KR20110094084A - 인간 단구 유래 치료용 줄기 세포 및 그의 유도 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단구를 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 존재하에서 배양하고, 탈분화시킴으로써 얻어지는 줄기 세포, 세포, 조직 또는 기관의 손상에 관련된 질환의 치료제; 세포 의약용제, 줄기 세포의 생산 방법, 단구의 탈분화 유도 배지, 탈분화 유도제, 세포 의약용 키트 또는 탈분화 세포 생산 키트 및 의약 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생체에 있어서 정상적으로 분화한 세포를 단기간에 탈분화시킴으로써, 세포 의약에 사용할 수 있는 세포를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포, 조직 또는 기관의 손상에 관련된 질환의 치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 효율적으로 탈분화 유도시키는 세포 의약용제, 줄기 세포의 생산 방법, 단구(monocyte)의 탈분화 유도 배지, 탈분화 유도제, 세포 의약용 키트 또는 탈분화 세포 생산 키트, 의약 조성물 및 줄기 세포에 관한 것이다.
질환에 대한 근본적인 치료 방법으로서, 어떠한 원인에 의해 조직에 있어서 상실된 세포를 보충하는 수법, 즉 재생 의료가 주목을 받은지 오래다. 그러나, 최근 더욱 줄기 세포 또는 조직 세포의 전구 세포를 주입하고, 질환 부위에서 재생 및 세포간 생리 활성 물질의 상호 작용을 통하여 조직을 수복해 가고자 하는 세포 의약의 사고 방식이 확대를 보이고 있다.
이에 호응하여, 조직에서의 분화 세포, 예를 들면 말초혈 유래 단구가 특정한 사이토카인의 존재하에서 배양됨으로써, 줄기 세포로 탈분화한다고 하는 보고가 잇따르고 있다.
그러나, 세포 의약을 목적으로 하여 줄기 세포 또는 조직 전구 세포를 생체 내에 투여한 경우에도, 목적하는 손상 부위에 세포가 도달하는 비율이 반드시 높지 않거나, 또는 일정하지 않다. 따라서 대량의 세포를 준비하지 않으면 안된다고 하는 문제가 있다. 또한, 목적 부위 이외의 부분에 분포한 세포가, 그 부위에서 어떠한 거동을 나타내는지에 관하여 상세한 검토는 이루어져 있지 않아, 부작용 발병의 점에서 문제를 남기고 있다. 또한, 치료 효과를 높이기 위해서는 대량의 세포를 투여하지 않으면 안되지만, 자기의 세포를 단기간에 조달하는 것은 곤란하다고 생각된다.
최근, 손상 부위에 있어서 허혈 상태 하에 SDF1(스트로마 세포 유래 인자 1) 또는 VEGF(혈관 내피 세포 증식 인자)가 발현하여, 생체 내 수복 기구의 일환으로서 본 분자가 유인 분자가 되어, 이들 유인 분자에 대한 수용체를 발현하고 있는 세포가 손상 부위에 가까이 당겨지는(소위 호밍) 현상이 생기는 것이 밝혀지고 있다. 이들 수용체에 관해서는 SDF1에 대해서는 CXCR4이고, VEGF에 대해서는 VEGFR이다. 예를 들면, 비특허문헌 1은 허혈 부위에 있어서 SDF1를 블록하거나, 또는 CXCR4 발현 세포를 혈액 중으로부터 제거한 경우, 상처가 치유되지 않게 된다는 것을 보고하고 있다.
인간 단구를 기원으로 탈분화 유도에 의해 다분화능을 갖는 줄기 세포를 얻는 기술은, 판드리히(Fandrich)나 후베르만(Huberman)(비특허문헌 2, 3) 등에 의해 보고되어 있다. 모두 M-CSF를 비롯하여 여러가지 사이토카인을 배양에 이용하고 있다. 어느 배양 방법에 있어서도, 몇가지 미분화 마커가 양성으로 바뀌고 있는 것이 확인되고 있다. 또한, 구와나(Kuwana) 등(비특허문헌 4)은 피브로넥틴을 도포한 배양 접시를 이용하여 인간 단핵구로부터 다능성 줄기 세포 MOMC를 유도할 수 있는 것을 보고하고 있다.
Nat. Med. 2004 Aug; 10(8): 858-64
Ruhnke M, Fandrich F., Differentiation of in vitro-modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells., Gastroenterology. 128(2005) 1774
Yong Zhao, Eliezer Huberman, A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells, PNAS 100(2003) 2426
Kuwana M. et al., Human circulating CD14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation. J Leukoc Biol. 74(2003) 833
Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G. H.: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem., 226, 497-509(1957)
본 발명은 세포 의약의 분야에 있어서 문제로 되어 온, 표적 부위에 효율적으로 도달할 수 있는 줄기 세포의 제공, 및 그의 단기 대량 제조 방법, 및 해당 세포를 유도하기 위한 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 세포, 조직 또는 기관의 손상에 관련된 질환의 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 탈분화 유도 배지, 탈분화 유도제, 세포 의약용 키트 또는 탈분화 세포 생산 키트 및 줄기 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하는 것으로, 말초혈 단구를 이용하여, 본 발명의 탈분화 유도제의 존재하에 단기간 배양함으로써, 탈분화 세포를 대량으로 유도할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명의 의약 조성물을 직접 생체에 투여함으로써, 손상 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 투여함으로써, 생체 내의 M-CSF와 필시 협동하여 단구를 줄기 세포 등의 세포, 조직 또는 기관의 손상을 수복 가능한 세포로 유도할 수 있고, 그에 의해 세포, 조직 또는 기관의 손상에 관련된 질환의 치료제를 제공할 수 있는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 구체적으로는 이하의 발명을 제공하는 것이다.
항 1. 단구를 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 존재하에서 배양하고 탈분화시킴으로써 얻어지는 줄기 세포.
항 2. 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분이 당 또는 복합 당질인, 항 1에 기재된 줄기 세포.
항 3. 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분의 분자량이 1000 내지 500000인, 항 1에 기재된 줄기 세포.
항 4. 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분이 Con A 칼럼에 흡착되는, 항 1에 기재된 줄기 세포.
항 5. 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분이 음이온 교환 수지에 흡착되는, 항 1에 기재된 줄기 세포.
항 6. 수용성 식물 추출물이 식물 유래 폴츠(Folch) 추출 수상 분획 또는 그의 정제물인, 항 1에 기재된 줄기 세포.
항 7. 단구가 인간 단구인, 항 1에 기재된 줄기 세포.
항 8. 미분화 마커 Nanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4 중 적어도 1종을 발현하고 있고, 단구를 M-CSF 단독 존재하에 배양한 경우에 얻어진 줄기 세포와 비교한 경우, CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현하고 있는 것을 특징으로 하는, 항 1 내지 7 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포.
항 9. 미분화 마커 Nanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4 중 적어도 1종을 발현하며, CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현하고 있는 것을 특징으로 하는 줄기 세포.
항 10. 단구를 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포의 생산 방법.
항 11. 배양 기간이 7일부터 14일간인, 항 6에 기재된 방법.
항 12. (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 단구의 탈분화 유도 배지.
항 13. 항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물.
항 14. 항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포를 유효 성분으로서 함유하는 세포 의약용제.
항 15. (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효 성분으로 하는 탈분화 유도제.
항 16. 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효 성분으로 하는 세포, 조직 또는 기관의 손상에 관련된 질환의 치료제.
항 17. 상기 질환이 외상, 염증성 질환, 뼈ㆍ연골의 손상, 순환기 질환, 신경 질환, 간 질환 및 신장 질환, 당뇨병, 아토피성 피부염, GVHD(이식편대숙주병)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항 16에 기재된 치료제.
