MX2011005480A

MX2011005480A - Celula madre para uso terapeutico, la cual se deriva de monocito humano y metodo para inducir la misma.

Info

Publication number: MX2011005480A
Application number: MX2011005480A
Authority: MX
Inventors: Hironobu Ishiyama; Hisanobu Hirano; Yasushi Ohkubo; Kenjiro Sasaki
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2011-06-20
Also published as: CA2977820A1; TW201024415A; JP5800505B2; US20110223143A1; BRPI0921371A2; CA2744289A1; RU2011126165A; IL212638A; CO6341484A2; MX336067B; EP2365061A1; KR20110094084A; AU2009320881B2; ZA201103268B; KR101682731B1; WO2010061781A1; JPWO2010061781A1; AR074406A1; US9169463B2; CA2977823A1

Abstract

La presente invención se refiere a células madre obtenidas cultivando monocitos en presencia de (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, desdiferenciando de esta manera los monocitos; un agente terapéutico para tratar células, tejidos u órganos dañados; un agente de fármaco para células; un método para producir células madre; un medio de cultivo para desdiferenciar monocitos; un agente inductor de desdiferenciación; un kit de fármaco para células; un kit para producir células desdiferenciadas; y una composición farmacéutica.

Description

CÉLULA MADRE PARA USO TERAPÉUTICO, LA CUAL SE DERIVA DE MONOCITO HUMANO Y MÉTODO PARA INDUCIR LA MISMA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un método para proveer células para su uso en fármacos para células, desdiferenciando rápidamente células que están adecuadamente diferenciadas en un cuerpo vivo. La presente invención se refiere también a un agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados. La presente invención se refiere además a un agente de fármaco para células, un método para producir células madre, un medio de cultivo para desdiferenciar monocitos, un agente inductor de desdiferenciación, un kit de fármaco para células, un kit para producir células desdiferenciadas, y una composición farmacéutica, todos los cuales inducen eficientemente la desdiferenciación de células, y células madre.

TÉCNICA ANTECEDENTE Ha pasado cierto tiempo desde que procedimientos médicos, a saber, la medicina de regeneración, para el reemplazo de células que se han perdido de un tejido por alguna razón, han atraído la atención como un tratamiento fundamental para enfermedades. En años recientes, se ha ampliado adicionalmente el concepto de fármacos para células, el cual pretende regenerar y reparar el tejido en un sitio de enfermedad, por medio de la interacción de sustancias bioactivas intercelulares inyectando células madre o células precursoras de células de tejido.

En respuesta a estas circunstancias, ha habido muchos reportes de que células diferenciadas en tejido, por ejemplo, monocitos derivados de sangre periférica, se desdiferencían en células madre cuando se cultivan en presencia de citocinas específicas.

Sin embargo, cuando células madre o células precursoras de tejido, como un fármaco para células, se administran a un cuerpo vivo, el porcentaje de células que llegan al área dañada objetivo no siempre es alto y no es constante. Esto necesita problemáticamente la preparación de una gran cantidad de células. Además, el comportamiento de las células que están distribuidas en áreas diferentes del área objetivo no se ha estudiado aún en detalle, y continúa habiendo el problema de efectos secundarios. Además, aunque la administración de una gran cantidad de células es necesaria para un efecto terapéutico mejorado, parece difícil obtener células autólogas en un período corto.

Recientemente ha llegado a ser evidente que ocurre un fenómeno denominado arribada. Este es un fenómeno en el cual el SDF1 (factor 1 derivado de células estromáticas) o el VEGF (factor de crecimiento de células endoteliales vasculares) es expresado en un área dañada bajo condiciones isquémicas; como parte del sistema de reparación biológico, estos factores funcionan como moléculas inducibles; y células que expresan receptores que corresponden a estas moléculas inducibles, son llevadas hacia el área dañada. Los receptores para estos factores son CXCR4 para el SDF1 y VEGFR para el VEGF. Por ejemplo, el documento no de patente 1 reporta que una herida no sana cuando el SDF1 es bloqueado en el área isquémica o cuando células que expresan CXCR4 son removidas de la sangre.

Fándrich (documento no de patente 2), Huberman (documento no de patente 3), etc., reportan técnicas para obtener células madre con pluripotencia de monocitos humanos, induciendo desdiferenciación. Estas técnicas usan varias citocinas, incluyendo M-CSF, para incubación. Cada método de cultivo mostró que algunos marcadores no diferenciados llegaron a ser positivos. Además, Kuwana et al. (documento no de patente 4), reportan que células madre multipotenciales (MOMC) pueden ser inducidas de células mononucleares humanas, usando una placa de cultivo a la cual se aplica fibronectina.

Lista de referencias Documento no de patente 1 : Nat. Med. Agosto de 2004; 10 (8): 858-64.

Documento no de patente 2: Ruhnke M, Fándrich F, "Differentiation of ¡n vitro-modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells", Gastroenterology, 128 (2005) Documento no de patente 3: Yong Zhao, Eliezer Huberman, "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells", PNAS 100 (2003) 2426.

Documento no de patente 4: Kuwana M. et al., "Human circu!ating CD14+ monoc tes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation", J. Leukoc. Biol., 74 (2003) 833.

Documento no de patente 5: Folch J., Lees M. , Sloane-Stanley G. H., "A simple method for the isolation and purificaron of total lipids from animal tissues", J. Biol. Chem., 226, 497-509 (1957).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema técnico La producción de células madre que son eficientemente accesibles hacia un área objetivo, se ha considerado desafiante en el campo de fármacos para células. Un objetivo de la presente invención es proveer dichas células madre, un método para la producción en masa a corto plazo de células madre, y una composición farmacéutica para inducir las células madre.

Otro objetivo de la invención es proveer un agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados.

Otro objetivo de la invención es proveer un medio de cultivo inductor de desdiferenciación, un agente inductor de desdiferenciación, un kit de fármaco para células, un kit para producir células desdiferenciadas, y células madre.

Solución al problema Como una solución para los problemas anteriores, la presente invención encontró que el cultivo de monocitos de sangre periférica en un corto periodo en presencia de un agente inductor de desdiferenciación de la presente invención, produce una gran cantidad de células desdiferenciadas. La presente invención encontró también que la administración directa de una composición farmacéutica de la presente invención a un cuerpo vivo, es significativamente efectiva para tratar enfermedades relacionadas con el daño. La presente invención encontró además que la administración de por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, induce la desdiferenciación de monocitos en células capaces de recuperar tejidos u órganos dañados, tales como células madre, posiblemente en cooperación con el M-CSF intravital. La presente invención puede proveer de esta manera un agente terapéutico para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados.

