die in Beispiel 1 isolierten Monozyten wurden auf den Boden von Kulturflaschen mit einem Volumen von etwa 250 ml und flachen Wänden (T75-Zellkulturflaschen) gegeben. Etwa 10 x 106 Zellen wurden in jede Flasche übertragen und mit jeweils 20 ml des oben angegebenen Nährmediums aufgefüllt. Die Bestimmung der Zellzahl für die exakte Dosierung je Flasche erfolgte nach bekannten Verfahren, vgl. Hay R. J., "Cell Quantification and Characterisation" in Methods of Tissue Engineering, Academic Press (2002), Kapitel 4, Seiten 55–84.
  • Die Zellkulturflasche wurde 6 Tage lang in einem Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die Zellen setzten sich nach 24 Stunden am Boden der Flasche ab. An jedem zweiten Tag wurde der Überstand abgenommen und die Flaschen mit jeweils 20 ml frischem Nährmedium neu befällt.
  • Am 6. Tag wurden die Flaschen zweimal mit je 10 ml PBS gespült, nachdem zuvor das Nährmedium aus den Flaschen abpipettiert worden war. Durch diesen Vorgang wurden alle Zellen entfernt, die nicht am Boden der Flaschen hafteten. Die adhärent am Boden der Flaschen wachsenden Zellen wurden anschließend mit einem sterilen Zellschaber von dem Boden der Flaschen abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden nun durch Spülen mit PBS aus den Flaschen entfernt und in einem 50 ml Falconröhrchen vereinigt und 10 Min. lang mit 1800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde nachfolgend verworfen und das Sediment in frischem RPMI 1640 Medium (2 ml/105 Zellen) resuspendiert.
  • Diese Zellsuspension konnte direkt zur Differenzierung in verschiedene Zielzellen verwendet werden.
  • Alternativ wurden die Zellen nach Zentrifugation mit DMSO/FCS als Einfriermedium versetzt und in einer Konzentration von 106/ml tiefgefroren.
  • Das Einfriermedium enthielt 95% FCS und 5% DMSO. Jeweils etwa 106 Zellen wurden in 1 ml des Mediums aufgenommen und entsprechend den folgenden Stufen abgekühlt:
    30 Min. auf Eis;
    2 Stunden bei –20°C im vorgekühlten Styroporkasten;
    24 Stunden bei –80°C in Styropor;
    Lagerung in Röhrchen in Flüssigstickstoff (N2) bei –180°C.

Claims (43)

  1. Verfahren zur Herstellung von dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen humanen monozytären Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß man a) Monozyten aus isoliertem Human-Blut in einem geeigneten Kulturmedium vermehrt, welches den zellulären Wachstumsfaktor M-CSF enthält; b) die Monozyten gleichzeitig mit oder im Anschluß an Stufe a) in einem IL-3 enthaltenden Kulturmedium kultiviert; und c) die humanen adulten dedifferenzieren, programmierbaren Stammzellen gewinnt, indem man die Zellen von dem Kulturmedium abtrennt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium in Stufe b) ferner eine Mercaptoverbindung zusetzt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mercaptoverbindung verwendet wird, in der mindestens eine Kohlenstoffgruppe an den Schwefel gebunden ist, und wobei die Kohlenwasserstoffgruppe(n) mit einer oder mehreren weiteren funktionellen Gruppen substituiert sein kann (können).
  4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mercaptoverbindung 2-Mercapto-ethanol oder Dimethylsulfoxid ist.
  5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen im Anschluß an Stufe b) und vor Stufe c) mit einem biologisch verträglichen organischen Lösungsmittel in Kontakt bringt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch verträgliche organische Lösungs-mittel ein Alkohol mit 1–4 Kohlenstoffatomen ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol Ethanol ist.
  8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit der Dampfphase des biologisch verträglichen organischen Lösungsmittels in Kontakt bringt.
  9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen im Anschluß an Stufe c) in einem geeigneten Zellkulturmedium suspendiert.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium RPMI oder DMEM ist.
  11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium ein Zytokin oder LIF enthält.
  12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen in einem flüssigen Medium suspendiert und anschließend tiefgefriert.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium ein Zellkulturmedium ist.
  14. Dedifferenzierte programmierbare Stammzellen humanen monozytären Ursprungs, die durch das membranständige monozytenspezifische Oberflächenantigen CD14 und mindestens einen Pluripotenzmarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CD117, CD123 und CD135 gekennzeichnet sind.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach Anspruch 14.