항 18. 상기 질환이 외상, 췌염, 방사선 손상, 피부근염, 다발성 근염, 괴사성 근막염, 만성 기관지염, 골절, 골다공증, 골연골 골절, 골연골염, 확장형 심근증, 심근경색, 허혈성 심근증, 심부전, 심근비대, 울혈성 심부전, 재협착, 부정맥, 아테롬성 동맥 경화증, 혈관염, 말초 신경 장애, 신경 장애통, 뇌졸중, 뇌염, 수막염, 당뇨병성 신경 장애, 주의 결함 장해, 자폐증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병, 뇌 또는 척수의 외상 또는 허혈, 간경변, 만성 간염, 만성 신부전, 사구체신염, 신허혈, 당뇨병, 아토피성 피부염, GVHD(이식편대숙주병)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항 16에 기재된 치료제.
항 19. 적어도 항 1 내지 9에 기재된 줄기 세포를 필수 구성 성분으로 하는 세포 의약용 키트.
항 20. (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 필수 구성 성분으로 하는 탈분화 세포 생산 키트.
항 21. 단구를 구성 성분으로서 더 포함하는, 항 20에 기재된 키트.
항 22. 강글리오시드가 GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, GT1b 및 GQ1b로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 항 1 내지 21 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포, 줄기 세포의 생산 방법, 단구의 탈분화 유도 배지, 세포 의약용제, 치료제, 탈분화 유도제, 세포 의약용 키트 또는 탈분화 세포 생산 키트.
본 발명에 의해, 조직 손상 부위에 도달할 수 있는 줄기 세포를 단구를 이용하여 단기간에 대량으로 공급할 수 있다. 또한, 해당 줄기 세포 유도제를 제공할 수도 있어, 세포 의약의 분야에 공헌하는 것을 기대할 수 있다.
또한, 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물, 예를 들면 식물 유래 폴츠 추출 수상 분획 또는 그의 정제물이 세포, 조직 또는 기관의 손상에 관련된 질환의 치료제가 되는 것이 명확하게 되었다.
도 1은 배지 1 내지 배지 5에서 배양함으로써 단구로부터 유도된 줄기 세포의 증식 곡선을 나타내는 도면.
도 2는 RT-PCR에 의한 유전자 발현의 결과를 나타내는 도면.
도 3은 각 강글리오시드 첨가에 의한 줄기 세포에의 탈분화 작용을 나타내는 도면.
도 4는 각 강글리오시드 첨가에서의 세포 형태를 나타내는 도면.
도 5는 각 식물 추출 분획에서의 탈분화 유도 활성을 나타내는 도면.
도 6은 고구마 줄기 추출물 유래 탈분화 유도 성분의 각종 크로마토그래피에 의한 분획의 활성 결과를 나타내는 도면.
도 7은 마우스 간조직에서의 항콜라겐 항체 염색상을 나타내는 도면.
도 2는 RT-PCR에 의한 유전자 발현의 결과를 나타내는 도면.
도 3은 각 강글리오시드 첨가에 의한 줄기 세포에의 탈분화 작용을 나타내는 도면.
도 4는 각 강글리오시드 첨가에서의 세포 형태를 나타내는 도면.
도 5는 각 식물 추출 분획에서의 탈분화 유도 활성을 나타내는 도면.
도 6은 고구마 줄기 추출물 유래 탈분화 유도 성분의 각종 크로마토그래피에 의한 분획의 활성 결과를 나타내는 도면.
도 7은 마우스 간조직에서의 항콜라겐 항체 염색상을 나타내는 도면.
본 발명은 탈분화시키는 세포로서 단구, 예를 들면 말초혈 단구를 이용한다.
본 발명에서 사용하는 단구는 포유 동물 유래의 것이다. 포유 동물로서는 인간, 말, 소, 원숭이, 침팬지, 돼지, 양, 토끼, 마우스, 래트, 개, 고양이 등을 들 수 있고, 바람직하게는 인간, 원숭이, 침팬지 등의 영장류를 들 수 있고, 특히 인간 단구가 바람직하다. 단구는 골수, 혈액 등에 유래하지만, 바람직하게는 혈액, 특히 말초혈 단구를 바람직하게 사용할 수 있다.
혈액 등의 샘플로부터 단구를 분리하는 방법은 공지이며, 예를 들면 혈구 분리 용액 림포프렙(LymphoprepTM: 코스모ㆍ바이오사)를 이용하여 단핵구를 제조하고, CD14의 표면 항원을 인식하는 항체 자기 비드(밀테니ㆍ바이오테크사)에 의해 제조하는 방법, 또는 단핵구 그대로도 본 발명의 단구의 공급원으로서 사용할 수 있다.
또는, 인간 단구는 시판품을 이용하여도 된다. 시판품으로서는, 예를 들면 PT038(론자(LONZA)사) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 단구는 줄기 세포로 탈분화되고, 그것을 증식 후에 인간 등의 피검체에 복귀시키는 것이 상정된다. 이 경우, 환자로부터 단구를 분리하게 되므로, 될 수 있는 한 적은 양의 단구로부터 대량의 줄기 세포를 얻는 것이 필요하게 된다. 본 발명에 따르면, 단구를 탈분화한 줄기 세포의 증식 효율이 높고, 소량의 단구로부터 대량의 줄기 세포를 제조할 수 있기 때문에 바람직하다.
단구로서는 M-CSF 수용체(c-fms)를 갖는 단구계 세포(단구, 단핵구, 단아구)가 포함된다. 단핵구를 이용하여도 단구만이 증식하기 때문에, 단구뿐만 아니라 단핵구도 탈분화의 대상 세포로서 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「줄기 세포」란, 미분화 마커를 발현하여 자기 복제능을 갖는 것이다. 본 발명의 줄기 세포는 단구로부터 대량으로 얻을 수 있다. 또한, 줄기 세포는 분화 유도할 수 있고, 바람직하게는 다능성 분화능을 갖는다. 본 발명에서 얻어지는 줄기 세포는 CD14 및 CD45가 양성이다.
본 발명의 줄기 세포의 특징으로서는 CXCR4 유전자의 유의하게 강한 발현과 Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 및 Oct3/4 중 적어도 1종, 바람직하게는 적어도 2종, 보다 바람직하게는 적어도 3종, 더욱 바람직하게는 적어도 4종, 특히 바람직하게는 Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 및 Oct3/4 유전자 모두가 발현되고 있는 것을 들 수 있다.
바람직한 본 발명의 줄기 세포는, 단구를 M-CSF 단독 존재하에서 배양한 경우에 얻어진 줄기 세포와 비교한 경우에 CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현되고, 또한 Nanog, Nestin, c-Kit, CD9 및 Oct3/4 유전자 중 적어도 1종, 바람직하게는 적어도 2종, 보다 바람직하게는 적어도 3종, 더욱 바람직하게는 적어도 4종, 특히 바람직하게는 5종 모두가 발현된 것이다.
보다 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 줄기 세포의 특징을 이하에 열거한다:
(i) 단구를 M-CSF 단독 존재하에서 배양한 경우에 얻어진 줄기 세포와 비교한 경우, CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현하고 있는 것,
(ii) c-Kit를 발현하고 있는 것, 및
(iii) Nanog, Nestin, CD9 및 Oct3/4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 미분화 마커를 발현하고 있는 것.