Específicamente, la presente invención provee lo siguiente: ítem 1. Células madre obtenidas cultivando monocitos en presencia de (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, desdiferenciando de esta manera los monocitos. ítem 2. Las células madre de conformidad con el ítem 1 , en donde un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas es azúcar o un complejo que contiene azúcar, el ingrediente activo desdiferenciando los monocitos. ítem 3. Las células madre de conformidad con el ítem 1 , en donde un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas tiene un peso molecular de 1000 a 500000, el ingrediente activo desdiferenciando los monocitos. ítem 4. Las células madre de conformidad con el ítem 1 , en donde un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas es adsorbido a una columna de Concanavalina A (Con A), el ingrediente activo desdíferenciando los monocitos. ítem 5. Las células madre de conformidad con el ítem 1 , en donde un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas es adsorbido a una resina de intercambio amónico, el ingrediente activo desdíferenciando los monocitos. ítem 6. Las células madre de conformidad con el ítem 1 , en donde el extracto soluble en agua derivado de plantas es una fracción de fase acuosa derivada de plantas extraída de Folch, o un producto purificado del mismo. ítem 7. Las células madre de conformidad con el ítem 1 , en donde los monocitos son monocitos humanos. ítem 8. Las células madre de conformidad con cualquiera de los ítems 1 a 7, en donde por lo menos un miembro de los marcadores no diferenciados Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 y Oct3/4 es expresado, y la expresión de un gen de CXCR4 es significativa en comparación con células madre obtenidas cultivando monocitos en la sola presencia del M-CSF. ítem 9. Células madre en las cuales por lo menos un miembro de los marcadores no diferenciados Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 y Oct3/4 es expresado, y la expresión de un gen de CXCR4 es significativa. ítem 10. Un método para producir células madre, que comprende cultivar monocitos en presencia de (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósidp y un extracto soluble en agua derivado de plantas. ítem 11. El método de conformidad con el ítem 10, en donde el cultivo se realiza por 7 a 14 días. ítem 12. Un medio de cultivo para desdiferenciar monocitos, que contiene (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo qué consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas. ítem 13. Una composición farmacéutica que contiene a las células madre de conformidad con cualquiera de los ítems 1 a 9 como un ingrediente activo. ítem 14. Un agente de fármaco para células que contiene a las células madre de conformidad con cualquiera de los ítems 1 a 9 como un ingrediente activo. ítem 15. Un agente inductor de desdiferenciación que contiene (i) M-CSF y (i¡) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua denvado de plantas como ingredientes activos. ítem 16. Un agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados, que contiene por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas como un ingrediente activo. ítem 17. El agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados de conformidad con el ítem 16, en donde las enfermedades se seleccionan del grupo que consiste de lesiones externas, enfermedades inflamatorias, hueso o cartílago dañado, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurológicos, enfermedades del hígado, enfermedades renales, diabetes, dermatitis atópica y GVHD. ítem 18. El agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados de conformidad con el ítem 16, en donde las enfermedades se seleccionan del grupo que consiste de lesiones externas, pancreatitis, daño por radiación, dermatomiositis, miositis múltiple, fascitis necrótica, bronquitis crónica, fractura de hueso, osteoporosis, fractura osteocartilaginosa, osteocondritis, cardiomiopatía dilatada, infarto al miocardio, cardiomiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, hipertrofia del miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis, arritmia, aterosclerosis, vasculitis, neuropatía periférica, dolor neuropático, apoplejía cerebral, encefalitis, meningitis, neuropatía diabética, trastorno de déficit de atención, autismo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, lesiones externas o isquemia del cerebro o espina dorsal, cirrosis hepática, hepatitis crónica, insuficiencia renal crónica, nefritis glomerular, isquemia del riñon, diabetes, dermatitis atópica y GVHD. ¡tem 19. Un kit de fármaco para células que contiene por lo menos las células madre de conformidad con cualquiera de los ítems 1 a 9 como un ingrediente esencial. ítem 20. Un kit para producir células desdiferenciadas, que comprende ^) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas como ingredientes esenciales. ítem 21. El kit de conformidad con el ítem 20, que comprende además monocitos como un componente. ítem 22. Las células madre, el método para producir células madre, el medio de cultivo para desdiferenciar monocitos, el agente de fármaco para células, el agente para tratar enfermedades, el agente inductor de desdiferencíación, el kit de fármaco para células, o el kit para producir células desdiferenciadas de conformidad con el ítem 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 , en donde el gangliósido es por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de GD1 a, GD1 b, GD2, GD3, GM1 , GM2, GM3, GT1 b y GQ1 b.

Efectos ventajosos de la invención Mediante el uso de monocitos, la presente invención provee una producción en masa de células madre en un período corto, accesible a tejidos dañados. La presente invención provee también un agente para inducir células madre. Se espera de esta manera que la presente invención contribuya al campo de fármacos para células.

Además, se ha demostrado que el gangliósido y el extracto soluble en agua derivado de plantas, tal como una fracción de fase acuosa derivada de plantas extraída de Folch o un producto purificado del mismo, sirve como un fármaco para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra las curvas de crecimiento de células madre inducidas de monocitos por cultivo en los medios 1 a 5.

La figura 2 muestra los resultados de la expresión génica por RT- PCR.

La figura 3 exhibe los efectos de la desdiferenciación en células madre añadiendo gangliósidos.

La figura 4 ilustra formas de células después de la adición de los gangliósidos.

La figura 5 indica la actividad inductora de desdiferenciación de cada fracción extraída de plantas.

La figura 6 muestra los resultados de la actividad de fracciones del componente inductor de desdiferenciación derivado del extracto del tallo de la planta de camote obtenido por cromatografías.

La figura 7 muestra las imágenes de anticuerpos anti-colágena teñidos en tejido de hígado de ratón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención usa monocitos, tales como monocitos de sangre periférica, como las células sujetas a desdiferenciación.

La presente invención usa monocitos derivados de mamífero, obtenidos de humanos, equinos, bovinos, monos, chimpancés, cerdos, ovejas, conejos, ratones, ratas, caninos, felinos y mamíferos similares. Entre éstos, son preferibles humanos, monos, chimpancés y primates similares. Los monocitos humanos son particularmente preferibles. Los monocitos se derivan de médula ósea o sangre. Es preferible usar monocitos derivados de sangre, en particular, monocitos derivados de sangre periférica.

Un método para separar monocitos de sangre muestra o similares, es públicamente conocido. Por ejemplo, existe un método que consiste en separar primero células mononucleares de la sangre usando una solución de separación de células sanguíneas "Lymphoprep™" (Cosmo Bio Co. Ltd.), y tratando las células mononucleares obtenidas con perlas magnéticas de anticuerpo (Miltenyi Biotec) capaces de reconocer el antígeno de superficie de CD14, separando de esta manera los monocitos objetivo. Las células mononucleares pueden usarse también directamente como una fuente para obtener el monocito de la presente invención.

Pueden seleccionarse monocitos humanos de productos que están disponibles comercialmente, tales como PT038 (Lonza).

La presente invención desdiferencía monocitos en células madre, y las células resultantes se hacen proliferar antes de que sean puestas de nuevo en un sujeto de prueba tal como una persona. En este caso, los monocitos se toman del paciente y, por lo tanto, es necesario obtener tantas células madre como sea posible de la cantidad mínima de monocitos. La presente invención tiene la ventaja de que desdiferencía células madre de monocitos con alta eficiencia de proliferación, produciendo de esta manera una gran cantidad de células madre de una pequeña cantidad de monocitos.

Ejemplos de los monocitos incluyen células tipo monocito (monocitos, células mononucleares, monoblastos) que tienen un receptor del M-CSF (c-fms). Puesto que sólo los monocitos prolíferan cuando los monocitos y las células mononucleares se usan al mismo tiempo, la presente invención permite el uso de células mononucleares como las células desdiferencíadas, además de los monocitos.

En la presente especificación, el término "célula madre" denota una célula que expresa un marcador no diferenciado y que tiene una propiedad auto-reproductiva. Mediante el uso de monocitos, puede obtenerse una gran cantidad de células madre de la presente invención. Las células madre de la presente invención pueden inducir diferenciación, y tienen de preferencia una propiedad de diferenciación pluripotente. Las células madre obtenidas en la presente invención son positivas para CD14 y CD45.

Las células madre de la presente invención se caracterizan por la expresión significativa de genes de CXCR4; se caracterizan también porque por lo menos un miembro, de preferencia por lo menos dos miembros, más preferiblemente por lo menos tres miembros, más preferiblemente por lo menos cuatro miembros, en particular de preferencia todos los miembros de Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 y Oct3/4, son expresados.

En una forma preferida de la célula madre de la presente invención, el gen de CXCR4 es expresado más significativamente que en las células madre obtenidas cultivando monocitos en la sola presencia del M-CSF, y por lo menos un miembro, de preferencia por lo menos dos miembros, más preferiblemente por lo menos tres miembros, más preferiblemente por lo menos cuatro miembros, en particular de preferencia los cinco miembros de Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 y Oct3/4, son expresados.

Las siguientes son características de las células madre de la presente invención en una modalidad más preferible: (i) el gen de CXCR4 es expresado más significativamente que el gen en las células madre obtenidas cultivando monocitos en la sola presencia de monocitos del M-CSF; (ii) c-Kit es expresado; y (iii) por lo menos un marcador no diferenciado seleccionado del grupo que consiste de Nanog, Nestin, CD9 y Oct3/4, es expresado.

