WO2010061781A1 - ヒト単球由来治療用幹細胞およびその誘導方法 - Google Patents

ヒト単球由来治療用幹細胞およびその誘導方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010061781A1
WO2010061781A1 PCT/JP2009/069648 JP2009069648W WO2010061781A1 WO 2010061781 A1 WO2010061781 A1 WO 2010061781A1 JP 2009069648 W JP2009069648 W JP 2009069648W WO 2010061781 A1 WO2010061781 A1 WO 2010061781A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
water
stem cell
disease
plant extract
soluble plant
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/069648
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
尚伸 平野
悌 大久保
賢次郎 佐々木
広信 石山
Original Assignee
大塚製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to KR1020117014559A priority Critical patent/KR101682731B1/ko
Priority to JP2010540461A priority patent/JP5800505B2/ja
Priority to US13/130,099 priority patent/US9169463B2/en
Priority to BRPI0921371-6A2A priority patent/BRPI0921371A2/pt
Application filed by 大塚製薬株式会社 filed Critical 大塚製薬株式会社
Priority to AU2009320881A priority patent/AU2009320881B2/en
Priority to EP09829029A priority patent/EP2365061A4/en
Priority to UAA201107956A priority patent/UA110691C2/uk
Priority to MX2011005480A priority patent/MX336067B/es
Priority to RU2011126165/10A priority patent/RU2573906C2/ru
Priority to CN200980146977.1A priority patent/CN102245757B/zh
Priority to CA2744289A priority patent/CA2744289A1/en
Publication of WO2010061781A1 publication Critical patent/WO2010061781A1/ja
Priority to IL212638A priority patent/IL212638A/en
Priority to ZA2011/03268A priority patent/ZA201103268B/en
Priority to US14/864,712 priority patent/US20160008434A1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)