  16. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach Anspruch 14 zur in vitro-Herstellung von Zielzellen und Zielgewebe.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man a) die gewünschten Zielzellen enthaltendes Gewebe zerkleinert; b) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben aus dem zerkleinerten Gewebe gewinnt; c) die Zielzellen und/oder Fragmente derselben in einem geeigneten Kulturmedium inkubiert; d) den Überstand des Kulturmediums während und nach der Inkubation als Zielzell-konditioniertes Medium sammelt; und e) zum Reprogrammieren/Dedifferenzieren der Stammzellen in die gewünschten Zielzellen die Stammzellen in Gegenwart des Zielzell-konditionierten Mediums wachsen läßt.
  18. Verwendung nach den Ansprüchen 16 oder 17 zur Herstellung von Adipozyten, von Neuronen und Gliazellen, von Endothelzellen, von Keratinozyten, von Hepatozyten oder von Inselzellen.
  19. Verfahren zur Herstellung von transgen modifizierten dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen humanen monozytären Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß man nach den Ansprüchen 1 bis 13 hergestellte Zellen mit einem oder mehreren Genen transfiziert.
  20. Stammzellen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen durch Transfektion mit einem oder mehreren Genen transgen modifiziert sind.
  21. Zusammensetzung, enthaltend dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 in einem geeigneten Medium.
  22. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Leberzirrhose.
  23. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Pankreasinsuffizienz.
  24. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von akutem oder chronischem Nierenversagen.
  25. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von hormonellen Unterfunktionen.
  26. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Herzinfarkt.
  27. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Lungenembolien.
  28. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Schlaganfall.
  29. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Hautschäden.
  30. Verwendung der dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche zur in vivo-Herstellung von Zielzellen und Zielgewebe geeignet ist.
  31. Dedifferenziertes, isoliertes, somatisches Zielgewebe und/oder Zellen von somatischem Zielgewebe, erhalten durch Reprogrammierung der Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20, gekennzeichnet durch das membranständige Oberflächenantigen CD14, wobei humane Monozyten ausgeschlossen sind.
  32. Somatische Zielzellen und/oder Zielgewebe nach Anspruch 31, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adipozyten, Neuronen und Gliazellen, Endothelzellen, Keratinozyten, Hepatozyten und Inselzellen.
  33. Somatische Zielzellen und/oder Zielgewebe nach den Ansprüchen 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem oder mehreren Genen transfiziert sind.
  34. Implantierbare Materialien, beschichtet mit den dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 oder den somatischen Zielzellen und/oder Zielgewebe nach den Ansprüchen 31 bis 33.
  35. Implantierbare Materialien nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Materialien Prothesen snd.
  36. Implantierbare Materialien nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Prothesen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Herzklappen, Gefäßprothesen, Knochen- und Gelenkprothesen.
  37. Implantierbare Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß sie künstliche und/oder biologische Trägermaterialien sind, welche die dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen nach den Ansprüchen 14 oder 20 oder die Zielzellen nach den Ansprüchen 31 bis 33 umfassen.
  38. Implantierbare Materialien nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermaterialien Beutel oder oder Kammern zum Einbringen in den menschlichen Körper sind.
  39. Verwendung eines Beutels oder einer Kammer nach Anspruch 38, der Inselzellen nach Anspruch 32 enthält, zur Herstellung eines pharmazeutischen Konstruktes, welches für den Einsatz als künstliche Inselzellportkammer zur Versorgung mit Insulin geeignet ist.
  40. Verwendung eines Beutels oder einer Kammer nach Anspruch 38, der Adipozyten nach Anspruch 32 enthält, zur Herstellung eines pharmazeutischen Konstruktes, das künstliche mit Adipozyten gefüllte Polymere umfaßt und zum Brustaufbau nach Operationen und zur Verwendung bei der plastischen und/oder kosmetischen Korrektur geeignet ist.
  41. Implantierbare Materialien nach den Ansprüchen 34 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie semipermeable Portkammersysteme sind, welche dedifferenzierte isolierte, somatische Zielzellen nach den Ansprüchen 31 oder 32 enthalten.
  42. Verwendung des semipermeablen Portkammersystems nach Anspruch 41 zur Herstellung eines pharmazeutischen Konstruktes, welches zur in vivo-Behandlung endokriner, metabolischer oder hämostatischer Erkrankungen geeignet ist.
  43. Verwendung von M-CSF und IL-3 zur Herstellung von dedifferenzierten, programmierbaren Stammzellen humanen, monozytären Ursprungs in einem Kulturmedium.
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