La característica que desdiferencía a las células madre derivadas de monocitos de la presente invención de otras células madre desdiferenciadas, es la expresión significativa del gen de CXCR4, la cual está implicada en la arribada de células. En las células madre de la presente invención, los genes de CXCR4 son expresados más significativamente que los genes en células madre obtenidas cultivando monocitos en la sola presencia del M-CSF. Por ejemplo, en una modalidad preferida de las células madre de la presente invención, la cantidad de expresión del gen de CXCR4 puesta a prueba por RT-PCR o similares, es más de tres o cuatro veces mayor que la cantidad de expresión que resulta del cultivo de monocitos en la sola presencia del M-CSF, o en presencia de M-CSF+IL-3, M-CSF+IL-6 y LIF etc. Además, en una modalidad preferida de las células madre de la presente invención, los genes de CXCR4 son expresados más significativamente que los genes en células madre mesenquimáticas derivadas de célula ósea; más específicamente, la cantidad de expresión del gen de CXCR4 puesta a prueba por RT-PCR o similares, es más de dos o tres veces mayor que la cantidad en la médula ósea.

Las células madre derivadas de monocitos de la presente invención se caracterizan, como con las otras células madre desdiferenciadas, por la expresión de c-Kit, el cual es un marcador de células madre.

Se sabe que SDF1 , el ligando para el receptor de CXCR4, es expresado en tejidos que son dañados como resultado de fracturas de huesos y enfermedades del sistema circulatorio, en las porciones dañadas de tejido neural, o similares. Por lo tanto, las células proveen otro efecto mejorado de arribada de células con respecto a áreas dañadas, cuando sirve como un fármaco para células.

Las células madre obtenidas por la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades administrándolas/inyectándolas en las áreas afectadas. Antes de la inyección, es preferible cultivar las células madre en un medio de cultivo adecuado para que proliferen las células. Entonces, las células se administran/inyectan directamente en las áreas afectadas. Las células madre pueden cultivarse en un medio de cultivo de células general; sin embargo, es preferible cultivar las células madre en el medio de cultivo inductor de desdiferenciación de la presente invención.

De conformidad con una modalidad de la presente invención, las células madre de la presente invención pueden usarse para tratar lesiones externas, enfermedad inflamatoria (pancreatitis, daño por radiación, dermatomiositis, miositis múltiple, fascitis necrótica, bronquitis crónica), hueso o cartílago dañado (fractura de hueso, osteoporosis, fractura osteocartilaginosa, osteocondritis), enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, cardiomiopatía dilatada, infarto al miocardio, cardiomiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, hipertrofia del miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis, arritmia, aterosclerosis, vasculitis, etc.), trastornos neurológicos (por ejemplo, neuropatía periférica, dolor neuropático, apoplejía cerebral, encefalitis, meningitis, neuropatía diabética, trastorno de déficit de atención, autismo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, lesiones externas o isquemia del cerebro o espina dorsal, etc.), enfermedades del hígado (cirrosis hepática, hepatitis crónica), enfermedades renales (insuficiencia renal crónica, nefritis glomerular, isquemia del riñon, etc.), diabetes, dermatitis atópica, GVHD, o similares.

Las células madre desdiferenciadas de la presente invención se depositaron con el International Patent Organism Depositan/ del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1 , Higashi 1 -chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón), en Septiembre 30 de 2009, bajo el número de acceso ABP-11 84.

Como se mencionó anteriormente, los monocitos son convertidos en células madre cultivando los monocitos en presencia de (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas.

En la presente especificación, el término "extracto soluble en agua derivado de plantas", denota un extracto de la planta entera, o una parte (por ejemplo, hojas, tallos, tallos subterráneos, rizomas, tubérculos, enredaderas, raíces, flores, yemas, pétalos, ovarios, frutos, vainas, cápsulas, semillas, fibras, óvulos, etc.) de una planta. Ejemplos de los solventes de extracción incluyen agua, un solvente acuoso (por ejemplo, alcohol acuoso tal como metanol acuoso, etanol acuoso o propanol acuoso; THF acuoso; acetona acuosa), y solventes polares tales como DMF, DMSO o dlmetilacetamida. El "extracto soluble en agua derivado de plantas", es una sustancia extraída de dicho solvente, es decir, agua, un solvente acuoso, o un solvente polar capaz de disolver la sustancia polar en alta cantidad. El extracto soluble en agua derivado de plantas puede obtenerse como sigue. Primero, un extracto de la planta se extrae usando hidrocarburos clorados tales como cloroformo o cloruro de metileno; alcoholes tales como metanol, etanol o propanol; hidrocarburos aromáticos tales como benceno o tolueno; esteres tales como acetato de etilo; éteres tales como THF o éter dietílico; cetonas tales como acetona y metil etil cetona; o hidrocarburos alifáticos o alicíclicos tales como hexano o ciclohexano. Después, el extracto de la planta se trata con agua o un solvente acuoso para obtener la sustancia objetivo soluble en agua. La sustancia soluble en agua obtenida de esta manera usando agua, un solvente acuoso o un solvente polar puede tratarse adicionalmente, según se requiera, con hidrocarburos clorados tales como cloroformo o cloruro de metileno; hidrocarburos aromáticos tales como benceno o tolueno; esteres tales como acetato de etilo; éteres tales como THF o éter dietílico; o hidrocarburos alifáticos o alicíclicos tales como hexano o ciclohexano, para eliminar por el lavado el componente lipofílico. El extracto soluble en agua derivado de plantas es de preferencia una fracción de fase acuosa extraída de Folch derivada de plantas, o un producto purificado del mismo.

El extracto de Folch denota una fracción que queda en la fase acuosa como resultado de un procedimiento de extracción de la planta usando un solvente de cloroformo: metanol = 2:1 , y lavando el solvente mixto con agua. El cloroformo puede ser más bien otro hidrocarburo clorado, tal como cloruro de metileno, tetracloruro de carbono o 1 ,2-dicloroetano. El metanol puede ser más bien alcoholes inferiores, tales como etanol, n-propanol, isopropanol o butanol. La proporción de hidrocarburo clorado a alcohol no se limita a 2: 1 . Puede usarse una amplia gama de proporciones. Aquí, el solvente mixto de hidrocarburo clorado y alcohol tiene una alta propiedad de disolución, facilitando de esta manera la extracción. La proporción de hidrocarburo clorado a alcohol se ajusta de preferencia a un valor que pueda garantizar la separación en una fase acuosa y una fase orgánica cuando se añade agua, extrayendo de esta manera la sustancia activa en la fase acuosa. Cuando la fase no es dividida por la adición de agua, se añade un solvente orgánico para separar el solvente en dos capas. En la presente especificación, la fase acuosa que resulta de la separación en dos capas añadiendo agua se denomina una "fracción de fase acuosa extraída de Folch derivada de plantas". Una fracción de fase acuosa extraída por un método diferente se incluye también en la gama de "fracción de fase acuosa extraída de Folch derivada de plantas", en tanto tenga la misma sustancia activa.

El extracto soluble en agua derivado de plantas de la presente invención contiene una sustancia tipo glucolípido (que contiene un glucolípido y azúcar o uno de ellos) como un ingrediente activo. Puesto que esta sustancia tipo glucolípido tiene una baja solubilidad para un solvente orgánico, el extracto soluble en agua derivado de plantas se aisla de preferencia como una fracción de fase acuosa. Además, el extracto soluble en agua derivado de plantas puede purificarse adicionalmente usando varios tipos de cromatografía, tales como cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad. El producto purificado puede usarse también como el ingrediente activo.

