DE102011004335A1

DE102011004335A1 - Verfahren zur Herstellung eines Vakzins

Info

Publication number: DE102011004335A1
Application number: DE102011004335A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-02-17
Filing date: 2011-02-17
Publication date: 2012-08-23
Also published as: WO2012110639A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins zur Behandlung eines Tiers, umfassend die Schritte: Bereitstellung von Körpergewebe, welches wenigstens einmalig eingefroren und aufgetaut wird; und Bereitstellung einer geeigneten Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Blut, Knochenmark oder Rückenmark, erhältlich mittels: — Verhinderung der Gerinnung der Körperflüssigkeit, — differentielle Schwerkraftabsetzung der Bestandteile der Körperflüssigkeit, — Abtrennung zumindest eines Teils des resultierenden Überstands, — Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, — Bestimmung der Zellzahl der innerhalb der schweren Bestandteile, — Vermischung der schweren Bestandteile mit RMPI und autologem Serum, — Zugabe von Zytokinen — Inkubieren der Mischung; sowie Vermischung der Körperflüssigkeit mit dem Körpergewebe, umfassend die Schritte: — Inkubieren der Mischung aus zubereiteter Körperflüssigkeit und behandeltem Körpergewebe, — Ernte der gewonnenen Zeilen, — differentielle Schwerkraftabsetzung der Zellen, — Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, — Bestimmung der Zellzahl.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins.
Vakzine d. h. Impfstoffe, sind in unterschiedlichen Ausführungen im Stand der Technik bekannt. Dabei bezeichnet der Begriff Vakzin ein Antigen, meist bestehend aus Proteinen, Erbgutbruchstücken, abgetöteten oder abgeschwächten Erregern, die eine Immunantwort des Immunsystems provozieren. Vakzine finden beispielsweise Anwendung bei der Vorbeugung von Infektionskrankheiten. Sie finden aber auch Anwendung bei der Behandlung von Tumorerkrankungen.
Hierbei kommen häufig dendritische Zellen zum Einsatz. Grundlagen für therapeutische Anwendungen der dendritischen Zellen sind die Fähigkeiten der dendritischen Zellen, Antigene aufzunehmen, zu präsentieren und primäre Immunantworten zu induzieren. Dies prädestiniert sie für Einsatzgebiete in allen Bereichen des Immunsystems. Neben einer Verwendung zur Induktion einer Immunantwort bei bakteriellen oder viralen Infektionen und zum anderen der Ausbildung einer Toleranz gegen Antigene im Falle von Autoimmunerkrankungen und degenerativen Organerkrankungen werden sie auch bei der Behandlung von Tumoren eingesetzt. Zusätzlich können sie zur Stärkung des Immunsystems, oder als speziell generierte suppressive Dendriten für die Behandlung einer spezifischen Immuntoleranz (beispielsweise bei Organtransplantationen) eingesetzt werden.
Hierbei besteht die Möglichkeit, dendritische Zellen ex vivo mit tumorrelevanten Antigenen zu beladen, zu aktivieren und in den Körper zurückzugeben. Ziel ist es dabei, eine Immunreaktion gegen den Tumor zu indizieren.
Für die Herstellung eines solchen Vakzins in vitro müssen zunächst dendritische Zellen aus monozytären Zellen aus dem peripheren Blut extrahiert werden. Im Anschluss wird den inaktiven dendritischen Zellen das Antigen, gegen das eine Immunantwort induziert werden soll, in einer Zellkultur zugeführt.
Hierzu kommen Tumolysate, apoptotische Tumorzellen, Tumorpeptide, Tumor RNA, Tumor DNA, Liposome mit Nukleinsäuren oder Tumorantigene in viralen Vektoren zum Einsatz.
Problematisch dabei ist häufig, dass Tumore aus heterogenen Zellpopulationen bestehen und oft ein breites Spektrum an Tumorantigenen exprimieren. Häufig ist es dabei nicht bekannt, welches dieser Antigene eine potente T-Zellantwort hervorrufen kann.
Die Beladung der dendritischen Zellen mit nur einem Tumorantigen kann in der Therapie eines Tumors erfolglos sein und unter Umständen das Tumorwachstum durch vorhandene Escape-Mechanismen induzieren. Auch konnte gezeigt werden, dass die Verwendung eines, auf einem Tumorantigen basierenden Vakzins auch Immunantworten gegen andere Tumorantigene induzieren kann. Es wird vermutet, dass die Zerstörung von Tumorzellen durch antigenspezifische T Zellen zu einer Induktion anderer antigenspezifischer zytotoxischer T-Zellen führen kann. Kritisch dabei ist, dass bei der Verwendung ganzer Gewebeportionen die Gefahr der Induktion von Autoimmunreaktionen besteht.