Definitions

  • the present invention relates to a method for providing a cell that can be used for a cell medicine by dedifferentiating a normally differentiated cell in a short period of time.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for diseases related to cell, tissue or organ damage.
  • the present invention relates to a cell pharmaceutical agent that efficiently induces dedifferentiation, a stem cell production method, a monocyte dedifferentiation induction medium, a dedifferentiation inducer, a cell pharmaceutical kit or a dedifferentiated cell production kit, and a pharmaceutical composition. And stem cells.
  • differentiated cells in tissues such as peripheral blood-derived monocytes are dedifferentiated into stem cells by culturing in the presence of specific cytokines.
  • Non-Patent Document 1 reports that wounds cannot be cured when SDF1 is blocked at the ischemic site or when CXCR4-expressing cells are removed from the blood.
  • Non-patent Documents 2 and 3 Techniques for obtaining stem cells having pluripotency by inducing dedifferentiation starting from human monocytes have been reported by Fandrich, Huberman (Non-patent Documents 2 and 3) and the like. All use M-CSF and various cytokines for culture. In any culture method, it has been confirmed that some undifferentiated markers have turned positive. Kuwana et al. (Non-patent Document 4) have reported that pluripotent stem cells MOMC can be induced from human mononuclear cells using a culture dish coated with fibronectin.
  • An object of the present invention is to provide a stem cell capable of efficiently reaching a target site, which has been a problem in the field of cell medicine, a method for short-term mass production thereof, and a pharmaceutical composition for inducing the cell.
  • Another object of the present invention is to provide a therapeutic agent for diseases related to cell, tissue or organ damage.
  • an object of the present invention is to provide a dedifferentiation induction medium, a dedifferentiation inducer, a kit for cell medicine or a dedifferentiation cell production kit, and a stem cell.
  • the present invention solves the above problems, and it has been found that a large amount of dedifferentiated cells can be induced by using peripheral blood monocytes and culturing in the presence of the dedifferentiation inducer of the present invention for a short period of time. Moreover, it discovered that an injury related disease could be effectively treated by administering the pharmaceutical composition of this invention directly to a biological body. Furthermore, by administering at least one selected from the group consisting of gangliosides and water-soluble plant extracts, the monocytes are damaged in cells, tissues or organs such as stem cells, possibly in cooperation with M-CSF in vivo. Has been found to be capable of being induced into repairable cells, thereby providing therapeutic agents for diseases associated with cell, tissue or organ damage.
  • Item 1 A stem cell obtained by culturing monocytes in the presence of at least one selected from the group consisting of (i) M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract and dedifferentiation.
  • Item 2. Item 8. The stem cell according to Item 1, wherein the active ingredient that dedifferentiates monocytes of the water-soluble plant extract is a sugar or a complex carbohydrate.
  • Item 3. Item 2. The stem cell according to Item 1, wherein the molecular weight of the active ingredient for dedifferentiating monocytes of the water-soluble plant extract is 1000 to 500,000.
  • the stem cell according to Item 1 wherein the active ingredient that dedifferentiates monocytes of the water-soluble plant extract is adsorbed to the ConA column.
  • Item 2. The stem cell according to Item 1, wherein the active ingredient for dedifferentiating monocytes of the water-soluble plant extract is adsorbed to the anion exchange resin.
  • Item 6. The stem cell according to Item 1, wherein the water-soluble plant extract is a plant-derived Folch extract aqueous phase fraction or a purified product thereof.
  • the monocyte is a human monocyte.
  • a stem cell characterized in that it expresses at least one of the undifferentiated markers Nanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3 / 4 and the CXCR4 gene is significantly strongly expressed.
  • Item 10 A stem cell characterized in that it expresses at least one of the undifferentiated markers Nanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3 / 4 and the CXCR4 gene is significantly strongly expressed.
  • a method for producing stem cells comprising culturing monocytes in the presence of at least one selected from the group consisting of (i) M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract.
  • Item 11. Item 7. The method according to Item 6, wherein the culture period is 7 to 14 days.
  • Item 12. A monocyte dedifferentiation induction medium containing at least one member selected from the group consisting of (i) M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract.
  • Item 13 Item 10. A pharmaceutical composition comprising the stem cell according to any one of Items 1 to 9 as an active ingredient.
  • An agent for cell medicine containing the stem cell according to any one of Items 1 to 9 as an active ingredient.
  • a dedifferentiation inducer comprising at least one selected from the group consisting of M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for a disease related to cell, tissue or organ damage comprising at least one selected from the group consisting of ganglioside and water-soluble plant extract as an active ingredient.
  • Item 17. The therapeutic agent according to Item 16, wherein the disease is selected from the group consisting of trauma, inflammatory disease, bone / cartilage damage, cardiovascular disease, neurological disease, liver disease and kidney disease, diabetes, atopic dermatitis, and GVHD.
  • the disease is trauma, pancreatitis, radiation damage, dermatomyositis, polymyositis, necrotizing fasciitis, chronic bronchitis, fracture, osteoporosis, osteochondral fracture, osteochondritis, dilated cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemic myocardium Disease, heart failure, myocardial hypertrophy, congestive heart failure, restenosis, arrhythmia, atherosclerosis, vasculitis, peripheral neuropathy, neuropathic pain, stroke, encephalitis, meningitis, diabetic neuropathy, attention deficit disorder, autism , Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, brain or spinal cord trauma or ischemia, cirrhosis, chronic hepatitis, chronic renal failure, glomerulonephritis, renal ischemia, diabetes, atopic dermatitis, GVHD Item 17.
  • Item 19 A kit for cell medicine comprising at least the stem cells according to items 1 to 9 as essential components.
  • Item 20. A kit for producing a dedifferentiated cell comprising at least one selected from the group consisting of (i) M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract as an essential component.
  • Item 21. Item 20.
  • a large amount of stem cells that can reach the tissue damage site can be supplied in a short time using monocytes.
  • the said stem cell inducer can also be provided and can be expected to contribute to the field of cell medicine.
  • gangliosides and water-soluble plant extracts such as plant-derived Folch extract aqueous phase fractions or purified products thereof are therapeutic agents for diseases associated with cell, tissue or organ damage.
  • the growth curve of stem cells derived from monocytes by culturing in medium 1 to medium 5 is shown.
  • the result of the gene expression by RT-PCR is shown.
  • action to the stem cell by each ganglioside addition is shown.
  • the cell morphology in each ganglioside addition is shown.
  • Dedifferentiation-inducing activity in each plant extract fraction is shown.
  • the activity result of the fraction by the various chromatography of the dedifferentiation induction component derived from a sweet potato stalk extract is shown.
  • mouth liver tissue is shown.
  • monocytes such as peripheral blood monocytes are used as cells to be dedifferentiated.
  • the monocytes used in the present invention are derived from mammals. Mammals include humans, horses, cows, monkeys, chimpanzees, pigs, sheep, rabbits, mice, rats, dogs, cats, etc., preferably primates such as humans, monkeys, chimpanzees, etc. Human monocytes are preferred. Monocytes are derived from bone marrow, blood and the like, but preferably blood, particularly peripheral blood monocytes can be preferably used.
  • separating monocytes from samples such as blood are well known.
  • a mononuclear cell is prepared and an antibody magnetism that recognizes the surface antigen of CD14.
  • a method of preparing with beads (Miltenyi Biotech) or a mononuclear cell can be used as a source of monocytes of the present invention.
  • human monocytes may be used.
  • examples of commercially available products include PT038 (LONZA).
  • monocytes are dedifferentiated into stem cells and returned to a subject such as a human after proliferation.
  • a subject such as a human after proliferation.
  • monocytes since monocytes are separated from the patient, it is necessary to obtain a large amount of stem cells from as little monocyte as possible.
  • the proliferation efficiency of stem cells dedifferentiated from monocytes is high, and a large amount of stem cells can be prepared from a small amount of monocytes, which is preferable.
  • Monocytes include monocytic cells (monocytes, mononuclear cells, monoblasts) having M-CSF receptor (c-fms). Since only monocytes proliferate even when using mononuclear cells, not only monocytes but also mononuclear cells can be used as the target cells for dedifferentiation.
  • stem cells are those that express an undifferentiated marker and have self-replicating ability.
  • the stem cells of the present invention can be obtained in large quantities from monocytes.
  • Stem cells can be induced to differentiate, and preferably have pluripotent differentiation ability.
  • the stem cells obtained in the present invention are positive for CD14 and CD45.
  • the characteristics of the stem cell of the present invention include significantly strong expression of the CXCR4 gene and at least one of Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 and Oct3 / 4, preferably at least 2, more preferably at least 3, more preferably It is mentioned that at least 4 kinds, particularly preferably all of Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 and Oct3 / 4 genes are expressed.
  • Preferred stem cells of the present invention are those in which CXCR4 gene is significantly strongly expressed when compared to stem cells obtained when monocytes are cultured in the presence of M-CSF alone, and Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 and At least one of the Oct3 / 4 genes, preferably at least 2, more preferably at least 3, more preferably at least 4, particularly preferably all 5 are expressed.
  • the characteristics of the stem cells of the present invention are listed below: (i) the CXCR4 gene is significantly strongly expressed when compared to stem cells obtained when monocytes are cultured in the presence of M-CSF alone; (ii) expressing c-Kit, and (iii) It expresses at least one undifferentiated marker selected from the group consisting of Nanog, Nestin, CD9 and Oct3 / 4.
  • Characterization of the difference between the monocyte-derived stem cells of the present invention and other dedifferentiated stem cells is the strong expression of the CXCR4 gene related to the homing action of the cells.
  • the CXCR4 gene is significantly strongly expressed when compared with stem cells obtained by culturing monocytes in the presence of M-CSF alone.
  • the expression level of the CXCR4 gene is M-CSF alone, M-CSF + IL-3, M-CSF + The expression level is 3 times or more, especially 4 times or more than IL-6 & LIF.
  • the stem cell of the present invention expresses CXCR4 gene significantly more strongly than bone marrow-derived mesenchymal stem cells, specifically when analyzed by RT-PCR
  • the expression level of the CXCR4 gene is 2 times or more, preferably 3 times or more that of mesenchymal stem cells derived from bone marrow.
  • the monocyte-derived stem cells of the present invention are characterized by expressing c-Kit, which is a stem cell marker, like other dedifferentiated stem cells.
  • the ligand SDF1 for CXCR4 receptor has been found to be expressed in damaged tissue at the time of fracture, diseases of the circulatory system, or damaged sites of nerve tissue, etc. It is effective in giving a strong homing effect.
  • the stem cells obtained in the present invention can be used for treatment of diseases by direct administration / injection into the affected area.
  • the stem cells Prior to injection into the affected area, the stem cells are preferably cultured in an appropriate medium and the number is increased before administration / injection directly into the affected area.
  • a culture medium for stem cells a general cell culture medium can be used, but it is preferably cultured in the dedifferentiation induction medium of the present invention.
  • diseases that can be treated using the stem cells of the present invention trauma, inflammatory diseases (pancreatitis, radiation damage, dermatomyositis, polymyositis, necrotizing fasciitis Chronic bronchitis), bone / cartilage damage (eg fracture, osteoporosis, osteochondral fracture, osteochondritis), cardiovascular disease (eg dilated cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemic cardiomyopathy, heart failure, myocardial hypertrophy, congestion) Congenital heart failure, restenosis, arrhythmia, atherosclerosis, vasculitis, etc., neurological diseases (eg peripheral neuropathy, neuropathic pain, stroke, encephalitis, meningitis, diabetic neuropathy, attention deficit disorder, autism, Alzheimer Disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, brain or spinal cord trauma or ischemia), liver disease (cirrhosis, chronic hepatitis), kidney disease (chronic renal failure,
  • the dedifferentiated stem cells of the present invention were deposited on September 30, 2009 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1st-chome, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 305-8566, Japan . Receipt number FERM ABP-11184.
  • monocytes can be induced into stem cells by culturing in the presence of at least one selected from the group consisting of (i) M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract.
  • a water-soluble plant extract refers to a whole plant or a part thereof (e.g., leaves, stems, rhizomes, rhizomes, tubers, vines, roots, flowers, buds, petals, ovary, fruits, pods, It means the extract of fruit (fruit, seed, fiber, ovule).