El ingrediente activo en el extracto soluble en agua de la planta puede estar compuesto sólo de azúcar, o puede contener azúcar y otros componentes (lípidos, etc.). Ejemplos de componentes de azúcar incluyen glucosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, fucosa, desoxirribosa, mañosa, fructosa, galactosa, maltosa, lactosa, celobiosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, melibiosa, maltotriosa, melezitosa, turanosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico, ácido manurónico, ácido idurónico, glucosamina, galactosamina, manosamina, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, N-acetilmanosamina, ácido neuramínico, ácido N-acetilneuramínico, y similares. Éstos pueden estar sulfatados. Se prefiere que éstos estén presentes en la forma de oligosacáridos, polisacáridos, glucósidos o glucolípidos. Ejemplos específicos de polisacáridos incluyen glucosaminoglucano, a-glucano, ß-glucano, levano, fructano, galactano, mañano, xilano, arabinano, ácido péctico, ácido algínico, sustancias pécticas, guaraná, polisacárido sulfatado, polisacárido en el cual uno o más tipos de residuos de azúcar están enlazados, polisacáridos formados de unidades de repetición de uno o más miembros de los residuos de azúcar anteriores, y polisacárido en el cual residuos de azúcar plurales estén enlazados intrincadamente. Es preferible que el extracto soluble en agua de la planta se trate con una resina de intercambio catiónico después de que es extraído. En una modalidad, el extracto soluble en agua de la planta de la presente invención contiene de preferencia un componente que es adsorbido a una resina de intercambio aniónico (el componente teniendo un grupo aniónico en agua) como un ingrediente activo. En otra modalidad, el extracto soluble en agua de la planta de la presente invención contiene de preferencia un componente que se une a Concanavalina A agarosa como un ingrediente activo. En una modalidad preferida de la presente invención, el extracto soluble en agua de la planta es adsorbido a una resina de intercambio aniónico y contiene un componente que se une a Concanavalina A agarosa como un ingrediente activo. Como el ingrediente activo que se une a Concanavalina A agarosa, se prefieren polisacáridos o azúcares (incluyendo complejos que contienen azúcar tales como glucolipidos) que contienen un residuo de glucosa y/o residuo de mañosa, en particular un residuo de mañosa. En una modalidad preferida, el extracto soluble en agua de la planta contiene un componente que tiene un residuo de azúcar y que es soluble en agua fría o agua caliente (extraíble). El componente es de preferencia un polisacárido o complejo que contiene azúcar en el cual el límite inferior del peso molecular es de aproximadamente 500, 1000, 2000, 3000, 4000 o 5000, y el límite superior es de aproximadamente 500000, 300000, 200000, 100000, 80000, 60000, 50000, 40000, 30000 o 20000.

La inducción en células madre puede realizarse cultivando los monocitos en presencia de por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas.

Puesto que el M-CSF existe ya en un organismo vivo (por ejemplo, en el cuerpo humano), un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas puede servir como un inductor para causar una conversión de monocitos a células madre. Las células madre arriban en el área enferma, y sirven de esta manera como un agente terapéutico para varios tipos de enfermedades. El agente terapéutico que contiene, como un ingrediente activo, por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, es efectivo para tratar lesiones externas, enfermedad inflamatoria (pancreatitis, daño por radiación, dermatomiositis, miositis múltiple, fascitis necrótica, bronquitis crónica), hueso o cartílago dañado (fractura de hueso, osteoporosis, fracturas osteocartilaginosas, osteocondritis), enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, cardiomiopatía dilatada, infarto al miocardio, cardiomiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, hipertrofia del miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis, arritmia, aterosclerosis, vasculitis, etc.), trastornos neurológicos (por ejemplo, neuropatía periférica, dolor neuropático, apoplejía cerebral, encefalitis, meningitis, neuropatía diabética, trastorno de déficit de atención, autismo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, lesiones externas o isquemia del cerebro o espina dorsal, etc.), enfermedades del hígado (cirrosis hepática, hepatitis crónica), enfermedades renales (insuficiencia renal crónica, nefritis glomerular, isquemia del riñon, etc.), diabetes, dermatitis atópica, GVHD, o similares.

La dosificación efectiva del agente terapéutico que contiene por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas como un ingrediente activo depende, por ejemplo, del uso, la edad y género del paciente, la severidad de la enfermedad, o condiciones similares. Típicamente, la cantidad del ingrediente activo usada es, para un adulto, aproximadamente 0.0001 a 100 mg, de preferencia aproximadamente 0.001 a 10 mg, y más preferiblemente aproximadamente 0.01 a 5 mg con respecto a por kg del peso corporal. La dosificación del agente terapéutico por día puede dividirse de 1 a 4 veces.

La "fracción de fase acuosa extraída de Folch derivada de plantas", incluye una amplia gama de extractos de plantas obtenidos por métodos similares. Además, el ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas que contiene a la fracción de fase acuosa extraída de Folch derivada de plantas, es combinable con resinas de intercambio amónico y Concanavalina A agarosa; y su actividad puede incrementarse por el paso a través de una resina de intercambio catiónico.

Cuando se usa realmente como una preparación medicinal, el agente terapéutico o composición farmacéutica de la presente invención puede formarse en una forma de dosificación general usando un vehículo farmacéutico, junto con un ingrediente activo que contenga por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, y M-CSF, según se requiera. El vehículo terapéutico se selecciona dependiendo de la forma de fármaco, dosificación y método de administración deseado. Ejemplos de vehículos terapéuticos incluyen varios diluyentes y llenadores, tales como agentes de abultamiento, diluyentes, aglutinantes, emulsiones hidratantes, desintegrantes, agentes tensoactivos, lubricantes, etc.

La forma de dosificación de la presente invención puede seleccionarse de varias formas, dependiendo del propósito de tratamiento. Ejemplos típicos de las formas de dosificación incluyen tabletas, pildoras, polvos, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, gránulos, cápsulas, supositorios, inyecciones (de líquidos, suspensiones, etc.), ungüentos, etc. El fármaco se prepara en una forma adecuada por un método general usando un vehículo adecuado. La tableta puede ser una tableta que tenga un recubrimiento general, como es el caso de tabletas recubiertas de azúcar, tabletas recubiertas de gelatina, tabletas entéricas; tabletas recubiertas de película, tabletas de doble capa o tabletas de capas múltiples, etc. Cuando los fármacos de la presente invención se preparan como inyecciones en la forma de un liquido, emulsión o suspensión, el fármaco es de preferencia esterilizado, y es de preferencia isotónico con la sangre. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener sal, glucosa o glicerol en una cantidad suficiente para preparar una solución isotónica. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener también un agente de solubilización general, regulador de pH, agente calmante, etc. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener también un colorante, conservador, perfume, agente de sabor, agente edulcorante, etc., u otras medicaciones. Cuando se administran el M-CSF y el miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas (por lo menos uno), pueden administrarse simultáneamente o por separado.

El miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas (por lo menos uno) puede ser ingerido en la forma de alimento, por ejemplo, bebidas, barras (barras de suplemento), etc. Dicha composición alimenticia puede prepararse de acuerdo con un método general, usando otras materias alimenticias (materias primas) adecuadas públicamente conocidas, excipientes, diluyentes, etc.

Las células madre desdiferenciadas pueden obtenerse induciendo desdiferenciación por medio del cultivo del material celular anterior, en la coexistencia de (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, por un período predeterminado.

Existe M-CSF unido a la membrana cuyo peso molecular es de aproximadamente 22,000, y M-CSF secretorio cuyo peso molecular es de aproximadamente 42,000. Con un enlace disulfuro, su peso molecular llega a ser aproximadamente 45000 (dimero de 22000), y aproximadamente 85000 (dimero de 42000), respectivamente. Existe también un M-CSF del tipo de alto peso molecular en el cual el proteoglucano es unido adicionalmente con un componente de 85 kDa. Puede usarse cualquiera de estos tipos diferentes de M-CSF; sin embargo, se prefieren el M-CSF secretorio cuyo peso molecular sea aproximadamente 42000, y el M-CSF cuyo peso molecular sea aproximadamente 85000 (dimero de 42000), y el M-CSF del tipo de alto peso molecular, en el cual el proteoglucano es unido adicionalmente con el componente de 85 kDa. El M-CSF se deriva de preferencia de humanos, equinos, bovinos, monos, chimpancés, cerdos, ovejas, conejos, ratones, ratas, caninos, felinos y mamíferos similares. Entre ellos, son preferibles humanos, monos, chimpancés y primates similares. Los monocitos humanos son particularmente preferibles. El M-CSF puede obtenerse purificando un producto natural; sin embargo, se prefiere el M-CSF recombinante. Por ejemplo, es posible usar un recombinante expresado en E. coli sin cadena de azúcar, debido a que se sabe que el M-CSF tiene una actividad específica similar a un producto natural cuando tiene los aminoácidos por lo menos del extremo N-terminal hasta el 153.

