KR20040099366A - 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포, 이의생성 방법 및 용도 - Google Patents

단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포, 이의생성 방법 및 용도 Download PDF

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프레드 판드리히
마렌 런키
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블라스티콘 바이오테크놀로지셰 포르슝 게엠베하
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Abstract

본 발명은 M-CSF와 IL-3을 함유하는 배양 배지에서 단구를 배양함으로써, 사람 단구로부터 완전히 성장한 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 생성하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 이러한 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 함유하는 약제학적 제제, 및 표적 세포와 표적 조직을 생성시키기 위한 이들 줄기 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포, 이의 생성 방법 및 용도{Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use}
당해 기술 분야에 있어서, 용어 "줄기 세포(stem cell)"는 (a) 자기 복제 능력이 있고, (b) 비대칭적 분할 능력으로 인해 1개 이상, 종종 수 많은 특수 세포 유형을 형성하는 능력을 지니고 있는 세포를 지칭한다[참조: Donovan, P.J., Gearhart, J., Nature 414: 92-97 (2001)]. 용어 "다능성(pluripotent)"은 필수적으로 사람과 동물 신체의 가능한 모든 세포 유형으로 분화될 수 있는 줄기 세포를지칭한다. 지금까지는 이러한 줄기 세포가 배아 조직이나 배아 암종(고환 종양)으로부터만 수득될 수 있었다[Donovan, P.J., Gearhart, J., 상기 인용문 참조]. 배아 줄기 세포의 사용은, 특히 독일에서 광범위하고도 공개적으로 논의되어 온 주제이지만, 지금은 상당한 문제가 되는 것으로 간주되고 있다. 배아 줄기 세포와 연관된 윤리적 문제점과 법적 문제점 이외에도, 이러한 세포를 치료학적으로 사용하는 것 또한 곤란에 직면하고 있다. 본래, 배아 줄기 세포는 이들 세포로부터 발생된 분화 세포 또는 조직(체 표적 세포 또는 표적 조직으로 후술됨)의 잠재적 수용자와 비교하여 이종(heterologous)인 공여자 유기체로부터 수득된 것이다. 따라서, 이러한 표적 세포는 잠재적인 수용자에게서 거부 형태의 즉각적인 면역 반응을 촉발시킬 것으로 예상된다.
줄기 세포는 완전히 성장한 상이한 조직, 즉 분화된 개개인으로부터 분리할 수도 있다. 이러한 줄기 세포는 당해 기술 분야에서 "다능성의 완전히 성장한 줄기 세포"로 지칭된다. 체내에서는 이들이 조직 재생과 생체 항상성에 있어 일정 역할을 한다. 배아 다능성 줄기 세포와 완전히 성장한 다능성 줄기 세포 간의 본질적인 차이는, 각각의 세포로부터 수득될 수 있는 분화 조직 수에 있다. 예상컨대, 이는, 다능성 줄기 세포는 정자 세포로부터 유래되거나 또는 정자를 생산할 수 있는 세포로부터 유래되는 반면, 완전히 성장한 다능성 줄기 세포는 정자를 생산할 수 없는, 완전히 성장한(성인) 개개인의 신체 또는 세포체로부터 유래된다는 사실 때문이다[Donovan, P.J., Gearhart, J., 상기 인용문 참조, Page 94].
그러나, 완전히 성장한 줄기 세포를 수득하고 사용하는 것과 관련된 실제적인 문제점은 이들 세포의 희소성에 있다. 따라서, 골수에서는 줄기 세포가 1:10,000의 비율로만 존재하고, 말초혈에서는 1:250,000의 비율로 존재하며, 간에서는 1:100,000의 비율로만 존재한다. 따라서, 이러한 줄기 세포를 수득하는 것은 비용면에서 매우 비싸고, 환자에게 스트레스를 많이 준다. 또한, 지금까지는, 임상 요법에 요구되는 바대로 세포를 대량 생성시키는 것이 합리적인 비용으로는 거의 불가능하였다.
이는, 이의 피부 세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 섬 세포, 신경 세포, 신경원 세포, 뼈 세포, 연골 세포, 내피 세포 및 지방 세포 등을 대체시켜야 하는 외곽구조 내에서, 세포 요법으로서 또는 "조직 공학" 형태로 파괴된 조직을 치료할 수 있는 가능성에 대한 필요성은 지속적으로 증가하는 것과는 대조적이다.
이와 관련해서, 가까운 시일 내에 서방 세계 집단의 연령과 질병 프로필을 개발하는 것은 거의 확실하기 때문에, 미국과 캐나다를 포함한 서방 유럽 집단의 건강 관리 섹터에서는 앞으로의 10년이 급격한 전환점이 될 것으로 예상하고 있다. 독일에서만 시행된 인구통계학적 연구 결과는 45세 내지 64세 그룹 집단이 2015년까지 21% 성장하고, 65세 이상 그룹 집단은 26% 성장한다고 제시하고 있다. 이는 결과적으로, 환자 구조와 치료를 요하는 질병 스펙트럼 상의 변화를 가져다 준다. 예상컨대, 심장순환계 질환(고혈압, 심근 경색), 동맥경화증과 대사성 질환으로 인한 혈관성 질환, 당뇨병 등의 대사성 질환, 간 대사 질환, 신장 질환 뿐만 아니라 노화와 관련된 변성(퇴화)에 의해 야기된 골격계 질환, 및 신경원과 신경교 세포 손실에 의해 유발된 뇌의 퇴행성 질환이 증가하여, 혁신적인 치료 개념이 요구될것이다.
이러한 사실들은 조직(간, 뼈, 연골, 근육, 피부 등) 특유의 분화 세포로 프로그램될 수 있는 줄기 세포를 수득하기 위해, 이에 참여한 전문가들의 막대한 국가적 및 국제적인 연구 개발 노력들을 설명해준다.
따라서, 본 발명의 근간을 이루는 문제점은 이의 생성이 윤리적 및/또는 법적 문제점을 유발시키지 않고, 계획된 치료학적 용도에 요구되는 양과 타당한 생성 비용으로 이러한 치료 용도에 신속하게 이용될 수 있어야 하며, "세포 요법"으로서 사용되는 경우에는 문제의 환자에게서 세포 거부 및 종양(특히, 악성 종양) 유도와 같은 부작용을 전혀 야기시키지 않는(또는 특별히 언급할 만한 수준으로 야기시키지 않는), 완전히 성장한 줄기 세포를 입수 가능하게 만드는데 있다.
본 발명에 따르면, 이러한 문제점은 사람 단구로부터, 탈분화된 프로그램 가능한 세포(이는 본 발명의 목적상, "줄기 세포"로서 후술됨)을 생성시킴으로써 해결된다. 용어 "탈분화(dedifferentiation)"는 당업자에게 널리 알려져 있다[참조: Weissman I.L., Cell 100: 157-168, Fig. 4, (2000)]. 이는 이미 특수화된(분화된) 완전히 성장한 체 세포가, 결국에는 수 많은 세포 유형으로 전이(프로그램)될 수 있는 세포인 줄기 세포 상태로 퇴행되는 것을 의미한다. 놀랍게도, 본 발명에 따르는 방법이 단구의 탈분화를 가져다 주는 것으로 입증되었다. 이러한 방식으로 생성된 줄기 세포는 다수의 상이한 표적 세포/표적 조직으로 형질전환(프로그램)될 수 있다(실시예 참조). 본 발명에 따르는 줄기 세포는 분화된 단구에 특징적인 CD14 표면 항원 이외에도, 전형적인 다능성 마커 CD90, CD117, CD123 및 CD135 중의 1개 이상, 바람직하게는 2개 또는 3개를 발현한다. 특히 바람직한 방식으로, 본 발명에 따라서 생성된 줄기 세포는 CD14 표면 항원 뿐만 아니라 4가지 다능성 마커인 CD90, CD117, CD123 및 CD135를 발현한다(실시예 2, 표 1 참조). 바람직하게는, 본 발명의 줄기 세포는 막 관련 단구-특이적 표면 항원 CD14와, CD117, CD123 및 CD135로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1개 이상의 다능성 마커를 발현한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 줄기 세포는 CD14 항원을, 적어도 다능성 마커 CD123 및/또는 CD135와 조합하여 수반한다. 본 발명에 따르는 줄기 세포의 3% 미만, 바람직하게는 1% 미만이 CD34 항원을 발현한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 어떠한 줄기 세포도 CD34 항원을 발현하지 않는다. 이와 같은 방식으로, 완전히 성장한 줄기 세포를 처음으로 입수 가능하게 만들었으며, 이러한 세포는 바람직하게는 자가 유래 조직 내로 단시간 내에 재프로그램될 수 있다.
본 발명에 따르는 줄기 세포의 생성은 환자에게 전혀 해가 없으며, 자가 유래 사용의 경우에도, 자신의 혈액을 수혈하는 것에 필적한다. 통상의 치료 옵션(상기 참조)에 요구되는 줄기 세포의 양(108내지 109개 세포)은 채혈 후 10 내지 14일 이내에 비용 측면에서 효과적으로 입수 가능해질 수 있다. 또한, 자가 유래 사용의 경우에, 해당 치료법에 제공된 세포 생성물은 세포 거부와 같은 면역학적 문제점을 전혀 유발시키지 않는데, 이는 세포와 수용자가 바람직하게는 유전적으로 동일하기 때문이다.
본 발명에 따르는 줄기 세포는 또한, 악성 종양을 유발시키는 것과 관련해서는, 동물 실험과 배양물 모두에서 위험이 전혀 없는 것으로 입증되었으며, 이러한 결과는 본 발명에 따르는 줄기 세포가 유래하는 단구성 기원의 세포 때문인 것으로 단지 예상된다. 사람 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 생성하기 위한 본 발명에 따르는 방법의 필수 단계는
(a) 사람 혈액으로부터 단구를 분리하는 단계;
(b) 이러한 단구를, 대식 세포(macrophage)-콜로니-자극 인자(M-CSF로서 후술됨)를 함유하는 세포 배양 배지를 함유하는 적합한 배양 용기에서 증식시키는 단계;
(c) 상기 단구를 인터루킨-3(IL-3)의 존재 하에 배양하는 단계; 및
(d) 상기 배양 배지로부터 사람 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 격리시킴으로써, 이러한 사람 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 수득하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, M-CSF와 IL-3을 단계 (b)의 세포 배양 배지에 동시에 가한다.
그러나, 단구를 증식시키기 위해서는 초기에 단계 (b)의 세포 배양 배지에 M-CSF 만을 가한 다음, 연속해서 IL-3을 세포 배양 배지에 가하는 것도 가능한다.
최종적으로, 단계 (b)의 공정은, M-CSF 만을 함유하는 세포 배양 배지에서 단구를 초기에 증식시킨 다음, 배지를 세포로부터 격리시킨 후, IL-3을 함유하는 제2의 세포 배양 배지를 사용하는 방식으로 수행할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 단계 b)의 배양 배지를 배양 용기의 바닥에 부착된 세포로부터 격리시키고, 이러한 세포를 상기 바닥으로부터 떨어지게 하여 세포를 분리시킴으로써 사람의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 수득한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 세포를 황 화합물의 존재 하에 추가로 배양한다. 이러한 배양은 상기 언급된 배양 단계 b) 다음에 별도의 공정 단계로 수행할 수 있다. 그러나, 상기 배양은, 바람직하게는 이미 배양 개시시 배양 배지에 황 화합물을 추가로 부가함으로써, 단계 b)에서 수행할 수도 있다.
본 발명에 따르는 방법은 놀랍게도 단구의 탈분화를 가져다 주는데, 이러한 탈분화로부터 비롯된 완전히 성장한 줄기 세포는 분화된 단구 특유의 CD14 표면 항원 이외에도, 다능성 마커 CD90, CD117, CD123 및 CD135 중의 1개 이상, 바람직하게는 이들 다능성 마커 모두를 또한 발현한다(표 1 참조). 바람직하게는, 본 발명의 줄기 세포는 막 관련 단구-특이적 표면 항원 CD14와, CD117, CD123 및 CD135로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1개 이상의 다능성 마커를 발현한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 줄기 세포는 CD14 항원을, 적어도 다능성 마커 CD123 및/또는 CD135와 조합하여 수반한다. 본 발명에 따르는 줄기 세포의 3% 미만, 바람직하게는 1% 미만이 CD34 항원을 발현한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 어떠한 줄기 세포도 CD34 항원을 발현하지 않는다. 각각의 마커(표면 항원)의 발현은, 표준 면역 검정 과정(실시예 2 참조)을 사용하여, 탐지하고자 하는 각각의 항원에 대해 특이성을 지닌 시판용 항체를 통하여 입증될 수 있다.
상기 세포는 증식과 탈분화 공정 동안에 각각의 배양 용기 바닥에 부착되기때문에, 세포를 단계 b)로부터의 배양 배지로부터 격리시키고, 탈분화 완료 후에는 이들을 바닥으로부터 떨어지게 하는 것이 필요하다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 세포 배양 상등액을 경사 제거한 후에, 바닥에 부착된 세포를 떨어지게 하고, 연속해서 부착 세포를 신선한 배양 배지로 세정하는 것이 바람직하다. 이러한 세정 후, 신선한 배양 배지를, 바닥에 부착되어 있는 세포에 다시 가한 다음, 바닥으로부터 세포를 방출시키는 단계를 수행한다(실시예 13 참조).
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 단계 c) 말기와 단계 d) 이전에, 세포를 생물학적으로 널리 관용되는 유기 용매와 접촉시킨다. 이러한 생물학적으로 널리 관용되는 유기 용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있으며, 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
추가의 양태에서는, 단계 c) 말기와 단계 d) 이전에, 세포를 생물학적으로 널리 관용되는 유기 용매의 증기 상과 접촉시킨다.
더우기, 세포를 바닥으로부터 떨어지게 하는(방출) 공정을 기계적으로 수행할 수도 있지만, 예를 들어, 트립신을 사용하여 효소적으로 떨어지게 하는 공정이 바람직하다.
이러한 방식으로 수득된, 배지 중에서 자유로이 부유하는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포는 재프로그래밍 공정에 직접 전달될 수 있거나, 또는 배양 배지 내에서 수 일 동안 유지시킬 수 있는데, 후자의 경우에는, 프로그램 능력이 미숙하게 상실되는 것을 피하기 위해, 사이토킨 또는 LIF(백혈병 억제 인자)를 상기 배지에 가하는 것이 바람직하다[Donovan, P.J., Gearhart, J., 상기 인용문 참조, Page94]. 최종적으로, 상기 세포를 프로그램 능력 상실 없이 저장하기 위해 급속-동결시킬 수 있다.