Während Vakzine zur Tumorbekämpfung bei Menschen häufiger Einsatz finden, ist deren Verwendung bei Tieren bisher nicht beschrieben. Dadurch ist eine systematische Verwendung in der Veterinär-Medizin nicht möglich.
Hiervon ausgehend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins zur Tumorbehandlung in der Veterinär-Medizin zur Verfügung zu stellen.
Gelöst wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Patentanspruches 1. Vorteilhafte Ausführungsformen und Weiterentwicklungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins zur Behandlung eines Tiers zur Verfügung, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellung von Körpergewebe, welches wenigstens einmalig eingefroren und aufgetaut wird; und Bereitstellung einer geeigneten Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Blut, Knochenmark oder Rückenmark, erhältlich mittels, Verhinderung der Gerinnung der Körperflüssigkeit, differentielle Schwerkraftabsetzung der Bestandteile der Körperflüssigkeit, Abtrennung zumindest eines Teils des resultierenden Überstands, Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, Bestimmung der Zellzahl der innerhalb der schweren Bestandteile, Vermischung der schweren Bestandteile mit RMPI und autologem Serum, Zugabe von Zytokinen, Inkubieren der Mischung; sowie Vermischung der Körperflüssigkeit mit dem Körpergewebe, umfassend die Schritte: Inkubieren der Mischung aus zubereiteter Körperflüssigkeit und behandeltem Körpergewebe, Ernte der gewonnenen Zellen, differentielle Schwerkraftabsetzung der Zellen, Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, Bestimmung der Zellzahl.
Dadurch wird gegenüber dem Stand der Technik eine erhebliche Verbesserung erreicht. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es nun, Haustiere, insbesondere Pferde, Hunde und Katzen bei Tumorerkrankungen gezielt zu behandeln. Bei dem bereitzustellenden Körpergewebe handelt es sich bevorzugt um Tumorgewebe. Dazu wird mit Hilfe eines sterilen Skalpells tumorös entartetes Gewebe entfernt und direkt in ein steriles Gefäß mit steriler Kochsalzlösung überführt.
Im Anschluss an die Entfernung des Tumorgewebes erfolgt eine Wundversorgung bis zur Abheilung. Dieser Verfahrensschritt hat den Vorteil, dass die chirurgische Behandlung der erkrankten Stelle mit der Gewinnung des Antigenmaterials in einem Schritt erfolgt. Dadurch wird eine überflüssige Mehrfachbelastung des zu behandelnden Tieres vermieden und gleichzeitig eine wirtschaftliche Gewinnung des Materials gewährleistet.
In einem weiteren Schritt wird eine erforderliche Menge einer geeigneten Körperflüssigkeit, welche ausgewählt ist aus Blut, Knochenmark und Rückenmark, bereitgestellt. Dies kann beim Pferd beispielsweise durch Blutentnahme aus der Jugularvene erfolgen. Bei einem Pferd sind beispielsweise 450 bis 500 ml Blut erforderlich. Bei einem Hund oder bei einer Katze entsprechend weniger. Nach einer Verhinderung der Gerinnung der gewonnenen Körperflüssigkeit erfolgt eine differentielle Schwerkraftabsetzung der Bestandteile der Körperflüssigkeit. Dabei kommt es aufgrund eines Dichtegradienten zur Auftrennung der mononukleären Zellen (Monozyten und Lymphozyten) von den Erythrozyten und den meisten polymorphkernigen Leukozyten.
Erythrozyten und Leukozyten sammeln sich aufgrund ihrer größeren Dichte im unteren Bereich des Röhrchens als Pellet an. Nach Schwerkraftabsetzung werden die Überstände, in welchen sich die Monozyten und Lymphozyten befinden, abgesaugt und erneut zentrifugiert.
Hierzu werden Mono- und Lymphozyten mit PBS resuspendiert und anschließed bis 50 ml mit PBS aufgefüllt, erneut zentrifugiert, wieder resuspendiert, aufgefüllt und zentrifugiert. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt, ca. 3–4 mal, bis der Überstand frei von Thrombozyten und unerwünschten Zellen ist (Waschschnitt). Die abgesetzten Zellen (Pellet) werden mit RPMI Medium inkubiert (ca. 1 Stunde Adhärenzzeit) und die nicht adhärenten Zellen im Anschluss vorsichtig von der Platte gespült. Die adhärenten Zellen werden mit frischem RPMI, autologem Serum und Zytokinen für 6–7 Tage je nach Tierart (und Erkrankung) inkubiert.