El gangliósido no es particularmente limitado, en tanto se seleccione de la siguiente lista, que incluye GM1 , GD1 a, GT1 b, etc. Puede combinarse una pluralidad de estos gangliósidos. Además, un extracto derivado de plantas (sustancia tipo glucolípido derivada de plantas) puede inducir también significativamente desdiferenciación. Puede usarse también un extracto derivado de tejido animal (sustancia tipo glucolípido derivada de animales). El extracto puede producirse bajo condiciones generales para extraer una sustancia tipo glucolípido. El ingrediente activo del fármaco de la presente invención es un gangliósido o un extracto soluble en agua derivado de plantas. Puede usarse cualquier extracto derivado de plantas o extracto derivado de tejido animal que contenga al gangliósido o el extracto soluble en agua derivado de plantas. Por ejemplo, el gangliósido está contenido abundantemente en el tejido nervioso/cerebro de un animal, y los extractos derivados del cerebro y los tejidos nerviosos de un animal pueden usarse como gangliósido. Puede purificarse el gangliósido extraído. En tanto la fracción contenga un componente glucolipidico que contenga gangliósido, puede hacerse variar el grado de purificación. Como el componente de extracción, por lo general, se puede usar una fracción obtenida bajo la condición de que se extrae una sustancia de tipo glucolípido. Ejemplos de fracciones del extracto natural incluyen una fracción de fase acuosa extraída de Folch (literatura no de patente 5). Ejemplos preferibles de anímales incluyen mamíferos (bovinos, cerdos, conejos, ovejas, caballos, etc.), y un gangliósido de tejidos nerviosos o de cerebro de cerdo es particularmente preferible. Puede usarse también un gangliósido derivado de la leche de mamíferos, tales como leche de vaca.

Ejemplos preferibles de gangliósídos o los extractos solubles en agua derivados de plantas que se usarán como el material de la sustancia tipo glucolípido, incluyen camote, Ipomoea batatas sp, dondiego de día, dondiego de día de los pantanos, dondiego de día de hojas reniformes, dondiego de día de hojas digitiformes, Quamoclit sloteri, dondiego de día azul, Ipomoea congesta, y Convolvuláceas similares; Nelumbo nucífera (raíz de loto), Nelumbo lútea, y lotos similares; Solanum americanum, Solanum lycopersicum, Solanum mammosum, Solanum melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Datura mete!, Datura meteloides, Datura stramonium, Brugmansia arbórea, Brugmansia suaveolens, Physalis alkekengi var. franchetü, P. japonicum, Petunia x hybrida, y solanáceas similares. Además de los ejemplos anteriores, puede usarse una amplia gama de gangliósidos o extractos solubles en agua derivados de plantas que tengan un glucolípido. La planta puede ser hojas, tallos, tallos subterráneos, rizomas, tubérculos, enredaderas, raíces, flores, yemas, pétalos, ovarios, frutos, vainas, cápsulas, semillas, fibras, óvulos, hierbas, etc. El extracto puede derivarse de cualquiera de estas porciones.

Por ejemplo, puede usarse la porción del bulbo de papas o camotes, además de otras porciones de papas o camotes, tales como las hojas, tallos, tallos subterráneos, rizomas, tubérculos, enredaderas, raíces, flores, yemas, pétalos, ovarios, frutos, vainas, cápsulas, semillas, fibras, óvulos, hierbas, etc.

Por ejemplo, es posible usar una planta transgénica que sea procesada para introducir genes necesarios o para bloquear la expresión de genes innecesarios para incrementar la producción del gangliósido o sustancias tipo glucolípido.

El término "gangliósido" es un nombre general de un glucoesfingolípido que tiene un ácido siálico, tal como GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, GT1b o GQ1b.

Estos gangliósidos tienen las siguientes estructuras: GD1a=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGIcp(1-1)Cer GD1b=bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2- 3) ]bDGalp(1 -4)bDGIcp(1 -1 )Cer GD2=bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1- 4) bDGIcp(1-1)Cer GD3=aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1 -4)bDGIcp(1 -1 )Cer G 1=bDGalp(1-3)bDGalNAc[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGIcp(1-1)Cer GM2=bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGIcp(1- 1)Cer GM3=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGIcp(1-1)Cer GT1b=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGIcp(1-1)Cer GQ1b=aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGIcp(1-1)Cer aNeu5Ac = ácido 5-acetil-a-neuramínico aNeu5Ac9Ac = ácido 5,9-diacetil-a-neuramínico bDGalp = ß-D-galactopiranosa bDGalpNAc = N-acetil-p-D-galactopiranosa bDGIcp = -D-glucopiranosa Cer = ceramida (esfingoide N-acilado general).

Puede usarse cualquier medio de cultivo para mamíferos. Por ejemplo, el cultivo puede realizarse usando un medio tal como RPMI 1640, DMEM, MEM de Eagle, aMEM, IMEM o M199 que contenga, por ejemplo, aproximadamente 1 a 20% de componente de suero tal como FBS, FCS, CS o HS. El cultivo se realiza de preferencia con, pero no está limitado a, un medio DMEM que contenga aproximadamente 10% de FBS. Puede usarse también un cultivo libre de suero, tal como Ultra CULTURE™ (medio para tipos de células de mamífero). El medio de cultivo libre de suero no es particularmente limitado.

Las células madre desdiferenciadas pueden obtenerse cultivando monocitos en un medio que contenga (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, a 37°C por aproximadamente 7 a 14 días en presencia de C02 a 5%. Durante este período de cultivo, la desdiferenciación procede, y se obtienen las células madre especificas de la presente invención que expresan un marcador no diferenciado. Además, durante este período de cultivo, la expresión del gen de CXCR4, la cual es una característica de las células madre de la presente invención, se incrementa significativamente. Incluso si el período de cultivo es extendido, las células madre de la presente invención pueden obtenerse en tanto exista un nivel significativo de expresión del gen de CXCR4.

Cuando el material celular se cultiva bajo dichas condiciones, el número final de las células madre obtenidas es aproximadamente cinco veces el número de las obtenidas por un cultivo usando sólo el M-CSF o una combinación con otras citocinas.

Es posible usar un complejo de enlace covalente o un complejo de enlace no covalente del M-CSF y por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, como un agente inductor de desdiferenciación.

Hasta ahora, algunos reportes han mostrado la producción de células madre cultivando monocitos usando sólo el M-CSF. En contraste, la presente invención combina (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, para obtener células madre que tengan expresión particularmente significativa del gen de CXCR4. El cultivo se realiza usando el M-CSF a una concentración de 5-100 ng/ml, más preferiblemente 25 ng/ml. El gangliósido puede ser una mezcla de extractos derivados de plantas o animales, un material obtenido purificando un producto natural que contenga gangliósido, o una composición química.

El gangliósido puede ser contenido en un medio de cultivo a una concentración final de aproximadamente 1-100 pg/ml. El extracto soluble en agua derivado de plantas puede ser contenido en un medio de cultivo a una concentración final de aproximadamente 0.1-100 pg/ml.

La concentración final del miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliosido y un extracto soluble en agua derivado de plantas (por lo menos uno), es aproximadamente 1-100 µg ml. En la presente especificación, el término "gangliosido" denota un gangliosido individual, tal como GD1 a, GD1 b, GD2, GD3, GM1 , GM2, GM3, GT1 b o GQ1 b, o una mezcla de estos gangliósidos. El "contenido de gangliosido" denota el contenido general cuando se usan gangliósidos múltiples.

Kit La presente invención provee también un kit de fármaco para células, el cual contiene a las células madre de la presente invención como un ingrediente esencial; y un kit que produce células desdiferenciadas, el cual contiene (i) M-CSF y (ii) un gangliosido o un extracto soluble en agua derivado de plantas, como ingredientes esenciales.

El kit de fármaco para células contiene a las células madre derivadas de monocitos de la presente invención y, según se requiera, un medio de cultivo que contiene (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliosido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, un contenedor de cultivo, etc. El kit puede ser una jeringa para inyección llena con las células madre derivadas de monocitos.