  • the extraction solvent include water or water-containing solvents (for example, water-containing alcohols such as water-containing methanol, water-containing ethanol, water-containing propanol, water-containing THF, water-containing acetone), polar solvents such as DMF, DMSO, and dimethylacetamide.
  • Water-soluble plant extracts are chlorinated hydrocarbons such as chloroform and methylene chloride, alcohols such as methanol, ethanol and propanol, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, esters such as ethyl acetate, ethers such as THF and diethyl ether.
  • a plant may be extracted with a ketone such as acetone or methyl ethyl ketone, an aliphatic or alicyclic hydrocarbon such as hexane or cyclohexane, and then a target water-soluble substance may be extracted with water or a hydrous solvent.
  • Extracts such as water or water-containing solvents and polar solvents can be used as required, such as chlorinated hydrocarbons such as chloroform and methylene chloride, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, esters such as ethyl acetate, THF, and diethyl ether.
  • the fat-soluble component may be removed by washing with an aliphatic or alicyclic hydrocarbon such as ether, hexane, or cyclohexane.
  • a preferable water-soluble plant extract is a plant-derived Folch extract aqueous phase fraction or a purified product thereof.
  • Chloroform may use other chlorinated hydrocarbons such as methylene chloride, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, and may use lower alcohols such as ethanol, n-propanol, isopropanol, butanol instead of methanol. Good.
  • the ratio of the chlorinated hydrocarbon to the alcohol is not limited to 2: 1, and a wide range is exemplified.
  • the mixed solvent of the chlorinated hydrocarbon and the alcohol has a high ability to dissolve the substance, and the extraction can be performed efficiently.
  • the ratio of the chlorinated hydrocarbon to the alcohol is preferably such that when water is added thereto, the active phase can be extracted into the aqueous phase by separating into an aqueous phase and an organic phase.
  • an organic solvent may be added to separate into two layers.
  • the aqueous phase that has been separated into two layers by adding water is referred to herein as “plant-derived Folch extracted aqueous phase fraction”.
  • plant-derived Folch extracted aqueous phase fraction includes an aqueous phase fraction extracted by another method as long as it has the same active substance.
  • the water-soluble plant extract of the present invention contains a glycolipid-like substance (including one or both of glycolipid and sugar) as an active ingredient. Since this glycolipid-like substance has low solubility in an organic solvent, the water-soluble plant extract is preferably isolated as an aqueous phase fraction.
  • the water-soluble plant extract can be further purified using chromatography such as ion exchange chromatography and affinity chromatography, and such purified product may be used as an active ingredient.
  • the active ingredient of the water-soluble plant extract may be composed only of sugar, and may contain both sugar and other components (such as lipids).
  • sugar components glucose, arabinose, xylose, ribose, rhamnose, fucose, deoxyribose, mannose, fructose, galactose, maltose, lactose, cellobiose, sucrose, trehalose, raffinose, melibiose, maltotriose, melezitose, turanose, Glucuronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid, iduronic acid, glucosamine, galactosamine, mannosamine, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylmannosamine, neuraminic acid, N-acetylneuraminic acid, etc.
  • oligosaccharides or polysaccharides are preferably oligosaccharides or polysaccharides, glycosides and glycolipids.
  • specific examples of the polysaccharide include glycosaminoglycan, ⁇ -glucan, ⁇ -glucan, levan, fructan, galactan, mannan, xylan, arabinan, pectinic acid, alginic acid, pectic substance, guaran, sulfated polysaccharide, Examples include polysaccharides in which one or more sugar residues are bound, polysaccharides having one or more of the above sugar residues as a repeating unit, and polysaccharides in which a plurality of sugar residues are complexly bound.
  • the water-soluble plant extract is preferably treated with a cation exchange resin after extraction.
  • the water-soluble plant extract of the present invention preferably contains a component adsorbed with an anion exchange resin (having an anion group in water) as an active ingredient.
  • the water-soluble plant extract of the present invention preferably contains as an active ingredient a component that binds to Con A agarose.
  • the water-soluble plant extract contains an ingredient adsorbed with an anion exchange resin and bound to Con A agarose as an active ingredient.
  • the active ingredient that binds to Con A agarose is preferably a glucose residue and / or a mannose residue, particularly a polysaccharide or carbohydrate containing a mannose residue (including complex carbohydrates such as glycolipids).
  • the water-soluble plant extract contains components that contain sugar residues and are soluble (extractable) in cold or hot water, and the molecular weight is about 500, 1000, 2000, 3000, 4000 or 5000 at the lower limit.
  • the upper limit is preferably exemplified by those containing about 500000, 300000, 200000, 100000, 80000, 60000, 50000, 40000, 30000 or 20000 polysaccharides or complex polysaccharides.
  • It can be induced into stem cells by culturing in the presence of at least one selected from the group consisting of gangliosides and water-soluble plant extracts.
  • M-CSF is already present in vivo (for example, humans)
  • at least one selected from the group consisting of gangliosides and water-soluble plant extracts can act as an inducer from monocytes to stem cells.
  • the stem cells When the stem cells reach the disease site, they function as therapeutic agents for various diseases.
  • the therapeutic agent comprising at least one selected from the group consisting of ganglioside and water-soluble plant extract as an active ingredient is trauma, inflammatory disease (pancreatitis, radiation damage, dermatomyositis, polymyositis, necrotizing fasciitis, chronic Bronchitis), bone / cartilage damage (eg fracture, osteoporosis, osteochondral fracture, osteochondritis), cardiovascular disease (eg dilated cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemic cardiomyopathy, heart failure, myocardial hypertrophy, congestive heart failure) , Restenosis, arrhythmia, atherosclerosis, vasculitis, etc.), neurological diseases (eg peripheral neuropathy, neuropathic pain, stroke, encephalitis, meningitis, diabetic neuropathy, attention deficit disorder, autism, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, brain or spinal cord trauma or ischemia, liver disease (cirrhosis, chronic he
  • the effective amount of the therapeutic agent comprising at least one selected from the group consisting of ganglioside and water-soluble plant extract as an active ingredient is appropriately selected depending on its usage, patient age, sex and other conditions, disease severity, and the like.
  • the amount of the active ingredient is about 0.0001 to 100 mg, preferably about 0.001 to 10 mg, more preferably about 0.01 to 5 mg per kg body weight of a human adult.
  • the therapeutic agent can be administered in 1 to 4 divided doses per day.
  • the plant-derived Folch extract aqueous phase fraction broadly encompasses plant extracts extracted by the same method.
  • the active ingredient of the water-soluble plant extract containing the plant-derived Folch extract aqueous phase fraction has a property of binding to an anion exchange resin, Con A agarose, and the activity can be increased by passing through a cation exchange resin. .
  • the therapeutic agent or pharmaceutical composition of the present invention is put into practical use as a pharmaceutical preparation, it is formulated with at least one selected from the group consisting of gangliosides and water-soluble plant extracts and optionally an active ingredient containing M-CSF.
  • a carrier can be used to form a general dosage form.
  • the preparation carrier include diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants, lubricants and the like that are commonly used, depending on the dosage form. These are appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the dosage form to be obtained.
  • various forms can be selected according to the purpose of treatment, and representative examples thereof include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, Suppositories, injections (solutions, suspensions, etc.), ointments and the like can be mentioned. All of these can be prepared according to a conventional method and using the appropriate carrier.
  • the tablet can be a tablet coated with a normal coating as necessary, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet.
  • the drug of the present invention When the drug of the present invention is prepared as an injection such as a solution, emulsion, suspension, etc., it is preferred that the drug is sterilized and isotonic with blood, in an amount sufficient to prepare an isotonic solution.
  • Sodium chloride, glucose or glycerin may be contained in the pharmaceutical composition of the present invention, and usual solubilizers, buffers, soothing agents and the like may be added.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals as necessary.
  • M-CSF and at least 1 sort (s) chosen from the group which consists of a ganglioside and a water-soluble plant extract these may be administered simultaneously and may be administered separately.
  • At least one selected from the group consisting of gangliosides and water-soluble plant extracts may be ingested in the form of food, for example, drinks or blocks (supplement blocks).
  • a food composition can be prepared according to a conventional method, and other generally known food materials (raw material components), excipients, diluents and the like can be appropriately used for the preparation.
  • Dedifferentiated stem cells are obtained by inducing dedifferentiation by culturing the aforementioned raw material cells for a certain period in the presence of at least one selected from the group consisting of (i) M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract. Can do.
  • M-CSF has a membrane-bound type with a molecular weight of about 22000 and a secreted type with a molecular weight of about 42000. These are disulfide bonds and have a molecular weight of about 45000 (22000 dimer), about 85000 (42000 dimer), 85 kDa type. Further, there is a high molecular weight type in which proteoglycan is further bound, and any of these may be used.
  • a secretory form having a molecular weight of about 42000, a molecular weight of about 85000 (42000 dimer), and a high molecular weight form in which a proteoglycan is further bound to the 85 kDa form can be used.
  • M-CSF The origin of M-CSF includes mammals (human, horse, cow, monkey, chimpanzee, pig, sheep, rabbit, mouse, rat, dog, cat), preferably human, monkey, chimpanzee, etc. Examples include primates, and humans are particularly preferable.
  • M-CSF may be used after purifying a natural product, but a product produced by gene recombination is preferably used.
  • M-CSF has been found to have a specific activity comparable to that of the natural type as long as it has at least the amino acid from the N-terminus to about the 153rd position. Etc. can be illustrated.
  • the type of ganglioside is not particularly limited as long as it is described below, such as GM1, GD1a, GT1b. Further, these mixtures may be used, and there is no problem even if these mixtures are used. Furthermore, dedifferentiation can be strongly induced even by plant-derived extract components (plant-derived glycolipid-like substances). Animal tissue-derived extracts (animal-derived glycolipid-like substances) may also be used. The extract can be prepared under the general conditions for extracting glycolipid-like substances.
  • the active ingredient of the medicament of the present invention is ganglioside or a water-soluble plant extract, and any plant extract or animal tissue extract can be used as long as these are contained.
  • ganglioside is abundantly contained in animal brain / nerve tissue, and an extract derived from animal brain / nerve tissue can be used as ganglioside.
  • the ganglioside of the extract may be purified, and fractions having various degrees of purification containing glycolipid components containing ganglioside can be used.
  • the extraction component the fraction obtained may be used under the conditions where a glycolipid-like substance is generally extracted.
  • the water phase fraction by Folch extraction method nonpatent literature 5
  • Preferred examples of the animal include mammals (cow, pig, rabbit, sheep, horse, etc.), and ganglioside derived from porcine brain / nerve tissue is particularly preferred.
  • ganglioside derived from milk of mammals such as milk can also be used.
  • a water-soluble plant extract to be a material of a ganglioside or a glycolipid-like substance
  • a sweet potato sweet potato
  • a Simon moth Ipomea Batatas sp
  • a morning glory morning-glory
  • a morning moth morning moth
  • Momijigigao Ivy-leaved morning glory
  • Hatsudeasagao Fingerleaf morning glory
  • Hosakiaagao cardinal climber
  • Sorairoasagao blue morning glory
  • Ryukyu morning glory Ipomoea congesta nucifera) (lotus root)
  • Lotus family such as Nelumbo lutea, American dogwood (Solanum americanum), tomato (Solanum lycopersicum), horned moth (Solanum mammosum), eggplant (Solanum melongena), ola numbo Srum Potato (Solanum tuberosum), Capsicum ⁇ annuum, Capsicum ⁇ ann
  • Plants include leaves, stems, rhizomes, rhizomes, tubers, vines, roots, flowers, buds, petals, ovaries, fruits, pods, berries, seeds, fibers, ovules, whole grasses, etc. It may be extracted.
  • potatoes such as sweet potatoes and potatoes do not necessarily have to be part of the cocoon, but leaves, stems, rhizomes, rhizomes, tubers, vines, roots, flowers, buds, petals, ovary, fruits, pods, berries, Any of seeds, fibers, ovules, whole plants and the like may be used.
  • a genetically modified plant into which a necessary gene has been introduced and / or an unnecessary gene has been knocked out so that a large amount of a ganglioside or glycolipid-like substance can be produced can also be used.
  • Ganglioside is a general term for glycosphingolipids having sialic acid, and types include GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, GT1b, and GQ1b. Each ganglioside has the following structure.