Anschließend werden die adhärenten Zellen für die Dauer von sechs oder 7 Tagen (bei Hund und Pferd 7 Tage, bei der Katze 6 Tage) bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit werden Zytokine zugegeben.
Bevor die entsprechend behandelte Körperflüssigkeit mit dem Körpergewebe vermischt wird, wird dieses Gewebe verarbeitet. Hierzu wird das Gewebe bei einer Temperatur von beispielsweise minus 80°C eingefroren. Es empfiehlt sich, diesen Schritt zu wiederholen und mehrfach einzufrieren und aufzutauen. Durch diese wiederholte Prozedur wird eine möglichst umfassende Zerstörung der Zellstruktur erreicht, so dass die Zellbestandteile später löslich vorliegen. Durch zusätzliches mechanisches Homogenisieren wird eine weitere Zerstörung des Zellgewebes erreicht. Der gewonnene Gewebebrei wird in einer geeigneten Lösung, beispielsweise PBS gelöst und einer differentiellen Schwerkraftabsetzung unterworfen. Anschließend kann die Proteinkouzentration im Zell-Lysat ermittelt werden. Das dergestalt behandelte Zell-Lysat wird mit der wie oben beschriebenen behandelten Körperflüssigkeit zusammengegeben. Die Zellen inkubieren erneut über 24 Stunden bei 37°C am 5. oder 6. Tag je nach Tierart. Daraufhin wird eine visuelle Betrachtung der Zellen durchgeführt, welche von unregelmäßiger Gestalt sind und Zytoplasmafortsätze aufweisen. Nichtadhährente Zellen werden durch Abgießen des Zellkulturmediums entfernt. Die Platte wird ca. 1 Stunde auf Eis gestellt, damit die adhärenten Zellen bzw. autigenbeladenen Zellen (mature) (auch nicht adhärente Zellen werden mit aufgenommen) leichter mit kaltem PBS zu ernten sind. Die am Boden der Zellkulturschale haftenden adhärenten Zellen werden mit einer Lösung wie beispielsweise kaltem PBS von der Zellkulturschale abgelöst, abpipettiert und in ein Röhrchen überführt, geerntete Zellen werden zentrifugiert, das Pellet wird mit geeigneter Lösung resuspendiert und in der Spritze aufgezogen. Mit einer Spritze kann die Zellsuspension injektionsfähig entnommen werden.
Anschließend wird das in der Weise gewonnene Vakzin dem betreffenden Tier zuführt. Dies erfolgt je nach zu behandelnder Art intravenös (bei Lungenerkrankungen), intracutan oder intraperitoneal. Bei oberflächlichen Tumoren erfolgt eine intrakutane Injektion der Vakzine direkt an die zuvor gereinigten Bereiche der Wundränder aller chirurgisch entfernten Gewebeteile. Die Behandlung erfolgt in der Regel in der zweiten Woche, d. h. eine Woche postoperativ, und in der sechsten Woche nach der Entnahme des Gewebes.
Ist kein Tumorgewebe vorhanden, können Virenimpfstoffe oder Interferone verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das verwendete Körpergewebe ein Tumorgewebe. In den beteiligten Kreisen besteht ein hohes Bedürfnis nach einer effektiven und nebenwirkungsarmen Tumorbehandlung. Die derzeit zur Verfügung stehenden Behandlungsmethoden, die meist invasive Therapieformen umfassen, umfassen das Abbinden, die Kryochirurgie, die Exzision, die Elektrotomie sowie die Laserchirurgie. Zu den nichtinvasiven Therapieformen zählen die photodynamische Therapie, Bestrahlung sowie die Chemotherapie. Durch die Fähigkeit der dendritischen Zellen, Antigene aufzunehmen, zu präsentieren und primäre Immunantworten zu induzieren, können sie eine Aktivierung des Immunsystems bewirken. Dies ist bei der Behandlung von Tumorerkrankungen von großem Wert.
Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn das Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins an einem Hund und/oder einer Katze und/oder einem Pferd vorgenommen wird.