El número de las células madre derivadas de monocitos en el kit de fármaco para células es, por ejemplo, aproximadamente 1 x 104 a 1 x 107 por kit.

El kit que produce las células desdiferenciadas de la presente invención contiene (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas; contiene además, según se requiera, un medio de cultivo de células, un contenedor de cultivo, monocitos, etc.

Campo de aplicación industrial Campo técnico al cual la invención puede aplicarse La presente invención es aplicable a todos los campos a los cuales se aplican células madre, en particular al campo de fármacos para células, el cual está atrayendo la atención en años recientes. Cuando se aplica a este campo, las células deben producirse y proveerse dentro de un periodo corto. Además, considerando el rechazo ¡nmunológico, es importante producir las células madre desdiferenciadas de células tomadas del cuerpo de un paciente, y poner las células madre producidas de nuevo en el cuerpo del mismo paciente por razones de seguridad. Por lo tanto, es importante producir una cierta cantidad de células madre dentro de un corto período después dé que el material celular se toma del cuerpo del paciente. La presente invención es significativa en este respecto.

Una modalidad de la presente invención es la administración intravenosa de células desdiferenciadas.

Las células pueden administrarse al paciente por un método general después de que las células objetivo se obtienen por el cultivo. Por ejemplo, después del tratamiento con tripsina, las células se colectan por centrifugación, y se dispersan en una solución isotónica adecuada antes de que sean administradas intravenosamente. Además, es posible añadir un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para estabilizar las células. Cuando existe un intervalo de tiempo entre el aislamiento de las células de la solución de cultivo y la administración de las células cultivadas, las células pueden conservarse en un método general a -80°C o en presencia de nitrógeno líquido. Más preferiblemente, las células se colectan para ser usadas por el tratamiento objetivo 7 a 14 días después del inicio del cultivo para desdiferenciar los monocitos, y entonces se usan de inmediato para el tratamiento objetivo, debido a que es probable que el nivel de expresión del gen de CXCR4 sea más grande durante este período. Por consiguiente, puede determinarse el período de uso de las células, dependiendo del nivel de expresión del gen marcador y no limitado al período de cultivo.

Campo técnico al cual el agente terapéutico/componente medicinal puede aplicarse La presente invención administra por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas y, según se requiera, M-CSF, a mamíferos, tales como humanos, tratando de esta manera varias enfermedades, tales como lesiones externas, enfermedades inflamatorias, hueso o cartílago dañado, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurológicos, enfermedades del hígado y enfermedades renales, diabetes, dermatitis atópica o GVHD. El miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas (por lo menos uno), sirve para desdiferenciar los monocitos del sujeto de prueba en células madre capaces de recuperarse de las enfermedades. Las células madre son movidas hacia el área de enfermedad y funcionan como un agente terapéutico. De otro modo, por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y una fracción de fase acuosa extraída de Folch derivada de plantas puede actuar directamente o indirectamente sobre células diferentes de monocitos.

Uso como un kit Las células madre desdiferenciadas producidas usando el agente inductor de desdiferenciación pueden usarse como un kit después de que son sometidas a un tratamiento de conservación adecuado.

Asimismo, el agente inductor de desdiferenciación puede usarse como un kit que contiene al agente como el ingrediente esencial.

Lo siguiente describe los ejemplos de la presente invención que describen más específicamente la invención. Sin embargo, la presente invención no se limita a los ejemplos.

EJEMPLOS La presente invención se explica en más detalle a continuación con base en ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos.

EJEMPLO 1 De conformidad con la presente invención, se cultivaron monocitos humanos (PT038; LONZA) con la adición de los aditivos 1 a 5 siguientes, a un medio de cultivo basal (las concentraciones se expresan como la concentración final; en lo sucesivo referida como "FC"). La figura 1 muestra los resultados. El eje vertical de la figura 1 indica el número de células viables, y el eje horizontal indica el número de días de cultivo. Los resultados demuestran que las células madre derivadas de monocitos de la presente invención tienen una actividad proliferativa muy alta en comparación con las obtenidas por las técnicas reportadas por Fándrich, Huberman, etc.

Aditivo 1 : M-CSF (FC: 25 ng/ml) + gangliósidos (GD1 a de cerebro de bovino; SIGMA) (FC: 100 ^g/ml).

Aditivo 2: M-CSF (FC: 5 ng/ml) + IL-3 (FC: 0.5 ng/ml) (documento no de patente 2).

Aditivo 3: M-CSF (FC: 25 ng/ml) + IL-6 (FC: 20 ng/ml) y LIF (FC: 1000 unidades/ml) (documento no de patente 3).

Aditivo 4: M-CSF (FC: 25 ng/ml).

Aditivo 5: M-CSF (FC: 25 ng/ml) + glucolipido (preparado disolviendo una fracción de fase acuosa extraída de Folch obtenida de 1 g de la planta (camote) sobre una base de peso seco en 500 mi de medio de cultivo).

La fracción de fase acuosa extraída de Folch usada en el aditivo 5, se preparó de la manera siguiente. Se homogenizaron completamente células liofilizadas (tejido de camote) en una cantidad adecuada de una solución salina fisiológica, y entonces se mezclaron vigorosamente con una cantidad equivalente de solución de cloroformo/metanol (2:1 ). Después de que la mezcla se separó por centrifugación en una fase de solvente orgánico, fase de proteína modificada y fase acuosa, se usó un extracto en la fracción soluble en agua de la capa superior.

Mediante la adición de todos los aditivos a DMEM (suero de bovino fetal a 20%), un cultivo de monocitos humanos se inició a una concentración de 1.5 x 105 células/ml (200 µ?/cavidad, placa de 96 cavidades). El conteo de células viables se cuantificó usando la prueba de viabilidad de células luminiscente CelITiter-Glo™ de Promega. Más específicamente, las células se lavaron con una solución salina fisiológica tres veces cada día de cultivo para remover las células no unidas, y entonces se cuantificaron las células unidas y desarrolladas.

Mientras, los niveles de expresión génica de las células madre obtenidos por los métodos de cultivo de conformidad con la presente invención y la técnica anterior, se analizaron por RT-PCR. Un cultivo de monocitos humanos se inició bajo las condiciones anteriores y a una concentración de 1.5 x 105 células/ml (6 ml/placa, 6 cm de diámetro). En el día 14, se colectó ARNm usando el kit Micro Fast Track 2.0 (Invitrogen). Después, se realizó el análisis del nivel de expresión por RT-PCR. Los ítems y la información de secuencia de los iniciadores, son los siguientes: Nanog F 5'-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3' (SEQ ID NO: 1 ) R 5'-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3' (SEQ ID NO: 2) Nestin F 5'-CTCTGACCTGTCAGAAGAAT-3' (SEQ ID NO: 3) R 5'-GACGCTGACACTTACAGAAT-3' (SEQ ID NO: 4) Oct3/4 F 5'-GAGCAAAACCCGGAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 5) R 5'-TTCTCTTTCGGGCCTGCAC-3' (SEQ ID NO: 6) c-Kit F 5'-CCAAGTCATTGTTGGATAAG-3' (SEQ ID NO: 7) R 5'-CTTAGATGAGTTTTCTTTCAC-3' (SEQ ID NO: 8) CXCR4 F 5'-ATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATC-3' (SEQ ID NO: 9) R 5'-ATCCAGACGCCAACATAGACCACCTTTTCA-3' (SEQ ID NO: 10).

Estructura del campo (las concentraciones se expresan como la concentración final; referida en lo sucesivo como "FC") 1 : M-CSF (FC: 25 ng/ml) + gangliósidos (GD1 a de cerebro de bovino; SIG A) (FC: 100 g/ml). 2: M-CSF (FC: 5 ng/ml) + IL-3 (FC: 0.5 ng/ml) (documento no de patente 2). 3: M-CSF (FC: 25 ng/ml) + IL-6 (FC: 20 ng/ml) + LIF (FC: 1000 unidades/ml) (documento no de patente 3). 4: M-CSF (FC: 25 ng/ml). 5: M-CSF (FC: 25 ng/ml) + fracción de fase acuosa extraída de Folch derivada de plantas. 6: Sin cultivo. 7: Sin cultivo. 1-6: Monocitos humanos, 7: médula ósea humana (ADNc Marathon-Ready de médula ósea humana; Clontech).