  • the medium used is not particularly limited as long as it is a medium for mammalian cells.
  • UltraCULTURE TM can be exemplified for mammalian culture, but there is no particular limitation.
  • the culture conditions are (i) M-CSF and (ii) ganglioside and at least one selected from the group consisting of water-soluble plant extracts, preferably at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2.
  • dedifferentiated stem cells can be obtained. That is, dedifferentiation proceeds during this culture period, and a stem cell expressing the undifferentiated marker specified in the present invention can be obtained.
  • the expression of the CXCR4 gene that characterizes the stem cell of the present invention is remarkably increased during this culture period, and if the CXCR4 gene is highly expressed even when the culture period is extended thereafter, it corresponds to the stem cell of the present invention.
  • the number of stem cells finally obtained can be about 5 times as many stem cells as compared with the case of culturing with M-CSF alone or in combination with other cytokines. .
  • a complex in which at least one member selected from the group consisting of M-CSF, ganglioside and water-soluble plant extract is covalently or non-covalently bound can also be used as a dedifferentiation inducer.
  • the present invention is selected from the group consisting of (i) M-CSF, (ii) ganglioside and water-soluble plant extract
  • M-CSF can be used at a concentration of 5-100 ng / ml, and preferably cultured at 25 ng / ml.
  • ganglioside a mixture such as an extract derived from a plant or an animal may be used, a natural ganglioside-containing material may be purified, or may be used after chemical synthesis.
  • Ganglioside is used in the medium at a final concentration of about 1-100 ⁇ g / ml.
  • the water-soluble plant extract is used in the medium at a final concentration of about 0.1-100 ⁇ g / ml.
  • ganglioside is used to mean both gangliosides such as GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, GT1b, GQ1b, and mixtures thereof.
  • the amount of ganglioside means the amount of ganglioside, and when there are a plurality of gangliosides, it means the total amount.
  • Kit The present invention also provides a kit for cell medicine comprising the stem cell of the present invention as an essential component, and (i) M-CSF and (ii) a dedifferentiated cell production kit comprising an ganglioside water-soluble plant extract as an essential component. To do.
  • the kit for cell medicine contains the monocyte-derived stem cell of the present invention as an essential component, and if necessary, at least selected from the group consisting of (i) M-CSF, (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract.
  • a medium containing one kind, a culture container, or the like may be included.
  • a form in which monocyte-derived stem cells are filled in a syringe may be used.
  • the number of monocyte-derived stem cells contained in the kit for cell medicine is, for example, about 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 per kit.
  • the dedifferentiated cell production kit of the present invention comprises at least one selected from the group consisting of (i) M-CSF and (ii) ganglioside and a water-soluble plant extract as an essential component, and if necessary, a cell culture medium , Culture vessels, monocytes and the like.
  • intravenous administration of dedifferentiated cells may be performed.
  • the cells to be used can be appropriately seeded according to a conventional method.
  • cells can be collected after trypsin treatment, collected by centrifugation, dispersed in a suitable isotonic solution, and then administered intravenously, for example.
  • cells obtained by culturing can be stored in the presence of liquid nitrogen or at ⁇ 80 ° C. according to a conventional method if there is a time difference in the appropriate administration timing after recovery from the culture medium.
  • monocytes are collected from 7 to 14 days after the start of dedifferentiation culture and used immediately for the intended treatment. This is because the expression level of the CXCR4 gene is likely to reach the maximum during this time. In that sense, taking into account the expression level of the gene marker, the period of use of the stem cells can be determined without being limited to the culture period.
  • the present invention provides at least one selected from the group consisting of gangliosides and water-soluble plant extracts and M-CSF as necessary to mammals such as humans. It can treat trauma, inflammatory diseases, bone / cartilage damage, cardiovascular diseases, neurological diseases, liver and kidney diseases, diabetes, atopic dermatitis, GVHD and the like. This is because the monocytes of the subject to be administered, and if necessary, stem cells capable of repairing the disease by at least one action selected from the group consisting of M-CSF consisting of ganglioside and plant-derived Folch extract aqueous phase fraction It moves to the disease site and acts as a therapeutic agent. Alternatively, it cannot be denied that at least one selected from the group consisting of ganglioside and plant-derived Folch-extracted aqueous phase fraction acts directly or indirectly on cells other than monocytes.
  • the dedifferentiated stem cells produced in the present dedifferentiation inducer can be used as a kit after appropriate preservation treatment.
  • the dedifferentiation inducer can also be made into a kit as an essential component.
  • Example 1 Human monocytes (LONZA, PT038) were cultured according to the present invention by adding the following additives 1 to 5 to the basal medium (concentrations are expressed as final concentrations (hereinafter referred to as “FC”)). The results are shown in Figure 1.
  • the vertical axis in FIG. 1 corresponds to the number of viable cells, and the horizontal axis represents the number of culture days. Compared with the method reported by Fandrich and Huberman et al., It can be seen that the proliferation of the monocyte-derived stem cells of the present invention is very high.
  • Additive 1 M-CSF (FC: 25ng / ml) + Gangliosides (Bovine Brain GD1a SIGMA) (FC: 100ug / ml)
  • Additive 2 M-CSF (FC: 5 ng / ml) + IL-3 (FC: 0.5 ng / ml)
  • Additive 3 M-CSF (FC: 25 ng / ml) + IL-6 (FC: 20 ng / ml) & LIF (FC: 1000 unit / ml) (Non-patent Document 3)
  • Additive 5 M-CSF (FC: 25 ng / ml) + glycolipid (Folch extract water phase fraction of 1 g dry weight of plant (sweet potato) dissolved in 500 ml of medium)
  • the Folch extract aqueous phase fraction used in Additive 5 was vigorously mixed with an equal volume of chloroform / methanol 2: 1 solution after lyophilized cells (sweet potato plant tissue) were thoroughly homogenized with an appropriate amount of physiological saline.
  • a component that can be extracted into the upper water-soluble fraction after mixing into an organic solvent phase, a denatured protein phase, and an aqueous phase by centrifugation was used.
  • DMEM fetal bovine serum
  • human monocytes were cultured at 1.5 ⁇ 10 5 / ml (200 ul / well, 96 well plate).
  • Viable cell counts were quantified using the Promega CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay. That is, cells that did not adhere to each culture day were removed by washing the wells three times with physiological saline, and then the cells that adhered and proliferated were quantified.
  • the gene expression of stem cells obtained by the culture method according to the present invention and the prior art was analyzed by RT-PCR.
  • Human monocytes were cultured at 1.5 ⁇ 10 5 / ml (6 ml / Dish, diameter 6 cm) under the above conditions, and mRNA was collected on the 14th day (Invitrogen: Micro Fast Track 2.0 Kit), followed by RT -The expression level was analyzed by PCR.
  • the item and primer sequence information is as follows.
  • Nanog F 5′-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 1) R 5'-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 2) Nestin F 5′-CTCTGACCTGTCAGAAGAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 3) R 5′-GACGCTGACACTTACAGAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 4) Oct3 / 4 F 5'-GAGCAAAACCCGGAGGAGT-3 '(SEQ ID NO: 5) R 5′-TTCTCTTTCGGGCCTGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 6) c-Kit F 5′-CCAAGTCATTGTTGGATAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) R 5′-CTTAGATGAGTTTTCTTTCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) CXCR4 F 5′-ATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATC-3 ′ (SEQ ID NO: 9) R 5′-ATCCAGACG
  • ganglioside was added to the medium to a final concentration of 100 ug / ml, and peripheral blood monocytes were cultured.
  • rhM-CSF was added to a final concentration of 25 ng / ml.
  • the number of viable cells in the second week of culture was quantified as luciferase activity by cell-titer Glo (Promega). That is, although culture was performed using GM1, GD1a, GT1b, and their Mix, all showed strong stem cell inducing activity to the same extent (FIG. 3). In addition, no difference was observed in cell morphology (photograph is the second week of culture) (FIG. 4).
  • the lane configuration in FIG. 3 is as follows (the concentration is expressed as the final concentration (hereinafter referred to as “FC”)).
  • FC final concentration
  • Specific activity is a value obtained by setting the cell growth activity to 100 for the sweet potato stem extract.
  • this active ingredient is that it is mainly extracted into the aqueous phase by the Folch extraction method.
  • Water-soluble plant extracts can be fractionated, separated or purified by several column chromatography. That is, the active ingredient of the water-soluble plant extract is characterized by binding to an anion exchange resin (Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, etc.) and a lectin binding resin (Con ⁇ A, etc.) in a wide pH range.
  • an anion exchange resin Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, etc.
  • a lectin binding resin Con ⁇ A, etc.
  • FIG. 6 shows the result of applying the extract to a resin having binding ability with an active ingredient and evaluating the activity of the flow-through fraction. That is, it was found that the activity disappears in the flow-through fraction when the active ingredient binds to the anion exchange resin, Con A agarose. The activity is increased, suggesting that the inhibitor was removed by the cation exchange resin.
  • the activity of the sweet potato stem extract was calculated as 100.
  • An increase in activity in the flow-through fraction of the cation exchange resin suggests that the inhibitor has been removed.
  • the lectin Con ⁇ A resin the activity disappeared, indicating that the active factor was retained.
  • Example 2 Curative effect by animal model of stem cell administration (Example of treatment using liver cirrhosis model mouse) Administer carbon tetrachloride (1 ml / kg body weight) twice a week for 12 consecutive weeks to artificially cause cirrhosis in experimental mice.
  • the human monocyte-derived dedifferentiated stem cell (hMDDSC) of the present invention was administered twice to the cirrhosis model mouse from the tail vein (second time after 1 week, 1 x 10 5 cells per individual), and the second time One week after administration (2 weeks after the first administration), the liver was collected and subjected to pathological analysis and biochemical analysis using tissue sections.
  • SDF1 Stromal cell derived factor-1
  • CXCR4 a receptor for SDF1
  • hMDDSC a receptor for SDF1
  • GOT / GPT values decrease rapidly after completion of carbon tetrachloride administration and return to normal values. There was no significant difference in measured values.
  • the drug treatment for 12 weeks causes intense fibrosis in the liver tissue, resulting in cirrhosis.
  • the hMDDSC of the present invention showed a dramatic effect on the reduction and removal of fibrous tissue developed in the liver.
  • Type III procollagen peptide The blood concentration of type III procollagen peptide was measured in a liver cirrhosis treatment experiment using a mouse model.
  • Pro-collagen type III peptide PIIIP
  • PIIIP Pro-collagen type III peptide
  • the control group (Saline) administered with saline after induction of cirrhosis showed a value about 5 times higher than that of the normal control group (Normal) mice, whereas hMDDSC administration dramatically decreased the amount of procollagen in the blood. The value was close to that of a healthy mouse. Since the physiological saline administration group shows a high value, it can be seen that abnormal high production of collagen molecules continues for a while after the induction of cirrhosis induced by carbon tetrachloride stimulation. However, it can be seen that this abnormal high collagen production is rapidly suppressed by hMDDSC administration, and it is lowered to near the normal level.
  • the hMDDSC administration group decreased by 22.6% compared to the saline administration target group (Saline), that is, improvement of liver fibrosis was detected.
  • Treatment with hMDDSC of the present invention in a mouse cirrhosis model is thus characterized by significant suppression of fiber production and decreased removal of fibrous tissue in just 2 doses of 2 weeks of treatment / period. As a result, it is an epoch-making treatment system that works for quick escape from liver cirrhosis and restoration of normal liver tissue, and promotes liver regeneration.
  • Cited references Jung YJ, Ryu KH, Cho SJ, Woo SY, Seoh JY, Chun CH, Yoo K, Moon IH, Han HS.Syngenic bone marrow cells restore hepatic function in carbon tetrachloride-induced mouse liver injury.Stem Cells Dev. 2006, 15 687-695.
  • Kollet O Shivtiel S, Chen YQ, Suriawinata J, Thung SN, Dabeva MD, Kahn J, Spiegel A, Dar A, Samira S, Goichberg P, Kalinkovich A, Arenzana-Seisdedos F, Nagler A, Hardan I, Revel M, Shafritz DA, Lapidot T.
  • HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34 + stem cell recruitment to the liver.J Clin Invest. 2003, 112, 160-169. Nervi B, Link DC, DiPersio JF. Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization. J Cell Biochem. 2006, 99, 690-705. Giannini E, Caglieris S, Ceppa P, Risso D, Lantieri PB, Testa R. Serum pro-collagen III peptide levels are related to lobular necrosis in untreated patients with chronic hepatitis C. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001, 13, 137-141 . Reddy GK, Enwemeka CS.A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues.Clin Biochem. 1996, 29, 225-229.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