본 발명의 단구 유래 줄기 세포와 다른 탈분화 줄기 세포의 차이를 특징짓고 있는 것은, 세포의 호밍 작용에 관련된 CXCR4 유전자의 강한 발현이다. 본 발명의 줄기 세포는, 단구를 M-CSF 단독 존재하에 배양하여 얻어진 줄기 세포와 비교한 경우, CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현하고 있다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 줄기 세포는 RT-PCR로 해석한 경우에, CXCR4 유전자의 발현량은 M-CSF 단독, M-CSF+IL-3, M-CSF+IL-6&LIF 등에 대하여 3배 이상, 특히 4배 이상의 발현량을 갖고 있다. 또한, 본 발명의 하나의 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 줄기 세포는 골수 유래의 간엽계 줄기 세포와 비교하여도 CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현하고, 구체적으로는 RT-PCR로 해석한 경우에, CXCR4 유전자의 발현량은 골수 유래의 간엽계 줄기 세포의 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상이다.
본 발명의 단구 유래 줄기 세포는 다른 탈분화 줄기 세포와 마찬가지로 줄기 세포 마커인 c-Kit를 발현하고 있는 것을 특징으로 한다.
CXCR4 수용체에 관한 리간드 SDF1은, 골절 시의 손상 조직, 순환 계통의 질환, 또는 신경 조직의 손상 부위 등에 발현하고 있는 것이 판명되고 있으며, 세포 의약의 관점에서 본 세포의 손상 부위에의 호밍 효과를 보다 강하게 갖게 하는 측면에서 효과적이다.
본 발명에서 얻어지는 줄기 세포는 환부에 직접 투여/주입함으로써, 질환의 치료에 사용할 수 있다. 환부에 주입하기 전에는 줄기 세포를 적절한 배지에서 배양하여, 수를 늘리고 나서 환부에 직접 투여/주입하는 것이 바람직하다. 줄기 세포의 배양 배지로서는, 일반적인 세포 배양용의 배지를 사용할 수 있지만, 본 발명의 탈분화 유도 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명의 줄기 세포를 이용하여 치료될 수 있다고 생각되는 질환은 외상, 염증성 질환(췌염, 방사선 손상, 피부근염, 다발성 근염, 괴사성 근막염, 만성 기관지염), 뼈ㆍ연골의 손상(예를 들면 골절, 골다공증, 골연골 골절, 골연골염), 순환기 질환(예를 들면 확장형 심근증, 심근경색, 허혈성 심근증, 심부전, 심근비대, 울혈성 심부전, 재협착, 부정맥, 아테롬성 동맥 경화증, 혈관염 등), 신경 질환(예를 들면 말초 신경 장애, 신경 장애통, 뇌졸중, 뇌염, 수막염, 당뇨병성 신경 장애, 주의 결함 장해, 자폐증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병, 뇌 또는 척수의 외상 또는 허혈), 간질환(간경변, 만성 간염), 신질환(만성 신부전, 사구체신염, 신허혈), 당뇨병, 아토피성 피부염, GVHD(이식편대숙주병) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 탈분화 줄기 세포는 2009년 9월 30일에 일본국 305-8566 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쥬오 제6 독립 행정 법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁하였다. 수령 번호 FERM ABP-11184.
상기한 바와 같이 단구는, (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 존재하에서 배양함으로써 줄기 세포로 유도할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 수용성 식물 추출물이란, 식물의 전초(全草) 또는 그 일부(예를 들면 잎, 줄기, 지하경, 근경, 괴경, 덩굴, 뿌리, 꽃, 꽃봉오리, 꽃잎, 자방, 과실, 콩깍지, 삭과, 종자, 섬유, 배주)의 추출물을 의미한다. 추출 용매는 물 또는 함수 용매(예를 들면 함수 메탄올, 함수 에탄올, 함수 프로판올 등의 함수 알코올, 함수 THF, 함수 아세톤), DMF, DMSO, 디메틸아세트아미드 등의 극성 용매를 들 수 있고, 이들 물, 함수 용매 또는 극성 물질의 용해도가 큰 극성 용매에 의해 추출되는 물질을 의미한다. 수용성 식물 추출물은 클로로포름, 염화메틸렌 등의 염소화 탄화수소, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소, 아세트산 에틸 등의 에스테르, THF, 디에틸에테르 등의 에테르, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤, 헥산, 시클로헥산 등의 지방족 또는 지환식 탄화수소 등에 의해 식물을 추출하고, 그 후 물 또는 함수 용매에 의해 목적으로 하는 수용성 물질을 추출하여도 된다. 물 또는 함수 용매, 극성 용매 등의 추출물은, 필요에 따라 클로로포름, 염화메틸렌 등의 염소화 탄화수소, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소, 아세트산 에틸 등의 에스테르, THF, 디에틸에테르 등의 에테르, 헥산, 시클로헥산 등의 지방족 또는 지환식 탄화수소에 의해 지용성 성분을 세정 제거하여도 된다. 바람직한 수용성 식물 추출물은 식물 유래 폴츠 추출 수상 분획 또는 그의 정제물이다.
폴츠 추출은 식물을 클로로포름:메탄올=2:1로 추출하고, 이 혼합 용매를 물로 세정하여 수상으로 이행한 분획을 의미한다. 클로로포름은 염화메틸렌, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 등의 다른 염소화 탄화수소를 이용하여도 되고, 메탄올 대신에 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올을 사용하여도 된다. 또한, 염소화 탄화수소와 알코올의 비도 상기 2:1에 한정되지 않고, 넓은 범위가 예시된다. 여기서, 염소화 탄화수소와 알코올의 혼합 용매는 물질의 용해능이 높아 추출을 효율적으로 행할 수 있다. 염소화 탄화수소와 알코올의 비율은, 여기에 물을 첨가한 경우에 수상과 유기상으로 분리되어, 수상에 활성 물질을 추출할 수 있는 비율이 바람직하다. 물을 첨가하여 2상으로 분리되지 않는 경우에는 유기 용매를 첨가하여 2층 분리시키면 된다. 물을 첨가하여 2층 분리된 수상을 본 명세서에서는 「식물 유래 폴츠 추출 수상 분획」이라고 한다. 또한,「식물 유래 폴츠 추출 수상 분획」은 이것과 마찬가지의 활성 물질을 갖는 한, 다른 방법으로 추출한 수상 분획을 포함한다.
본 발명의 수용성 식물 추출물은 당지질 모양 물질(당지질과 당 중 한쪽 또는 양쪽을 포함함)을 유효 성분으로서 포함한다. 이 당지질 모양 물질은 유기 용매에 대한 용해도가 낮기 때문에, 수용성 식물 추출물은 수상 분획으로서 바람직하게 단리된다. 수용성 식물 추출물은, 또한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 이용하여 더욱 정제할 수 있고, 이러한 정제물을 유효 성분으로서 사용하여도 된다.