본 발명에 따르는 줄기 세포는 막-관련 단구-특이적 CD14 표면 항원 이외에도, 이들의 표면 상에 CD90, CD117, CD123 및 CD135로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1개 이상의 다능성 마커를 수반한다는 점에서, 지금까지 공지된 배아 기원의 다능성 줄기 세포와 상이하고, 또한 상이한 조직으로부터 공지된 완전히 성장한 줄기 세포와 상이하다. 바람직하게는, 본 발명의 줄기 세포는 막 관련 단구-특이적 표면 항원 CD14와, CD117, CD123 및 CD135로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1개 이상의 다능성 마커를 수반한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 줄기 세포는 CD14 항원을, 적어도 다능성 마커 CD123 및/또는 CD135와 조합하여 수반한다. 본 발명에 따르는 줄기 세포의 3% 미만, 바람직하게는 1% 미만이 CD34 항원을 발현한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 어떠한 줄기 세포도 CD34 항원을 발현하지 않는다.
본 발명에 따르는 방법을 사용하여 생성된 줄기 세포는 어떠한 체 세포로도 재프로그램될 수 있다. 줄기 세포를 재프로그램하는 공정은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들어, Weissman I.L., Science 287: 1442-1446 (2000) and Insight Review Articles Nature 414: 92-131 (2001), and the handbook "Methods of Tissue Engineering", Eds. Atala, A., Lanza, R.P., Academic Press, ISBN 0-12-436636-8; Library of Congress Catalog Card No. 200188747].
본 발명에 따르는 줄기 세포를 재프로그램함으로써 수득된, 분리된 분화 체 표적 세포 및/또는 표적 조직은 단구의 막 관련 CD14 분화 마커를 수반하기도 한다. 부가적으로, 본 발명에 따르는 이들 체 표적 세포 및/또는 표적 조직의 3% 미만, 바람직하게는 1% 미만이 CD34 항원을 발현한다. 가장 바람직하게는, 이들 세포 또는 조직의 어떠한 것도 CD34 항원을 발현하지 않는다. 실시예 11에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따르는 줄기 세포로부터 유도된 간 세포(hepatocyte)는 단구 특유의 CD14 표면 마커를 발현하지만, 이와 동시에 이들은 간 세포 특유의 단백질 알부민을 생성한다. 따라서, 본 발명에 따르는 줄기 세포로부터 유도된 간 세포는 천연의 간 세포와 구별될 수 있다. 동일한 방식으로, 막 관련 CD14 표면 마커를, 본 발명에 따르는 줄기 세포로부터 유도된 인슐린-생산 세포 상에서 탐지하였다(실시예 9).
본 발명의 한 양태에서는, 본 발명에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 표적 세포 및 표적 조직의 시험관내 생성에 사용한다(실시예 참조). 따라서, 본 발명에 따르는 줄기 세포를 분화(재프로그래밍)시킴으로써 수득되고, 막 관련 CD14 표면 항원을 수반하는, 분리된 분화 조직 세포가 또한, 본 발명의 주제이다.
본 발명에 따르는 줄기 세포는 바람직하게는, 각각의 표적 세포 및/또는 이의 단편을 항온 배양시킨 바 있는 배양 배지의 상등액을 함유하는 배지에서 본 발명의 줄기 세포를 성장시킴으로써(실시예 6 내지 8), 이들 줄기 세포를 시험관 내에서 목적하는 표적 세포, 예를 들면, 지방 세포(실시예 6 참조), 신경원 및 신경교 세포(실시예 3 참조), 내피 세포(실시예 5 참조), 각질 세포(실시예 8 참조), 간 세포(실시예 7 참조), 및 섬 세포(랑게르한 섬; 실시예 9 참조)로 간단하고도신뢰성 있게 분화시킨다. 상기 상등액은 "표적 세포-조건화 배지"로서 후술된다.
따라서, 본 발명에 따르는 탈분화된 줄기 세포를 분화(재프로그래밍)시키기 위해서는, 다음 과정을 수행할 수 있다:
a) 목적하는 표적 세포를 함유하거나 이로 이루어진 조직을 파쇄시키고;
b) 이러한 조직 세포(표적 세포) 및/또는 이의 단편을 수득하고;
c) 표적 세포 및/또는 이의 단편을 적합한 배양 배지에서 항온 배양하고;
d) 항온 배양 동안 및 후에, 배양 배지 상등액을 표적 세포-조건화 배지로서 수집하며;
e) 탈분화된 줄기 세포를 목적하는 표적 세포 또는 표적 조직으로 재프로그래밍/분화시키기 위해, 상기 줄기 세포를 표적 세포-조건화 배지의 존재 하에 성장시킨다.
표준 세포 배양 배지를 배양 배지로서 사용할 수 있다(실시예 참조). 이러한 배지는 바람직하게는, 표피 성장 인자 등의 성장 인자를 함유한다.
표적 세포 및/또는 이의 단편["세포 펠릿(cell pellet)"]을 항온 배양하는 것은 5 내지 15일, 바람직하게는 10일에 걸쳐 수행할 수 있다. 상등액, 즉 표적 세포-조건화 배지는 바람직하게는, 각 경우에 있어 2 내지 4일 후에 제거하고, 신선한 배지로 대체시킨다. 이로써 수득된 상등액은 멸균 조건 하에 별개로 또는 모아서 여과시키고, 대략 -20℃ 하에 저장하거나 또는 줄기 세포의 프로그래밍에 직접 사용할 수 있다. 상기 제시된 바와 같이, 줄기 세포를 목적하는 표적 세포로 프로그래밍하는 것은, 각각의 표적 세포로 조건화된 배지의 존재 하에 줄기 세포를성장시킴으로써 수행한다(실시예 참조). 성장 배지는 바람직하게는, 표적 세포-특이적 성장 인자, 예를 들면, "간 세포 성장 인자" 또는 "각질 세포 성장 인자"를 부가적으로 함유한다(실시예 참조).
본 발명의 한 양태에서는, 본 발명에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포가 그 자체로서, 표적 세포와 표적 조직의 시험관내 생성을 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용된다.
이러한 약제학적 제제는 생리학적으로 널리 관용되는 배지에 현탁된 본 발명에 따르는 줄기 세포를 함유할 수 있다. 적합한 배지는, 예를 들어, 20% 사람 알부민 용액 등을 갖는 PBS(인산염 완충 식염수) 또는 생리 식염수이다.
이들 약제학적 제제는, 표면 상에 CD14 표면 마커와, 다능성 줄기 세포 마커 CD90, CD117, CD123 및/또는 CD135 중의 1개 이상을 갖는, 생명 유지에 필요한 본 발명에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를, 제제 내에 존재하는 세포의 총 수를 기준으로 하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50% 이상, 바람직하게는 60 또는 70%, 특히 바람직하게는 80 또는 90%, 극히 바람직하게는 100%의 양으로 함유하고, 임의로 추가의 약제학적으로 널리 관용되는 아쥬반트(adjuvant) 및/또는 담체 물질을 함유한다.
줄기 세포 제제는, 표면 상에 CD14 표면 마커와, 다능성 줄기 세포 마커 CD90, CD117, CD123 및/또는 CD135 중의 1개 이상을 갖는, 생명 유지에 필요한 본발명에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를, 제제 내에 존재하는 세포의 총 수를 기준으로 하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59% 이상, 바람직하게는 60% 이상의 양으로 함유하는데; PBS 또는 RPMI 등의, 세포에 의해 널리 관용되는 세포 배양 배지 또는 수송 배지 중의 세포 현탁액, 또는 50% 사람 알부민 용액과 10% DMSO를 갖는 RPMI와 같은 적합한 저장 배지 중의 급속 동결된 세포 제제가 바람직하다.
생명 유지에 필요한 세포의 수와, 상기 언급된 조성물 중에서의 이들 세포의 비율은 "트립판 블루 염료 배제 기술"을 사용함으로써 광학적으로 결정할 수 있는데, 이는 상기 염료를 사용하여, 생명 유지에 필요한 세포를 생명 유지에 필요하지 않은 세포와 광학적으로 구별할 수 있기 때문이다.
대체로, 충분한 수의 기능적 줄기 세포가 존재한다는 조건 하에, 약제학적 제제 내에 존재하는 세포 중 일부가 본 발명에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 기준에 충족되지 못하는 경우에는, 임상 용도로 부적절할 것이다. 그러나, 이러한 제제 중의 본 발명에 따르는 탈분화된 세포 특유의 표면 마커를 기초로 하여, 당해 기술 분야에 공지된 공정을 통하여 비-탈분화 세포를 제거하는 것이 또한 가능하므로, 이들 약제학적 제제는 목적하는 세포를 거의 순수한 형태로 함유한다. 적합한 공정의 한 가지 예가 "면역 자기 비드 분류법"이다[참조: Romani et al., J. Immunol. Methods 196: 137-151 (1996)].
줄기 세포는, 특정의 세포 유형의 세포 그룹과 직접적으로 접촉함으로써 생체 내에서 이러한 유형의 세포로 자발적으로 분화되는 능력을 추가로 지니고 있다. 재분화될 수 있는 세포를 사용하여 조직을 생성시키는 방법("조직 공학")은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Wang, X. et al. ("Liver repopulation and correction of metabolic liver disease by transplanted adult mouse pancreatic cells" Am. J. Pathol. 158 (2): 571-579 (2001)]에는, 완전히 성장한 특정의 마우스 췌장 세포라도 FAH(푸마로일아세토아세테이트 하이드롤라제)-결핍성 마우스에서 간 세포로 형질전환될 수 있는데, 이로써 이들 동물에서의 대사적 결함이 충분히 상쇄될 수 있다고 보고되었다. 추가의 예는 다음 문헌에 기재된 실험이다[참조: Lagasse et al., "Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo", Nature Medicine, 6 (11): 1229-1234 (2000)]. 상기 저자는, 골수로부터의 조혈성 줄기 세포는 FAH-결핍성 마우스로의 생체내 전이 후에, 간 세포로 형질전환될 수 있었는데, 이로써 대사적 결함이 상세될 수 있었다고 보고하였다[참조: Grompe M., "Therapeutic Liver Repopulation for the Treatment of Metabolic Liver Diseases" Hum. Cell, 12: 171-180 (1999)].
본 발명에 따르는 탈분화된 줄기 세포의 생체내 분화를 위한 특별히 바람직한 적용 형태는, 본 발명의 줄기 세포를 체 내의 하나의 특정의 세포 연합물과 직접적으로 접촉시킴으로써 줄기 세포가 상기 세포 유형의 세포로 분화되도록 하기 위해, 줄기 세포를 상기 체 내의 하나의 특정의 세포 연합물 내로 주사, 주입 또는이식(implantation)하는 것이다. 주사 또는 주입하기 위해서는, 상기 세포를 PBS(인산염 완충 식염수) 중에서 투여할 수 있다.
이와 관련하여 연관된 전조 증상의 바람직한 예가 간 경변, 췌장 기능부전증, 급성 또는 만성 신부전증, 호르몬 기능 저하(hormonal under-functioning), 심근 경색, 폐 색전증, 발작 및 피부 손상이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 간 경변, 췌장 기능부전증, 급성 또는 만성 신부전증, 호르몬 기능 저하, 심근 경색, 폐 색전증, 발작 및 피부 손상을 치료하기 위한 상이한 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 본 발명의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도이다.
본 발명에 따르는 줄기 세포로부터 수득될 수 있는 표적 세포를 치료학적으로 사용하기 위해, 수 많은 개념들을 이용할 수 있다[상기 Science 287: 1442-1446 (2000) and Nature 414: 92-131 (2001) 참조].
추가의 바람직한 적용은 본 발명에 따르는 탈분화된 줄기 세포를 복막 내로 주사하여, 이들을 둘러싸고 있는 세포들의 영향으로 인해 상기 줄기 세포가 복막 세포로 분화되도록 하는 것에 관한 것이다. 신부전증 환자를 복막 투석하는 경우에는, 상기 세포가 이들의 반-투과성 막을 통하여 신장 기능을 인계받아, 신장 의존적 폐기물을 복막(이로부터 투석액을 통하여 이들 세포가 제거된다) 내로 방출시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 줄기 세포를 재프로그래밍함으로써 수득되고, 막 관련 CD14 항원을 특징으로 하는, 분리된 분화 체 표적 세포 및/또는 표적 조직 또한 본발명의 주제이다. 이들 체 표적 세포 및/또는 표적 조직은 바람직하게는, 지방 세포, 신경원 및 신경교 세포, 내피 세포, 각질 세포, 간 세포 및 섬 세포를 함유한다.
그러나, 재구성될 기관 내로 이들 세포를 직접 도입할 수도 있다. 이러한 도입은 상응하는 분화 세포 또는 분화할 수 있는 세포로 피복시킨 매트릭스 작제물을 통하여 수행할 수 있다. 이러한 매트릭스 작제물은 대체로 생체 분해성이므로, 새로이 도입된 세포가 존재하는 세포와 함께 성장하는 동안에 신체로부터 소멸된다. 이러한 관점에서 보면, 예를 들어, 섬 세포, 간 세포, 지방 세포, 피부 세포, 근육, 심근, 신경, 뼈, 내분비 세포 등의 형태의 세포성, 바람직하게는 자가 유래 이식체를, 예를 들어, 기관 기능이 결여되거나 기능 부전의 경우에, 외상 후의 복원 또는 지지용으로 기관의 부분 외과적 절제 후의 회복에 사용하는 것이 고려 중에 있다.
본 발명에 따르는 줄기 세포 및 이로부터 수득된 표적 세포는 생체 적합성을 증대시키기 위해, 이식 가능한 물질을 피복시키는데 추가로 사용될 수 있다. 따라서, 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포 또는 체 표적 세포 및/또는 표적 조직으로 피복시킨 이식 가능한 물질 역시 본 발명의 주제이다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 이들 이식 가능한 물질은 인공 삽입물(보철)이다. 특히 바람직한 양태에서는, 이들 인공 삽입물이 심장판, 혈관 인공 삽입물, 뼈- 및 관절 인공 삽입물이다.
이식 가능한 물질은 또한, 본 발명의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포 또는 표적 세포를 함유하는, 인공 및/또는 생물학적 담체 물질일 수 있다. 이와관련하여, 담체 물질은 인체 내로 삽입하기 위한 봉지(bag) 또는 챔버(chamber)일 수 있다.
본 발명의 한 양태에서는, 본 발명에 따르는 분화된 체 세포인 섬 세포를 함유하는 봉지는 인슐린을 공급하기 위한 인공 섬 세포 포트 챔버(port chamber)로서 사용하기 위한 약제학적 작제물을 제조하는데 사용된다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본 발명에 따르는 분화된 체 세포인 지방 세포를 함유하는 봉지 또는 챔버는, 수술 후 유방 작제를 위해 및 추가의 바람직한 성형 및/또는 미용 교정 조치를 취하는 경우에 사용하기 위해, 지방 세포로 채워진 인공 중합체를 약제학적 작제물로서 제조하는데 사용된다.