Von Vorteil ist es weiterhin, wenn das Vakzin zur autologen und/oder allogenen und/oder xenogenen Behandlung geeignet ist. Bei der autologen Behandlung werden Gewebeteile des Tieres, das anschließend mit Antigenen behandelt werden soll, entfernt und für die Antigenbehandlung zubereitet. Diese Behandlung hat den Vorteil, dass sie speziell an das Immunsystem des zu behandelnden Tieres angepasst ist. Sie hat jedoch den Nachteil, dass sie teilweise mit hohen Kosten verbunden ist, da die Antigengewinnung für jedes Tier anders durchgeführt werden muss. Eine allogene Behandlung, bei der beispielsweise ein Vakzin an einem Hund gewonnen wird und an einem anderen Hund eingesetzt wird, ist demgegenüber deutlich wirtschaftlicher. Unter bestimmten Voraussetzungen kommt auch eine xenogene Behandlung in Betracht. Bei einer xenogenen Behandlung wird beispielsweise ein Vakzin, das bei einer Katze gewonnen wurde, bei einem Hund eingesetzt. Die Auswahl des Verfahrens erfolgt in Abhängigkeit von der zu behandelnden Spezies sowie vom Schweregrad der zu behandelnden Erkrankung.
Weiterhin ist von Vorteil, wenn die aus der Körperflüssigkeit gewonnenen Zellen natürliche Killerzellen und/oder Stromazellen und/oder Dendritzellen und/oder Osteoblastenzellen und/oder Endothelzellen sind. In Abhängigkeit von der zu behandelnden Spezies sowie dem Schweregrad der Erkrankung können gezielt Mischungen der Zellen zubereitet werden. Bevorzugt hierbei ist der Einsatz von Dendritzellen.
Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn das eingesetzte Zytokin aus einer Gruppe umfassend Interleukin 1 (1α und/oder 1β), Interleukin 2, Interleukin 3 (Multipotential CSF), Interleukin 4, Interleukin 5, Interleukin 6, Interleukin 7, Interleukin 8, Interleukin 9, Interleukin 10, Interleukin 11, Interleukin 12, Interleukin 13, Interleukin 15, Interleukin 16, Interleukin 17, Interleukin 18, Interleukin 22, Interleukin 23, Interleukin 31, Interleukin 32, Interleukin 33, Interleukin 34, Interleukin 35, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierendes-Faktor (GM-CSF), Interferon (IFN) und Tumor-Nekrose-Faktoren ausgewählt ist.
Eine selektive Auswahl der zu verwendenden Zytokine in Anhängigkeit von der zu behandelnden Spezies und der zu behandelnden Erkrankung ermöglicht eine sehr genaue therapeutische Behandlung.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Arzneimittel zur Behandlung eines Tiers, erhältlich durch ein Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins zur Behandlung eines Tiers zur Verfügung, umfassend die Schritte: Bereitstellung von Körpergewebe, welches wenigstens einmalig eingefroren und aufgetaut wird; und Bereitstellung einer geeigneten Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Blut, Kriochenmark oder Rückenmark, erhältlich mittels: Verhinderung der Gerinnung der Körperflüssigkeit, differentielle Schwerkraftabsetzung der Bestandteile der Körperflüssigkeit, Abtrennung zumindest eines Teils des resultierenden Überstands, Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, Bestimmung der Zellzahl der innerhalb der schweren Bestandteile, Vermischung der schweren Bestandteile mit RMPI und autologem Serum, Zugabe von Zytokinen, Inkubieren der Mischung; sowie Vermischung der Körperflüssigkeit mit dem Körpergewebe, umfassend die Schritte: Inkubieren der Mischung aus zubereiteter Körperflüssigkeit und behandeltem Körpergewebe, Ernte der gewonnenen Zellen, differentielle Schwerkraftabsetzung der Zellen, Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, und Bestimmung der Zellzahl.
Ein derartiges Arzneimittel umfasst entsprechende Begleit- und Hilfsstoffe.
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn das Vakzin bzw. das Arzneimittel zur Behandlung von Mammakarzinom und/oder Ovarialkarzinom und/oder chronische Leukämien und/oder Lymphomen und/oder Hodenkarzinom und/oder anderen chemotherapiesensitiven Karzinomen eingesetzt wird wie beispielsweise Sarkome oder andere Tumorarten.
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn das Arzneimittel zur autologen (autogenen) und/oder allogenen (homogenen) und/oder xenogenen Behandlung einsetzbar ist. Je nach Einzelfall sind hierbei therapeutische Wirksamkeit und Wirtschaftlichkeit gegeneinander abzuwägen.
Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn das Arzneimittel zur Behandlung eines Menschen und/oder Hundes und/oder einer Katze und/oder eines Pferdes eingesetzt wird.
Weiterhin ist es von besonderem Vorteil, wenn die aus der Körperflüssigkeit ausgewählten Zellen natürliche Killerzellen und/oder Stromerzellen und/oder Dendritzellen und/oder Osteoplastenzellen und/oder Endothelzellen umfassen.
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn das zugesetzte Zytokin aus einer Gruppe umfassend Interleukin 1 (1α und/oder 1β), Interleukin 2, Interleukin 3 (Multipotential CSF), Interleukin 4, Interleukin 5, Interleukin 6, Interleukin 7, Interleukin 8, Interleukin 9, Interleukin 10, Interleukin 11, Interleukin 12, Interleukin 13, Interleukin 15, Interleukin 16, Interleukin 17, Interleukin 18, Interleukin 22, Interleukin 23, Interleukin 31, Interleukin 32, Interleukin 33, Interleukin 34, Interleukin 35, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierendes-Faktor (GM-CSF), Interferon (IFN) und Tumor-Nekrose-Faktoren ausgewählt ist.
Durch eine gezielte Auswahl der Zytokine kann eine sehr spezifische und damit äußerst erfolgreiche Therapie ermöglicht werden.
Es hat sich auch als vorteilhaft erwiesen, wenn das Arzneimittel zur adjuvanten Unterstützung einer Strahlenbehandlung eingesetzt wird. Dies bietet sich insbesondere bei der Behandlung von schweren Erkrankungen, insbesondere schweren Tumorerkrankungen im fortgeschrittenen Stadium an.
Die praktische Umsetzung der Erfindung sowie deren Vorteile in der Praxis wird anhand des nachfolgenden Ausführungsbeispiels veranschaulicht.
Herstellung eines Tumorvakzins für die Behandlung eines Pferdes
Die Entfernung des Tumors erfolgt an einem stehenden Pferd nach Sedation mit Xylazin 2% Injektionslösung (0,8 mg/kg i. V.) und lokaler Anästhesie mit Mepivacain 4% (Scandicain-Injektionslösung). Das Fell an der betreffenden Operationsstelle wird geschoren und anschließend nass rasiert. Darauffolgend wird die Haut entsprechend desinfiziert. Mittels eines sterilen Skalpells wird die tumorös entartete Haut entfernt und direkt in ein steriles Glasgefäß mit vorgelegtem PBS mit hochkonzentriertem Antibiotika-Mix umfassend Penizillin/Streptomyzin (200 u/ml G-Penizillin und 200 Mikrogramm/ml Streptomyzin) überführt. Durch diesen Schritt wird ein Wachstum verbliebener bakterieller Mikroorganismen verhindert. Im Anschluss an die Operation erfolgt eine Wundversorgung mit direkter Überwachung bis zur Abheilung.
Je nach Bedarf und zu behandelnder Erkrankung kann auch ein Antibiotikamix umfassend Amphotericin-Pulver 0,0013 g, Ampicillin 0,5 g Trockensubstanz oder 0,0500 g Lösung, Gentamycin sulfuricum 0,0250 g, Metronidazolum 0,050 g. Die Mischung wird mit Spiritus 20% Vol. auf 500 ml aufgefüllt.
Bei einer Behandlung eines Hundes oder einer Katze ist diese Vorgehensweise gleich oder sehr ähnlich.
Noch am selben Tag wird das Tumormaterial unter sterilen Bedingungen mit PBS von Blut und anderen Verunreinigungen befreit und in eine sterile Petrischale überführt. Ein kleiner Teil des Tumormaterials wird zur histopathologischen Untersuchung verwendet, um die gestellte Diagnose histologisch zu bestätigen. Die restlichen Hautteile werden abpräpariert und das saubere Tumorgewebe in eine frische sterile Petrischale gelegt. Die Proben werden viermal schnell (bei minus 80°C) eingefroren und langsam bei Raumtemperatur wieder aufgetaut. Dies bewirkt eine Zerstörung der Zellstruktur, so dass die Zellbestandteile später löslich im PBS vorliegen. In einem sterilen Homogenisator wird die Suspension gegeben und durch Reibung eine weitere Zerstörung des Zellgewebes erreicht. Dies wird fortgesetzt, bis eine einheitliche feine Gewebekonsistenz erkennbar ist. Dieser Gewebebrei wird in PBS gelöst und in ein steriles 50 ml-Röhrchen überführt. Es erfolgt nun eine Zugabe von 1 ml Wasserstoffperoxyd. Um die auftretende Schäumung zu reduzieren, wird 70%-iger Äthanol zugegeben. Das Pulver wird auf ein Sieb gegeben und mit reichlich PBS gespült. Die gereinigte Flüssigkeit wird mit dem oben beschriebenen Antibiotika-Mix versehen (4 ml) und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt.