　本発明は、単球を(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養し、脱分化させることにより得られる幹細胞、細胞、組織もしくは器官の損傷に関係する疾患の治療剤；細胞医薬用剤、幹細胞の生産方法、単球の脱分化誘導培地、脱分化誘導剤、細胞医薬用キットまたは脱分化細胞産生キットおよび医薬組成物に関する。

Description

ヒト単球由来治療用幹細胞およびその誘導方法
　本発明は、生体において正常に分化した細胞を短期間に脱分化させることにより、細胞医薬に使用できる細胞を提供する方法に関する。また、本発明は、細胞、組織もしくは器官の損傷に関係する疾患の治療剤に関する。さらに、本発明は、効率的に脱分化誘導させる細胞医薬用剤、幹細胞の生産方法、単球の脱分化誘導培地、脱分化誘導剤、細胞医薬用キットまたは脱分化細胞産生キット、医薬組成物および幹細胞に関する。
　疾患に対する根本的な治療方法として、何らかの原因により組織において喪失した細胞を補充する手法、つまり再生医療が注目を浴びて久しい。しかしながら、近年更に幹細胞或いは組織細胞の前駆細胞を注入し、疾患部位で再生および細胞間生理活性物質の相互作用を通じて組織を修復していこうという細胞医薬の考え方が広がりを見せている。
　これに呼応して、組織における分化細胞たとえば末梢血由来単球が、特定のサイトカインの存在下で培養することにより、幹細胞に脱分化するとの報告が相次いでされている。
　しかしながら、細胞医薬を目的として幹細胞或いは組織前駆細胞を生体内に投与した場合でも、目的の損傷部位に細胞が到達する率が必ずしも高くなく、また一定ではない。したがって大量の細胞を準備しなくてはならないという問題がある。また、目的部位以外の部分に分布した細胞が、その部位でどのような挙動を示すのかに関して詳細な検討はなされておらず、副作用発症の点で問題を残している。さらに、治療効果を上げるためには大量の細胞を投与しなくてはならないが、自己の細胞を短期間で調達することは困難であると思われる。
　近年、損傷部位において虚血状態のもとSDF1（ストローマ細胞由来因子１）或いはVEGF（血管内皮細胞増殖因子）が発現し、生体内修復機構の一環として本分子が誘引分子となり、これら誘引分子に対するレセプターを発現している細胞が損傷部位に引き寄せられる（所謂ホーミング）現象が生じることが明らかとなっている。これらの受容体に関しては、SDF1に対してはCXCR4であり、VEGFに対してはVEGFRである。例えば、非特許文献1は、虚血部位においてSDF1をブロックするか、またはCXCR4発現細胞を血液中から除去した場合、傷が治らなくなることを報告している。
　ヒト単球を起原に脱分化誘導によって多分化能を有する幹細胞を得る技術は、ファンドリッヒ（Fandrich）やフーバーマン（Huberman）（非特許文献2、3）らによって報告されている。いずれもM-CSFをはじめ、様々なサイトカインを培養に用いている。いずれの培養方法においても、いくつかの未分化マーカーが陽性に転じていることが確かめられている。また、桑名ら（非特許文献４）は、フィブロネクチンを塗布した培養皿を用いてヒト単核球から多能性幹細胞MOMCを誘導できることを報告している。
Nat.Med.2004 Aug; 10(8):858-64 Ruhnke M, Fandrich F., Differentiation of in vitro-modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells., Gastroenterology. 128(2005)1774 Yong Zhao, Eliezer Huberman, A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells, PNAS 100(2003)2426 Kuwana M. et al., Human circulating CD14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation.J Leukoc Biol. 74(2003) 833 Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G. H.: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem., 226,497-509(1957).
　本発明は細胞医薬の分野において問題とされてきた、標的部位に効率的に到達できる幹細胞の提供、およびその短期大量製造方法、および当該細胞を誘導するための医薬組成物を提供することを目的とする。
　また、本発明は、細胞、組織もしくは器官の損傷に関係する疾患の治療剤を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、脱分化誘導培地、脱分化誘導剤、細胞医薬用キットまたは脱分化細胞産生キットおよび幹細胞を提供することを目的とする。
　本発明は上記課題を解決するもので、末梢血単球を用いて、本発明脱分化誘導剤の存在下に短期間培養することにより、脱分化細胞を大量に誘導できることを見出した。また、本発明の医薬組成物を直接生体に投与することにより、損傷関連疾患が効果的に治療できることを見出した。さらに、ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を投与することで、生体内のM-CSFとおそらくは協働して、単球を幹細胞などの細胞、組織もしくは器官の損傷を修復可能な細胞に誘導でき、それにより細胞、組織もしくは器官の損傷に関係する疾患の治療剤を提供できることを見出した。
　即ち、本発明は具体的には以下の発明を提供するものである。
項１．　単球を(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養し、脱分化させることにより得られる幹細胞。
項２．　水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分が糖もしくは複合糖質である、項１に記載の幹細胞。
項３．　水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分の分子量が1000～500000である項１に記載の幹細胞。
項４．　水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分が、ConAカラムに吸着される、項１に記載の幹細胞。
項５．　水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分が、アニオン交換樹脂に吸着される項１に記載の幹細胞。
項６．　水溶性植物抽出物が植物由来Folch抽出水相画分もしくはその精製物である、項１に記載の幹細胞。
項７．　単球がヒト単球である項１記載の幹細胞。
項８．　未分化マーカーNanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4の少なくとも１種を発現しており、単球をM-CSF単独存在下培養した場合に得られた幹細胞と比較した場合、CXCR4遺伝子が有意に強く発現していることを特徴とする項１～７のいずれかに記載の幹細胞。
項９．　未分化マーカーNanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4の少なくとも１種を発現し、かつCXCR4遺伝子が有意に強く発現していることを特徴とする幹細胞。
項１０．　単球を(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養することを特徴とする幹細胞の生産方法。
項１１．　培養期間が７日から１４日間である項６記載の方法。
項１２．　(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む単球の脱分化誘導培地。
項１３．　項１～９のいずれかに記載の幹細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
項１４．　項１～９のいずれかに記載の幹細胞を有効成分として含有する細胞医薬用剤。
項１５．　(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする脱分化誘導剤。
項１６．　ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする細胞、組織もしくは器官の損傷に関係する疾患の治療剤。
項１７．　前記疾患が外傷、炎症性疾患、骨・軟骨の損傷、循環器疾患、神経疾患、肝疾患および腎疾患、糖尿病、アトピー性皮膚炎、GVHDからなる群から選ばれる、項１６に記載の治療剤
項１８．　前記疾患が外傷、膵炎、放射線損傷、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎、慢性気管支炎、骨折、骨粗鬆症、骨軟骨骨折、骨軟骨炎、拡張型心筋症、心筋梗塞、虚血性心筋症、心不全、心筋肥大、うっ血性心不全、再狭窄、不整脈、アテローム性動脈硬化症、血管炎、末梢ニューロパシー、ニューロパシー痛、脳卒中、脳炎、髄膜炎、糖尿病性ニューロパシー、注意欠陥障害、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト－ヤコブ病、脳または脊髄外傷もしくは虚血、肝硬変、慢性肝炎、慢性腎不全、糸球体腎炎、腎虚血、糖尿病、アトピー性皮膚炎、GVHDからなる群から選ばれる、項１６に記載の治療剤。
項１９．　少なくとも項１～９記載の幹細胞を必須構成成分とする細胞医薬用キット。
項２０．　(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を必須構成成分とする脱分化細胞産生キット。
項２１．　さらに単球を構成成分として含む項２０記載のキット。
項２２．　ガングリオシドがGD1a、GD1b、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、GT1b、およびGQ1bからなる群から選ばれる少なくとも1種である、項１～２１のいずれかに記載の幹細胞、幹細胞の生産方法、単球の脱分化誘導培地、細胞医薬用剤、治療剤、脱分化誘導剤、細胞医薬用キットまたは脱分化細胞産生キット。
　本発明により、組織損傷部位に到達できる幹細胞を、単球を用いて短期間に大量に供給することができる。また、当該幹細胞誘導剤を提供することもでき、細胞医薬の分野に貢献することが期待できる。
　さらに、ガングリオシド及び水溶性植物抽出物、例えば植物由来Folch抽出水相画分またはその精製物が細胞、組織もしくは器官の損傷に関係する疾患の治療剤となることが明らかにされた。
培地１～培地５で培養することにより単球から誘導された幹細胞の増殖曲線を示す。 RT-PCRによる遺伝子発現の結果を示す。 各ガングリオシド添加による幹細胞への脱分化作用を示す。 各ガングリオシド添加における細胞形態を示す。 各植物抽出画分における脱分化誘導活性を示す。 サツマイモ茎抽出物由来脱分化誘導成分の各種クロマトによる分画の活性結果を示す。 マウス肝組織における抗コラーゲン抗体染色像を示す。
　本発明は、脱分化させる細胞として単球、例えば末梢血単球を用いる。
　本発明で使用する単球は、哺乳動物由来のものである。哺乳動物としては、ヒト、ウマ、ウシ、サル、チンパンジー、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、イヌ、ネコなどが挙げられ、好ましくは、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類が挙げられ、特にヒト単球が好ましい。単球は、骨髄、血液などに由来するが、好ましくは血液、特に末梢血単球を好ましく使用できる。
　血液などのサンプルから単球を分離する方法は公知であり、例えば血球分離溶液LymphoprepTM （リンホプレップ：コスモ・バイオ社）を用いて、単核球を調製し、CD14の表面抗原を認識する抗体磁気ビーズ（ミルテニー・ バイオテク社）にて調製する方法、あるいは単核球のままでも本発明の単球の供給源として用いることができる。
　あるいは、ヒト単球は市販品を用いてもよい。市販品としては、例えばPT038 (LONZA社）などが挙げられる。
　本発明において、単球は幹細胞に脱分化され、それを増殖後にヒトなどの被験体に戻すことが想定される。この場合、患者から単球を分離することになるため、できるだけ少ない量の単球から大量の幹細胞を得ることが必要になる。本発明によれば、単球を脱分化した幹細胞の増殖効率が高く、少量の単球から大量の幹細胞を調製できるため、好ましい。
　単球としては、M-CSF受容体(c-fms)を有する単球系細胞(単球、単核球、単芽球)が包含される。単核球を用いても単球だけが増殖するので、単球だけでなく単核球も脱分化の対象細胞として用いることができる。
　本明細書において、「幹細胞」とは、未分化マーカーを発現し自己複製能を有するものである。本発明の幹細胞は、単球から大量に得ることができる。また、幹細胞は、分化誘導することができ、好ましくは多能性分化能を有する。本発明で得られる幹細胞は、CD14及びCD45が陽性である。
　本発明幹細胞の特徴としては、CXCR4遺伝子の有意に強い発現とNanog, Nestin, c-Kit, CD9及び Oct3/4の少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、より好ましくは少なくとも3種、さらに好ましくは少なくとも4種、特に好ましくはNanog, Nestin, c-Kit, CD9および Oct3/4遺伝子全てが発現されていることが挙げられる。
　好ましい本発明の幹細胞は、単球をM-CSF単独存在下で培養した場合に得られた幹細胞と比較した場合にCXCR4遺伝子が有意に強く発現され、さらにNanog, Nestin, c-Kit, CD9 およびOct3/4遺伝子の少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、より好ましくは少なくとも3種、さらに好ましくは少なくとも4種、特に好ましくは5種全てが発現されたものである。
　より好ましい実施形態において、本発明幹細胞の特徴を以下に列挙する：
(i)単球をM-CSF単独存在下で培養した場合に得られた幹細胞と比較した場合、CXCR4遺伝子が有意に強く発現していること、
(ii) c-Kitを発現していること、および
(iii) Nanog, Nestin, CD9およびOct3/4からなる群から選ばれる少なくとも1種の未分化マーカーを発現していること。
　本発明の単球由来幹細胞と他の脱分化幹細胞との違いを特徴付けているのは、細胞のホーミング作用に関係するCXCR4遺伝子の強い発現である。本発明幹細胞は、単球をM-CSF単独存在下に培養して得られた幹細胞と比較した場合、CXCR4遺伝子が有意に強く発現している。例えば、本発明の1つの好ましい実施形態において、本発明の幹細胞は、RT-PCRで解析した場合に、CXCR4遺伝子の発現量はM-CSF単独、M-CSF+IL-3、M-CSF+IL-6＆LIFなどに対して3倍以上、特に4倍以上の発現量を有している。また、本発明の1つの好ましい実施形態において、本発明の幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞と比較してもCXCR4遺伝子が有意に強く発現し、具体的にはRT-PCRで解析した場合に、CXCR4遺伝子の発現量は骨髄由来の間葉系幹細胞の2倍以上、好ましくは3倍以上である。
　本発明の単球由来幹細胞は他の脱分化幹細胞と同様に幹細胞マーカーであるc-Kitを発現していることを特徴とする。
　CXCR4受容体に対するリガンドSDF1は、骨折時の損傷組織、循環系統の疾患、或いは神経組織の損傷部位などに発現していることが判明しており、細胞医薬の観点から本細胞の損傷部位へのホーミング効果をより強く持たせる上で、効果的である。
　本発明で得られる幹細胞は、患部に直接投与／注入することにより、疾患の治療に用いることができる。患部に注入する前には、幹細胞を適切な培地で培養し、数を増やしてから患部に直接投与／注入するのが好ましい。幹細胞の培養培地としては、一般的な細胞培養用の培地を使用することができるが、本発明の脱分化誘導培地で培養することが好ましい。
　本発明の一つの態様によれば、本発明の幹細胞を用いて治療され得ると考えられる疾患は）、外傷、炎症性疾患（膵炎、放射線損傷、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎、慢性気管支炎）、骨・軟骨の損傷(例えば骨折、骨粗鬆症、骨軟骨骨折、骨軟骨炎)、循環器疾患（例えば拡張型心筋症、心筋梗塞、虚血性心筋症、心不全、心筋肥大、うっ血性心不全、再狭窄、不整脈、アテローム性動脈硬化症、血管炎など）、神経疾患（例えば末梢ニューロパシー、ニューロパシー痛、脳卒中、脳炎、髄膜炎、糖尿病性ニューロパシー、注意欠陥障害、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト－ヤコブ病、脳または脊髄外傷もしくは虚血）、肝疾患（肝硬変、慢性肝炎）、腎疾患（慢性腎不全、糸球体腎炎、腎虚血）、糖尿病、アトピー性皮膚炎、GVHDなどが挙げられる。
　なお、本発明脱分化幹細胞は、2009年9月30日に日本国〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託した。受領番号 FERM ABP-11184。
　上記のように単球は、(i)M－CSFおよび(ii) ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養することで幹細胞に誘導することができる。
　本明細書において、水溶性植物抽出物とは、植物の全草もしくはその一部(例えば葉、茎、地下茎、根茎、塊茎、つる、根、花、つぼみ、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠)の抽出物を意味する。抽出溶媒は、水または含水溶媒(例えば含水メタノール、含水エタノール、含水プロパノール、などの含水アルコール、含水ＴＨＦ、含水アセトン)、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジメチルアセトアミドなどの極性溶媒が挙げられ，これらの水、含水溶媒もしくは極性物質の溶解度の大きな極性溶媒により抽出される物質を意味する。水溶性植物抽出物は、クロロホルム、塩化メチレンなどの塩素化炭化水素、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素、酢酸エチルなどのエステル、ＴＨＦ，ジエチルエーテルなどのエーテル、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン、ヘキサン、シクロヘキサンなどの脂肪族もしくは脂環式炭化水素などで植物を抽出し、その後水もしくは含水溶媒で目的とする水溶性物質を抽出してもよい。水もしくは含水溶媒、極性溶媒などの抽出物は、必要に応じてクロロホルム、塩化メチレンなどの塩素化炭化水素、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素、酢酸エチルなどのエステル、ＴＨＦ，ジエチルエーテルなどのエーテル、ヘキサン、シクロヘキサンなどの脂肪族もしくは脂環式炭化水素で脂溶性成分を洗浄除去してもよい。好ましい水溶性植物抽出物は、植物由来Folch抽出水相画分もしくはその精製物である。
　Folch抽出は、植物をクロロホルム：メタノール＝２：１で抽出し、この混合溶媒を水で洗浄して水相に移行した画分を意味する。クロロホルムは塩化メチレン、四塩化炭素、１，２-ジクロロエタンなどの他の塩素化炭化水素を用いてもよく、メタノールの代わりにエタノール、ｎ-プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどの低級アルコールを使用してもよい。また、塩素化炭化水素とアルコールの比も上記２:１に限定されることはなく、広い範囲が例示される。ここで、塩素化炭化水素とアルコールの混合溶媒は、物質の溶解能が高く、抽出を効率的に行うことができる。塩素化炭化水素とアルコールの比率は、ここに水を加えた場合に水相と有機相に分離し、水相に活性物質を抽出できる比率が好ましい。水を加えて２相に分離しない場合には、有機溶媒を加えて二層分離させればよい。水を加えて二層分離した水相を本明細書では「植物由来Folch抽出水相画分」という。なお、「植物由来Folch抽出水相画分」は、これと同様な活性物質を有する限り、別の方法で抽出した水相画分を包含する。
　本発明の水溶性植物抽出物は、糖脂質様物質（糖脂質と糖の一方または両方を含む）を有効成分として含む。この糖脂質様物質は有機溶媒に対する溶解度が低いため、水溶性植物抽出物は、水相画分として好ましく単離される。水溶性植物抽出物は、さらに、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを用いて更に精製することができ、このような精製物を有効成分として使用してもよい。
　水溶性植物抽出物の有効成分は、糖のみから構成されてもよく、糖とそれ以外の成分（脂質など）の両方を含んでいてもよい。糖の構成成分としては、グルコース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、フコース、デオキシリボース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、セロビオース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、メリビオース、マルトトリオース、メレジトース、ツラノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ-アセチルマンノサミン、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸などが挙げられ、これらは硫酸化されていてもよい。これらは、オリゴ糖または多糖、配糖体、糖脂質になっているのが好ましい。多糖としては、具体的にはグリコサミノグリカン、α－グルカン、β－グルカン、レバン、フルクタン、ガラクタン、マンナン、キシラン、アラビナン、ペクチン酸、アルギン酸、ペクチン質、グアラン(guaran)、硫酸化多糖、１種または２種以上の糖残基が結合した多糖、あるいは上記の糖残基の1種または2種以上を繰り返し単位とする多糖、複数の糖残基が複雑に結合した多糖が挙げられる。水溶性植物抽出物は、抽出後に陽イオン交換樹脂で処理することが望ましい。1つの実施形態で、本発明の水溶性植物抽出物は、好ましくは陰イオン交換樹脂で吸着される（水中でアニオン基を有する）成分が有効成分として含まれる。別の実施形態で、本発明の水溶性植物抽出物は、好ましくはCon Aアガロースに結合する成分が有効成分として含まれる。本発明の好ましい実施形態において、水溶性植物抽出物は、陰イオン交換樹脂で吸着され、かつ、Con Aアガロースに結合する成分が有効成分として含まれる。Con Aアガロースに結合する有効成分は、グルコース残基及び/又はマンノース残基、特にマンノース残基を含む多糖もしくは糖質(糖脂質などの複合糖質を含む)が好ましい。好ましい実施形態では、水溶性植物抽出物は、糖残基を含み冷水もしくは熱水に可溶性(抽出可能)である成分を含み、分子量は、下限が500、1000、2000、3000、4000または5000程度であり、上限は、500000、300000、200000、100000、80000、60000、50000、40000、30000または20000程度の多糖または複合多糖を含むものが好ましく例示される。
　ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養することで幹細胞に誘導することができる。
　生体内(例えばヒト)では、M－CSFが既に存在しているので、ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種は、単球から幹細胞への誘導剤として働くことができ、この幹細胞が疾患部位に到達することで、各種の疾患の治療剤として機能する。ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする治療剤は、外傷、炎症性疾患（膵炎、放射線損傷、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎、慢性気管支炎）、骨・軟骨の損傷(例えば骨折、骨粗鬆症、骨軟骨骨折、骨軟骨炎)、循環器疾患（例えば拡張型心筋症、心筋梗塞、虚血性心筋症、心不全、心筋肥大、うっ血性心不全、再狭窄、不整脈、アテローム性動脈硬化症、血管炎など）、神経疾患（例えば末梢ニューロパシー、ニューロパシー痛、脳卒中、脳炎、髄膜炎、糖尿病性ニューロパシー、注意欠陥障害、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト－ヤコブ病、脳または脊髄外傷もしくは虚血）、肝疾患（肝硬変、慢性肝炎）、腎疾患（慢性腎不全、糸球体腎炎、腎虚血）、糖尿病、アトピー性皮膚炎、GVHDの治療に有用である。
　ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする治療剤の有効量は、その用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常有効成分の量がヒト成人の体重１ｋｇあたり0.0001～100mg程度、好ましくは0.001～10mg程度、より好ましくは0.01～5mg程度である。該治療剤は１日に１～４回に分けて投与することができる。
　植物由来Folch抽出水相画分は、同様な方法で抽出した植物抽出物を広く包含する。なお、植物由来Folch抽出水相画分を含む水溶性植物抽出物の有効成分は陰イオン交換樹脂、Con Aアガロースに結合する性質を有し、陽イオン交換樹脂を通すことにより活性が上昇し得る。
　本発明の治療剤ないし医薬組成物は、これを医薬製剤として実用する場合、ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種と必要に応じてM-CSFを含む有効成分と共に製剤担体を用いて一般的な剤形(dosage form)とすることができる。該製剤担体としては剤形に応じて、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を例示でき、これらは得られる剤形の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
　本発明剤形としては、各種の形態(form)が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、軟膏剤等が挙げられ、之等は何れも常法に従い、上記適当な担体を用いて調製できる。また、錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠とすることもできる。本発明薬剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤として調整される場合、之等は殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましく、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを本発明医薬組成物中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。更に、本発明の医薬組成物には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。また、ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種とM-CSFを両方とも投与する場合には、これらは同時に投与してもよく、別々に投与してもよい。
　ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種は、食品形態、例えばドリンク類やブロック(サプリメントブロック)等の形態で摂取されてもよい。このような食品組成物は、常法に従って調製でき、その調製には一般的によく知られている他の食品素材（原料成分）、賦形剤、希釈剤等を適宜利用できる。
　脱分化幹細胞は(i)M-CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の共存下前述原料細胞を一定期間培養することにより脱分化誘導して得ることができる。
　M-CSFは、分子量約22000の膜結合型、分子量約42000の分泌型があり、これらはジスルフィド結合により分子量約45000(22000の二量体)、約85000(42000の二量体)、85kDa型にさらにプロテオグリカンが結合した高分子量型があり、これらのいずれを使用してもよい。好ましくは分子量約42000の分泌型、分子量約85000(42000の二量体)、85kDa型にさらにプロテオグリカンが結合した高分子量型が使用できる。また、M-CSFの由来は、哺乳動物（ヒト、ウマ、ウシ、サル、チンパンジー、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、イヌ、ネコ）が挙げられ、好ましくは、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類が挙げられ、特にヒトが好ましい。M-CSFは、天然物を精製して使用してもよいが、遺伝子組換え的に製造したものが好ましく用いられる。例えばM-CSFは少なくともN末端から１５３番目辺りまでのアミノ酸があれば、天然型と同程度の比活性を有することが判明しており、このような糖鎖を持たない大腸菌発現の組換え体などを例示することが出来る。
　ガングリオシドの種類としては、GM1, GD1a, GT1bなど以下に記載したものであれば特に制限はない。さらにこれらの混合物でも良くこれら混合物を使用しても問題はない。更に、植物由来抽出成分（植物由来糖脂質様物質）でも強く脱分化を誘導させることができる。また、動物組織由来抽出物（動物由来糖脂質様物質）を使用してもよい。該抽出物は、糖脂質様物質を抽出するための一般的な条件下で調製し得る。本発明の医薬の有効成分は、ガングリオシドもしくは水溶性植物抽出物であり、これらが含まれている成分であれば、植物抽出物、動物組織抽出物のいずれも使用できる。例えばガングリオシドは動物の脳・神経組織に豊富に含まれ、動物の脳・神経組織由来の抽出物がガングリオシドとして使用できる。抽出物のガングリオシドは精製したものであってもよく、ガングリオシドを含む糖脂質成分が含まれるさまざまな精製度の画分を使用できる。抽出成分としては、一般的に糖脂質様物質の抽出されてくる条件で、得られる画分を使用すればよい。天然の抽出画分としては、例えば、Folch抽出法（非特許文献５）による水相画分を挙げることができる。動物としては、哺乳動物(ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ウマなど)が好ましく例示され、ブタの脳・神経組織由来のガングリオシドが特に好ましい。また、牛乳のような哺乳動物のミルク由来のガングリオシドを使用することもできる。
　ガングリオシドもしくは糖脂質様物質の材料(material)となる水溶性植物抽出物としては、好適にはサツマイモ(sweet potato)、シモン芋(Ipomea Batatas sp)、アサガオ(morning-glory)、アサガオナ(swamp morning-glory)、モミジヒルガオ（Ivy-leaved morning glory）、ヤツデアサガオ(fingerleaf morning glory)、ホザキアサガオ(cardinal climber)、ソライロアサガオ (blue morning glory）、琉球朝顔（Ipomoea congesta）などのヒルガオ科、ハス（Nelumbo nucifera）(レンコン（lotus root）)、キバナハス(Nelumbo lutea)などのハス科、アメリカイヌホオズキ(Solanum americanum) 、トマト (Solanum lycopersicum)、ツノナス(Solanum mammosum)、ナス (Solanum melongena)、イヌホオズキ(Solanum nigrum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、キダチトウガラシ(Capsicum frutescens) 、チョウセンアサガオ(Datura metel)、アメリカチョウセンアサガオ(Datura meteloides)、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ(Datura stramonium)、コダチチョウセンアサガオ(Brugmansia arborea)、キダチチョウセンアサガオ(Brugmansia suaveolens)、ホオズキ(Physalis alkekengi var. franchetii)、イガホオズキ(P. japonicum)、ペチュニア(Petunia x hybrida)などのナス科の植物の抽出物を挙げることができる。上記の植物は単なる例示であり、ガングリオシドまたは糖もしくは糖脂質を有する水溶性植物抽出物を広く使用することができる。植物は、葉、茎、地下茎、根茎、塊茎、つる、根、花、つぼみ、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠、全草などが挙げられ、これらのいずれを抽出してもよい。
　例えば、サツマイモ、ジャガイモなどのイモ類は、必ずしも芋の部分である必要はなく葉、茎、地下茎、根茎、塊茎、つる、根、花、つぼみ、花弁、子房、果実、さや、さく果、種子、繊維、胚珠、全草などのいずれであっても良い。　
　植物として、例えばガングリオシドもしくは糖脂質様物質を多く製造できるように必要な遺伝子を導入および/または必要でない遺伝子をノックアウトした遺伝子組み換え植物を使用することもできる。
　ガングリオシドは、シアル酸を有するスフィンゴ糖脂質の総称であり、種類としてはGD1a、GD1b、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、GT1b、およびGQ1bなどがある。また、各ガングリオシドは以下の構造を有するものである。
GD1a=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GD1b=bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GD2=bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GD3=aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GM1=bDGalp(1-3)bDGalNAc[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GM2=bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GM3=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GT1b=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
GQ1b=aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
aNeu5Ac = 5-アセチル-α-ノイラミン酸（5-acetyl-α-neuraminic acid）
aNeu5Ac9Ac = 5,9-ジアセチル-α-ノイラミン酸（5,9-diacetyl-α-neuraminic acid）
bDGalp = β-D-ガラクトピラノース（β-D-galactopyranose）7
bDGalpNAc = N-アセチル-β-D-ガラクトピラノース（N-acetyl-β-D-galactopyranose）
bDGlcp = β-D-グルコピラノース（β-D-glucopyranose）
0Cer = セラミド (general N-acylated sphingoid)
　使用培地は、哺乳動物細胞用培地であれば特に制限はないが、例えばRPMI 1640, DMEM, イーグルMEM, αMEM, IMEM, M199の各培地に血清成分例えばFBS, FCS, CS, HSなどを1～20％程度加えることにより培養することが可能である。好適な事例としては１０％前後のFBSを含むDMEM培地中にての培養を挙げることが出来るが、この限りではない。さらに無血清培地を使用することも可能である。無血清培地の例としては、哺乳動物培養用としてUltraCULTURETMを例示することができるが、特に制限はない。
　培養条件としては、(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む培地中で、好適には5％ＣＯ２存在下、３７℃にて７日～14日程度単球を培養することにより、脱分化幹細胞を得ることができる。つまり、この培養期間で脱分化が進行し、上記本発明で特定した未分化マーカーを発現した幹細胞を得ることができる。さらに、この培養期間に本発明幹細胞を特徴付けるCXCR4遺伝子の発現が著しく上昇するが、この後培養期間を延ばした場合でもCXCR4遺伝子が高度に発現していれば、本発明幹細胞に該当する。
　また、このような条件で原料細胞を培養した場合、最終的に得られる幹細胞数はM-CSF単独或いは他のサイトカインとの組合せで培養した場合に比べて約５倍の幹細胞を得ることができる。
　なお、脱分化誘導剤としてM-CSFとガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種が共有結合又は非共有結合的に結合した複合体を使用することもできる。
　単球をM-CSF単独で培養した場合でも脱分化幹細胞が得られるという報告があるが、本発明は(i)M-CSFと(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を組み合わせることにより、特にCXCR4遺伝子を強く発現した幹細胞を得ることができる。培養条件としては、M-CSFを5-100 ng/mlの濃度で使用することができ、好適には25 ng/mlで培養することが好ましい。ガングリオシドは、植物、動物などに由来する抽出物などの混合物を用いてもよく、天然のガングリオシド含有材料を精製して用いてもよく、化学合成して用いてもよい。
　ガングリオシドは、最終濃度1-100 μg/ml程度で培地に使用される。水溶性植物抽出物は最終濃度0.1-100 μg/ml程度で培地に使用される。
　ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の量としては、最終濃度1-100 ug/ml程度で培養することができる。なお、本明細書において「ガングリオシド」は、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、GT1b、GQ1bなどのガングリオシド単品と、これらの混合物の両方の意味に用いられる。ガングリオシドの量は、その中のガングリオシド量を意味し、ガングリオシドが複数ある場合にはその総量を意味する。
キット
　本発明はまた、本発明の幹細胞を必須構成成分とする細胞医薬用キット、(i)M-CSFおよび(ii)ガングリオシド水溶性植物抽出物を必須構成成分とする脱分化細胞産生キットを提供する。
　細胞医薬用キットは、本発明の単球由来の幹細胞を必須構成成分として含み、必要に応じてさらに(i)M-CSFと(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む培地、培養容器などが含まれていてもよい。あるいは、単球由来の幹細胞を注射器に充填した形態であってもよい。
　細胞医薬用キットに含まれる単球由来の幹細胞の数は、1つのキットあたり、例えば1×104～1×107個程度である。
　本発明の脱分化細胞産生キットは、(i)M-CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を必須構成成分とし、さらに必要に応じて細胞培養培地、培養容器、単球などを含んでいてもよい。
・本細胞の適用分野
幹細胞の適応できる分野全般に関して使用することが可能である。特に、近年話題になっている細胞医薬の分野での使用を考えることができ、このような分野での使用の場合においては、短期間に使用細胞を作製し提供する必要がある。しかも、拒絶反応の問題を考慮すれば、自己細胞を使用し脱分化幹細胞を調製した後生体に戻す手法がもっとも安全面で重要である。自己細胞を摂取した後短期間にある程度まとまった幹細胞を生産できることが重要になる。本発明は、このような観点からも重要である。
　本発明の具体的使用態様の一つとしては、脱分化細胞の静脈内投与を行えば良い。
　細胞の投与形態について、目的細胞を培養により得た後、使用細胞を適宜常法に従って播種することができる。例えば、トリプシン処理後細胞を回収し遠心分離により細胞を回収した後適当な等張液に分散させた後、例えば静脈内投与することも可能である。更に、その際適当な薬学的に許容できる担体を添加することにより、細胞を安定化できるのであれば使用することも可能である。
また、培養により得られた細胞は培養液中から回収後、適当な投与時期に時間差のある場合は、常法に従い液体窒素存在下或いは－８０℃において保存しておくことも可能である。好適には単球を脱分化培養開始後７日～１４日の間に細胞を回収し直ちに目的の治療に用いることが望ましい。なぜならば、CXCR4遺伝子の発現レベルがこの間最大限に達する可能性が高いからである。その意味において、当該遺伝子マーカーの発現レベルを勘案し、培養期間に限定されずに当該幹細胞の使用期間を決定することもできる。
・治療剤／医薬組成物の適用分野
　本発明は、ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種と必要に応じたM－CSFをヒトなどの哺乳動物に投与することにより、外傷、炎症性疾患、骨・軟骨の損傷、循環器疾患、神経疾患、肝疾患および腎疾患、糖尿病、アトピー性皮膚炎、GVHDなどの疾患を治療することができる。これは、投与される被験体の単球、必要に応じて更にM-CSFがガングリオシド及び植物由来Folch抽出水相画分からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用により、前記疾患を修復可能な幹細胞に変化し、これが疾患部位に移動して治療剤として作用する。あるいは、ガングリオシド及び植物由来Folch抽出水相画分からなる群から選ばれる少なくとも１種が、単球以外の細胞に直接または間接的に作用することも否定しない。
・キットとしての使用に関して
　本脱分化誘導剤において作製された脱分化幹細胞は適当な保存処理を施された後にキットとして使用することができる。
　また、同時に脱分化誘導剤に関しても、必須構成成分として含むキットとしてキット化することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
  ヒト単球（LONZA社、PT038）を本発明に従い、以下の添加物1から5を基礎培地に添加して培養を行った(濃度は最終濃度(以下「FC」で示す)として表す)。結果を図1に示す。図1の縦軸は、生細胞数に相当し、横軸は、培養日数である。ファンドリッヒ（Fandrich）やフーバーマン（Huberman）らによって報告された方法と比べてみても、本発明の単球由来幹細胞の増殖性は、非常に高いことが判る。
添加物1: M-CSF(FC: 25ng/ml)+Gangliosides（Bovine Brain  GD1a  SIGMA）（FC: 100ug/ml)　
添加物2: M-CSF（FC: 5ng/ml）+IL-3（FC: 0.5ng/ml）（非特許文献２）
添加物3: M-CSF(FC: 25ng/ml)+IL-6（FC: 20ng/ml）&LIF（FC: 1000unit/ml）（非特許文献３）
添加物4: M-CSF(FC: 25ng/ml)
添加物5: M-CSF(FC: 25ng/ml)+糖脂質（植物(サツマイモ)の乾燥重量1gのFolch抽出水相画分を培地500ｍｌに溶解したもの)　 
　なお、添加物５で用いたFolch抽出水相画分は、凍結乾燥した細胞（サツマイモ植物組織）を適量の生理食塩水で、よくホモジナイズした後に、等容量のクロロホルム・メタノール2:1溶液と激しく混ぜ合わせて、遠心分離によって有機溶媒相、変性蛋白質相、水相に分離後、上層の水溶性画分に抽出され得る成分を用いた。
　添加物はすべて、DMEM(20% Fetal Bovine Serum)に添加して、ヒト単球を1.5x105/ml（200ul/well 、96well Plate)にて培養を開始した。生細胞のカウントは、プロメガ社のCellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assayを用いて、定量化した。すなわち、各培養日ごとに接着していない細胞を生理食塩水にてwellを3回洗浄して除去した後に、接着・増殖した細胞を定量化した。
　一方で、本発明および従来技術による培養方法にて得られる幹細胞の遺伝子発現をRT-PCRにて解析を行った。ヒト単球は、上記条件で、1.5x105/ml（6ml/ Dish、直径6cm）にて培養を開始し、14日目にmRNAを回収し（Invitrogen社：Micro Fast Track 2.0 Kit）、引き続きRT-PCRによる発現量解析を行った。項目およびプライマーの配列情報は、下記の通りである。