더우기, 극히 광범위한 출처의 내분비 세포를 함유하는 반투과성 포트 챔버 시스템은, 내분비, 대사성 또는 지혈성 장애 치료를 위해 생체내에서 사용할 수 있다. 이러한 내분비 세포의 예는 티록신, 스테로이드, ADH, 알도스테론, 멜라토닌, 세로토닌, 아드레날린, 노르아드레날린, TSH, LH, FSH, 렙틴, 콜레키스토키닌, 가스트린, 인슐린, 글루카곤 또는 응고 인자를 생성시키는 세포이다.
따라서, 분리된 분화 체 표적 세포를 함유하는, 반투과성 포트 챔버 시스템인 이식 가능한 물질 역시 본 발명의 주제이다. 이들 반투과성 챔버 시스템은 내분비, 대사성 또는 지혈성 장애를 생체내 치료하기 위한 약제학적 작제물을 제조하기 위한 본 발명의 상이한 양태에 사용된다.
본 발명에 따르는 줄기 세포로부터 수득된 표적 세포는 또한, 예를 들어, 해독 반응을 수행하기 위해, 신체 외부의 생물 반응기(bioreactor) 중의 세포 배양물로서 사용될 수 있다. 이러한 형태의 사용은 급성 질환의 경우에 특히 적절한데, 예를 들어, 간 세포-생물 반응기로서 급성 간부전증의 경우에 특히 적절하다.
상기 언급된 작제물의 제조와, 상응하는 치료학적 과정을 수행하는 것은 당해 기술 분야에서 이미 수 차례 보고된 바 있으며, 예를 들어, 다음 문헌을 비교하기 바란다[참조: Lalan, S., et al. "Tissue engineering and its potential impact on surgery" World J. Surg. 25: 1458-1466 (2001); Nasseri, B.A., et al. "Tissue engineering: an evolving 21st-century science to provide replacement for reconstruction and transplantation" Surgery 130: 781-784 (2001) and Fuchs, J.R., et al., "Tissue engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction" Ann. Thorac. Surg. 72: 577-591 (2001)].
최종적으로, 본 발명에 따르는 다능성 줄기 세포는 형질전환성 변형과 치료법을 광범위한 분야로 확대시켜 준다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포 그 자체 또는 이들로부터 최종적으로 분화된 체 표적 세포 및/또는 표적 조직을 하나 이상의 유전자로 형질감염시킨다(transfect). 이러한 방식으로, 특정 기관, 예를 들면, 간 또는 신장의 대사를 유지시키기 위해 요구되는 하나 이상의 유전자를 복구하고/하거나 지지 또는 재도입한다. 예를 들어, 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 간 세포는 FAH(푸마로일아세토아세테이트 하이드롤라제) 유전자로 형질감염시킬 수 있다. FAH-결핍성 마우스 모델에서, 6 내지 8주 후에 간을 완전히 재거주시키고, 간 경변을 유발시키는 대사성 결함을 완전히 상쇄시키기 위해서는, 1000개 FAH-양성 공여자 간 세포를 비장내 주사하는 것으로 충분하다[참조: Grompe, M., et al., Nat. Genet. 12: 266 ff. (1996)].
상응하게는, 줄기 세포, 또는 프로그래밍에 의해 이러한 줄기 세로로부터 수득된 각각의 표적 세포(예를 들면, 조혈 세포, 간 세포, 난소 세포, 근육 세포, 신경 세포, 신경원, 신경교 세포, 연골 또는 뼈 세포 등)를 "다중 약물 내성 유전자"로 형질감염시킴으로써, 상응하는 조혈 재구성 또는 방사선 내성으로 인해 악성 질환이 야기될 수 있는 경우에 광범위한 근치적 화학요법(radical chemotherapy)을 가능하게 할 수 있다.
본 발명은 사람 단구로부터 유래된, 완전히 성장한 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포, 및 이의 생성 방법 및 체 세포와 체 조직을 생성하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 이들 세포는 자가 유래 사람 줄기 세포인데, 즉 단구성 기원의 세포는, 본래의 세포로부터 생성된 줄기 세포로 치료하고/하거나 이러한 줄기 세포로부터 생성된 체 세포로 치료해야 하는 환자로부터 유래된 것이다.
본 발명은 다음과 같이 상세하게 설명된다:
본 발명에 따르는 방법에 대한 출발 물질은 사람 혈액으로부터의 단구이다. 이는 바람직하게는 자가 유래 단구, 즉 본 발명에 따르는 줄기 세포 또는 이로부터 생성된 표적 세포로 처리할 환자의 혈액으로부터 유래된 단구이다.
이러한 단구를 수득하기 위해, 혈액을 먼저, 공지된 방법, 바람직하게는 원심분리시킴으로써 항응고제로 표준 처리한 후에, 혈장과 백혈구 및 적혈구로 분리시킬 수 있다. 원심분리 후, 혈장이 상등액에서 발견되어야 하며; 이 아래에는 백혈구 전체를 함유하는 층이 놓여 있다. 이러한 층은 "연막(buffy coat)"으로서 지칭되기도 한다. 이 아래에는 적혈구를 함유하는 상이 놓여 있다(헤마토크리트: haematocrit).
이어서, 예를 들어, 공지된 공정을 사용하여 원심분리시킴으로써, 상기 "연막" 층을 분리 및 격리시켜 단구를 수득한다. 바람직한 공정 변수에 따르면, 상기 "연막" 층을 림프구 격리용 배지(예: Ficoll Hypaque) 상으로 피복시킨 다음, 원심분리시킨다. 추가로 원심분리 및 세정시킴으로써, 혈액으로부터 단구 분획을 수득한다(실시예 1 참조).
전혈로부터 단구를 수득하기 위한 또 다른 방법의 예는 "형광-활성화 세포 분류법"(FACS), "면역 자기 비드 분류법"[참조: Romani et al., J. Immunol. Methods 196: 137-151 (1996)] 및 "자기-활성화 세포 분류법"(MACS), 또는 소위 "로제팅 공정(Rosetting process)"[참조: Gmelig-Meyling, F., et al., "Simplified procedure for the separation of human T and non-T cells" Vox Sang. 33: 5-8 (1977)]이다.
본 발명에 따르면, 분리된 어떠한 사람 혈액으로부터도 단구를 수득할 수 있으며, 이러한 혈액은 비장, 림프절 또는 골수 등의 기관으로부터 유래될 수도 있다. 기관으로부터 단구를 수득하는 것은, 예를 들어, 빈혈이나 백혈병인 경우에 사람 혈액으로부터 단구를 분리시키는 것이 가능하지 않거나, 또는 충분한 양으로 분리되지 않은 경우, 및 동종 이계 사용의 경우에 다중-기관 제거 구축 내에서 비장이 단구 분리용 공급원으로서 이용 가능한 경우에 특히 고려된다.
본 발명에 따르는 줄기 세포를 충분한 양으로 생성하기 위해서는, 먼저 단구를 증식시키는 것이 필요하다. 이를 위해, 단구에 적합한 성장 배지를 사용할 수 있으며, 본 발명에 따르면, 이러한 배지는 M-CSF(대식 세포 콜로니 자극 인자)를 함유한다. M-CSF(CSF-1로 지칭되기도 함)은 단구, 섬유아세포 및 내피 세포에 의해 생성된다. 배양 배지 중의 M-CSF의 농도는 배지 1리터당 2 내지 20㎍, 바람직하게는 4 내지 6㎍, 특히 바람직하게는 5㎍일 수 있다.
단구 상에서는, 단구의 표면에만 존재하고 M-CSF와만 결합하는 특이적 c-Fms 수용체(CSF-1R로서 지칭되기도 함)에 M-CSF가 결합된다[참조: Sherr C.J., et al., Cell 41(3): 665-676 (1985)]. M-CSF와 상기 수용체 간의 특이적 상호 작용이 단구의 분할을 유도시키기 때문에, 단구를 배양하는 배지는 M-CSF 또는 이의 동족체를 함유하고, 이는 상기 수용체와 결합하여 이를 활성화시킬 수 있다. 기타 성장 인자, 예를 들면, GM-CSF(과립구-단구 콜로니 자극 인자) 및 G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자)는 적합하지 않은데, 이는 c-Fms 수용체에 대한 친화성이 결여되어 있어, 이들 성장 인자가 단구 분할을 유도할 수 없기 때문이다.
본 발명의 방법의 특히 바람직한 양태에서는, 본 방법의 단계 b)에서 세포 배양 배지에 M-CSF와 IL-3을 동시에 가한다. 배지 중의 IL-3의 농도는 0.2 내지 1㎍/ℓ, 바람직하게는 0.3 내지 0.5㎍/ℓ, 특히 바람직하게는 0.4㎍/ℓ일 수 있다.
그러나, 단계 b)에서 초기에 M-CSF 만을 세포 배양 배지에 가한 후에, IL-3을 가하는 것도 가능하다.
추가의 양태에서는, 배양 용기가 초기에, M-CSF 만을 함유하는 세포 배양 배지를 함유하고, 세포를 격리시킨 후에, IL-3을 함유하는 제2의 세포 배양 배지로써 대체시킨다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b)에서의 세포를 황 화합물, 예를 들면, 머캅토 화합물의 존재 하에 부가적으로 배양하는데, 상기화합물에서는 1개 이상의 탄화수소 그룹이 황에 결합하고, 탄화수소 그룹(들)이 하나 이상의 작용성 그룹에 의해 치환될 수 있다. 머캅토 그룹은 특정의 탄화수소 그룹에 결합되는, 1개 이상의 머캅토 그룹(-SH)을 갖는 화합물로서 정의된다. 이러한 황 화합물을 부가적으로 사용함으로써, 줄기 세포 마커 CD90, CD117, CD123 및 CD135 중의 1개 이상을 발현하는, 단구성 기원의 세포를 탈분화시킴으로써 수득된 줄기 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
상기 작용성 그룹(들)은 바람직하게는, 하이드록실- 및/또는 아민 그룹이다. 특히 바람직한 양태에서는, 황 화합물이 2-머캅토에탄올이다. 추가의 바람직한 양태에 따르면, 황 화합물은 디메틸설폭사이드(DMSO)이다.
사용된 황 화합물의 양은 황을 기준하여 대략 4 내지 대략 200 μmol/ℓ의 범위일 수 있다. 대략 100 μmol/ℓ이 바람직하다.
2-머캅토에탄올이 사용된 경우, 배양 배지는 2-머캅토에탄올을 대략 3 내지 대략 13 ㎕/ℓ, 바람직하게는 대략 7 ㎕/ℓ함유해야 한다.
IL-3 및 임의의 황 화합물로 처리하는 것은, M-CSF와 함께 배양함으로써 단구를 증식시키는 것과 동시에 수행하거나 또는 증식 후에 수행할 수 있으며, IL-3 및 임의의 황 화합물로의 처리를 증식과 동시에 수행하는 것이 바람직하다. 증식과 탈분화는 합해서 10일을 초과해서는 안되고, IL-3 및 임의의 황 화합물로의 처리는 최소한 3일 많게는 10일, 바람직하게는 6일에 걸쳐 수행되어야 한다.
따라서, 본 발명에 따르면, M-CSF, IL-3 및 바람직하게는 머캅토 화합물을 동시에 함유하는 배양 배지에서 단구를 배양하는 경우에는, 배양 용기 바닥으로부터 세포를 방출(떨어지게 함)할 때까지의 배양 기간은 적어도 3일 많게는 10일, 바람직하게는 5 내지 8일, 특히 바람직하게는 6일이다.
바람직한 양태에서 본 발명에 따르는 방법을 이러한 방식으로 수행하여, 단계 b)에서의 단구를 M-CSF 만을 함유하는 배지에서 초기에 증식시킨 경우에는, 이러한 배양 배지에서의 증식이 2일 이상, 바람직하게는 3일, 특히 바람직하게는 4일에 걸쳐 일어날 수 있으며(최대 기간은 7일이다), IL-3 및 임의의 머캅토 화합물의 존재 하에서의 후속 배양은 추가 3일에 걸쳐 일어날 수 있다. 그러나 바람직하게는, 이러한 경우에 M-CSF 만을 함유하는 배지 중에서의 배양은 최대 4일 동안만 지속될 것이며, 이에 이은 IL-3 및 임의의 머캅토 화합물의 존재 하에서의 배양은 3, 4, 5 또는 6일에 걸쳐 지속될 것이다.
증식과 탈분화를 연합해서 수행하기 위해서는, 실시예 2 및 13에 기재된 바와 같이, 단구를 분리 후에, M-CSF와 IL-3 둘 다를 함유할 뿐만 아니라 바람직하게는 황 화합물, 특히 머캅토에탄올 또는 DMSO를 함유하는 배지에 옮긴다.
부착 특성으로 인해, 단구와 본 발명의 방법 동안 이로부터 생성된 줄기 세포는 각각의 배양 용기 바닥에 부착된다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 배양 배지를 단계 c) 후에, 배양 용기 바닥에 부착되어 있는 세포로부터 격리시켜, 경사 제거한다. 이어서, 바닥에 부착되어 있는 세포를 배양 배지로 세정하는 것이 바람직한데, 이후에는 상기 세포를 신선한 배양 배지로 덮는다(실시예 13 참조).
이 단계에서는, 상기 언급된 증식과 탈분화 배지를 배양 배지로서 뿐만 아니라 표준 세포 배양 배지(예를 들면, RPMI)로서 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 방법이 끝날 무렵 배지 중에서 자유로이 부유하는 줄기 세포의 수를 증가시키기 위해, 세포를 단계 c) 말기와 단계 d) 이전에 생물학적으로 널리 관용되는 유기 용매와 접촉시킨다. 용매의 양은 10㎕ 내지 1㎖의 범위일 수 있다. 이는 바람직하게는, 탄소수 1 내지 4의 알코일이며, 에탄올을 부가하는 것이 특히 바람직하다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 세포를 앞서 규정된 생물학적으로 널리 관용되는 유기 용매의 증기 상, 바람직하게는 에탄올 증기와 접촉시킨다(실시예 2 참조). 유기 용매, 특히 바람직하게는 에탄올 증기에 대한 노출 시간은 4 내지 12시간, 바람직하게는 8 내지 10시간이어야 한다.
본 발명에 따르는 방법은, 이의 표면을 태아 송아지 혈청(FCS)으로 미리 피복시킨 바 있는 배양 용기에서 수행하는 것이 바람직하다(실시예 2 참조). 또 다른 한편으론, 남성 공여자로부터의 사람 AB-혈청을 사용할 수도 있다. FCS로 피복시키는 것은, 사용 전 및 얼마 간의 노출 시간, 특히 2 내지 12시간, 특히 바람직하게는 7시간의 노출 후 배양 용기의 표면을 FCS로 덮은 다음, 표면에 부착되지 않은 FCS를 적당한 방법으로 제거함으로써 수행할 수 있다.