La figura 2 muestra los resultados. Los resultados presentados en la figura 2 demostraron que las células madre obtenidas por la presente invención (campo 1 ó 5), tuvieron un nivel de expresión muy alto de CXCR4.

Después, se hizo una comparación de las actividades inductoras de células madre de varios gangliósidos.

Más específicamente, se añadieron gangliósidos a un medio de cultivo a una concentración final de 100 g/ml, y se cultivaron monocitos de sangre periférica.

Se añadieron a los mismos rhM-CSF a una concentración final de 25 ng/ml. Entonces, el número de células viables en la segunda semana de cultivo se cuantificó como actividad de luciferasa, usando CelITiter-Glo (Promega). Los cultivos usando GM1 , GD1 a, GT1 b, y una mezcla de los mismos, mostraron actividades inductoras de células madre igualmente fuertes en los resultados (figura 3). Además, no se observó diferencia alguna en la morfología de las células (figura 4; las fotografías ilustran la morfología de las células en la segunda semana de cultivo).

La estructura de los campos en la figura 3, es la siguiente (las concentraciones se expresan como la concentración final; referida en lo sucesivo como "FC"): 1 : GM1 (FC: 25 ng/ml). 2: GD1a (FC: 25 ng/ml). 3: GT1b (FC: 25 ng/ml). 4: Mezcla de cantidades iguales de GM1 , GD1a y GT1 b (FC: 25 ng/ml (concentración final)). 5: Sólo M-CSF. 6: Sólo plasma.

Actividades inductoras de células madre de varios extractos derivados de plantas Se obtuvieron extractos de los tallos de una raíz de loto e Ipomoea congesta, bajo las mismas condiciones como en las del tallo de la planta de camote anterior. La comparación de las actividades se estandarizó con base en los pesos secos de las plantas usadas para la extracción. La actividad específica se basa en la actividad proliferativa de las células del extracto del tallo de la planta de camote como 100. Como es claro de la figura 5, se observaron actividades inductoras de células madre similares en los extractos de los tallos de la raíz de loto e Ipomoea congesta.

Una característica del ingrediente activo del extracto soluble en agua de la planta, es que es extraído principalmente en una fase acuosa por el método de extracción de Folch. El extracto soluble en agua de la planta puede ser fraccionado, separado o purificado, haciéndolo pasar a través de varias columnas. El ingrediente activo se caracteriza por su unión a resinas de intercambio aniónico (Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, etc.) y resinas de unión a lectina (Concanavalina A, etc.) en una amplia escala de pH.

La figura 6 muestra los resultados de la evaluación de la actividad de las fracciones de flujo pasante después de la aplicación de los extractos a resinas que tienen una afinidad de unión al ingrediente activo. Los resultados revelaron que las fracciones de flujo pasante perdieron actividad debido a la unión del ingrediente activo a una resina de intercambio aniónico y Concanavalina A agarosa. Los resultados sugieren también que un inhibidor fue removido por medio de una resina de intercambio catiónico, elevando de esta manera la actividad.

El cálculo se basó en la actividad del extracto del tallo de la planta de camote como 100. La actividad incrementada en la fracción de flujo pasante de la resina de intercambio catiónico, indica la remoción de un inhibidor. Las fracciones de flujo pasante de la resina de intercambio aniónico y la resina de lectina Concanavalina A perdieron actividad, sugiriendo la retención del factor activo.

EJEMPLO 2 Efecto de curación en el modelo animal al que se le administró células madre (ejemplo de prueba terapéutica usando el modelo de cirrosis hepática en ratones) Se administró tetracloruro de carbono (1 ml/kg (peso corporal)) a ratones de laboratorio dos veces por semana por 12 semanas consecutivas, para inducir artificialmente cirrosis hepática. Las células madre desdiferenciadas derivadas de monocitos humanos (hMDDSC) de la presente invención, se administraron dos veces a los ratones del modelo de cirrosis hepática por medio de la vena de la cola (la segunda administración se llevó a cabo una semana después de la primera administración; 1 x 105 por individuo). Una semana después de la segunda administración (dos semanas después de la primera administración), el hígado se extrajo de cada ratón; y se realizó el análisis patológico y bioquímico de las secciones de tejido. En la hepatitis inducida por el tetracloruro de carbono, según se informa, SDF1 (factor 1 derivado de células estromátícas) es expresado altamente en el área inflamada como en la hepatitis viral (Jung et al., 2006). Puesto que las hMDDSC de la presente invención expresan altamente CXCR4, el cual es un receptor para SDF1 , se espera que las hMDDSC se acumulen en el área inflamada a través de un enlace entre las hMDDSC y el CXCR4 para ejercer un efecto de curación sobre los tejidos circundantes (Kollet et al., 2003; Nervi et al., 2006).

Con respecto a la función hepática detectada por marcadores sanguíneos, los valores de GOT y GPT disminuyeron inmediatamente y regresaron a los niveles normales, después de que concluyó la administración del tetracloruro de carbono. Por consiguiente, estos valores mostraron niveles casi normales después de un tratamiento curativo por dos semanas, y no se observaron grandes diferencias en los valores medidos entre los grupos de prueba. Sin embargo, como se muestra más adelante, el tratamiento con fármaco por 12 semanas causó fibrosis severa en el tejido del hígado, resultado en cirrosis hepática. Las hMDDSC de la presente invención tuvieron un efecto dramático sobre la reducción y remoción del tejido fibroso desarrollado en el hígado. 1. Análisis histopatológico Se obtuvieron secciones de parafina del hígado extraído e inmovilizado de un ratón, y se detectaron fibras de colágena, las cuales son un anticuerpo anti-colágena I y el componente principal de la estructura fibrosa (figura 7, café oscuro). Al mismo tiempo, se tiñó el núcleo de color azul (tinción con hematoxilina).

Las imágenes superiores muestran tres ejemplos de un grupo control en el cual se administró una solución salina, pero no se administraron hMDDSC, después de la inducción de cirrosis hepática, y las imágenes inferiores muestran tres ejemplos en los cuales se administraron intravenosamente dos veces hMDDSC. La administración de hMDDSC resultó en la remoción obvia de haces de fibras gruesos (indicados por flechas en las imágenes superiores) detectados por anticuerpos anti-colágena.

Además, se realizó tinción de Azan-Mallory en las mismas secciones de hígado, y el área de la porción de tejido fibroso teñida de azul se calculó usando un microscopio de análisis de imágenes (Keyence BZ-9000) (cuadro 1).

CUADRO 1 Resultados del análisis dé las imágenes de las porciones fibrosas teñidas usando la tinción de Azan-Mallory El grupo al que se le administraron hMDDSC (hMDDSC), mostró un valor más de 5 veces mayor que el del grupo control normal (normal) al que no se administró tetracloruro de carbono; sin embargo, la cantidad de tejido fibroso en el grupo al que se le administraron hMDDSC disminuyó tanto como 23%, en comparación con el grupo al que se le administró solución salina fisiológica (solución salina). 2. Análisis bioquímico A) Péptido tipo III de pro-colágena El nivel del péptido tipo III de pro-colágena en sangre, se midió en un experimento de tratamiento de cirrosis hepática usando un modelo de ratón similar. El péptido tipo III de pro-colágena (PIIIP) es un péptido terminal presente en un precursor de colágena, y está libre en la sangre y el tejido como péptido después de que es digerido durante la producción de colágena. El PIIIP se usa por lo tanto como un marcador que refleja la producción de colágena (Giannini et al., 2001). Se extrajo sangre de la cola del ratón inmediatamente después del experimento de tratamiento por dos semanas, y se midió el PIIIP en plasma por el método de ELISA (CUSABIO CSB-E08095) (cuadro 2).