　　Nanog　F　5′-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3′（配列番号１）　　　
 　　　　　R  5′-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3′（配列番号２）

　　Nestin　F  5′-CTCTGACCTGTCAGAAGAAT-3′（配列番号３）
 　　　　　R  5′-GACGCTGACACTTACAGAAT-3′（配列番号４）

　　Oct3/4　F　5′-GAGCAAAACCCGGAGGAGT-3′（配列番号５）
           R  5′-TTCTCTTTCGGGCCTGCAC-3′（配列番号６）

　　c-Kit　　F  5′-CCAAGTCATTGTTGGATAAG-3′（配列番号７）
            R  5′-CTTAGATGAGTTTTCTTTCAC-3′（配列番号８）

　　CXCR4　
　　　 F  5′-ATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATC-3′（配列番号９）
       R  5′-ATCCAGACGCCAACATAGACCACCTTTTCA-3′（配列番号１０）

レーン構成(濃度は最終濃度(以下「FC」で示す)として表す)
 1: M-CSF(FC: 25ng/ml)+Gangliosides（Bovine Brain  GD1a  SIGMA）（FC: 100ug/ml)　
 2: M-CSF(FC: 5ng/ml)+IL-3(FC: 0.5ng/ml)（非特許文献２）
 3: M-CSF(FC: 25ng/ml)+IL-6(FC: 20ng/ml) +LIF(FC: 1000unit/ml)　（非特許文献３）
 4: M-CSF(FC: 25ng/ml)
 5: M-CSF(FC: 25ng/ml)+ 植物由来Folch抽出水相画分
 6: No Culture 
 7: No Culture
 1-6:ヒト単球、7:ヒト骨髄（Clontech社　Human Bone Marrow Marathon-Ready cDNA）
　結果を図2に示す。図2の結果より、本発明（レーン１又はレーン５）により得られた幹細胞はCXCR4の発現量が極めて高いことが実証された。
　次いで、様々なガングリオシドによる幹細胞誘導活性の比較を行った。
　即ち、ガングリオシドを終濃度、100ug/mlになるように培地に添加し、末梢血単球を培養した。
rhM-CSFは、終濃度25ng/mlになるように添加した。その結果、培養二週間目の生細胞の数をcell-titer Glo（Promega社）によってルシフェラーゼ活性として定量化した。つまり、GM1、GD1a、GT1bおよびそれらのMixを用いて培養を行ったが、いずれにも同程度に、強い幹細胞誘導活性を示した（図３）。また、細胞の形態にも差は認められなかった（写真は培養二週間目）（図４）。
　図3のレーン構成は、以下のとおりである(濃度は最終濃度(以下「FC」で示す)として表す)。
1: GM1 (FC: 25ng/ml）、
2: GD1a（FC: 25ng/ml）、
3: GT1b FC: 25ng/ml）、
4: GM1, GD1a, GT1bの等量混合物(Mix)、合計のFC: 25ng/ml）、
5: M-CSFのみ、
6: 血清のみ。
　種々の植物由来抽出物による幹細胞誘導活性
　レンコン、琉球朝顔の茎からの抽出は、いずれも前述サツマイモの茎と同条件にて抽出した。尚、活性の比較は、抽出に用いた乾燥重量を元に標準化した。
　比活性は、細胞増殖活性をサツマイモ茎抽出物を100とした値である。
　図５から判るように、レンコン、琉球朝顔の茎からも同様の幹細胞誘導活性を確認した。
　本有効成分の1つの特徴は、Folchの抽出方法による水相に主に抽出されることである。水溶性植物抽出物はいくつかのカラムクロマトグラフィーにより分画、分離又は精製可能である。すなわち、水溶性植物抽出物の有効成分は、陰イオン交換樹脂（Q-Sepharose、DEAE-Sepharoseなど）、レクチン結合樹脂（Con Aなど）に広範囲なpH領域で結合することを特徴とする。
　図６は、有効成分と結合能を有する樹脂に抽出液をアプライし、素通り画分の活性を評価した結果である。すなわち、陰イオン交換樹脂、Con Aアガロースに有効成分が結合することにより、素通り画分に活性が消失することが判った。陽イオン交換樹脂により阻害因子が取り除かれたことが示唆され、活性は上昇している。
　サツマイモ茎抽出物の活性を100として、算出した。陽イオン交換樹脂の素通り画分で、活性が上昇しているのは、阻害物質が取り除かれたと示唆される。陰イオン交換樹脂、レクチンのCon A樹脂の素通り画分では、活性が消失しており、活性因子が保持されたことを示しうる。
実施例２
幹細胞投与動物モデルによる治癒効果（肝硬変モデルマウスを用いた治療試験例）
　四塩化炭素（1ml/kg体重）週2回投与を12週間連続して実験用マウスに人為的に肝硬変を引き起こす。この肝硬変モデルマウスに本発明のヒト単球由来脱分化幹細胞(hMDDSC)を尾静脈より2回投与し（1投与後1週間目に2回目、1個体あたり1 x 105細胞）、2回目の投与後１週後（最初の投与から2週間目）に肝臓を採取し、組織切片による病理解析と生化学的分析を行った。四塩化炭素によって誘導された肝炎では、ウイルス性肝炎同様に炎症部でSDF1（Stromal cell derived factor-1）が高発現することが報告されており（Jung et al., 2006）、本発明のhMDDSCはSDF1のレセプターであるCXCR4を高発現しているため、これらの結合を介してhMDDSCが炎症部に集積し、組織周囲に治癒効果を及ぼすことが期待される（Kollet et al., 2003; Nervi et al., 2006）。
　血中マーカーで検出できる肝機能について、GOT/GPT値については四塩化炭素投与終了後速やかに低下して正常値に戻るため、2週間の治療処置後には既にほぼ正常値を示し、試験群間で計測値の大きな差異は認められなかった。しかし下記に示すようにこの12週間の薬物処理により肝組織中では強度の線維化が起き、肝硬変状態になっている。その肝中に発達した線維状組織の低下と除去に本発明のhMDDSCは劇的な効果を示した。
１．病理組織解析
　採取固定されたマウス肝臓からパラフィン切片を作製し、抗コラーゲンI抗体で線維構造の主成分であるコラーゲン線維を検出した（図７、茶褐色）。同時に細胞核を青色に染色した（ヘマトきシレン染色）。
上段は肝硬変誘導後hMDDSC投与を行わず生理食塩水を投与した対照実験、下段はhMDDSCを2回静脈投与したのもの各3例を示した。hMDDSC投与により抗コラーゲン抗体で検出される太い線維束（上段矢印）が顕著に消失している。
　また同じ肝臓切片でAzan/Mallory染色を行い、画像解析顕微鏡（KeyenceBZ9000）により青色に染色される線維組織部分の面積計算を行った（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　四塩化炭素処理をしていない正常対照群（Normal）に比べると5倍以上の数値を示しているが、hMDDSC投与群では生理食塩水投与群(Saline)よりも23%も線維組織量が減少している。
２．生化学的解析
　Ａ）III型プロコラーゲンペプチド
　同様マウスモデルによる肝硬変治療実験で血中のIII型プロコラーゲンペプチドの血中濃度を測定した。III型プロコラーゲンペプチド(Pro-collagen type III peptide (PIIIP)) はコラーゲン前駆体に存在する末端ペプチドであり、コラーゲン産生時に消化されてペプチドとして血中、組織中に遊離するため、コラーゲンの生産量を反映したマーカーとして用いられている（Giannini et al., 2001）。2週間の治療試験直後のマウス尾部より血液を採取し、血漿中のPIIIPをELISA法(CUSABIO CSB-E08095)により測定した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　肝硬変誘導後に生理食塩水投与の対照群(Saline)が正常対照群(Normal)マウスの約5倍の高値を示しているのに対して、hMDDSC投与によって血中プロコラーゲン量は劇的な減少を示し、健康マウスに近い数値を示した。生理食塩水投与群が高値を示す事から、四塩化炭素刺激による肝硬変誘発の停止後もしばらくはコラーゲンの分子の異常な高生産が継続していることが伺える。しかし、hMDDSC投与によってこの異常なコラーゲン高生産が速やかに抑制され、正常レベル近くまで下がっていることがわかる。
　Ｂ）ヒドロキシプロリン
　肝組織内部の総線維量を組織から直接的に定量する目的で、コラーゲンの構成分子であるヒドロキシプロリンの肝組織中の含有量を測定した。2週間の治療処置後採取された肝臓を破砕均質化し、水酸化ナトリウム処理によって含有タンパク質を分解し、Chloramine T とdimethylaminobenzaldehydeのヒドロキシプロリン特異的呈色反応によりヒドロキシプロリン濃度を測定した（表3、Reddy et al, 1996）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　正常対照群(Normal)の数値に比べれば3倍と依然非常に高値ではあるものの、生理食塩水投与対象群(Saline)に比してhMDDSC投与群は22.6%もの減少、つまり肝線維化の改善が検出された。
　前記肝硬変モデルマウスに、サツマイモ茎のFolch抽出水相画分を6.6mg/kg尾静脈から投与したところ、肝硬変が軽減されていることを本発明者は確認した。
３．結論
　マウス肝硬変モデルにおいて本発明のhMDDSCを用いた治療はこのようにわずか2投与2週間の治療処置/期間で、大幅な線維生産の抑制と、線維組織の除去減少を引き起こすことを特徴とする。その結果、肝硬変状態からの速やかな脱出と正常肝組織への修復に働き、肝再生を促す画期的な治療システムである。
４．引用文献
Jung YJ, Ryu KH, Cho SJ, Woo SY, Seoh JY, Chun CH, Yoo K, Moon IH, Han HS. Syngenic bone marrow cells restore hepatic function in carbon tetrachloride-induced mouse liver injury. Stem Cells Dev. 2006, 15, 687-695.
Kollet O, Shivtiel S, Chen YQ, Suriawinata J, Thung SN, Dabeva MD, Kahn J, Spiegel A, Dar A, Samira S, Goichberg P, Kalinkovich A, Arenzana-Seisdedos F, Nagler A, Hardan I, Revel M, Shafritz DA, Lapidot T. HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver. J Clin Invest. 2003, 112, 160-169.
Nervi B, Link DC, DiPersio JF. Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization. J Cell Biochem. 2006, 99, 690-705.
Giannini E, Caglieris S, Ceppa P, Risso D, Lantieri PB, Testa R. Serum pro-collagen III peptide levels are related to lobular necrosis in untreated patients with chronic hepatitis C. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001, 13, 137-141.
Reddy GK, Enwemeka CS. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem. 1996, 29, 225-229.

Claims (22)

  1. 単球を(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養し、脱分化させることにより得られる幹細胞。
  2. 水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分が糖もしくは複合糖質である、請求項１に記載の幹細胞。
  3. 水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分の分子量が1000～500000である請求項１に記載の幹細胞。
  4. 水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分が、ConAカラムに吸着される、請求項１に記載の幹細胞。
  5. 水溶性植物抽出物の単球を脱分化させる有効成分が、アニオン交換樹脂に吸着される請求項１に記載の幹細胞。
  6. 水溶性植物抽出物が植物由来Folch抽出水相画分もしくはその精製物である、請求項１に記載の幹細胞。
  7. 単球がヒト単球である請求項１記載の幹細胞。
  8. 未分化マーカーNanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4の少なくとも１種を発現しており、単球をM-CSF単独存在下培養した場合に得られた幹細胞と比較した場合、CXCR4遺伝子が有意に強く発現していることを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の幹細胞。
  9. 未分化マーカーNanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4の少なくとも１種を発現し、かつCXCR4遺伝子が有意に強く発現していることを特徴とする幹細胞。
  10. 単球を(i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養することを特徴とする幹細胞の生産方法。
  11. 培養期間が７日から１４日間である請求項６記載の方法。
  12. (i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む単球の脱分化誘導培地。
  13. 請求項１～９のいずれかに記載の幹細胞を有効成分として含有する医薬組成物。
  14. 請求項１～９のいずれかに記載の幹細胞を有効成分として含有する細胞医薬用剤。
  15. (i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする脱分化誘導剤。
  16. ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする細胞、組織もしくは器官の損傷に関係する疾患の治療剤。
  17. 前記疾患が外傷、炎症性疾患、骨・軟骨の損傷、循環器疾患、神経疾患、肝疾患および腎疾患、糖尿病、アトピー性皮膚炎、GVHDからなる群から選ばれる、請求項１６に記載の治療剤
  18. 前記疾患が外傷、膵炎、放射線損傷、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性筋膜炎、慢性気管支炎、骨折、骨粗鬆症、骨軟骨骨折、骨軟骨炎、拡張型心筋症、心筋梗塞、虚血性心筋症、心不全、心筋肥大、うっ血性心不全、再狭窄、不整脈、アテローム性動脈硬化症、血管炎、末梢ニューロパシー、ニューロパシー痛、脳卒中、脳炎、髄膜炎、糖尿病性ニューロパシー、注意欠陥障害、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト－ヤコブ病、脳または脊髄外傷もしくは虚血、肝硬変、慢性肝炎、慢性腎不全、糸球体腎炎、腎虚血、糖尿病、アトピー性皮膚炎、GVHDからなる群から選ばれる、請求項１６に記載の治療剤。
  19. 少なくとも請求項１～９記載の幹細胞を必須構成成分とする細胞医薬用キット。
  20. (i)M－CSFおよび(ii)ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を必須構成成分とする脱分化細胞産生キット。
  21. さらに単球を構成成分として含む請求項２０記載のキット。
  22. ガングリオシドがGD1a、GD1b、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、GT1b、およびGQ1bからなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項１～２１のいずれかに記載の幹細胞、幹細胞の生産方法、単球の脱分化誘導培地、細胞医薬用剤、治療剤、脱分化誘導剤、細胞医薬用キットまたは脱分化細胞産生キット。
PCT/JP2009/069648 2008-11-25 2009-11-19 ヒト単球由来治療用幹細胞およびその誘導方法 WO2010061781A1 (ja)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09829029A EP2365061A4 (en) 2008-11-25 2009-11-19 THERAPEUTIC USE STRAIN CELL HAVING HUMAN MONOCYTE AND METHOD OF INDUCING THE SAME
US13/130,099 US9169463B2 (en) 2008-11-25 2009-11-19 Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte, and method for inducing same
BRPI0921371-6A2A BRPI0921371A2 (pt) 2008-11-25 2009-11-19 Células-tronco para uso terapêutico que são derivados de monócito humano, e método para induzir as mesmas.
MX2011005480A MX336067B (es) 2008-11-25 2009-11-19 Celula madre para uso terapeutico, la cual se deriva de monocito humano y metodo para inducir la misma.
AU2009320881A AU2009320881B2 (en) 2008-11-25 2009-11-19 Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte, and method for inducing same
JP2010540461A JP5800505B2 (ja) 2008-11-25 2009-11-19 ヒト単球由来治療用幹細胞およびその誘導方法
UAA201107956A UA110691C2 (uk) 2008-11-25 2009-11-19 Одержана з моноциту людини стовбурова клітина для терапевтичного застосування і спосіб її індукції
KR1020117014559A KR101682731B1 (ko) 2008-11-25 2009-11-19 인간 단구 유래 치료용 줄기 세포 및 그의 유도 방법
RU2011126165/10A RU2573906C2 (ru) 2008-11-25 2009-11-19 Полученная из моноцита человека стволовая клетка для терапевтического применения и способ ее индукции
CN200980146977.1A CN102245757B (zh) 2008-11-25 2009-11-19 来自人单核细胞的治疗用干细胞及其诱导方法
CA2744289A CA2744289A1 (en) 2008-11-25 2009-11-19 Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte, and method for inducing same
IL212638A IL212638A (en) 2008-11-25 2011-05-03 Stem cells derived from monocytes, a method for producing their own uses
ZA2011/03268A ZA201103268B (en) 2008-11-25 2011-05-05 Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte,and method for inducing same
US14/864,712 US20160008434A1 (en) 2008-11-25 2015-09-24 Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte, and method for inducing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008299359 2008-11-25
JP2008-299359 2008-11-25