수용성 식물 추출물의 유효 성분은 당만으로 구성되어도 되고, 당과 그 이외의 성분(지질 등)의 양쪽을 포함하여도 된다. 당의 구성 성분으로서는 글루코오스, 아라비노오스, 자일로오스, 리보오스, 람노오스, 푸코오스, 데옥시리보오스, 만노오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 말토오스, 락토오스, 셀로비오스, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 멜리비오스, 말토트리오스, 멜레지토오스, 투라노오스, 글루쿠론산, 갈락투론산, 만누론산, 이두론산, 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸만노사민, 뉴라민산, N-아세틸뉴라민산 등을 들 수 있고, 이들은 황산화되어 있어도 된다. 이것들은 올리고당 또는 다당, 배당체, 당지질로 되어 있는 것이 바람직하다. 다당으로서는, 구체적으로는 글루코사미노글리칸, α-글루칸, β-글루칸, 레반, 프룩탄, 갈락탄, 만난, 키실란, 아라비난, 펙틴산, 알긴산, 펙틴질, 구아란(guaran), 황산화다당, 1종 또는 2종 이상의 당 잔기가 결합한 다당, 또는 상기의 당 잔기의 1종 또는 2종 이상을 반복 단위로 하는 다당, 복수의 당 잔기가 복잡하게 결합된 다당을 들 수 있다. 수용성 식물 추출물은 추출 후에 양이온 교환 수지로 처리하는 것이 바람직하다. 하나의 실시 형태에서, 본 발명의 수용성 식물 추출물은, 바람직하게는 음이온 교환 수지에 의해 흡착되는(수중에서 음이온기를 갖는) 성분이 유효 성분으로서 포함된다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 수용성 식물 추출물은, 바람직하게는 Con A 아가로오스에 결합하는 성분이 유효 성분으로서 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에 있어서, 수용성 식물 추출물은 음이온 교환 수지에 의해 흡착되고, 또한 Con A 아가로오스에 결합하는 성분이 유효 성분으로서 포함된다. Con A 아가로오스에 결합하는 유효 성분은 글루코오스 잔기 및/또는 만노오스 잔기, 특히 만노오스 잔기를 포함하는 다당 또는 당질(당지질 등의 복합 당질을 포함함)이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서는, 수용성 식물 추출물은 당 잔기를 포함하고 냉수 또는 열수에 가용성(추출 가능)인 성분을 포함하고, 분자량은 하한이 500, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000 정도이고, 상한은 500000, 300000, 200000, 100000, 80000, 60000, 50000, 40000, 30000 또는 20000 정도의 다당 또는 복합 다당을 포함하는 것이 바람직하게 예시된다.
강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 존재하에서 배양함으로써 줄기 세포로 유도할 수 있다.
생체 내(예를 들면 인간)에서는 M-CSF가 이미 존재하고 있기 때문에, 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종은 단구로부터 줄기 세포로의 유도제로서 기능할 수 있고, 이 줄기 세포가 질환 부위에 도달함으로써 각종 질환의 치료제로서 기능한다. 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효 성분으로 하는 치료제는 외상, 염증성 질환(췌염, 방사선 손상, 피부근염, 다발성 근염, 괴사성 근막염, 만성 기관지염), 뼈ㆍ연골의 손상(예를 들면 골절, 골다공증, 골연골 골절, 골연골염), 순환기 질환(예를 들면 확장형 심근증, 심근경색, 허혈성 심근증, 심부전, 심근비대, 울혈성 심부전, 재협착, 부정맥, 아테롬성 동맥 경화증, 혈관염 등), 신경 질환(예를 들면 말초 신경 장애, 신경 장애통, 뇌졸중, 뇌염, 수막염, 당뇨병성 신경 장애, 주의 결함 장해, 자폐증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병, 뇌 또는 척수의 외상 또는 허혈), 간질환(간경변, 만성 간염), 신질환(만성 신부전, 사구체신염, 신허혈), 당뇨병, 아토피성 피부염, GVHD(이식편대숙주병)의 치료에 유용하다.
강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효 성분으로 하는 치료제의 유효량은, 그 용법, 환자의 연령, 성별 그 밖의 조건, 질환의 정도 등에 따라 적절하게 선택되지만, 통상 유효 성분의 양이 인간 성인의 체중 1kg당 0.0001 내지 100mg 정도, 바람직하게는 0.001 내지 10mg 정도, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5mg 정도이다. 상기 치료제는 1일에 1 내지 4회에 나누어 투여할 수 있다.
식물 유래 폴츠 추출 수상 분획은, 동일한 방법으로 추출한 식물 추출물을 널리 포함한다. 또한, 식물 유래 폴츠 추출 수상 분획을 포함하는 수용성 식물 추출물의 유효 성분은 음이온 교환 수지, Con A 아가로오스에 결합하는 성질을 갖고, 양이온 교환 수지를 통과시킴으로써 활성이 상승할 수 있다.
본 발명의 치료제 내지 의약 조성물은, 이것을 의약 제제로서 실용하는 경우, 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종과 필요에 따라 M-CSF를 포함하는 유효 성분과 함께 제제 담체를 이용하여 일반적인 제형(dosage form)으로 할 수 있다. 상기 제제 담체로서는 제형에 따라, 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 부습제, 붕괴제, 표면 활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 예시할 수 있고, 이것들은 얻어지는 제형의 투여 단위 형태에 따라 적절하게 선택 사용된다.
본 발명의 제형으로서는 각종 형태(form)를 치료 목적에 따라 선택할 수 있고, 그 대표적인 것으로서는 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 좌제, 주사제(액제, 현탁제 등), 연고제 등을 들 수 있으며, 이것들은 어느 것도 통상법에 따라 상기 적당한 담체를 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 정제는 필요에 따라 통상의 제피를 실시한 정제, 예를 들면 당의정, 젤라틴 코팅정, 장용피정, 필름 코팅정 또는 이중정, 다층정으로 할 수도 있다. 본 발명의 약제가 액제, 유제, 현탁제 등의 주사제로서 조정되는 경우, 이것들은 살균되고 또한 혈액과 등장인 것이 바람직하고, 등장성의 용액을 조정하는 데 충분한 양의 식염, 포도당 또는 글리세린을 본 발명의 의약 조성물 중에 함유시켜도 되며, 또한 통상의 용해 보조제, 완충제, 무통화제 등을 첨가하여도 된다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에는, 필요에 따라 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등이나 다른 의약품을 함유시킬 수도 있다. 또한, 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종과 M-CSF를 양쪽 모두 투여하는 경우에는, 이것들은 동시에 투여하여도 되고, 별개로 투여하여도 된다.
강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종은 식품 형태, 예를 들면 드링크류나 블록(서플리먼트 블록) 등의 형태로 섭취되어도 된다. 이러한 식품 조성물은 통상법에 따라 제조할 수 있고, 그 제조에는 일반적으로 잘 알려져 있는 다른 식품 소재(원료 성분), 부형제, 희석제 등을 적절하게 이용할 수 있다.
탈분화 줄기 세포는 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 공존하에 상술한 원료 세포를 일정 기간 배양함으로써 탈분화 유도하여 얻을 수 있다.
M-CSF는 분자량 약 22000의 막 결합형, 분자량 약 42000의 분비형이 있으며, 이것들은 디술피드 결합에 의해 분자량 약 45000(22000의 2량체), 약 85000(42000의 2량체), 85kDa형에 프로테오글리칸이 더 결합된 고분자량형이 있으며, 이들 중 어느 것을 사용하여도 된다. 바람직하게는 분자량 약 42000의 분비형, 분자량 약 85000(42000의 2량체), 85kDa형에 프로테오글리칸이 더 결합한 고분자량형을 사용할 수 있다. 또한, M-CSF의 유래는 포유 동물(인간, 말, 소, 원숭이, 침팬지, 돼지, 양, 토끼, 마우스, 래트, 개, 고양이)을 들 수 있고, 바람직하게는 인간, 원숭이, 침팬지 등의 영장류를 들 수 있고, 특히 인간이 바람직하다. M-CSF는 천연물을 정제하여 사용하여도 되지만, 유전자 재조합적으로 제조한 것이 바람직하게 이용된다. 예를 들면 M-CSF는 적어도 N말단부터 153번째 부근까지의 아미노산이 있으면, 천연형과 동일 정도의 비활성을 갖는 것이 판명되어 있으며, 이러한 당쇄를 갖지 않는 대장균 발현의 재조합체 등을 예시할 수 있다.