유기 용매로의 처리가, 임의로 배양 배지 교환 후 단계 c) 이후에 일어나는 경우, 이러한 공정 단계에서는 세포가 이미 바닥으로부터 어느 정도는 떨어지게 되었다. (추가의) 떨어짐은 예를 들어, 미세한 세포 스크래퍼, 압설자 또는 피펫 팁을 사용하여 기계적으로 수행할 수 있다(실시예 13 참조).
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 세포를 완전히 떨어지게 하는 것은 적합한 효소, 예를 들면, 트립신으로 처리함으로써 수행한다(실시예 2 참조). 세포를 CO2의 존재 하에 35 내지 39℃, 바람직하게는 37℃에서 트립신 용액(0.1 내지 0.025g/l, 바람직하게는 0.05g/l)에 2 내지 10분 동안 노출시킬 수 있다.
이어서, 트립신 활성을 표준 방법에 의해 차단시키고, 지금 자유로이 부유하는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 표준 방법, 예를 들면, 원심분리에 의해 수득할 수 있고, 한 양태에서는 단계 d)의 말기에 적합한 세포 배양물에 현탁시킴으로써 수득할 수 있다. 이들 세포는 목적하는 표적 세포로의 즉각적인 분화를 위해, 지금 이용 가능하고, 적합한 배지, 예를 들면, RPMI 1640 또는 DMEM에 현탁되어 있다. 그러나, 이들을 상기 배지에서 수 일 동안 저장할 수도 있다. 바람직한 양태에서는, 세포를 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포로서 대략 48시간 이상 동안 배양물 내에 저장해야 하는 경우에는, 배지가 사이토킨 또는 LIF 인자(백혈병 억제 인자)를 함유한다[Nature 414: 94 (2001), Donovan, P.J., Gearhardt, J., 상기 인용문 참조]. 이러한 인자를 함유하는 배지에서는, 줄기 세포가 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포로서 적어도 10일 동안은 유지될 수 있다.
바람직한 양태에서는, 세포를 액상 배지에서 보다 장기간 저장하기 위해 현탁시킨 다음, 급속 동결시킨다. 살아 있는 세포를 급속 동결시키는 프로토콜은 당해 기술 분야에 공지되어 있다[참조: Griffith M., et al. "Epithelial Cell Culture, Cornea, in Methods of Tissue Engineering", Atala A., Lanza R.P., Academic Press 2002, Chapter 4, Pages 131 to 140]. 본 발명에 따르는 줄기 세포를 급속 동결시키는데 바람직한 현탁 배지는 FCS 함유 DMEM이다(실시예 2 참조).
본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 추가로 예시되고 기재된다.
실시예 내에서 별도로 규정되지 않는 한, 사용된 배지와 물질의 조성은 다음과 같다:
1. 페니실린/스트렙토마이신 용액:
생리적 염화나트륨 용액(NaCl 0.9%) 1ml당 페니실린 G의 나트륨 염으로서의 페니실린 10,000 단위 및 스트렙토마이신 설페이트로서의 스트렙토마이신 1000㎍.
2. 트립신-EDTA
0.5g 트립신 및 0.2g EDTA (4 Na)/l
3. 인슐린
이. 콜라이(E. coli)에서 생성된 사람 재조합 (대략 28 단위/mg)
4. RPMI 1640(1x, 액상(11875))은 L-글루타민을 함유한다
RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 배지 1640은 포유류 세포에 광범위하게 사용될 수 있는 증강된 제형이다.
성분 분자량 농도(mg/l) 몰 농도(nM)
무기 염
질산칼슘(Ca(NO3)24H2O) 236 100.00 0.424
염화칼륨(KCl) 75 400.00 5.30
황산마그네슘(MgSO4) 120 48.84 0.407
염화나트륨(NaCl) 58 6000.00 103.44
중탄산나트륨(NaHCO3) 84 2000.00 23.800
인산나트륨(Na2HPO4) 142 800.00 5.63
추가 성분
글루코즈 180 2000.00 11.10
글루타치온(환원) 307 1.50 0.0032
페놀 레드 398 5.00 0.0125
아미노산
L-아르기닌 174 200.00 1.10
L-아스파라긴 132 50.00 0.379
L-아스파라긴산 133 20.00 0.150
L-시스테인 디하이드로클로라이드 313 65.00 0.206
L-글루탐산 147 20.00 0.136
L-글루타민 146 300.00 2.05
글리신 75 10.00 0.133
L-히스티딘 155 15.00 0.0967
L-하이드록시프롤린 131 20.00 0.153
L-이소루이신 131 50.00 0.382
L-루이신 131 50.00 0.382
L-리신 하이드로클로라이드 146 40.00 0.219
L-메티오닌 149 15.00 0.101
L-페닐알라닌 165 15.00 0.0909
L-프롤린 115 20.00 0.174
L-세린 105 30.00 0.286
L-트레오닌 119 20.00 0.168
L-트립토판 204 5.00 0.0245
L-티로신 이나트륨, 이수화물 261 29.00 0.110
L-발린 117 20.00 0.171
비타민
바이오틴 244 0.20 0.008
D-칼슘 판토테네이트 477 0.25 0.0005
염화콜린 140 3.00 0.0214
폴산 441 1.00 0.0022
i-이노시톨 180 35.00 0.194
니아신아미드 122 1.00 0.0081
p-아미노벤조산(PABA) 137 1.00 0.0072
피리독신 HCl 206 1.00 0.0048
리보플라빈 376 0.20 0.0005
티아민 HCl 337 1.00 0.0029
비타민 B12 1355 0.005 0.00000369
[참조: Moore G.E., et al., J.A.M.A. 199: 519 (1967)]
5. PBS (Dulbecco's 인산염 완충 식염수)[참조: J. Exp. Med. 98: 167(1954)]:
성분 g/l
KCl 0.2
KH2PO4 0.2
NaCl 8.00
Na2PHO4 1.15
6. 2-머캅토에탄올
합성량: 함량 >98%, 밀도 1.115 내지 1.116 [참조: 예를 들어, Momo J., et al., J. Am. Chem. Soc. 73: 4961 (1951)].
7. 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque):
림프구 분리용 배지(삭카로즈/에피클로로하이드린 공중합물 Mg 400,000; 밀도 1.077, 나트륨 디아트리조에이트로 조정됨).
8. 레틴산:
비타민 A 산 (C20H28O2), 1mM에 상응하는 1.5ml PBS 중의 300㎕. 신경원과 신경교 세포를 프로그래밍하기 위한 배지로서, 10ml 배지(10-6M에 상응함)에 대해 150㎕를 사용한다.
9. DMEM
둘벡코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium)(고 글루코즈)
[참조: Dulbeco, R. et al., Virology 8: 396 (1959); Smith, J.D. et al., Virology 12: 158 (1960); Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6: 2 (1993)].
10. L-글루타민
액상: 29.2 mg/ml
11. 콜라게나제 유형 II:
[참조: Rodbell, M. et al., J. Biol. Chem. 239: 375 (1964)].
12. 인터루킨-3(IL-3):
이. 콜라이로부터의 재조합 사람 IL-3 [참조: Yang Y.C. et al., Cell 47: 10 (1986)]; 성숙한 IL-3을 포함한 133개 아미노산 잔사와 메티오닐 형태를 포함한 134개 아미노산 잔사를 대략 1:2의 비율로 함유함; 계산된 몰 질량 대략 17.5 kD; 고유 활성 1 x 103U/㎍; (R&D 카탈로그 번호 203-IL)
13. 대식 세포-콜로니 자극 인자 (M-CSF)
이. 콜라이로부터의 재조합 사람 M-CSF; 단량체(18.5kD)로서, N-말단 메티오닌을 포함한 135개 아미노산 잔사를 함유함; 몰 질량이 37 kD인 동종-이량체(homodimer)로서 존재함; (SIGMA 카탈로그 번호 M 6518)
14. 항체:
항원 CD14, CD31, CD90, CD117, CD123, CD135에 대해 본 실시예에서 사용된 항체는 시판되고 있다. 이들은 다음 공급원으로부터 수득되었다:
CD14: DAKO, 모노클로널 마우스 항-사람 CD14, 단구, 클론 TUK4, 코드 번호 M 0825, Lot 036 Edition 02.02.01;
CD31: PharMingen International, 모노클로널 마우스 항-랫트 CD31 (PECAM-1), 클론 TLD-3A12, 카탈로그 번호 22711D, 0.5mg;
CD90: Biozol Diagnostics, Serotec, 마우스 항-사람 CDw90, 클론 번호 F15-42-1, MCAP90, 배치 번호 0699;
CD117; DAKO, 모노클로널 마우스 항-사람 CD117, c-kit, 클론 번호 104D2, 코드 번호 M 7140, Lot 016, Edition 04.05.00;
CD123: Research Diagnostics Inc., 마우스 항-사람 CD123 항체, 클론 9F5, 카탈로그 번호 RDI-CD123-9F5;
CD135: Serotec, 마우스 항-사람 CD135, MCA1843, 클론 번호 BV10A4H2.
실시예 1
전혈로부터의 단구의 분리
혈액 응고를 피하고 세포를 공급하기 위해, 3-챔버 봉지 세트 중의 전혈 450ml를, H2O 1리터당 3.27g 시트르산, 26.3g 삼나트륨 시트레이트, 25.5g 덱스트로즈 및 22.22g 나트륨 디하이드록시포스페이트를 함유하는 안정화 용액 63ml와 혼합한다. 이 용액의 pH 값은 5.6 내지 5.8이다.
이어서, 상기 혼합물을 20℃에서 7분 동안 4000rpm으로 "신속한 원심분리"를 수행하여 혈액 성분을 분리시킨다. 이로써, 소체 성분과 비-소체 성분의 3겹 층배열이 형성된다. 이러한 목적을 위해 제공된 압착기 내로 상기 봉지 세트를 삽입시킴으로써, 적혈구를 하단 봉지 내로 압착시키고, 혈장은 상단 봉지 내로 압착시키며, "연막"은 중간 봉지 내에 유지시키는데, 이는 대략 50ml 용적을 함유한다.
이어서, 신선하게 수득된 "연막" 50ml의 양을 각 25ml씩 2 분획으로 나눈 다음, 이들 각각을, 사전에 2개의 50ml 팔콘(Falcon) 튜브 내로 도입시킨 25ml 피콜-하이파크 분리용 배지로 피복시킨다.
상기 혼합물을 30분 동안 2500rpm으로 연속해서(제동없이) 원심분리시킨다. 그 후, "연막"에 여전히 존재하는 사멸 세포와 적혈구는 피콜 상 아래에 놓여져 있는 반면, 단구를 포함한 백혈구는 피콜 상에 백색의 분열간기(interphase)로서 분리된다.
이어서, 상기 단구의 백색 분열간기를 조심스럽게 피펫팅하여 제거하고, 인산염 완충 생리 식염수(PBS) 10ml와 혼합하였다.
이어서, 상기 혼합물을 10분 동안 3회 제동을 걸면서 1800rpm으로 원심분리시키고; 각 원심분리 후에 상등액을 피펫팅하여 제거하고, 신선한 PBS로 채워 넣었다.
원심분리용 용기(피콜 튜브) 기저 상에 수집된 세포 침강물은 단핵성 세포 분획, 즉 단구를 함유하였다.
실시예 2
단구의 증식 및 탈분화
한편으론 단구를 배양 및 증식시키고, 또 다른 한편으론 세포를 탈분화시키는 것은 다음 조성의 영양 배지에서 1 단계로 수행하였다.
RPMI 1640 배지 440ml
태아 송아지 혈청(FCS) 50ml
페니실린/스트렙토마이신 용액 5ml
2-머캅토에탄올(스톡 용액) 5ml
총 용적 500ml
상기 영양 배지는 2.5㎍/500ml의 M-CSF와 0.2㎍/500ml의 인터루킨-3(IL-3)을 추가로 함유한다.
실시예 1에서 분리된 단구를, 각 경우에 있어 챔버당 대략 105개 세포의 양으로 6-챔버 웰 판(웰당 30mm 직경)의 5개 챔버 내로 옮기고, 각 경우에 있어 상기 언급된 영양 배지 2ml로 채워 넣었다. 상기 6-웰 판에, 순수한 불활성화 FCS를 미리 채워 놓고, 대략 7시간 후에 FCS를 경사 제거하여, 이러한 방식으로 FCS-피복된 판을 수득하였다. 웰당 정확한 용량에 대한 세포 수는 공지된 방법에 따라서 결정하였다[참조: Hay R.J., "Cell Quantification and Characterisation" in Methods of Tissue Engineering", Academic Press 2002, Chapter 4, Pages 55-84].
6-웰 판에 이의 뚜껑을 덮고, 37℃ 하의 항온 배양기에서 6일 동안 저장하였다. 24시간 후에, 세포는 챔버 바닥에 침강하였다. 격일로 상등액을 피펫팅하여 제거하고, 6-웰 판의 챔버 각각에 신선한 영양 배지 2ml를 다시 채워 넣었다.
6일째에는, 빈채로 있는 6-웰 판의 6번째 챔버 내로 70% 에탄올 2ml를 도입하고, 상기 판을 다시 밀봉한 다음, 37℃ 하의 항온 배양기 내에서 10시간 더 저장하였다.
이의 후속으로, PBS를 사용하여 1:10으로 희석시킨 트립신 용액 1ml를 피펫팅하여, 세포를 함유하고 있는 웰 판의 챔버 각각에 도입하였다. 밀봉시킨 웰 판을 항온 배양기 내에서 5% CO2하의 37℃에서 5분 동안 놓아 두었다.
이어서, 각각의 웰에 RPMI 1640 배지 2ml를 부가함으로써, 트립신 활성을 차단시켰다. 각 챔버 내의 총 상등액(1ml 트립신 + 2ml 배지)을 피펫팅하여 제거하고, 15ml 팔콘 튜브에 모은 다음, 10분 동안 1800rpm으로 원심분리시킨다. 이어서, 상등액을 경사 제거하고, 침전물을 신선한 RPMI 1640 배지(2ml/105개 세포)와 혼합하였다.
이러한 세포 현탁액은, 상이한 표적 세포로의 분화에 직접적으로 사용될 수 있었다.
또 다른 한편으론, 트립신 함유 상등액을 원심분리 및 경사 제거한 후, 세포를 동결 배지로서의 DMSO/FCS와 혼합하고, 106/ml의 농도에서 급속 동결시킨다.
동결 배지는 95% FCS와 5% DMSO를 함유하였다. 각 경우에 있어, 대략 106개 세포를 배지 1ml에 흡수시키고, 다음 단계로 냉각시킨다:
얼음 상에서 30분;
예비-냉각된 스티로포프(Styropor) 박스에서 -20℃ 하에 2시간;
스티로포르에서 -80℃ 하에 24시간;
-180℃ 하에 액체 질소(N2) 중의 튜브에서 저장.