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/130,099 A-371-Of-International US9169463B2 (en) 2008-11-25 2009-11-19 Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte, and method for inducing same
US14/864,712 Division US20160008434A1 (en) 2008-11-25 2015-09-24 Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte, and method for inducing same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010061781A1 true WO2010061781A1 (ja) 2010-06-03

Family

ID=42225657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/069648 WO2010061781A1 (ja) 2008-11-25 2009-11-19 ヒト単球由来治療用幹細胞およびその誘導方法

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9169463B2 (ja)
EP (1) EP2365061A4 (ja)
JP (1) JP5800505B2 (ja)
KR (1) KR101682731B1 (ja)
CN (1) CN102245757B (ja)
AR (1) AR074406A1 (ja)
AU (1) AU2009320881B2 (ja)
BR (1) BRPI0921371A2 (ja)
CA (3) CA2977823A1 (ja)
CO (1) CO6341484A2 (ja)
IL (1) IL212638A (ja)
MX (1) MX336067B (ja)
RU (1) RU2573906C2 (ja)
TW (1) TWI539000B (ja)
UA (1) UA110691C2 (ja)
WO (1) WO2010061781A1 (ja)
ZA (1) ZA201103268B (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018052082A1 (ja) * 2016-09-14 2018-03-22 株式会社Ｔｅｓホールディングス Ｌｉｎ２８ａ活性化剤及びその使用
JP6375076B1 (ja) * 2018-02-19 2018-08-15 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ 間葉系幹細胞を用いたアトピー性皮膚炎治療における治療効果予測判定法
JP2019144221A (ja) * 2018-07-21 2019-08-29 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ 間葉系幹細胞を用いたアトピー性皮膚炎治療における治療効果予測判定法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102399741A (zh) * 2010-09-19 2012-04-04 林雄斌 逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途
CN107904202B (zh) * 2017-11-22 2018-11-20 北京恩诺生物科技有限公司 一种制备多能干细胞样细胞的方法、组合物和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4778787A (en) * 1985-12-20 1988-10-18 Trustees Of Boston University Method for treatment of angina and myocardial infarctions with omental lipids
US5272138A (en) * 1988-02-12 1993-12-21 The Biomembrane Institute Naturally occurring gangliosides containing de-N-acetyl-sialic acid and their applications as modifiers of cell physiology
US6084060A (en) * 1996-12-09 2000-07-04 Imclone Systems Incorporated Composition and method for preserving progenitor cells
DE19651443A1 (de) * 1996-12-11 1998-06-18 Hoechst Ag Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme
EP0893493A3 (de) * 1997-07-21 2002-12-04 Aventis Pharma Deutschland GmbH Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen
US20030157113A1 (en) * 1999-12-28 2003-08-21 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
DE10214095C1 (de) * 2002-03-28 2003-09-25 Bernd Karl Friedrich Kremer Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung
TWI288779B (en) * 2002-03-28 2007-10-21 Blasticon Biotech Forschung Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use
CA2519803A1 (en) * 2003-03-27 2004-10-14 Janssen Pharmaceutica N.V. Use of erythropoietin in stroke recovery
CA2547570A1 (en) * 2003-12-02 2005-06-23 Celgene Corporation 4-(amino)-2-(2,6-dioxo(3-piperidyl))-isoindoline-1,3-dione for induction of fetal hemoglobin in individuals having anemia
US20050260748A1 (en) * 2004-02-27 2005-11-24 Michigan State University Adult stem cells and uses thereof
BRPI0720596B1 (pt) 2006-12-29 2017-10-24 Dow Agrosciences Llc Methods for producing and transforming a single plant cell

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CERSDINI, D, J. ET AL.: "Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1", NATURE MEDICINE, vol. 10, no. 8, August 2004 (2004-08-01), pages 858 - 864, XP008140707 *
FOLCH J., LEES M., SLOANE-STANLEY G. H.: "A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues", J. BIOL. CHEM., vol. 226, 1957, pages 497 - 509
GIANNINI E, CAGLIERIS S, CEPPA P, RISSO D, LANTIERI PB, TESTA R: "Serum pro-collagen III peptide levels are related to lobular necrosis in untreated patients with chronic hepatitis C", EUR J GASTROENTEROL HEPATOL, vol. 13, 2001, pages 137 - 141
JUNG YJ, RYU KH, CHO SJ, WOO SY, SEOH JY, CHUN CH, YOO K, MOON IH, HAN HS: "Syngenic bone marrow cells restore hepatic function in carbon tetrachloride-induced mouse liver injury", STEM CELLS DEV., vol. 15, 2006, pages 687 - 695
KOLLET 0, SHIVTIEL S, CHEN YQ, SURIAWINATA J, THUNG SN, DABEVA MD, KAHN J, SPIEGEL A, DAR A, SAMIRA S: "HGF, SDF-1, and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver", J CLIN INVEST., vol. 112, 2003, pages 160 - 169
KUWANA M. ET AL.: "Human circulating CD14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation", J. LEUKOC. BIOL., vol. 74, 2003, pages 833, XP002979383, DOI: doi:10.1189/jlb.0403170
KUWANA, M. ET AL.: "Human circulating CD14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation", JOURNAL OF LEUKOCYTE BIOLOGY, vol. 74, November 2003 (2003-11-01), pages 833 - 845, XP002979383 *
LI, J. ET AL.: "cDNA microarray analysis reveals fundamental differences in the expression profiles of primary human monocytes, monocyte-derived macrophages, and alveolar macrophages", JOURNAL OF LEUKOCYTE BIOLOGY, vol. 81, January 2007 (2007-01-01), pages 328 - 335, XP008140711 *
NAT. MED., vol. 10, no. 8, August 2004 (2004-08-01), pages 858 - 64
NERVI B, LINK DC, DIPERSIO JF: "Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization", J CELL BIOCHEM, vol. 99, 2006, pages 690 - 705, XP055059798, DOI: doi:10.1002/jcb.21043
REDDY GK, ENWEMEKA CS: "A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues", CLIN BIOCHEM., vol. 29, 1996, pages 225 - 229, XP001063280
RUHNKE M, FANDRICH F: "Differentiation of in vitro-modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells", GASTROENTEROLOGY, vol. 128, 2005, pages 1774, XP005313895, DOI: doi:10.1053/j.gastro.2005.03.029
RUHNKE, M. ET AL.: "Differentiation of In Vitro-Modified Human Peripheral Blood Monocytes Into Hepatocyte-like and Pancreatic Islet-like Cells", GASTROENTEROLOGY, vol. 128, 2005, pages 1774 - 1786, XP009063176 *
See also references of EP2365061A4
YONG ZHAO, ELIEZER HUBERMAN: "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells", PNAS, vol. 100, 2003, pages 2426, XP002410596, DOI: doi:10.1073/pnas.0536882100
ZHAO, Y. ET AL.: "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 100, no. 5, 4 March 2003 (2003-03-04), pages 2426 - 2431, XP002979380 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018052082A1 (ja) * 2016-09-14 2018-03-22 株式会社Ｔｅｓホールディングス Ｌｉｎ２８ａ活性化剤及びその使用
JP6375076B1 (ja) * 2018-02-19 2018-08-15 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ 間葉系幹細胞を用いたアトピー性皮膚炎治療における治療効果予測判定法
JP2019144045A (ja) * 2018-02-19 2019-08-29 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ 間葉系幹細胞を用いたアトピー性皮膚炎治療における治療効果予測判定法
JP2019144221A (ja) * 2018-07-21 2019-08-29 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ 間葉系幹細胞を用いたアトピー性皮膚炎治療における治療効果予測判定法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2977820A1 (en) 2010-06-03
TW201024415A (en) 2010-07-01
JP5800505B2 (ja) 2015-10-28
US20110223143A1 (en) 2011-09-15
BRPI0921371A2 (pt) 2014-11-18
CA2744289A1 (en) 2010-06-03
RU2011126165A (ru) 2013-01-10
IL212638A (en) 2017-08-31
CO6341484A2 (es) 2011-11-21
MX336067B (es) 2016-01-06
EP2365061A1 (en) 2011-09-14
KR20110094084A (ko) 2011-08-19
AU2009320881B2 (en) 2015-01-22
ZA201103268B (en) 2012-07-25
KR101682731B1 (ko) 2016-12-05
JPWO2010061781A1 (ja) 2012-04-26
AR074406A1 (es) 2011-01-12
US9169463B2 (en) 2015-10-27
CA2977823A1 (en) 2010-06-03
TWI539000B (zh) 2016-06-21
CN102245757B (zh) 2014-11-26
MX2011005480A (es) 2011-06-20
AU2009320881A1 (en) 2010-06-03
EP2365061A4 (en) 2013-03-13
RU2573906C2 (ru) 2016-01-27
CN102245757A (zh) 2011-11-16
IL212638A0 (en) 2011-07-31
US20160008434A1 (en) 2016-01-14
UA110691C2 (uk) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kouroupis et al. Mesenchymal stem cell functionalization for enhanced therapeutic applications
Madrigal et al. A review of therapeutic effects of mesenchymal stem cell secretions and induction of secretory modification by different culture methods
AU2004242091C1 (en) Administration of hyaluronic acid to enhance the function of transplanted stem cells
JP5639058B2 (ja) 造血前駆細胞の増殖
US20160008434A1 (en) Stem cell for therapeutic use which is derived from human monocyte, and method for inducing same
Sávio-Silva et al. Mesenchymal stem cell therapy for diabetic kidney disease: a review of the studies using syngeneic, autologous, allogeneic, and xenogeneic cells
US11406685B2 (en) Methods and compositions for stimulation of cell proliferation and provision of biologically active mixtures of FGF2 isoforms
JP7246569B2 (ja) 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物
Aizman et al. Cell injury-induced release of fibroblast growth factor 2: relevance to intracerebral mesenchymal stromal cell transplantations
KR20190063453A (ko) 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
AU2021403025A1 (en) Method of treating progressive heart failure in subjects with class ii heart failure
EP4264275A2 (en) Method of treating progressive heart failure in subjects with class ii heart failure
WO2023092043A1 (en) Method of treating progressive heart failure in subjects at high risk of poor outcomes
Mulvey et al. Hypoxic Culture and In Vivo Inflammatory Environments Affect the Assumption of Pericyte 1 Characteristics by Human Adipose and Bone Marrow Progenitor Cells 2 3 Peter J. Amos1 4
Kishore Effect of immobilized glycosaminoglycans on megakaryocyte expansion, apoptosis and platelet release

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980146977.1

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09829029

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12011500844

Country of ref document: PH

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 212638

Country of ref document: IL

Ref document number: 2009320881

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 592671

Country of ref document: NZ

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2744289

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2010540461

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13130099

Country of ref document: US

Ref document number: 3736/DELNP/2011

Country of ref document: IN

Ref document number: 2009829029

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2011/005480

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11074347

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2009320881

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20091119

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117014559

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201107956

Country of ref document: UA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011126165

Country of ref document: RU

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: PI0921371

Country of ref document: BR

Free format text: -COM BASE NA RESOLUCAO 228/09, SOLICITA-SE A APRESENTACAO DA DECLARACAO IMPRESSA E ASSINADA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0921371

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20110526