강글리오시드의 종류로서는 GM1, GD1a, GT1b 등 이하에 기재한 것이면 특별히 제한은 없다. 또한 이들의 혼합물이어도 되며, 이들 혼합물을 사용하여도 문제는 없다. 또한, 식물 유래 추출 성분(식물 유래 당지질 모양 물질)에서도 강하게 탈분화를 유도시킬 수 있다. 또한, 동물 조직 유래 추출물(동물 유래 당지질 모양 물질)을 사용하여도 된다. 상기 추출물은 당지질 모양 물질을 추출하기 위한 일반적인 조건하에서 제조할 수 있다. 본 발명의 의약의 유효 성분은 강글리오시드 또는 수용성 식물 추출물이며, 이것들이 포함되어 있는 성분이면 식물 추출물, 동물 조직 추출물 중 어느 것도 사용할 수 있다. 예를 들면 강글리오시드는 동물의 뇌ㆍ신경 조직에 풍부하게 포함되며, 동물의 뇌ㆍ신경 조직 유래의 추출물을 강글리오시드로서 사용할 수 있다. 추출물의 강글리오시드는 정제한 것이어도 되며, 강글리오시드를 포함하는 당지질 성분이 포함되는 여러가지 정제도의 분획을 사용할 수 있다. 추출 성분으로서는 일반적으로 당지질 모양 물질이 추출되어 오는 조건에서 얻어지는 분획을 사용하면 된다. 천연 추출 분획으로서는, 예를 들면 폴츠 추출법(비특허문헌 5)에 의한 수상 분획을 들 수 있다. 동물로서는 포유 동물(소, 돼지, 토끼, 양, 말 등)이 바람직하게 예시되고, 돼지의 뇌ㆍ신경 조직 유래의 강글리오시드가 특히 바람직하다. 또한, 우유와 같은 포유 동물의 밀크 유래의 강글리오시드를 사용할 수도 있다.
강글리오시드 또는 당지질 모양 물질의 재료(material)가 되는 수용성 식물 추출물로서는, 적합하게는 고구마(sweet potato), 백고구마(Ipomea Batatas sp), 나팔꽃(morning-glory), 공심채(swamp morning-glory), 미국나팔꽃(Ivy-leaved morning glory), 야쯔데아사가오(finger leaf morning glory), 유홍초(cardinal climber), 파란별 나팔꽃(blue morning glory), 류큐나팔꽃(Ipomoea congesta) 등의 메꽃과, 연꽃(Nelumbo nucifera)(연근(lotus root)), 미국황련(Nelumbo lutea) 등의 연꽃과, 미국까마중(Solanum americanum), 토마토(Solanum lycopersicum), 노랑혹가지(Solanum mammosum), 가지(Solanum melongena), 까마중(Solanum nigrum), 감자(Solanum tuberosum), 고추(Capsicum annuum), 기다찌토우가라시(Capsicum frutescens), 흰독말풀(Datura metel), 털독말풀(Datura meteloides), 독말풀(Datura stramonium), 엔젤 트럼펫(Brugmansia arborea), 엔젤 트럼펫(Brugmansia suaveolens), 꽈리(Physalis alkekengi var.franchetii), 갯기름나물(P. japonicum), 페튜니아(Petunia x hybrida) 등의 가지과의 식물의 추출물을 들 수 있다. 상기한 식물은 단순한 예시이며, 강글리오시드 또는 당 또는 당지질을 갖는 수용성 식물 추출물을 널리 사용할 수 있다. 식물은 잎, 줄기, 지하경, 근경, 괴경, 덩굴, 뿌리, 꽃, 꽃봉오리, 꽃잎, 자방, 과실, 콩깍지, 삭과, 종자, 섬유, 배주, 전초 등을 들 수 있고, 이들 중 어느 것을 추출하여도 된다.
예를 들면, 고구마, 감자 등의 고구마류는 반드시 알줄기의 부분일 필요는 없고, 잎, 줄기, 지하경, 근경, 괴경, 덩굴, 뿌리, 꽃, 꽃봉오리, 꽃잎, 자방, 과실, 콩깍지, 삭과, 종자, 섬유, 배주, 전초 등의 어느 것이어도 된다.
식물로서, 예를 들면 강글리오시드 또는 당지질 모양 물질을 많이 제조할 수 있도록 필요한 유전자를 도입 및/또는 필요하지 않은 유전자를 녹 아웃한 유전자 재조합 식물을 사용할 수도 있다.
강글리오시드는 시알산을 갖는 스핀고당지질의 총칭이며, 종류로서는 GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, GT1b 및 GQ1b 등이 있다. 또한, 각 강글리오시드는 이하의 구조를 갖는 것이다.
aNeu5Ac=5-아세틸-α-뉴라민산(5-acetyl-α-neuraminic acid)
aNeu5Ac9Ac=5,9-디아세틸-α-뉴라민산(5,9-diacetyl-α-neuraminic acid)
bDGalp=β-D-갈락토피라노오스(β-D-galactopyranose) 7
bDGalpNAc=N-아세틸-β-D-갈락토피라노오스(N-acetyl-β-D-galactopyranose)
bDGlcp=β-D-글루코피라노오스(β-D-glucopyranose)
0Cer=세라마이드(general N-acylated sphingoid)
사용 배지는 포유 동물 세포용 배지이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 RPMI1640, DMEM, 이글 MEM, αMEM, IMEM, M199의 각 배지에 혈청 성분, 예를 들면 FBS, FCS, CS, HS 등을 1 내지 20% 정도 첨가함으로써 배양하는 것이 가능하다. 바람직한 사례로서는 10% 전후의 FBS를 포함하는 DMEM 배지 중에서의 배양을 예시할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한 무혈청 배지를 사용하는 것도 가능하다. 무혈청 배지의 예로서는 포유 동물 배양용으로서 울트라컬쳐(UltraCULTURETM)를 예시할 수 있지만, 특별히 제한은 없다.
배양 조건으로서는 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 배지 중에서, 적합하게는 5% CO2 존재하, 37℃에서 7일 내지 14일 정도 단구를 배양함으로써 탈분화 줄기 세포를 얻을 수 있다. 즉, 이 배양 기간에 탈분화가 진행되어, 상기 본 발명에서 특정한 미분화 마커를 발현한 줄기 세포를 얻을 수 있다. 또한, 이 배양 기간에 본 발명의 줄기 세포를 특징짓는 CXCR4 유전자의 발현이 현저하게 상승하는데, 이 후 배양 기간을 연장한 경우에도 CXCR4 유전자가 고도로 발현되고 있으면, 본 발명의 줄기 세포에 해당한다.
또한, 이러한 조건에서 원료 세포를 배양한 경우, 최종적으로 얻어지는 줄기 세포수는 M-CSF 단독 또는 다른 사이토카인과의 조합에 의해 배양한 경우에 비하여 약 5배의 줄기 세포를 얻을 수 있다.
또한, 탈분화 유도제로서 M-CSF와 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이 공유 결합 또는 비공유 결합적으로 결합한 복합체를 사용할 수도 있다.
단구를 M-CSF 단독으로 배양한 경우에도 탈분화 줄기 세포가 얻어진다고 하는 보고가 있지만, 본 발명은 (i) M-CSF와 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 조합함으로써, 특히 CXCR4 유전자를 강하게 발현한 줄기 세포를 얻을 수 있다. 배양 조건으로서는 M-CSF를 5 내지 100ng/ml의 농도로 사용할 수 있고, 적합하게는 25ng/ml로 배양하는 것이 바람직하다. 강글리오시드는 식물, 동물 등에 유래하는 추출물 등의 혼합물을 이용하여도 되고, 천연의 강글리오시드 함유 재료를 정제하여 이용하여도 되고, 화학 합성하여 이용하여도 된다.
강글리오시드는 최종 농도 1 내지 100㎍/ml 정도로 배지에 사용된다. 수용성 식물 추출물은 최종 농도 0.1 내지 100㎍/ml 정도로 배지에 사용된다.