Am nächsten Tag erfolgt eine erneute Zentrifugation und ein erneutes Abgießen der Antibiotikalösung durch ein Sieb, wobei das zurückbleibende Tumorpulver wiederum mit PBS gespült wird. Es erfolgt eine erneute Zentrifugation über 10 Minuten und danach ein Abgießen des Überstandes. Die sterilen Tumorpartikel werden in ein Kryoröhrchen gegeben und zwei- bis dreimal bei minus 80°C eingefroren und wieder aufgetaut. Zur Gewinnung der Körperflüssigkeit wird Blut durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Bedingungen nach Stauung der Vene gewonnen. Je nach Größe des Tieres wird eine Mischung 1:10 Natriumcitrat mit frischem Blut aufgefüllt, wobei pro 10 Kg Körpergewicht 10 ml Blut entnommen werden. werden ein. Bei einem Hund mit einem Körpergewicht von 50 Kg sind somit 50 ml Blut mit 5 ml Natriumcitrat in einem Röhrchen anzusetzen. Bei einem Pferd wird das Blut in Baxter-Blutbeutel mit einem Volumen von 500 ml gegen, in denen die entsprechende Menge Natriumcitrat bereits enthalten ist.
Je nach Große werden ein bis sechs Lithiumheparinröhrchen mit extra Blut befüllt und abzentrifugiert; daraus wird das autologe Serum gewonnen. Für die Gewinnung von Monozyten über hypertonen Percoll wurden Mischungen von Blut mit EDTA bzw. Blut mit Citrat eingesetzt.
Leukosep-Röhrchen werden mit 15 ml Biocoll-Lösung überschichtet und kurz bei 1.000 Umdrehungen pro Minute und Raumtemperatur zentrifugiert. Auf diese Weise werden bei einem Pferd mittlerer Größe 18 Leukosept-Röhrchen entsprechend etwa 450 ml Blut verarbeitet. Daraufhin wird weitere 20 Minuten bei 1.800 Umdrehungen pro Minute und Raumtemperatur zentrifugiert. Bei der hier beschriebenen Dichteseparation trennen sich die einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte auf. Die oberste Schicht bildet das zellfreie Plasma. Zwischen Plasma und Lymphozytenseparationsmedium befand sich die sogenannte Interphase mit mononuklearen Zellen (MNC; Lymphozyten und Monozyten) sowie Anteile der Thrombozyten-Fraktion. Die Interphase wird mit einer weitlumigen Pipette abgesogen und in ein vorgekühltes 50 ml-Röhrchen überführt. Wenn möglich, werden zwei Interphasen in einem Röhrchen vereinigt. Mit PBS wird auf 50 ml aufgefüllt. Es erfolgt eine erneute Zentrifugation bei 1.800 bei 4 Grad, Umdrehungen über 10 Minuten. Der Überstand wird verworfen und die Pellets werden in kaltem PBS resuspendiert. Anschließend wird mit PBS auf 50 ml aufgefüllt. Der Schritt des Resuspendierens und Zentrifugierens wird so lange wiederholt, bis der Überstand frei von Thrombozyten ist. Nach jedem Schritt sollte hierzu neu beurteilt werden, ob die Pellets in ein Tube gepoolt werden können. Ziel ist es, am Ende den Inhalt aller Röhrchen in einem Röhrchen zu vereinigen. Die in einem Pellet vereinigten Rückstände sämtlicher Röhrchen werden resuspendiert und 10 Mikroliter davon abpipettiert. Diese werden mit 5 Mikroliter Trypanblau gemischt und in eine Zählkammer gegeben.
Nach dem Resuspendieren der Pellets werden die Zellen zusammen mit RPMi und autologem Serum für ca. 1 Std. in den Brutschrank gegeben (Adhärenzzeit). Nach Adhärenzzeit werden die nicht adhärenten Zellen verworfen und RPMi sowie Serum und Zytokine dazugegeben. Die Zytokine werden am ersten Tag dazugegeben, also am Tag der Aufbereitung. In der Humanmedizin hingegen werden die Zytokine oft erst am zweiten oder dritten Tag nach Aufbereitung hinzugegeben. Am sechsten Tag wird das Tumorlysat hinzugegeben, bei der Katze am fünften Tag.