상기 공정에 따라서 생성된, 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 세포 집단을 면역조직화학적 표현형별 검사(phenotyping)하기 위해, 각 경우에 있어 105개 세포를 취하고, 추가의 조직화학적 염색을 위해 이를 슬라이드 상에 사이토스핀(cytospin) 제제로서 고정시킨다[참조: Watson, P. "A slide centrifuge; an apparatus for concentrating cells in suspension on a microscope slide." J. Lab. Clin. Med., 68: 494-501 (1966)]. 이어서, APAAP 레드 복합체를 사용하고 문헌[Cordell, J.L., et al., 하기 인용문 참조]에 기재된 기술을 사용하여, 상기 세포를 염색시킬 수 있었다. 달리 지시되지 않는 한, 부가된 1차 항체는 PBS를 사용하여 1:10으로 희석시키고, 각 경우에 있어 상기 농도의 항체 200㎕를 사용하였다. 표 1에 열거된 세포 항원 에피토프에 대한 1차 항체로서 모노클로널 항체를 사용하였다. 도 6은 염색된 사이토스핀 제제와, 줄기 세포 마커 CD90, CD117, CD123 및 CD135의 상응하는 증거를 도시한 것이다.
염색 기술에 관한 문헌
[참조: Cordell J.L., et al. "Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes)." J. Histochem. Cytochem. 32: 219-229 (1984)].
마커에 관한 문헌:
CD14
[참조: Ferrero E., Goyert S.M. "Nucleotide sequence of the gene encoding the monocyte differentiation antigen, CD14" Nucleic Acids Res. 16:4173-4173 (1988)].
CD31
[참조: Newman P.J., Berndt M.C., Gorski J., White J.C. II, Lyman S., Paddock C., Muller W.A. "PECAM-1(CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily" Science 247: 1219-1222 (1990)].
CD90
[참조: Seki T., Spurr N., Obata F., Goyert S., Goodfellow P., Silver J. "The human thy-1 gene: structure and chromosomal location" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6657-6661 (1985)].
CD117
[참조: Yarden Y., Kuang W.-J., Yang-Feng T., Coussels L., Munemitsu S., Dull T.J., Chen E., Schlessinger J., Francke U., Ullrich A. "Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand." EMBO J. 6: 3341-3351 (1987)].
CD123
[참조: Kitamura T., Sato N., Arai K., Miyajima A. "expression cloning of the human IL-3 receptor cDNA reveals a shared beta subunit for the human IL-3 and GM-CSF receptors." Cell 66: 165-1174 (1991)].
CD135
[참조: Small D., Levenstein M., Kim E., Carow C., Amn S., Rockwell P., Witte L., Burrow C., Ratajazak M.Z., Gewirtz A.M., Civin C.I. "STK-1, the human homolog of Flk-2/Flt-3, is selectively expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the proliferation of early progenitor/stem cells." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 459-463 (1994)].
본 발명에 따르는 줄기 세포의 항원 발현
항원 색 반응
줄기 세포 마커
CD90 ++
CD117 +
CD123 ++
CD135 +(+)
분화 마커
CD14(단구) +
지시된 등급 매기기는 탐지된 항원 실증성(positivity)에 상응하는데, 이는 단구를 상응하는 특정의 배지에서 배양한지 4일에서 9일 후에 명백해졌으며, 이는 각각의 사이토스핀 착색물을 음성 대조군(1차 항체를 사용하지 않고 관찰된 착색물)과 현미경으로 비교함으로써 수행되었다.
+ 상기 세포와 1차 항체와의 명백한 색 반응;
++ 상기 세포와 1차 항체와의 강력한 색 반응.
전형적인 줄기 세포 형태(도 6 참조)를 지닌, 생명 유지에 필요한 세포를 70% 이상 갖는 사이토스핀 제제만을 평가하였다. 이들 세포의 1% 미만이 CD34 항원을 발현하였다.
실시예 3
완전히 성장한 줄기 세포로부터의 신경원과 신경교 세포의 생성
신경원과 신경교 세포의 생성은 직경이 100mm인 페트리 디쉬(petri dish)에서 수행한다. 이러한 페트리 디쉬를 준비하기 위해, 순수한 불활성화 태아 송아지 혈청(FCS) 5ml를 각 디쉬에 도입하여, 바닥을 덮는다. 7시간 후, 페트리 디쉬의 바닥에 부착되지 않은 FCS 분획을 피펫팅하여 제거한다. 실시예 2에 따라서 생성된 세포 대략 106개를 상기 준비된 페트리 디쉬 중의 1개에 도입하고, 다음 조성의 영양 배지 10ml를 가한다:
DMEM 용액 440ml
태아 송아지 혈청(FCS) 50ml
l-글루타민 5ml
페니실린(100U/l)/스트렙토마이신(100㎍/l) 용액 5ml
총 용적 500ml
상기 영양 배지는 레틴산을 1 x 10-6M/500ml의 양으로 추가로 함유하였다.
사용된 줄기 세포가 신경원과 신경교 세포로 재프로그래밍/분화되는 것은 10일 이내에 이루어졌으며, 이때 배지는 대략 3일 간격으로 바꾸었다. 이 기간 후, 상기 세포는 대부분이 챔버 바닥에 부착되었으며, 줄기 세포에 대해 앞서 기재된 바와 유사한 방식으로 간단하게 트립신 처리함으로써 판 바닥으로부터 떨어지게 할 수 있었다.
실시예 4
신경원 전구체 세포, 신경원 및 신경교 세포의 증거
탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포에 의해 유도된 표적 세포의 면역조직화학적 성상을 나중에 확인하기 위해, 6-웰 판(챔버당 직경 30mm)의 바닥에 놓여져 있고 웰 판당 영양 배지 2ml와 함께 배양시킨, 단구로부터 발생된 줄기 세포(105개 세포/유리 뚜껑)를 유리 뚜껑(20mm x 20mm)에 적용하였다. 각각의 표적 세포가 분화된 후, 이들을 다음과 같이 고정시켰다: 영양 배지(상등액)를 제거한 후, 배양된 표적 세포에 2ml 메탄올을 부가함으로써 상기 세포를 고정시키는데, 이는 10분에 걸쳐 수행되었다. 연속해서, 상기 에탄올을 피펫팅하여 제거하고, 웰 판을 PBS(각 경우에 있어 2ml)로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 문헌[참조: Cordell J.L., et al. "Immunoenzymatic labeling monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes)." J. Histochem. Cytochem. 32: 219-229 (1994)]에 기재된 기술을 사용하여 APAAP 레드 복합체로 염색할 수 있었다. 달리 지시되지 않는 한, 부가된 1차 항체는 PBS를 사용하여 1:10으로 희석시키고, 각 경우에 있어 이러한 농도의 항체 200㎕를 피펫팅하여 6 웰 각각에 도입하였다.
세포를 S100-항원에 대한 항체로 염색함으로써, 신경원 전구체 세포를 탐지하였다[도 1(x200)의 중간 그림 참조].
상응하는 특이적 항체(PBS를 사용하여 1:300으로 희석시킨 1차 항체)를 사용하여 시납토피신 MAP2(미소관 관련 단백질 2) 또는 신경세사(neurofilament) 68을 특이적 발현시킴으로써, 신경원을 탐지하였다[도 1(x200)의 우측 그림 참조].
GFAP(신경교 원섬유 관련 단백질)(PBS를 사용하여 1:200으로 희석시킨 1차항체)를 탐지함으로써, 성상세포와 같은 신경교 세포를 동정하였다[도 1(x200)의 좌측 그림 참조].
신경원 및 신경교 세포의 분리는, 예를 들어, 문헌[참조: Carmiol S., "Cell Isolation and Selection" Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Chapter 2, Pages 19-35]에 기재된 바와 같은 공정에 따라서 MACS(자기 활성화 세포 분류법)에 의해, MAP2(신경원) 또는 GFAP(신경교 세포)에 대해 특이적인 항체를 사용하여 수행하였다.
염색에 의해 가시화된 세포 유형이 도 1에 도시되어 있다.
실시예 5
단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포로부터의 내피 세포의 생성
내피 세포를 배양하기 위해, 마트리겔(Matrigel®; Beckton and Dickinson, Heidelberg, DE)를 매트릭스로서 사용한다. 이 매트릭스는 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐 I 및 IV로 이루어진다.
동결된 매트릭스를 12시간에 걸쳐 4℃ 하의 냉장고 안에서 서서히 해동시킨다. 이 동안, 이의 상태가 변하였는데, 즉 본래의 고체 매트릭스가 스폰지/액체로 되었다. 각각의 웰 바닥을 덮는 방식으로, 상기 상태의 매트릭스를 48-웰 판(웰당 10mm 직경)에 도입하였다.
적용 후, 겔이 부착 층으로서 바닥에서 고형화될 때까지, 상기 판을 실온에서 30분 동안 유지시킨다.
후속으로, 웰당 대략 1 x 102개 세포를, 영양 배지(실시예 2에 기재된 바와 같음)가 부가된 마트리겔 상에서 항온 배양한다.
4 내지 5일 후, 첫 번째 세관성 세포 스트랜드가 나타났으며, 이는 6 내지 8일 후에 3차원적 세포 네트워크로 전개되었다. 이러한 세포 상에서, 각각의 특이적 1차 항체(각 경우에 있어 PBS를 사용하여 1:100으로 희석시킴, 200㎕)를 사용하여 내피 마커 CD31 및 인자 VIII를 동정할 수 있다.
또 다른 방법으로는, 액화 매트릭스를 용기-인공 삽입물에 적용한 다음, 이를 실시예 2에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 완전히 성장한 줄기 세포로 피복시킨다. 대략 6일 후, 인공 삽입물을 원형 방식으로 피복시킨 내피 세포 론(lawn)을 동정할 수 있었다.
상응하는 내피-특이적 항체(상기 참조)로 염색함으로써 가시화된 내피 세포가 도 2에 도시되어 있다. 중간 그림에서는, 마트리겔 상에서 5일 동안 항온 배양한 후의 세포가 도시되어 있다. 첫 번째 세관 스트랜드가 개개의 세포 응집체와 합한다. 암갈색 표식된 세포는 CD31 항원을 발현한다(황색 필터를 이용한 x200). 8일 후, 3차원적 네트워크 구조 형성 증가가 일어난다(항-CD31-항원 염색, 황색 필터를 이용한 x200). 12일 후, 마트리겔 상에서 배양시켜 온, 새로이 분화된 CD31+세포가 다층 벽 구조를 지닌 용기-유사 3차원 튜브를 형성하는데, 이는 이미 형태학적으로 용기를 생각나게 한다. 지금 거의 모든 세포가 CD31 항원을 발현하는 것으로 인식된다(CD31 착색물, x400, 블루 필터)[우측 그림 참조].
실시예 6
지방 세포(adipocyte)의 생성
A: 실시예 2에 따르는 완전히 성장한 줄기 세포를 지방 세포로 프로그래밍/분화하기 위해, 먼저 조건화된 배지를 생성시킨다. 이를 위해, 단구 유래의 사람 혈액으로부터 자가 유래 지방 조직, 즉 동일한 사람 공여자로부터의 지방 조직 20g을 다음과 같이 처리하였다:
먼저, 지방 조직을 페트리 디쉬에서 파쇄시키고, 이와 같이 파쇄된 조직 조각을 시브(sieve)(구멍 직경 100㎛) 내로 통과시킨다.
이어서, 이로써 수득된 현탁액을 직경이 100mm인 페트리 디쉬로 옮기고, 30mg 콜라게나제 유형 II 함량을 지닌 10ml DMEM-배지를 가한다. 이 혼합물을 실온(22℃±2℃)에서 대략 60분 동안 방치시켜 두어, 콜라게나제가 지방 세포 상에서 효과를 발휘하도록 한다.
연속해서, 상기 혼합물을 50ml용 팔콘 튜브에 옮기고, 튜브를 10분 동안 1800rpm으로 원심분리시킨다.
원심분리시킨 후, 상등액을 경사 제거하고, 지방 세포와 전구체 세포로 이루어진 세포 펠릿을 다음 조성의 배지 8ml에 흡수시키고, 37℃ 하의 항온 배양기에서 10일 동안 페트리 디쉬(직경 100mm)에서 항온 배양한다:
DMEM 용액 444.5ml
태아 송아지 혈청(FCS) 50ml
인슐린 용액 0.5ml
페니실린(100U/l)/스트렙토마이신(100㎍/l) 용액 5ml
총 용적 500ml
상기 인슐린 용액은, 2ml의 아세트산 물(40ml의 H2O와 0.4ml의 빙초산으로이루어짐)에 용해된 18mg 인슐린(Sigma 1-0259)를 함유하였다. 이 용액은 아세트성 물을 사용하여 1:10으로 희석시킨다.
10일 간에 걸친 항온 배양 동안, 지방 세포-조건화 배지(FCCM)가 상등액을 형성하였다. 각 경우에 있어 2 내지 4일 후에, 상기 상등액을 신선한 영양 배지로 대체시킨다. 각각의 배지 변화 동안 수득된 FCCM을 멸균 여과시키고, -20℃에서 저장하였다. 연속해서, 상기 언급된 FCCM 10ml를 실시예 2에 따르는 줄기 세포 대략 106개와 함께 페트리 디쉬(직경 100mm) 내로 도입하였다. 지방 소포(vacuole)를 함유하는 제1 전구체 세포는 4일 후에 가시화되었다(도 3A). 6일 후에, 단일 지방 세포가 나타났는데, 이는 수단 레드(Sudan red)로 염색할 수 있었다(도 3B 및 C). 10일 후에는, 이들 세포의 전형적인 응집과 클러스터 형성이 있었는데, 이 단계에서는 이미 육안으로 지방 조직으로서 관찰될 수 있었다(도 3D).
따라서, 도 3A 내지 3D에서 염색에 의해 가시화된 지방 세포는 대조군 3E 및 3F와는 상당히 상이한데: 도 3E는 IL-3과 2-머캅토에탄올을 부가하지 않은 영양 배지(실시예 2에 지시된 바와 같음)에서 6일 동안 배양시킨, 단구성 기원의 세포를 도시한 것이다. 이어서, FCCM을 부가하였다. 이들 세포는 지방 세포로 분화될 수 없었다. 도 F는 완전 배지(실시예 2에 따름)와 함께 6일 동안 배양시킨 다음, FCCM 대신 영양 배지(실시예 2에 따름)로 6일 더 처리시킨 세포를 도시한 것이다. 이로써, FCCM은 지방 세포로 분화시키기 위한 시그널을 제공하는데 요구되는 성분들을 함유한다.