강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 양으로서는 최종 농도 1 내지 100㎍/ml 정도로 배양할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 「강글리오시드」는 GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, GT1b, GQ1b 등의 강글리오시드 단품과, 이들 혼합물의 양쪽의 의미에 이용된다. 강글리오시드의 양은, 그 중의 강글리오시드량을 의미하며, 강글리오시드가 복수 있는 경우에는 그 총량을 의미한다.
키트
본 발명은, 또한 본 발명의 줄기 세포를 필수 구성 성분으로 하는 세포 의약용 키트, (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 수용성 식물 추출물을 필수 구성 성분으로 하는 탈분화 세포 생산 키트를 제공한다.
세포 의약용 키트는 본 발명의 단구 유래의 줄기 세포를 필수 구성 성분으로서 포함하고, 필요에 따라 (i) M-CSF와 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 배지, 배양 용기 등이 더 포함되어도 된다. 또는, 단구 유래의 줄기 세포를 주사기에 충전한 형태이어도 된다.
세포 의약용 키트에 포함되는 단구 유래의 줄기 세포의 수는 1개의 키트당, 예를 들면 1×104 내지 1×107개 정도이다.
본 발명의 탈분화 세포 생산 키트는 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 필수 구성 성분으로 하고, 또한 필요에 따라 세포 배양 배지, 배양 용기, 단구 등을 포함하여도 된다.
<산업상 이용가능성>
ㆍ본 세포의 적용 분야
줄기 세포를 적응시킬 수 있는 분야 전반에 관하여 사용하는 것이 가능하다. 특히, 최근 화제가 되고 있는 세포 의약의 분야에서의 사용을 생각할 수 있고, 이러한 분야에서의 사용의 경우에 있어서는, 단기간에 사용 세포를 제작하여 제공할 필요가 있다. 나아가, 거절 반응의 문제를 고려하면, 자기 세포를 사용하여 탈분화 줄기 세포를 제조한 후 생체로 복귀시키는 수법이 가장 안전면에서 중요하다. 자기 세포를 섭취한 후 단기간에 어느 정도 통합된 줄기 세포를 생산할 수 있는 것이 중요하게 된다. 본 발명은 이러한 관점에서도 중요하다.
본 발명의 구체적 사용 양태 중 하나로서는 탈분화 세포의 정맥 내 투여를 행하면 된다.
세포의 투여 형태에 대하여 목적 세포를 배양에 의해 얻은 후, 사용 세포를 적절하게 통상법에 따라 파종할 수 있다. 예를 들면, 트립신 처리 후 세포를 회수하고 원심 분리에 의해 세포를 회수한 후 적당한 등장액에 분산시킨 후, 예를 들면 정맥 내 투여하는 것도 가능하다. 또한, 그때 적당한 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 첨가함으로써, 세포를 안정화할 수 있는 것이면 사용하는 것도 가능하다.
또한, 배양에 의해 얻어진 세포는 배양액 중에서 회수한 후, 적당한 투여 시기에 시간차가 있는 경우에는, 통상법에 따라 액체 질소 존재하 또는 -80℃에 있어서 보존해 두는 것도 가능하다. 적합하게는 단구를 탈분화 배양 개시후 7일 내지 14일간에 세포를 회수하여 즉시 목적하는 치료에 이용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, CXCR4 유전자의 발현 레벨이 이 기간 최대한에 도달할 가능성이 높기 때문이다. 그 의미에 있어서, 해당 유전자 마커의 발현 레벨을 감안하여, 배양 기간에 한정되지 않고 해당 줄기 세포의 사용 기간을 결정할 수도 있다.
ㆍ치료제/의약 조성물의 적용 분야
본 발명은 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종과 필요에 따른 M-CSF를 인간 등의 포유 동물에 투여함으로써, 외상, 염증성 질환, 뼈ㆍ연골의 손상, 순환기 질환, 신경 질환, 간질환 및 신질환, 당뇨병, 아토피성 피부염, GVHD(이식편대숙주병) 등의 질환을 치료할 수 있다. 이것은 투여되는 피검체의 단구, 필요에 따라 또한 M-CSF가 강글리오시드 및 식물 유래 폴츠 추출 수상 분획으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 작용에 의해, 상기 질환을 수복 가능한 줄기 세포로 변화시키고, 이것이 질환 부위에 이동하여 치료제로서 작용한다. 또는 강글리오시드 및 식물 유래 폴츠 추출 수상 분획으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이, 단구 이외의 세포에 직접 또는 간접적으로 작용하는 것도 부정하지 않는다.
ㆍ키트로서의 사용에 관하여
본 탈분화 유도제에 있어서 제작된 탈분화 줄기 세포는 적당한 보존 처리가 실시된 후에 키트로서 사용할 수 있다.
또한, 동시에 탈분화 유도제에 관해서도 필수 구성 성분으로서 포함하는 키트로서 키트화할 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되지 않는 것은 물론이다.
실시예 1
인간 단구(론자사, PT038)를 본 발명에 따라 이하의 첨가물 1 내지 5를 기초 배지에 첨가하여 배양을 행하였다(농도는 최종 농도(이하 「FC」로 나타냄)로서 나타냄). 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1의 종축은 생세포수에 상당하고, 횡축은 배양 일수이다. 판드리히(Fandrich)나 후베르만(Huberman) 등에 의해 보고된 방법과 비교해 보아도, 본 발명의 단구 유래 줄기 세포의 증식성은 매우 높은 것을 알 수 있다.
첨가물 1: M-CSF(FC: 25ng/ml)+강글리오시드(보바인 브레인(Bovine Brain) GD1a; 시그마(SIGMA))(FC: 100㎍/ml)
첨가물 2: M-CSF(FC: 5ng/ml)+IL-3(FC: 0.5ng/ml)(비특허문헌 2)
첨가물 3: M-CSF(FC: 25ng/ml)+IL-6(FC: 20ng/ml)&LIF(FC: 1000unit/ml)(비특허문헌 3)
첨가물 4: M-CSF(FC: 25ng/ml)
첨가물 5: M-CSF(FC: 25ng/ml)+당지질(식물(고구마)의 건조 중량 1g의 폴츠 추출 수상 분획을 배지 500ml에 용해한 것)
또한, 첨가물 5에서 이용한 폴츠 추출 수상 분획은 동결 건조한 세포(고구마 식물 조직)를 적량의 생리 식염수에 의해 잘 균질화한 후에, 등용량의 클로로포름ㆍ메탄올 2:1 용액과 세차게 혼합하여 원심 분리에 의해 유기 용매상, 변성 단백질상, 수상으로 분리한 후, 상층의 수용성 분획에 추출될 수 있는 성분을 이용하였다.
첨가물은 모두 DMEM(20% 소태아혈청)에 첨가하여, 인간 단구를 1.5×105/ml(200㎕/웰(well), 96웰 플레이트)로 하여 배양을 개시하였다. 생세포의 카운트는 프로메가(Promega)사의 셀타이터-글로(CellTiter-GloTM) 발광 세포 생존력 어세이를 이용하여 정량화하였다. 즉, 각 배양일마다 접착되어 있지 않은 세포를 생리 식염수로 웰을 3회 세정하여 제거한 후에 접착ㆍ증식한 세포를 정량화하였다.
한편, 본 발명 및 종래 기술에 의한 배양 방법에 의해 얻어지는 줄기 세포의 유전자 발현을 RT-PCR로 해석을 행하였다. 인간 단구는 상기 조건에서 1.5×105/ml(6ml/디쉬(Dish), 직경 6cm)로 배양을 개시하여, 14일째에 mRNA를 회수하고(인비트로겐(Invitrogen)사: 마이크로 패스트 트랙(Micro Fast Track) 2.0 키트), 계속해서 RT-PCR에 의한 발현량 해석을 행하였다. 항목 및 프라이머의 서열 정보는 하기와 같다.