CUADRO 2 Cantidad de péptido III de pro-colágena en sangre n=7 El grupo control (solución salina) al que se le administró una solución salina fisiológica después de la inducción de cirrosis hepática, mostró un valor aproximadamente cinco veces mayor que el grupo control normal (normal), mientras que la cantidad de pro-colágena en la sangre indicó una disminución dramática debido a la administración de las hMDDSC; se alcanzó un valor cercano al de un ratón sano. Debido a que el grupo al que se le administró solución salina fisiológica alcanzó un alto valor, la producción inusualmente alta de moléculas de colágena presumiblemente continuó mucho después de que se interrumpió la inducción de cirrosis hepática por el estímulo con tetracloruro de carbono. Sin embargo, se encontró que la producción de colágena inusualmente alta fue inmediatamente suprimida por la administración de las hMDDSC, y la cantidad de pro-colágena en la sangre disminuyó hasta niveles casi normales.

B) Hidroxiprolina Con el propósito de cuantificar la cantidad total de fibra en el tejido del hígado directamente del tejido, se midió el contenido de hidroxiprolina, la cual es un constituyente de la colágena, en el tejido del hígado. El hígado extraído de un ratón después de un tratamiento curativo por dos semanas fue cortado y homogenizado, y la proteína contenida fue descompuesta por un tratamiento con hidróxido de sodio. Se midió la concentración de hidroxiprolina por la reacción de color específica de hidroxiprolina, de cloramina-T y dimetilaminobenzaldehído (cuadro 3, Reddy et al., 1996).

CUADRO 3 Cantidad de hidroxiprolina en el tejido del hígado Aunque el grupo al que se le administraron hMDDSC (hMDDSC) mostró aún un valor extremadamente alto, el cual fue tres veces mayor que el del grupo control normal (normal), mostró tanto como una disminución de 22.6% en comparación con el grupo al que se le administró solución salina fisiológica. En otras palabras, se detectó una mejora de la fibrosis del hígado en el grupo al que se le administraron hMDDSC.

Después de que se administró una fracción de fase acuosa extraída de Folch del tallo de la planta de camote a los ratones anteriores con cirrosis hepática por medio de la vena de la cola en una cantidad de 6.6 mg/kg, los inventores confirmaron que la cirrosis hepática fue reducida. 3. Conclusión De esta manera, el tratamiento de la cirrosis hepática en modelos de ratón usando las hMDDSC de la presente invención, se caracteriza porque la producción de fibras es suprimida significativamente, y el tejido fibroso es removido o reducido por un tratamiento simple y a corto plazo (sólo dos administraciones en dos semanas). Como resultado, es efectivo para el pronto alivio de la cirrosis hepática y para la restauración del tejido del hígado a tejido normal del hígado. De esta manera, este tratamiento es un sistema terapéutico novedoso que promueve la regeneración del hígado. 4. Documentos citados Jung YJ, Ryu KH, Cho SJ, Woo SY, Seoh JY, Chun CH, Yoo K, Moon IH y Han HS. "Syngenic bone marrow cells restore hepatic function in carbón tetrachloride-induced mouse liver injury", Stem Cells Dev., 2006, 15, 687-695.

Kollet O, Shivtiel S, Chen YQ, Suriawinata J, Thung SN, Dabeva MD, Kahn J, Spiegel A, Dar A, Samira S, Goichberg P, Kalinkovich A, Arenzana-Seisdedos F, NaglerA, Hardan I, Revel M, Shafritz DA, Lapidot T. "HGF, SDF-1 , and MMP-9 are involved in stress-induced human CD34+ stem cell recruitment to the liver", J Clin Invest. 2003, 1 12, 160-169.

Nervi B, Link DC, DiPersio JF. "Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization". J Cell Biochem, 2006, 99, 690-705.

Giannini E, Caglieris S, Ceppa P, Risso D, Lantieri PB, Testa R. "Serum pro-collagen III peptide levéis are related to lobular necrosis in untreated patients with chronic hepatitis C", Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001 , 13, 137-141.

Reddy GK, Enwemeka CS. "A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues", Clin Biochem. 1996, 29, 225-229.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Células madre obtenidas cultivando monocitos en presencia de (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas, desdiferenciando de esta manera los monocitos.

2. - Las células madre de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porqué un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas es azúcar o un complejo que contiene azúcar, el ingrediente activo desdiferenciando los monocitos.

3. - Las células madre de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas tiene un peso molecular de 1000 a 500000, el ingrediente activo desdiferenciando los monocitos.

4. - Las células madre de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas es adsorbido a una columna de Concanavalina A, el ingrediente activo desdiferenciando los monocitos.

5. - Las células madre de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque un ingrediente activo del extracto soluble en agua derivado de plantas es adsorbido a una resina de intercambio aniónico, el ingrediente activo desdiferenciando los monocitos.

6. - Las células madre de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque el extracto soluble en agua derivado de plantas es una fracción de fase acuosa derivada de plantas extraída de Folch, o un producto purificado del mismo.

7. - Las células madre de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además porque los monocitos son monocitos humanos.

8. - Las células madre de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizadas además porque por lo menos un miembro de los marcadores no diferenciados Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 y Oct3/4 es expresado, y la expresión de un gen de CXCR4 es significativa en comparación con células madre obtenidas cultivando monocitos en la sola presencia del M-CSF.

9. - Células madre en las cuales por lo menos un miembro de los marcadores no diferenciados Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 y Oct3/4 es expresado, y la expresión de un gen de CXCR4 es significativa.

10. - Un método para producir células madre, que comprende cultivar monocitos en presencia de (i) M-CSF y (¡i) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el cultivo se realiza por 7 a 14 días.

12. - Un medio de cultivo para desdiferenciar monocitos, que contiene (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas.

13.- Una composición farmacéutica que contiene a las células madre de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como un ingrediente activo.

14.- Un agente de fármaco para células que contiene a las células madre de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como un ingrediente activo.

15. - Un agente inductor de desdiferenciación que contiene (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas como ingredientes activos.

16. - Un agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados, que contiene por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas como un ingrediente activo.

17. - El agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque las enfermedades se seleccionan del grupo que consiste de lesiones externas, enfermedades inflamatorias, hueso o cartílago dañado, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurológicos, enfermedades del hígado, enfermedades renales, diabetes, dermatitis atópica y GVHD.

18. - El agente para tratar enfermedades relacionadas con células, tejidos u órganos dañados de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque las enfermedades se seleccionan del grupo que consiste de lesiones externas, pancreatitis, daño por radiación, dermatomiosítis, miositis múltiple, fascitis necrótica, bronquitis crónica, fractura de hueso, osteoporosis, fractura osteocartilaginosa, osteocondritis, cardiomiopatía dilatada, infarto al miocardio, cardiomiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, hipertrofia del miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis, arritmia, aterosclerosis, vasculitis, neuropatía periférica, dolor neuropático, apoplejía cerebral, encefalitis, meningitis, neuropatía diabética, trastorno de déficit de atención, autismo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, lesiones externas o isquemia del cerebro o espina dorsal, cirrosis hepática, hepatitis crónica, insuficiencia renal crónica, nefritis glomerular, isquemia renal, diabetes, dermatitis atópica y GVHD.

19.- Un kit de fármaco para células que contiene por lo menos las células madre de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como un ingrediente esencial.

20. - Un kit para producir células desdiferenciadas, que comprende (i) M-CSF y (ii) por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de un gangliósido y un extracto soluble en agua derivado de plantas como ingredientes esenciales.

21. - El kit de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende adicionalmente monocitos como un componente.

22.- Las células madre de conformidad con las reivindicaciones 1-9, el método para producir células madre de conformidad con las reivindicaciones 10 y 11 , el medio de cultivo para desdiferenciar monocitos de conformidad con la reivindicación 12, la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, el agente de fármaco para células de conformidad con la reivindicación 14, el agente para tratar enfermedades de conformidad con las reivindicaciones 16-18, el agente inductor de desdiferenciación de conformidad con la reivindicación 15, el kit de fármaco para células de conformidad con la reivindicación 19, o el kit para producir células desdiferenciadas de conformidad con las reivindicaciones 20 y 21 , caracterizados además porque el gangliósido es por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1 , GM2, G 3, GT1b y GQ1b.