도 3A, B, C 및 D에서 세포를 수단 레드로 염색하는 것은 문헌[참조: Patrick Jr., C.W., et al. "Epithelial Cell Culture: Breast", in Methods of Tissue Engineering", Academic Press 2002, Chapter 4, Pages 141-149]에 의해 기재된 방법에 따라서 이루어졌다.
B: 수단 레드로 염색함으로써 지방 세포를 표현형별 검사하는 것 이외에도, 지방 세포의 분자-생물학적 성상 확인을 mRNA 수준으로 수행하여, 사용된 지방 세포 조건화 배지로의 상응하는 프로그래밍 후에, 지방 세포의 유전적 프로그램이 상응하는 변형을 진행하는지의 여부와, 지방 세포에 대해 기재된 특유의 메신저-리보핵산(mRNA) 전사체가, 프로그램 가능한 단구로부터 프로그램된 지방 세포에서 동정될 수 있는지의 여부를 검사하였다. 지방 세포 대사 특유의 2개의 mRNA 서열이, 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포로부터 분리된 RNA 샘플로부터 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었으며, 이와 병행한 시험 화합물에서는 프로그램된 지방 세포로부터 증폭되었는데, 즉 "페록시솜 증식성 활성화 수용체 감마"(PPARG)-mRNA[참조: Tontonoz, P., et al. "Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor." Cell 79: 1147-1156 (1994), gene bank acess code number; NM_005037] 및 "렙틴(비만 상동체, 마우스)"-mRNA[참조: Zhang Y., et al. "Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue." Nature 372: 425-432 (1994), gene bank acess code number; NM_000320]가 증폭되었다.
이를 위해 필요한 RNA-분리, 역전사 방법, 및 목적하는 mRNA 서열의 PCR 증폭 조건은 당해 기술 분야에 상세히 기재된 바와 같이[참조: Ungefroren H., et al., "Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis", Cancer Res. 58: 1741-1749 (1998)] 수행하였다.
이를 위해서는, 정배향 프라이머와 역배향 프라이머가 mRNA 서열에 결합되는데, 이의 염색체성 유전자 내의 상동 영역이 2개의 상이한 엑손 내에 위치하고, 큰 인트론에 의해 서로 떨어져 있도록, PCR 증폭용으로 생성된 각각의 프라이머를 선택한다. 이로써, 수득된 증폭 단편이 세포 내에 함유되어 있는 mRNA로부터 유래된 것이며, 염색체성 DNA 내에 존재하는 서열로부터 유래된 것은 아니라는 사실을 확인할 수 있었다. 특히, 다음 프라이머 서열이 PPAR-γ 및 렙틴용으로 선택되었다:
PPAR-γ: 정배향 프라이머; 265-288(엑손 1에서 상응하는 유전자 서열), 역배향 프라이머: 487-465(엑손 2에서 상응하는 유전자 서열), 이로써, 487-265bp = 223bp의 증폭 단편이 생성된다(도 3G 참조). 도 3G에 의해 추가로 도시된 바와 같이, 전사된 미량의 PPAR-γ-특이적 mRNA는, 지방 세포 자체에서 보다는 상당히 더 협소한 시그널 밴드를 나타내긴 하지만, 프로그램 가능한 줄기 세포 및 종양 세포주 HL-60(사람 전골수성 백혈병 세포주 기원)에서 이미 동정할 수 있었다. 이와는 달리, 지방 세포-특이적 단백질 렙틴은 역전사효소 PCR에 의해 mRNA 수준에서, 프로그램 가능한 줄기 세포로부터 유도된 지방 세포에서만 탐지될 수 있었다.
대조군으로서 사용된 프로그램 가능한 줄기 세포(progr.stem cell), 및 사람 종양 세포주 HL-60, Panc-1 및 WI-38은 렙틴을 전혀 전사하지 않는다. 음성 대조군으로서, 역전사효소(지방 세포-RT)를 부가하지 않은 샘플과 H2O-샘플 모두를 동시에 함께 결정하였다. 양성 대조군에서 GAPDH "하우스-키핑(house-keeping)" 유전자를 동정함으로써, 각각의 PCR 증폭 단계가 개개의 혼합물에서 적절하게 수행되었다는 것은 확실하다.
실시예 7
간 세포(hepatocyte)의 생성
A: 실시예 2에 따르는 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 간 세포로 프로그래밍하기 위해, 먼저 조건화된 배지를 생성시킨다. 이를 위해, 사람 간 조직 40g을 다음과 같이 처리하였다:
먼저, 간 조직을 PBS에서 수 차례 세정하여, 적혈구를 거의 제거하였다. 이어서, 상기 조직을 페트리 디쉬에서 파쇄시키고, 해리 용액과 함께 실온에서 대략 45분 동안 항온 배양하였다. 이러한 해리 용액은 40ml PBS(인산염 완충 식염수), PBS로 1:10으로 희석시킨 트립신 용액 10ml 및 30mg 콜라게나제 유형 II로 구성되었다[참조: Rodbel M., et al., J. Biol. Chem. 239: 375 (1964)]. 45분 동안 항온 배양한 후, 조직 조각을 시브 내로 통과시킨다(실시예 6 참조).
이어서, 상기 혼합물을 50ml용 팔콘 튜브에 옮기고, PBS로 50ml가 되도록 채운 다음, 10분 동안 1800rpm으로 원심분리시킨다.
원심분리시킨 후, 상등액을 경사 제거하고, 간 세포를 함유하는 세포 펠릿을 50ml PBS로 다시 세척한 다음, 원심분리시킨다. 이로써 생성된 상등액을 다시 경사 제거하고, 세포 펠릿을 다음 조성의 배지 25ml에 흡수시키고, 37℃ 하의 항온 배양기에서 10일 동안 세포 배양 플라스크(250ml 용적)에서 항온 배양한다:
간 세포 성장 배지
간 세포 성장 배지, LCGM
RPMI 1640 배지 445ml
태아 송아지 혈청(FCS) 50ml
인슐린 용액 0.5ml
페니실린(100U/l)/스트렙토마이신(100㎍/l) 용액 5ml
총 용적 500ml
상기 영양 배지는 또한, 5㎍(10ng/ml)의 표피 성장 인자를 함유하였다[참조: Pascall, I.C. et al., J. Mol. Endocrinol. 12: 313 (1994)]. 인슐린 용액의 조성은 실시예 6에 기재된 바와 같다.
10일 간에 걸친 항온 배양 동안, 간 세포 조건화 배지(LCCM)가 상등액으로서 형성되었다. 2 내지 4일 후에, 상기 상등액을 신선한 영양 배지로 각각 대체시킨다. 각 경우에 있어 배지 변화 동안 수득된 각각의 LCCM을 멸균 여과시키고(공극 크기가 0.2㎛인 필터를 사용함), -20℃에서 저장하였다.
이어서, 1 x 106개의 탈분화된 줄기 세포를 다음 조성의 배지 10ml와 함께 페트리 디쉬(Ø100mm) 또는 배양 플라스크에서 배양한다:
간 세포 분화 배지
(간 세포 분화 배지, LCDM):
LCCM 100ml
인슐린 용액(실시예 6 참조) 0.1ml
표피 성장 인자 1㎍
간 세포 성장 인자 2㎍
간 세포 성장 인자[참조: Kobayashi, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 7 (1996)]는 40ng/ml의 농도로 사용되었다. 수 일 후, 평편한, 다각형 일배성 및 이배성 세포로의 형태학적 변화가 관찰될 수 있었다(도 4A). 도 4B 및 4C에 도시된 바와 같이, 10 내지 12일 후, 탈분화된 줄기 세포로부터 발생된 간 세포는, 간-특이적 항원 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein)의 면역조직화학적 탐지에 의해 동정될 수 있었다[참조: Jacobsen, G.K. et al., Am. J. Surg. Pathol. 5: 257-66 (1981)].
B: 알파-페토프로테인을 면역조직화학적 동정함으로써 간 세포를 표현형별 검사하는 것 이외에도, 간 세포의 분자-생물학적 성상 확인을 mRNA 수준으로 수행하여, 사용된 간 세포 조건화 배지로의 상응하는 프로그래밍 후에, 줄기 세포의 유전적 프로그램이 상응하는 변형을 진행하는지의 여부와, 본 발명에 따르는 줄기 세포로부터 발생된 간 세포에서, 간 세포 특유의 것으로 기재된 메신저-리보핵산(mRNA) 전사체를 동정할 수 있는지의 여부를 검사하였다. 이를 위해, 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포로부터 분리된 RNA 샘플과, 이와 병행한 시험 샘플에서는 줄기 세포를 프로그래밍함으로써 수득된 간 세포로부터 분리된 RNA 샘플에서 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여, 간 세포 특유의 5가지 상이한 mRNA 서열의 존재 여부를 검사하였다. 특히, 이러한 mRNA 서열은 호모 사피엔스(Homo sapiens) 알부민-mRNA[참조: Lawn, R.M., et al. "The sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E. coli." Nucleic Acids Res. 9: 6103-6114 (1981), gene bank acess code number; NM-000477], 알파-페토프로테인-mRNA[참조: Morinaga T., et al. "Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4604-4608 (1983), gene bank acess codenumber; V01514], 사람 카바밀 포스페이트 신테타제 I mRNA[참조: Haraguchi, Y., et al. "Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamyl phosphate synthetase I: molecular analysis of hyperammonemia" Gene 107: 335-340 (1991), gene bank acess code number D90282], 호모 사피엔스 응고 인자 II(트롬빈, F2) mRNA[참조: Degen, S.J. et al. "Characterization of the complementary deoxyribonucleic acid and gene coding for human prothrombin" Biochemistry 22: 2087-2097 (1983), gene bank acess code number NM-000506], 호모 사피엔스 응고 인자 VII(혈청 프로트롬빈 전환 촉진인자, F7) mRNA[참조: NCBI Annotation Project. Direct Submission, 06-Feb-2002, National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA, gene bank acess code number XM-027508]이다.
이러한 역전사 방법에 필요한 RNA-분리, 및 목적하는 mRNA 서열의 PCR 증폭 조건은 당해 기술 분야에 상세히 기재된 바와 같이[참조: Ungefroren H., et al., "Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosis", Cancer Res. 58: 1741-1749 (1998)] 수행하였다.
정배향 프라이머와 역배향 프라이머가 mRNA 서열에 결합되는데, 이의 염색체성 유전자 내의 상동 영역이 2개의 상이한 엑손 내에 위치하고, 큰 인트론에 의해 서로 떨어져 있도록, 각각의 PCR 증폭용 프라이머를 선택한다. 이로써, 수득된 증폭 단편이, 세포 내에 함유되어 있는 mRNA로부터 유래된 것이며, 염색체성 DNA 내에 존재하는 서열로부터 유래된 것은 아니라는 사실을 확인할 수 있었다.
다음에 지시된 프라이머 서열이 선택되었다; 각각의 PCR 분석 결과가 도 4D에 재현되었다. 본 발명에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포는 "프로그램 가능한 줄기 세포(progr.stem cell)"로서 지칭되고, 이들을 프로그래밍함으로써 유도된 간 세포는 "프로그램된 간 세포(progr.hepatocyte)"로서 지칭된다.
▶ 알파-페토프로테인: 정배향 프라이머: 1458-1478(엑손 1에서 상응하는 유전자 서열), 역배향 프라이머: 1758-1735(엑손 2에서 상응하는 유전자 서열), 이로써, 1758-1458bp = 391bp의 증폭 단편이 생성된다(도 4D 참조).
도 4에 도시된 바와 같이, 그 자체가 알파-페토프로테인에 대한 동정 가능한 어떠한 특이적 mRNA 전사체도 함유하고 있지 않은 프로그램 가능한 줄기 세포(progr. stem cell)는 이러한 mRNA 전사체(301bp의 분자량을 갖는 양성 밴드)를 함유하는 간 세포로 프로그램(progr. hepatocyte)될 수 있다. 이는 또한, 도 4B 및 4C에 도시된 바와 같이, 알파-페토프로테인의 면역조직화학적 탐지 능력을 설명해준다. 양성 대조군, 즉 사람 간 조직 및 사람 종양 세포주 HepG2는 또한, 301bp 밴드로써 확인된 바와 같이, 알파-페토프로테인-특이적 mRNA를 전사한다.
▶ 알부민: 정배향 프라이머: 1450-1473(엑손 1에서 상응하는 유전자 서열), 역배향 프라이머: 1868-1844(엑손 2에서 상응하는 유전자 서열), 이로써, 1868-1450bp = 419bp의 증폭 단편이 생성된다(도 4D 참조).
도 4D는 프로그램 가능한 줄기 세포에서 이미 전사된 미량의 알부민-특이적 mRNA를 도시하고 있지만, 이러한 줄기 세포를 프로그래밍함으로써 수득된 간 세포와, 정상적인 간 조직 뿐만 아니라 종양 세포주 HepG2(후자 둘 다는 양성 대조군으로서 사용되었다)는 뚜렷한 밴드로써 인지될 수 있는 바와 같이 mRNA를 강력하게 발현한다.
▶ 카바밀 포스파타아제 신테타제 I: 정배향 프라이머: 3135-3157(엑손 1에서 상응하는 유전자 서열), 역배향 프라이머: 4635-4613(엑손 2에서 상응하는 유전자 서열), 이로써, 4635-3135bp = 1500bp의 증폭 단편이 생성된다(도 4D 참조).
카바밀 포스페이트 신테타제 I은 "우레아 주기"에서 우레아의 대사에 중요한 역할을 하는, 간 세포에 특이적인 효소를 나타낸다. 이러한 해독 기능은 간 세포가 기능함으로써 보장받는다. 도 4D에 도시된 바와 같이, 프로그램 가능한 줄기 세포로부터 생성된 간 세포와 양성 대조군(사람 간 조직 및 HepG2-종양 세포주) 모두에서, 카바밀 포스페이트 신테타제 I에 대해 특이적인 mRNA 밴드(1500bp)를 동정할 수 있다. 프로그램된 간 세포(progr. hepatocyte)에 대한 mRNA 밴드의 다소 약한 발현은 배양 디쉬에 이용될 수 있는 기질이 결여되었기 때문이다.
▶ 응고 인자 II: 정배향 프라이머: 1458-1481(엑손 1에서 상응하는 유전자 서열), 역배향 프라이머: 1901-1877(엑손 2에서 상응하는 유전자 서열), 이로써, 1901-1458bp = 444bp의 증폭 단편이 생성된다(도 4D 참조).
이는 간 세포-특이적 단백질과 마찬가지로, 프로그램된 간 세포(progr. hepatocyte)와, 사람 간 조직으로부터의 양성 대조군에서 444bp 밴드 발현에 의해 mRNA 수준으로만 탐지될 수 있는 반면, 프로그램 가능한 줄기 세포(progr. stem cell)는 이러한 밴드를 나타내지 않는데, 즉 도 4D에 도시된 바와 같이 해당 유전자는 거기에서 전사되지 않는다.