Nanog F 5'-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3'(서열 번호 1)
R 5'-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3'(서열 번호 2)
Nestin F 5'-CTCTGACCTGTCAGAAGAAT-3'(서열 번호 3)
R 5'-GACGCTGACACTTACAGAAT-3'(서열 번호 4)
Oct3/4 F 5'-GAGCAAAACCCGGAGGAGT-3'(서열 번호 5)
R 5'-TTCTCTTTCGGGCCTGCAC-3'(서열 번호 6)
c-Kit F 5'-CCAAGTCATTGTTGGATAAG-3'(서열 번호 7)
R 5'-CTTAGATGAGTTTTCTTTCAC-3'(서열 번호 8)
CXCR4 F 5'-ATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATC-3'(서열 번호 9)
R 5'-ATCCAGACGCCAACATAGACCACCTTTTCA-3'(서열 번호 10)
레인 구성(농도는 최종 농도(이하 「FC」로 나타냄)로서 나타냄)
1: M-CSF(FC: 25ng/ml)+강글리오시드(보바인 브레인 GD1a; 시그마)(FC: 100㎍/ml)
2: M-CSF(FC: 5ng/ml)+IL-3(FC: 0.5ng/ml)(비특허문헌 2)
3: M-CSF(FC: 25ng/ml)+IL-6(FC: 20ng/ml)+LIF(FC: 1000unit/ml)(비특허문헌 3)
4: M-CSF(FC: 25ng/ml)
5: M-CSF(FC: 25ng/ml)+식물 유래 폴츠 추출 수상 분획
6: 배양 없음
7: 배양 없음
1-6: 인간 단구, 7: 인간 골수(클론테크(Clontech)사 휴먼 본 매로우 마라톤-레디(Human Bone Marrow Marathon-Ready) cDNA)
결과를 도 2에 나타낸다. 도 2의 결과로부터 본 발명(레인 1 또는 레인 5)에 의해 얻어진 줄기 세포는 CXCR4의 발현량이 매우 높은 것이 실증되었다.
이어서, 여러가지 강글리오시드에 의한 줄기 세포 유도 활성의 비교를 행하였다.
즉, 강글리오시드를 최종 농도 100㎍/ml가 되도록 배지에 첨가하여 말초혈 단구를 배양하였다.
rhM-CSF는 최종 농도 25ng/ml가 되도록 첨가하였다. 그 결과, 배양 2주일째의 생세포의 수를 셀타이터 글로(프로메가사)에 의해 루시페라아제 활성으로서 정량화하였다. 즉, GM1, GD1a, GT1b 및 이들의 혼합물(Mix)을 이용하여 배양을 행하였지만, 어느 것도 동일한 정도로 강한 줄기 세포 유도 활성을 나타내었다(도 3). 또한, 세포의 형태에도 차는 확인되지 않았다(사진은 배양 2주일째)(도 4).
도 3의 레인 구성은 이하와 같다(농도는 최종 농도(이하 「FC」로 나타냄)로서 나타냄).
1: GM1(FC: 25ng/ml)
2: GD1a(FC: 25ng/ml)
3: GT1b(FC: 25ng/ml)
4: GM1, GD1a, GT1b의 등량 혼합물(Mix)(합계의 FC: 25ng/ml),
5: M-CSF만
6: 혈청만
여러가지 식물 유래 추출물에 의한 줄기 세포 유도 활성
연근, 류큐나팔꽃의 줄기로부터의 추출은, 모두 상술한 고구마의 줄기와 동일 조건에서 추출하였다. 또한, 활성의 비교는 추출에 이용한 건조 중량을 바탕으로 표준화하였다.
비활성은 세포 증식 활성을 고구마 줄기 추출물을 100으로 한 값이다.
도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 연근, 류큐나팔꽃의 줄기로부터도 마찬가지의 줄기 세포 유도 활성을 확인하였다.
본 유효 성분의 하나의 특징은, 폴츠의 추출 방법에 의한 수상에 주로 추출되는 것이다. 수용성 식물 추출물은 몇가지 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획, 분리 또는 정제 가능하다. 즉, 수용성 식물 추출물의 유효 성분은 음이온 교환 수지(Q-세파로오스, DEAE-세파로오스 등), 렉틴 결합 수지(Con A 등)에 광범위한 pH 영역에서 결합하는 것을 특징으로 한다.
도 6은 유효 성분과 결합능을 갖는 수지에 추출액을 적용하여 통과 분획의 활성을 평가한 결과이다. 즉, 음이온 교환 수지, Con A 아가로오스에 유효 성분이 결합함으로써, 통과 분획에 활성이 소실되는 것을 알 수 있었다. 양이온 교환 수지에 의해 저해 인자가 제거된 것이 시사되고, 활성은 상승되어 있다.
고구마 줄기 추출물의 활성을 100으로서 산출하였다. 양이온 교환 수지의 통과 분획에서 활성이 상승하고 있는 것은 저해 물질이 제거된 것으로 시사된다. 음이온 교환 수지, 렉틴의 Con A 수지의 통과 분획에서는 활성이 소실되어 있고, 활성 인자가 유지된 것을 나타낼 수 있다.
실시예 2
줄기 세포 투여 동물 모델에 의한 치유 효과(간경변 모델 마우스를 이용한 치료 시험예)
사염화탄소(1ml/kg 체중) 주2회 투여를 12주간 연속하여 실험용 마우스에게 인위적으로 간경변을 야기시킨다. 이 간경변 모델 마우스에게 본 발명의 인간 단구 유래 탈분화 줄기 세포(hMDDSC)를 꼬리 정맥으로부터 2회 투여하고(1투여 후 1주일째에 2회째, 1개체당 1×105 세포), 2회째의 투여 후 1주일 후(최초 투여로부터 2주일째)에 간장을 채취하여 조직 세그먼트에 의한 병리 해석과 생화학적 분석을 행하였다. 사염화탄소에 의해 유도된 간염에서는 바이러스성 간염과 마찬가지로 염증부에서 SDF1(스트로마 세포 유래 인자-1)이 고발현하는 것이 보고되어 있고(Jung et al., 2006), 본 발명의 hMDDSC는 SDF1의 수용체인 CXCR4를 고발현하고 있기 때문에, 이들 결합을 통하여 hMDDSC가 염증부에 집적하여 조직 주위에 치유 효과를 미치는 것이 기대된다(Kollet et al., 2003; Nervi et al., 2006).
혈중 마커로 검출할 수 있는 간 기능에 대하여, GOT/GPT값에 대해서는 사염화탄소 투여 종료 후 신속하게 저하하여 정상값으로 되돌아가기 때문에, 2주간의 치료 처치 후에는 이미 거의 정상치를 나타내어 시험군 사이에서 계측값의 큰 차이는 확인되지 않았다. 그러나 하기에 나타낸 바와 같이 이 12주간의 약물 처리에 의해 간조직 중에서는 강도의 섬유화가 일어나 간경변 상태로 되어 있다. 그 간 중에 발달한 섬유상 조직의 저하와 제거에 본 발명의 hMDDSC는 극적인 효과를 나타내었다.
1. 병리 조직 해석
채취 고정된 마우스 간장으로부터 파라핀 세그먼트를 제작하고, 항콜라겐 I항체에 의해 섬유 구조의 주성분인 콜라겐 섬유를 검출하였다(도 7, 다갈색). 동시에 세포핵을 청색으로 염색하였다(헤마토크실렌 염색).