Anschließend erfolgt die Zugabe der Zytokine. Nach Zugabe der Zytokine wird sechs Tage bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Bei jeder Probe ist eine tägliche Zellkontrolle durchzuführen und je nach Bedarf frische RPMI hinzuzufügen. Am siebten Tag werden die Petrischalen ein bis zwei Stunden auf Eis gestellt, um adhärente Zellen zu lösen Die nichtadhärenten Zellen werden mit dem Abgießen des Zellkulturmediums entfernt. Die am Boden der Zellkulturschale haftenden adhärenten Zellen werden mit 25 ml kaltem PBS von der Zellkulturschale gelöst, anschließend abpipettiert und in ein 50 ml-Röhrchen überführt. Aus diesem Röhrchen wird mit einer Spritze die Zellsuspension injektionsfähig entnommen. Bis zur Injektion soll die Spritze mit der Zellsuspension auf Eis gelagert werden. Die Lagerungszeit sollte drei Stunden nicht überschreiten.
Die Vakzinierung wird 3x vorgenommen im Abstand von 4–5 Wochen; je nach Tumorstadium wird eine 1/2 jährliche Nachimpfung vorgenommen. Dazu wird das Pferd mittels intravenöser Injektion von Xylazin (1,1 mg/kg Körpergewicht) sediert. Es erfolgt eine intrakutane Injektion der Vakzine direkt an die zuvor gereinigten und desinfizierten Bereiche der Wundränder aller chirurgisch entfernten Gewebsteile. Jede Probe individuell, tägliche Zellkontrolle und je nach Bedarf frisches RPMI dazu (Nährlösung). Dabei ist darauf zu achten, dass an jeder Lokalisation, an der Gewebe chirurgisch entfernt wurde, eine Injektion durchgeführt wird. Je nach Anzahl und Größe der Wundfläche werden zwischen 0,2 ml und 0,4 ml Vakzin pro Applikationsort injiziert.
Die vorstehend beschriebene Erfindung ermöglicht eine deutliche Verbesserung der Behandlungssituation bei Haustieren, insbesondere Pferden, Katzen und Hunden. Monozyten des betreffenden Tieres können über einen hypertonen, 50%-igen Percollgradienten in guter Reinheit und Ausbeute separiert werden und sind in der Lage, in vitro identische Zellen zu differenzieren. Eine Charakterisierung der dendritischen Zellen ist sowohl morphologisch als auch phänotypisch mittels Oberflächenmarker möglich. In einer gemischten Leukozytenreaktion wurde die antigenpräsentierende Funktion der in vitro generierten dendritischen Zellen bestätigt. Dabei konnte gezeigt werden, dass autologe dendritische Zellen effektive Stimulatoren darstellen, die Aufnahme geeigneter Antigene vorausgesetzt.
Die Gefahr, eine Autoagression in den behandelten Tieren hervorzurufen, falls die dendritischen Zellen körpereigene Strukturen präsentieren sollten, besteht nach den vorliegenden Ergebnissen nicht. Lediglich konnte bei einigen Tieren durch ungepulste, autologe dendritische Zellen eine dosisabhängige Inhibition der Lymphozytenproliferation induziert werden, die eventuell auf der Aufnahme von Selbstantigenen aus dem autologen Serum beruht, welches im Rahmen der Kultivierung der dendritischen Zellen zugesetzt wurde. Die Gefahr einer Toleranzinduktion, wie sie für immature dendritische Zellen beschrieben wird, ist zwar nicht gänzlich auszuschließen, bei Pferd, Hund oder Katze aber unwahrscheinlich.

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins zur Behandlung eines Tiers, umfassend die Schritte: Bereitstellung von Körpergewebe, welches wenigstens einmalig eingefroren und aufgetaut wird; und Bereitstellung einer geeigneten Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Blut, Knochenmark oder Rückenmark, erhältlich mittels: – Verhinderung der Gerinnung der Körperflüssigkeit, – differentielle Schwerkraftabsetzung der Bestandteile der Körperflüssigkeit, – Abtrennung zumindest eines Teils des resultierenden Überstands, – Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, – Bestimmung der Zellzahl der innerhalb der schweren Bestandteile, – Vermischung der schweren Bestandteile mit RMPI und autologem Serum, – Zugabe von Zytokinen – Inkubieren der Mischung; sowie Vermischung der Körperflüssigkeit mit dem Körpergewebe, umfassend die Schritte: – Inkubieren der Mischung aus zubereiteter Körperflüssigkeit und behandeltem Körpergewebe, – Ernte der gewonnenen Zellen, – differentielle Schwerkraftabsetzung der Zellen, – Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, – Bestimmung der Zellzahl.
Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Körpergewebe ein Tumorgewebe ist.
Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das zu behandelnde Tier ein Hund und/oder eine Katze und/oder ein Pferd ist.
Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Vakzin zur autologen (autogenen) und/oder allogenen (homogenen) und/oder xenogenen Behandlung geeignet ist.
Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Körperflüssigkeit ausgewählten Zellen natürliche Killerzellen und/oder Stromazellen und/oder Dendritzellen und/oder Osteoblastenzellen und/oder Endothelzellen sind.
Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytokin aus einer Gruppe umfassend Interleukin 1 (1α und/oder 1β), Interleukin 2, Interleukin 3 (Multipotential CSF), Interleukin 4, Interleukin 5, Interleukin 6, Interleukin 7, Interleukin 8, Interleukin 9, Interleukin 10, Interleukin 11, Interleukin 12, Interleukin 13, Interleukin 15, Interleukin 16, Interleukin 17, Interleukin 18, Interleukin 22, Interleukin 23, Interleukin 31, Interleukin 32, Interleukin 33, Interleukin 34, Interleukin 35, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierendes-Faktor (GM-CSF), Interferon (IFN) uns Tumor-Nekrose-Faktoren ausgewählt ist.
Arzneimittel zur Behandlung eines Tiers, erhältlich durch ein Verfahren zur Gewinnung eines Vakzins zur Behandlung eines Tiers, umfassend die Schritte: Bereitstellung von Körpergewebe, welches wenigstens einmalig eingefroren und aufgetaut wird; und Bereitstellung einer geeigneten Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Blut, Knochenmark oder Rückenmark, erhältlich mittels: – Verhinderung der Gerinnung der Körperflüssigkeit, – differentielle Schwerkraftabsetzung der Bestandteile der Körperflüssigkeit, – Abtrennung zumindest eines Teils des resultierenden Überstands, – Resuspendierung, der gewonnenen schweren Bestandteile, – Bestimmung der Zellzahl der innerhalb der schweren Bestandteile, – Vermischung der schweren Bestandteile mit RMPI und autologem Serum, – Zugabe von Zytokinen – Inkubieren der Mischung; sowie Vermischung der Körperflüssigkeit mit dem Körpergewebe, umfassend die Schritte: – Inkubieren der Mischung aus zubereiteter Körperflüssigkeit und behandeltem Körpergewebe, – Ernte der gewonnenen Zellen, – differentielle Schwerkraftabsetzung der Zellen, – Resuspendierung der gewonnenen schweren Bestandteile, – Bestimmung der Zellzahl.
Arzneimittel zur Behandlung eines Tiers nach Anspruch 7 zur Behandlung eines Tumors.
Arzneimittel zur Behandlung eines Tiers nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur autologen (autogenen) und/oder allogenen (homogenen) und/oder xenogenen Behandlung geeignet ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Behandlung eines Menschen und/oder Hundes und/oder einer Katze und/oder eines Pferdes.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Körperflüssigkeit ausgewählten Zellen natürliche Killerzellen und/oder Stromazellen und/oder Dendritzellen und/oder Osteoblastenzellen und/oder Endothelzellen sind.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytokin aus einer Gruppe umfassend Interleukin 1 (1α und/oder 1β), Interleukin 2, Interleukin 3 (Multipotential CSF), Interleukin 4, Interleukin 5, Interleukin 6, Interleukin 7, Interleukin 8, Interleukin 9, Interleukin 10, Interleukin 11, Interleukin 12, Interleukin 13, Interleukin 15, Interleukin 16, Interleukin 17, Interleukin 18, Interleukin 22, Interleukin 23, Interleukin 31, Interleukin 32, Interleukin 33, Interleukin 34, Interleukin 35, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierendes-Faktor (GM-CSF), Interferon (IFN) uns Tumor-Nekrose-Faktoren ausgewählt ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur adjuvanten Unterstützung einer Strahlenbehandlung.