▶ 응고 인자 VII: 정배향 프라이머: 725-747(엑손 1에서 상응하는 유전자 서열), 역배향 프라이머: 1289-1268(엑손 2에서 상응하는 유전자 서열), 이로써, 1289-725bp = 565bp의 증폭 단편이 생성된다(도 4D 참조).
응고 인자 II의 경우에서와 같이, 상기 단백질은 또한, 응고 인자 II 보다는 약하긴 하지만, 프로그램된 간 세포(progr. hepatocyte)와 양성 대조군(사람 간 조직에서만 전사된다(656bp에서의 밴드 참조). 프로그램 가능한 줄기 세포나 음성 대조군(H2O) 중의 어떤 것도 이러한 특이적 mRNA 밴드를 나타내지 못한다.
▶ 글리세린 알데히드 데하이드로게나제: "하우스-키핑 유전자"로서 지칭되기도 하는 상기 유전자는 모든 진핵 세포에서 탐지될 수 있고, PCR 증폭이 모든 샘플에서 적절하게 수행되었든지 간에 대조군으로서 제공될 수 있으며; 이는 병행해서 함께 결정하고, 각각의 세포 샘플로부터 한정된 양의 RNA를 부가함으로써 비롯된다.
▶ 음성 대조군으로서, H2O 샘플을 모든 시험에서 동시에 함께 결정하였다. H2O가 RNA로 오염되지 않은 경우에는, PCR 동안에 증폭물이 전혀 생성되지 않고, 밴드도 전혀 탐지될 수 없다(따라서, 이는 역-대조군으로서 제공된다).
실시예 8
피부 세포(각질 세포)의 생성
실시예 2에 따르는 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 피부 세포로 프로그래밍하기 위해서는, 먼저 조건화 배지를 생성시킨다. 이를 위해, 완전한 사람 피부 1 내지 2㎠를 다음과 같이 처리하였다:
먼저, 멸균성 조건 하에 상기 피부 재료로부터 피하 조직을 제거한다. 이어서, 이 조직을 격렬하게 진탕시킴으로써 멸균 용기 중에서 PBS로 총 10회 세척한다. 2번째 세척 후, 표식 제거된 연결 조직 잔사를 상기 조직으로부터 다시 제거한다.
이어서, 상기 피부 재료를 직경이 60mm인 페트리 디쉬에 놓아 두고, PBS를 사용하여 1:10으로 희석시킨 트립신 용액 3ml와 혼합한 다음, 작은 조각(대략 0.5 내지 1㎣)으로 절단시킨다. 이 후, PBS를 사용하여 1:100으로 희석시킨 트립신 용액 3ml를 상기 혼합물에 다시 가하고, 이 혼합물을 간헐적으로 진탕시키면서 60분 동안 37℃ 하에 항온 배양한다.
이어서, 보다 큰 입자는 침강시키고, 각질 세포를 함유하는 상등액은 따라 부어 제거한 다음, 5분 동안 800rpm으로 원심분리시킨다. 이로써 생성된 상등액을 피펫팅하여 제거하고, 세포 펠릿을 다음 조성의 배지 3ml에 흡수시키며, 37℃ 하의 항온 배양기에서 15일 동안 페트리 디쉬(Ø100mm)에서 항온 배양한다:
각질 세포 성장 배지
(각질 세포 성장 배지, KGM)
DMEM 333.5ml
태아 송아지 혈청(FCS) 50ml
햄스(Ham's) F12 배지 111ml
페니실린(100U/l)/스트렙토마이신(100㎍/l) 용액 5ml
인슐린 용액(실시예 6 참조) 0.5ml
총 용적 500ml
상기 영양 배지는 5㎍의 표피 성장 인자(정확한 명세에 대해서는 실시예 7참조)와 5mg의 하이드로코르티손[참조: Merck Index: 12, 4828]를 함유하였다.
15일 간에 걸친 항온 배양 동안, 각질 세포 조건화 배지(KCCM)가 상등액으로서 형성되었다. 2 내지 4일 후에, 각 경우에 있어 상기 상등액을 신선한 영양 배지로 대체시킨다. 각 경우에 있어 배지 변화 동안 수득된 KCCM을 멸균 여과시키고, -20℃에서 저장하였다.
이어서, 1 x 106개의 탈분화된 줄기 세포를 다음 조성의 배지 10ml와 함께 페트리 디쉬(Ø100mm) 또는 배양 플라스크에서 배양한다:
각질 세포 분화 배지
(각질 세포 분화 배지, KDM):
KCCM 100ml
인슐린 용액(실시예 6 참조) 0.5ml
표피 성장 인자(EGF) 1㎍
하이드로코르티손 1mg
각질 세포 성장 인자(KGF) 25㎍
문헌[참조: Finch et al., Gastroenterology 110: 441 (1996)]에 기재된 바와 같이, 각질 세포 성장 인자는 25ng/ml의 농도로 사용되었다.
수 일 후, 세포의 형태학적 변화가 관찰될 수 있었다. 6일 후, 각질 세포-특이적 항원인 사이토케라틴 5 및 6(이들 둘 다는 사용된 1차 항원에 의해 결합된다)[참조: Exp. Cell. Res. 162: 114 (1986)]을 탐지할 수 있었다(도 5A). 10일 후, 상당히 더 큰 개개 세포의 세포 부착이 배양물 내에서 이미 일어났으며, 이로써 밀집성 세포(confluent cell)의 가시적 세포 조직 조합물을 동정할 수 있게 되었다(도 5B).
실시예 9
분화되고 프로그램된 줄기 세포로부터의 인슐린-생산 세포의 생성
인슐린-생산 세포의 생성은 용적이 대략 250ml이고 편평한 벽을 갖는 배양 플라스크(T75 세포 배양 플라스크)에서 수행한다. 실시예 13에 따라서 생성된 세포 대략 5 x 106개를 다음에 지시된 배양 배지(인슐린 생산 세포용 분화 배지) 대략 5ml에 현탁시키고, 플라스크 내로 도입한 후, 배양 배지 15ml와 더 혼합한다. 상기 세포를 분화시키기 위해, 플라스크를 37℃ 및 5% CO2하의 항온 배양기에서 수평 위치로 항온 배양한다.
배양 배지[문헌(Rameya V.K. et al., Nature Medicine, 6(3), 278-282 (2000))에 따라서 변형됨]:
RPMI 1640 445ml
태아 송아지 혈청(FCS) 50ml
페니실린(100U/l)/스트렙토마이신(100㎍/l) 용액 5ml
니코틴아미드 620mg
글루코즈 360mg
총 용적 500ml
영양 배지는 표피 성장 인자를 10ng/ml의 양으로 추가로 함유하고, 간 세포 성장 인자를 20ng/ml의 양으로 추가로 함유하였다.
1시간 내에, 세포가 배양 용기 바닥에 부착된다. 인슐린 생성을 기준으로 하여 줄기 세포의 분화를 모니터하였다. 이를 위해, 배양 배지를 대략 2 내지 3일 간격으로 변화시키고, 매회 세포 상등액을 수집한 다음, -20℃에서 동결시켰다. 배양 플라스크 바닥에 부착되어 있는 세포는 실시예 2에 기재된 바와 같이 트립신 처리함으로써 떨어지게 할 수 있었다.
상이한 시점에 수집된 상등액의 인슐린 함량은 사람 인슐린에 대한 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정)을 통하여 측정하고[참조: Bruhn H.D., Folsch U.R. (Eds.), Lehrbuch der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik Pathobiochemie[Textbook of Laboratory Medicine, Principles, Diagnosis, Clinical Pathobiochemistry](1999), Page 189], 이를 배지의 블랭크 판독치와 비교하였다. 도 8에 재현된 결과는 배양한지 14일 후에 세포가 최대 수준의 인슐린 생성에 도달하였다는 것을 나타낸다. 분화 과정 동안 처리된 세포에 의해 생성된 인슐린 양은 14일 후에 3μU/ml로 증가하였지만, 대조군 배지에서는 사람 인슐린이 전혀 탐지되지 않았다. 도 8에서의 바(막대)는 각각, 3가지 독립적인 개개 실험으로부터 각각 결정된 3가지 별도 값을 나타낸다.
본 발명에 따라서 인슐린 생산 세포로 분화된, 탈프로그램된 줄기 세포에서 인슐린 생성을 결정하는 것에 이어, 탈분화를 수행한지 3주 후에도 단구-특이적 표면 항원 CD14를 여전히 발현하는 인슐린 생산 세포 분획을 결정하였다. 3주 후에도, 이들 세포의 상당 부분에서(약 30 내지 40%) 단구-특이적 항원 CD14가 탐지될 수 있었다.
실시예 10
탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포로부터 간 세포를 생성시키기 위한 또 다른 방법
실시예 7에 기재된 바와 같이, 간 세포-조건화 배지(LCCM)를 사용하는 또 다른(대체) 방안으로서, 다음에 지시된 영양 배지(Ha)에 의해, 본 발명의 줄기 세포를 간 세포로 분화시키는 것을 유도하였다. 줄기 세포로부터의 간 세포의 생성은결과적으로, 용적이 대략 250ml이고 편평한 벽을 갖는 배양 플라스크(T75 세포 배양 플라스크)에서 일어났다. 실시예 13에 따라서 생성된 세포 대략 5 x 106개를 다음에 지시된 개선된 배양 배지(Ha, 간 세포용 분화 배지) 대략 5ml 내로 도입하고, 플라스크 내로 도입한 후, 배양 배지 15ml와 더 혼합한다. 상기 세포를 분화시키기 위해, 플라스크를 37℃ 및 5% CO2하의 항온 배양기에서 수평 위치로 항온 배양한다.
간 세포용 분화 배지(Ha)[문헌(Schwarz et al., "Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells", J. Clin. Invest. 10 (109), 1291-1302 (2002))에 따라서 변형됨]:
RPMI 1640 445ml
태아 송아지 혈청(FCS) 50ml
페니실린(100U/l)/스트렙토마이신(100㎍/l) 용액 5ml
총 용적 500ml
영양 배지는 또한, 섬유아세포 성장 인자-4(FGF-4)를 3ng/ml의 양으로 함유하였다.
1시간 내에, 세포가 배양 용기 바닥에 부착된다. 알부민 생성을 기준으로 하여 줄기 세포의 분화를 모니터하였다. 이를 위해, 배양 배지를 대략 2 내지 3일 간격으로 변화시키고, 매회 세포 상등액을 수집한 다음, -20℃에서 동결시켰다. 배양 플라스크 바닥에 부착되어 있는 세포는 실시예 2에 기재된 바와 같이 트립신 처리함으로써 떨어지게 할 수 있었다.
상이한 시점에 수집된 상등액의 알부민 함량은 사람 알부민에 대한 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정)을 통하여 측정하고[Bethyl Laboratories Inc.의 프로토콜에 따르고, Schwarz et al., 상기 인용문 참조에 따름], 이를 배지의 블랭크 판독치와 비교하였다. 도 9에 제시된 결과는 14 내지 28일 간의 배양 동안에 세포의 알부민 생성이 거의 일정하게 유지되었다는 것을 나타낸다. 측정은, Ha 배지 부가 시간에 기준하여 0일(배지의 블랭크 판독), 14, 21, 28 및 30일째에 수행하였다. 각 경우에 있어 결정된 값은 약 5ng/ml, 450ng/ml, 425ng/ml, 440ng/ml 및 165ng/ml이다. 도 9에서의 바(막대)는 각각, 3가지 독립적인 개개 실험으로부터 각각 결정된 3가지 별도 값을 나타낸다.
실시예 11
탈분화된 줄기 세포로부터 유도된 간 세포에서의 알부민과 단구-특이적 항원 CD14의 공동 발현의 결정
탈분화된 줄기 세포로부터 유도된 간 세포에서의 알부민과 단구-특이적 항원 CD14의 공동 발현의 결정은 한편으론, 이중-염색법(A)에 의해 수행하고, 또 다른 한편으론, FACS 분석법(B)에 의해 수행한다.
A) 실시예 10에 따라서 간 세포로 분화된 본 발명에 따르는 줄기 세포를, 6-웰 판 중의 커버 유리(cover glass) 상에서 배양하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 메탄올로 고정시킨다. 이어서, 이중-염색을 수행하여, 한편으론 항원 CD14(단구의 표현형 마커)와, 또 다른 한편으론 알부민(간-특이적 마커)의 동시 발현을 탐지하였다.
이를 위해, 세포를 먼저, PBS 중에서 1:50으로 희석시킨 사람 알부민(기니아피그 대 사람 알부민)에 대한 1차 항체와 함께, 실시예 4에 기재된 바와 같이 항온 배양한다. 세척 단계를 수행한 후, PBS 중에서 1:50으로 희석시킨, 기니아 피그 항체와 결합하는 2차 항체 마우스 항-랫트와 함께 45분 동안 항온 배양한다. 이어서, APAAP 레드 복합체를 사용하고 문헌[Cordell J.L., et al. 상기 인용문 참조]의 방법을 이용하여 실시예 4에 따라서 염색 공정을 수행한다.
제2 염색 단계를 위해, 상기 세포를 1차 항체인 마우스 항-사람-CD14와 함께 항온 배양하고, 실시예 4에 따르는 세척 단계 후, dem DAB-복합체(브라운)(Vector Laboratories)를 사용하고 문헌[참조: Hsu, S.M., et al. "The use of antiavidin antibody and avidin-biotin-peroxidase complex in immunoperoxidase technics" Am. J. Clin. Pathol. 75 (6): 816-821 (1981)]의 방법을 이용하여, 벡타스타틴(Vectastatin)의 ABC 스트렙트아비딘 KIT(Vector)로 염색하였다.
이어서, 실시예 4에 기재된 바와 같이 해말라운(haemalaun)으로의 핵 역-염색을 수행한 다음, 카이저(Kaiser) 글리세롤 젤라틴에 포매시킨다.
그 결과가 도 10에 도시되어 있다. 상기 도면은 항원 CD14의 발현을 갈색으로 도시하는데, 이는 간 세포로의 형태학적 변환과 병행해서 서서히 감소되는 반면, 적색으로 도시된 알부민 발현은 간 세포의 성숙도가 증가함에 따라 증가된다. 도 10에서의 그림 4는 간 세포-조건화 배지로 3주 동안 자극한 후의 세포를 도시한 것이다.
B) 이중 표식과 병행하여, 본 발명에 따라서 간 세포로 분화된 줄기 세포를 대상으로 하여 FACS(형광 활성화 세포 분류법) 분석을 수행하였다.