상단은 간경변 유도 후 hMDDSC 투여를 행하지 않고 생리 식염수를 투여한 대조 실험, 하단은 hMDDSC를 2회 정맥 투여한 것의 각 3가지 예를 나타내었다. hMDDSC 투여에 의해 항콜라겐 항체에 의해 검출되는 굵은 섬유 다발(상단 화살표)이 현저하게 소실되어 있다.
또한 동일한 간장 세그먼트에서 아잔/말로리(Azan/Mallory) 염색을 행하고, 화상 해석 현미경(키엔스(Keyence) BZ9000)에 의해 청색으로 염색되는 섬유 조직 부분의 면적 계산을 행하였다(표 1).
사염화탄소 처리를 하지 않은 정상 대조군(Normal)에 비하면 5배 이상의 수치를 보이고 있지만, hMDDSC 투여군에서는 생리 식염수 투여군(Saline)보다도 23%나 섬유 조직량이 감소되어 있다.
2. 생화학적 해석
A) III형 프로콜라겐 펩티드
마찬가지로 마우스 모델에 의한 간경변 치료 실험에서 혈중의 III형 프로콜라겐 펩티드의 혈중 농도를 측정하였다. III형 프로콜라겐 펩티드(Pro-collagen type III peptide(PIIIP))는 콜라겐 전구체에 존재하는 말단 펩티드이고, 콜라겐 생산 시에 소화되어 펩티드로서 혈중, 조직 중에 유리되기 때문에 콜라겐의 생산량을 반영한 마커로서 이용되고 있다(Giannini et al., 2001). 2주일간의 치료 시험 직후의 마우스 꼬리 부분으로부터 혈액을 채취하고, 혈장 중의 PIIIP를 ELISA법(쿠사바이오(CUSABIO) CSB-E08095)에 의해 측정하였다(표 2).
간경변 유도 후에 생리 식염수 투여의 대조군(Saline)이 정상 대조군(Normal) 마우스의 약 5배의 높은 값을 보이고 있는 데에 대하여, hMDDSC 투여에 의해 혈중 프로콜라겐량은 극적인 감소를 나타내어, 건강 마우스에 가까운 수치를 나타내었다. 생리 식염수 투여군이 높은 값을 나타내기 때문에, 사염화탄소 자극에 의한 간경변 유발의 정지 후에도 당분간은 콜라겐의 분자의 이상한 고생산이 계속되고 있는 것을 엿볼 수 있다. 그러나, hMDDSC 투여에 의해 이 이상한 콜라겐 고생산이 빠르게 억제되어, 정상 레벨 근처까지 떨어진 것을 알 수 있다.
B) 히드록시프롤린
간조직 내부의 총 섬유량을 조직으로부터 직접적으로 정량할 목적에서, 콜라겐의 구성 분자인 히드록시프롤린의 간조직 중의 함유량을 측정하였다. 2주간의 치료 처치 후 채취된 간장을 파쇄 균질화하고, 수산화나트륨 처리에 의해 함유 단백질을 분해하여 클로라민 T와 디메틸아미노벤즈알데히드의 히드록시프롤린 특이적 정색 반응에 의해 히드록시프롤린 농도를 측정하였다(표 3, Reddy et al, 1996).
정상 대조군(Normal)의 수치에 비하면 3배로 여전히 매우 높은 값이기는 하지만, 생리 식염수 투여 대조군(Saline)에 비하여 hMDDSC 투여군은 22.6%나 감소, 즉 간섬유화의 개선이 검출되었다.
상기 간경변 모델 마우스에게 고구마 줄기의 폴츠 추출 수상 분획을 6.6mg/kg 꼬리 정맥으로부터 투여한 바, 간경변이 경감되어 있는 것을 본 발명자는 확인하였다.
3. 결론
마우스 간경변 모델에 있어서 본 발명의 hMDDSC를 이용한 치료는 이와 같이 불과 2투여 2주일간의 치료 처치/기간에서 대폭적인 섬유 생산의 억제와, 섬유 조직의 제거 감소를 야기하는 것을 특징으로 한다. 그 결과, 간경변 상태로부터의 신속한 탈출과 정상 간조직으로의 수복에 작용하여 간 재생을 촉진하는 획기적인 치료 시스템이다.
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Claims (22)
- 단구를 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 존재하에서 배양하고 탈분화시킴으로써 얻어지는 줄기 세포.
- 제1항에 있어서, 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분이 당 또는 복합 당질인 줄기 세포.
- 제1항에 있어서, 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분의 분자량이 1000 내지 500000인 줄기 세포.
- 제1항에 있어서, 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분이 Con A 칼럼에 흡착되는 줄기 세포.
- 제1항에 있어서, 수용성 식물 추출물의 단구를 탈분화시키는 유효 성분이 음이온 교환 수지에 흡착되는 줄기 세포.
- 제1항에 있어서, 수용성 식물 추출물이 식물 유래 폴츠(Folch) 추출 수상 분획 또는 그의 정제물인 줄기 세포.
- 제1항에 있어서, 단구가 인간 단구인 줄기 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 미분화 마커 Nanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4 중 적어도 1종을 발현하고 있고, 단구를 M-CSF 단독 존재하에 배양한 경우에 얻어진 줄기 세포와 비교한 경우, CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현하고 있는 것을 특징으로 하는 줄기 세포.
- 미분화 마커 Nanog, Nestin, c-Kit, CD9, Oct3/4 중 적어도 1종을 발현하며, CXCR4 유전자가 유의하게 강하게 발현하고 있는 것을 특징으로 하는 줄기 세포.
- 단구를 (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포의 생산 방법.
- 제6항에 있어서, 배양 기간이 7일 내지 14일간인 방법.
- (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 단구의 탈분화 유도 배지.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포를 유효 성분으로서 함유하는 세포 의약용제.
- (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효 성분으로 하는 탈분화 유도제.
- 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효 성분으로 하는 세포, 조직 또는 기관의 손상에 관련된 질환의 치료제.
- 제16항에 있어서, 상기 질환이 외상, 염증성 질환, 뼈ㆍ연골의 손상, 순환기 질환, 신경 질환, 간 질환 및 신장 질환, 당뇨병, 아토피성 피부염, GVHD(이식편대숙주병)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료제.
- 제16항에 있어서, 상기 질환이 외상, 췌염, 방사선 손상, 피부근염, 다발성 근염, 괴사성 근막염, 만성 기관지염, 골절, 골다공증, 골연골 골절, 골연골염, 확장형 심근증, 심근경색, 허혈성 심근증, 심부전, 심근비대, 울혈성 심부전, 재협착, 부정맥, 아테롬성 동맥 경화증, 혈관염, 말초 신경 장애, 신경 장애통, 뇌졸중, 뇌염, 수막염, 당뇨병성 신경 장애, 주의 결함 장해, 자폐증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병, 뇌 또는 척수의 외상 또는 허혈, 간경변, 만성 간염, 만성 신부전, 사구체신염, 신허혈, 당뇨병, 아토피성 피부염, GVHD(이식편대숙주병)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료제.
- 적어도 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포를 필수 구성 성분으로 하는 세포 의약용 키트.
- (i) M-CSF 및 (ii) 강글리오시드 및 수용성 식물 추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 필수 구성 성분으로 하는 탈분화 세포 생산 키트.
- 제20항에 있어서, 단구를 구성 성분으로서 더 포함하는 키트.
- 강글리오시드가 GD1a, GD1b, GD2, GD3, GM1, GM2, GM3, GT1b 및 GQ1b로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 줄기 세포, 줄기 세포의 생산 방법, 단구의 탈분화 유도 배지, 세포 의약용제, 치료제, 탈분화 유도제, 세포 의약용 키트 또는 탈분화 세포 생산 키트.
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