실시예 10에 따라서 간 세포로 분화된 본 발명에 따르는 줄기 세포는 먼저, 세포 스크래퍼를 사용하여 배양 플라스크로부터 상기 세포를 기계적으로 분리시킴으로써 수거한다. PBS를 사용하여, 상기 세포를 플라스크로부터 조심스럽게 세정하고, 매회 PBS 용액 10ml로 2회 세척한다. 이를 위해, PBS 용액 중의 세포 현탁액을 15ml 원심분리용 튜브에 도입하고, 1600rpm으로 침전시킨다. 이로써 생성된 세포 침강물을 PBS로 희석시켜, 정확히 1 x 105개 세포가 100㎕ PBS에 존재하도록 하였다.
이어서, 이러한 세포 현탁액에, FITC-표식된 항-CD14 항체(BD Pharmingen) 또는 FITC-표식된 항-알부민 항체(Beckmann) 및 FITC-표식된 비-특이적 IgG1 마우스 항-사람 항체 각각 10㎕를 가한다. 20분 동안 항온 배양한 후, 세포를 500㎕ PBS에 2회 재현탁시키고, 각각 5분 동안 1600rpm으로 침전시킨 다음, 최종적으로 200㎕ PBS에 흡수시킨다. 세포를 재현탁시킨 후, BD Biosciences(Franklin Lakes, NJ) 회사로부터의 BD FACScalibur 유동 세포계수기를 사용하여 형광을 측정하였다[참조: Bruhn H.D., Folsch U.R. (Eds.), Lehrbuch der Labormedizin: Grundlagen, Diagnostik, Klinik Pathobiochemie[Textbook of Laboratory Medicine, Principles, Diagnosis, Clinical Pathobiochemistry], 395-403 (1999); and Holzer U. et al., "Differential antigen sensitivity and costimulatory requirements in human Th1 and Th2 antigen-specific CD4(+) cells with similar TCR avidity" J. Immunol. 170 (3): 1218-1223 (2003)]. 문헌[참조: MarquezM.G., et al. "Flow cytometric analysis of intestinal intra-epithelial lymphocytes in a model of immunodeficiency in Wistar rats." Cytometry 41 (2): 115-122 (2000)]을 참조로 하여 마이크로소프트(Microsoft) WinMDI 프로그램을 이용하여, 상기 결과를 평가하였다.
FACS-분석 결과가 도 11에 재현되어 있다. 상기 도면은 CD14의 발현(상단)과 알부민 항원의 발현(하단)을 도시한 것이며, 이는 탈분화된 단구(좌측 칼럼)와, 본 발명에 따라서 간 세포로 분화된 줄기 세포(우측 칼럼)에서 측정하였다. 탈분화된 단구에서는 CD14의 강력한 발현이 탐지되었지만, 알부민의 발현은 탐지되지 않은 반면, 탈분화된 단구로부터 발생된 간 세포에서는, CD14의 보다 약한 발현과 알부민의 매우 강력한 발현을 탐지할 수 있었다.
실시예 12
단구성 기원의 탈분화되고 프로그램된 줄기 세포의 생체내 사용
문맥을 통하여 유전적으로 동일한 수용자 동물의 간 내로 생체내 주사한 후에 본 발명의 프로그램 가능한 줄기 세포가, 간에 존재하는 시그널-제공인자를 통하여 어느 정도로 특이적 분화를 진행하는지를 명확히 하기 위해, 암컷 LEW 랫트의 간을 먼저 레트로르신(retrorsine)으로 처리하여, 간에 존재하는 간 세포(간 실질 세포; liver parenchyma cell)를 이의 증식 활성 측면에서 억제하였다[참조: Lacone, E., et al. "Long-term, near-total liver replacement by transplantation of isolated hepatocytes in rats treated with retrorsine" Am. J. Path. 153: 319-329 (1998)].
이를 위해, LEW 랫트에게, 피롤리지딘 알카로이드 레트로르신 30mg을 14일 동안 2회 복강내 주사하였다. 연속해서, 이러한 방식으로 처리된 간의 80% 절제를 수행한 다음, PBS 1ml당 프로그램 가능한 줄기 세포 5 x 105개를 나머지 잔여 간의 문맥에 투여하였다. 숫컷 LEW 랫트의 단구로부터, 실시예 2에 기재된 바와 같이 줄기 세포를 수득하였다. 줄기 세포를 투여한지 5일 후, 간의 펀치 생검을 대상으로 하여, 간의 조직학적 평가를 수행하고, 문헌[참조: Hoebee, B. et al. "Isolation of rat chromosome-specific paint probes by bivariate flow sorting followed by degenerate oligonucleotide primed-PCR." Cytogenet. Cell Genet. 66: 277-282 (1994)]에 상세히 기재된 바와 같이 Y-염색체-특이적 프로브를 이용한 형광-원위치-하이브리드화(FISH)를 통하여 줄기 세포로부터 분화된 세포 유형을 탐지하였다.
도 7A는 레트로르신-예비처리되고 80% -절제된 암컷 수용자 동물의 간 내로 문맥내 주사한지 5일째 되는 날에 숫컷 LEW 줄기 세포로부터 유도된 Y-염색체-양성(세포 핵 내의 적색 지점) 간 세포를 도시한 것이다. 줄기 세포 주사 후 25일째에 동일한 간의 선별적인 제거는, 줄기 세포가 간 세포, 내피 세포 및 담관 상피로 분화된 것을 나타낸다(도 7B). 이때, 간은 이미 이의 정상 크기에 도달하였으며, 세포의 >90%가 Y-염색체를 갖는다. 이로부터, 주사된 단구성 기원의 공통유전형의 프로그램 가능한 줄기 세포가, 정상적인 대사 기능을 지닌 간을 생체내에서 완전히 복구시킬 수 있다고 결론지을 수 있다. 도 7C는 이와 관련하여, 레트로르신의 투여와 80% 간 절제 후, 줄기 세포 처리된 랫트 대 처리되지 않은 수용자 랫트의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선(그룹당 n=4)을 도시한 것이다
기능 파라미터 빌리루빈 및 암모니아(NH3)는 장기간 생존하는 줄기 세포 처리된 동물의 완전한 대사 기능성을 입증해준다(도 7D 및 7E).
실시예 13
세포 배양 플라스크에서의 단구의 증식 및 탈분화
웰-판에서의 배양에 또한 사용되었던(실시예 2 참조) 바와 동일한 영양 배지 중의 배양 플라스크에서, 한편으론 단구의 배양과 증식을 수행하고, 또 다른 한편으론 이 세포의 탈분화를 대규모로 수행하였다. 상기 영양 배지는 2.5㎍/500ml M-CSF 및 0.2㎍/500ml 인터루킨 3(IL-3)을 함유한다.
실시예 1에서 분리된 단구를, 용적이 250ml이고 편평한 벽을 갖는 배양 플라스크(T75-세포 배양 플라스크)의 바닥에 옮긴다. 약 10 x 106개 세포를 각 플라스크에 옮기고, 상기 지시된 영양 배지 20ml를 각각에 채운다. 공지된 과정에 따라서, 플라스크당 정확한 투약을 위해 상기 세포 수를 결정하였다[참조: Hay R.J., "Cell Quantification and Characterization" in Methods of Tissue Engineering, Academic Press (2002), Chapter 4, pages 55-84].
세포 배양 플라스크를 37℃ 하의 항온 배양기에서 6일 동안 항온 배양하였다. 24시간 후, 세포가 플라스크의 바닥에 침강되었다. 상등액을 격일로 제거하고, 플라스크 각각에 신선한 영양 배지 20ml를 채운다.
6일째에, 플라스크로부터 영양 배지를 미리 피펫팅하여 제거한 후, 이러한 플라스크를 PBS 각각 10ml로 2회 세정한다. 이로써, 플라스크의 바닥에 부착되지 않은 모든 세포를 제거하였다. 연속해서, 멸균성 세포 스크래퍼를 사용하여, 플라스크의 바닥에 부착하여 성장하는 세포를 플라스크 바닥으로부터 제거하였다. 이어서, 격리된 세포를 PBS로 세정함으로써 플라스크로부터 제거하고, 이를 50ml 팔콘 튜브에 모은 다음, 10분 동안 1800rpm으로 원심분리시킨다. 그 후, 상등액을 경사 제거하고, 침강물을 신선한 RPMI 1640 배지에 재현탁시킨다(2ml/105개 세포).
이러한 세포 현탁액을 각종 표적 세포로의 분화에 직접 사용할 수 있다.
또 다른 한편으론, 상기 세포를, 원심분리 후 동결 배지로서 DMSO/FCS와 혼합하고, 106/ml의 농도로 급속-동결시킨다.
이러한 동결 배지는 95% FCS와 5% DMSO를 함유하였다. 약 106개 세포를 배지 1ml에 흡수시키고, 다음 후속 단계로 냉각시켰다:
얼음 상에서 30분;
예비-냉각된 스티로포프 박스에서 -20℃ 하에 2시간;
스티로포르에서 -80℃ 하에 24시간;
-180℃ 하에 액체 질소(N2) 중의 튜브에서 저장.

Claims (45)

  1. a) 사람 혈액으로부터 단구를 분리하는 단계;
    b) 이러한 단구를, 세포성 성장 인자 M-CSF를 함유하는 적합한 배양 배지에서 증식시키는 단계;
    c) 상기 단구를, IL-3을 함유하는 배양 배지에서 단계 b)와 동시에 또는 이의 후속으로 배양하는 단계; 및
    d) 배양 배지로부터, 완전히 성장한 사람의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 격리시킴으로써, 이러한 완전히 성장한 사람의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 수득하는 단계
    를 특징으로 하는, 사람 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 머캅토 화합물을, 단계 c)의 배양 배지에 추가로 가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 머캅토 화합물을 사용하는데, 여기서는 1개 이상의 탄소 그룹이 황에 결합하고, 탄화수소 그룹(들)이 하나 이상의 추가의 작용성 그룹에 의해 치환될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 머캅토 화합물이 2-머캅토에탄올 또는 디메틸설폭사이드임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 이후 및 단계 d) 이전에, 세포를 생물학적으로 허용되는 유기 용매와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 생물학적으로 허용되는 유기 용매가 탄소수 1 내지 4의 알코올임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 알코올이 에탄올임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포를, 생물학적으로 허용되는 유기 용매의 증기 상과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포를, 단계 d) 이후에 적합한 세포 배양 배지에 현탁시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 배지가 RPMI 또는 DMEM임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 배지가 사이토킨 또는 LIF를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포를 액상 배지에 현탁시킨 다음, 급속 동결시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 배지가 세포 배양 배지임을 특징으로 하는 방법.
  14. 사람 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포.
  15. 제14항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 줄기 세포.
  16. 제14항 또는 제15항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 함유하는 약제학적 조성물.
  17. 표적 세포 및 표적 조직을 생성하기 위한, 제14항 또는 제15항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  18. 제17항에 있어서,
    a) 목적하는 표적 세포를 함유하는 조직을 파쇄시키고;
    b) 이러한 파쇄된 조직으로부터, 표적 세포 및/또는 이의 단편을 수득하고;
    c) 표적 세포 및/또는 이의 단편을 적합한 배양 배지에서 항온 배양하고;
    d) 항온 배양 동안 및 후에, 배양 배지 상등액을 표적 세포-조건화 배지로서 수집하며;
    e) 줄기 세포를 목적하는 표적 세포로 재프로그래밍/분화시키기 위해, 상기 줄기 세포를 표적 세포-조건화 배지의 존재 하에 성장시키는 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 지방 세포, 신경원 및 신경교 세포, 내피 세포, 각질 세포, 간 세포 또는 섬 세포를 생성하기 위한 용도.
  20. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 하나 이상의 유전자로 형질감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제14항에 있어서, 막 관련 단구-특이적 표면 항원 CD14와, CD117, CD123 및 CD135로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1개 이상의 다능성 마커를 발현시키는 것을 특징으로 하는, 사람 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포.
  22. 제14항, 제15항 또는 제21항에 있어서, 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 하나 이상의 유전자로 형질감염시키는 것을 특징으로 하는 줄기 세포.
  23. 적합한 배지 중에, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 함유하는 줄기 세포 제제.
  24. 간 경변 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  25. 췌장 기능부전증 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  26. 급성 또는 만성 신부전증 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  27. 호르몬 기능 저하 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  28. 심근 경색 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  29. 폐 색전증 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  30. 발작 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  31. 피부 손상 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  32. 표적 세포와 표적 조직을 생체 내에서 생성시키기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포의 용도.
  33. 막 관련 표면 항원 CD14를 특징으로 하는, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 줄기 세포를 재프로그램함으로써 수득된, 분리된 분화 체 표적 세포 및/또는 표적 조직.
  34. 제33항에 있어서, 지방 세포, 신경원 및 신경교 세포, 내피 세포, 각질 세포, 간 세포 및 섬 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 체 표적 세포 및/또는 표적 조직.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 하나 이상의 유전자로 형질감염시키는 것을 특징으로 하는 체 표적 세포 및/또는 표적 조직.
  36. 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포, 또는 제33항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 따르는 체 표적 세포 및/또는 표적 조직으로 피복시킨 이식 가능한 물질.
  37. 제36항에 있어서, 인공 삽입물(prosteses)임을 특징으로 하는 이식 가능한 물질.
  38. 제37항에 있어서, 인공 삽입물이 심장판, 혈관 인공 삽입물, 뼈- 및 관절 인공 삽입물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 물질.
  39. 제36항에 있어서, 제14항, 제15항, 제21항 또는 제22항에 따르는 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포, 또는 제33항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 따르는 표적 세포를 함유하는 인공 및/또는 생물학적 담체 물질임을 특징으로 하는 이식 가능한 물질.
  40. 제39항에 있어서, 담체 물질이 인체 내로 도입하기 위한 봉지 또는 챔버임을 특징으로 하는 이식 가능한 물질.
  41. 인슐린을 공급하기 위한 인공 섬 세포 포트 챔버로서 사용하기 위한 약제학적 작제물을 제조하기 위한, 제33항에 따르는 섬 세포를 함유하는, 제40항에 따르는 봉지 또는 챔버의 용도.
  42. 수술 후 유방 작제를 위해 및 성형 및/또는 미용 교정의 경우에 사용하기 위해, 지방 세포로 채워진 인공 중합체를 함유하는 약제학적 작제물을 제조하기 위한, 제33항에 따르는 지방 세포를 함유하는, 제40항에 따르는 봉지 또는 챔버의 용도.
  43. 제36항 또는 제40항에 있어서, 제33항에 따르는 분리된 분화 체 표적 세포를 함유하는 반투과성 포트 챔버 시스템임을 특징으로 하는 이식 가능한 물질.
  44. 내분비, 대사성 또는 지혈성 질환을 생체내 치료하기 위한 약제학적 작제물을 제조하기 위한, 제43항에 따르는 반투과성 포트 챔버 시스템의 용도.
  45. 사람 단구성 기원의 탈분화된 프로그램 가능한 줄기 세포를 생성하기 위한,M-CSF 및 IL-3의 용도.
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