DE69634499T2

DE69634499T2 - Verwendungsmethoden von einkernigen phagozyten zur förderung der axonalen regeneration

Info

Publication number: DE69634499T2
Application number: DE69634499T
Authority: DE
Inventors: Michal Eisenbach-Schwartz; Orly Spiegler; L. David HIRSCHBERG
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-12
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2016-09-13
Also published as: EP0952772A4; AU714205B2; CA2232262A1; DK0952772T3; ATE290789T1; EP0952772B1; JP4100707B2; PT952772E; IL123642A0; JPH11513370A; DE69634499D1; IL123642A; NZ319365A; WO1997009885A1; US6117424A; ES2241002T3; AU7157296A; EP0952772A1; US5800812A

Description

1. Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Steigern der therapeutischen Fähigkeit mononuclearer Phagocyten, die Regeneration von Axons im Zentralnervensystem zu fördern.
2. Stand der Technik
Nach einer Verletzung von Axons haben die Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS) von Säugern ein geringes Potential zur Regeneration von Axons. Im Gegensatz dazu ist die Fähigkeit von Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS) von Säugern zur Regeneration von Axons wesentlich stärker ausgeprägt. Vgl. Schwartz et al., 1989, FASEB J. 3: 2371–2378.
Der Unterschied zwischen der Regeneration von Axons im ZNS und im PNS wurde der zellulären Umgebung der Neuronen und weniger den Neuronen selbst zugeschrieben. Nach einer Nervenverletzung werden die Schwann-Zellen, welche die PNS-Neuronen umgeben, so moduliert, dass sie die Regeneration von Axons erlauben oder unterstützen. Im Gegensatz dazu zeigen die Astrocyten, Oligodendrocyten und Mikroglia, welche die ZNS-Neuronen umgeben, keine solche Modulation und verbleiben im einem Zustand, der die Regeneration von Axons nicht unterstützt oder sogar hemmt. Vgl. Schwartz et al., 1987, CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 89–110.
Dieses Fehlen einer Modulation wurde mit Unterschieden in der nach der Verletzung auftretenden Entzündungsreaktion in Zusammenhang gebracht. Vgl. Perry und Brown, 1992, Bioessays 14: 401–406; Lotan und Schwartz, 1994, FASEB J. 8: 1026–1033. Insbesondere wird die Akkumulation von mononuclearen Phagocyten als Antwort auf eine ZNS-Verletzung im Vergleich zur Anwort auf eine Verletzung im PNS verzögert und begrenzt. Diese begrenzte Antwort von mononuclearen Phagocyten im ZNS führt möglicherweise ihrerseits (1) zu einer ineffizienten Entfernung der Myelin-reste, wodurch nachweislich die Regeneration von Axons gehemmt wird, und (2) zu einer suboptimalen Freisetzung von aus Makrophagen stammenden Cytokinen, die eine Modulation von Astrocyten und Oligodendrocyten zur Unterstützung der Regeneration von Axons fördern würden.
Die vorstehenden Beobachtungen haben die Vermutung bestätigt, dass eine geeignete Modulation der Makrophagen-Antwort die Regeneration von Axons nach einer ZNS-Verletzung fördern könnte. In einem in vitro-System zeigten David et al., dass bei einem gemeinsamen Züchten von Cryostat-Schnitten eines normalen Sehnervs der Ratte mit mononuclearen Phagocyten, die aus Läsionen des Ratten-ZNS stammten, die Sehnerv-Schnitte eine gesteigerte Adhäsion für embryonale Hühner-Hinterwurzelganglion-Zellen aufwiesen. David et al., 1990, Neuron 5: 463–469. Außerdem förderte ein konditioniertes Medium von aktivierten peritonealen Makrophagen in diesem in vitro-Test wirksam die Adhäsion von Schnitten des Sehnervs.
Jedoch haben Ergebnisse, die aus in vivo-Modellen von ZNS-Verletzungen stammten, gezeigt, dass gewissen Eingriffe, welche die Makrophagen-Antwort auf eine Verletzung des ZNS steigern, nicht zu einer verstärkten Regeneration führen. Z.B. steigerte eine lokale Injektion entweder des Tumornekrosefaktors alpha (TNF-α) oder des koloniestimulierenden Faktors 1 (CSF-1) die Makrophagen-Antwort auf eine experimentelle Verletzung des Sehnervs. Jedoch erhöhte nur TNF-α, nicht jedoch CSF-1, die Fähigkeit von verletzten Sehnerven, die Adhäsion von Nervenzellen zuzulassen, wie in vitro getestet wurde. Lotan et al., 1984, Exp. Neurol. 126: 284–290. Als eine mögliche Erklärung wurde angenommen, dass „nur geeignet stimulierte Makrophagen die neuronale Regeneration beeinflussen können". Schwartz et al., 1994, Progress Brain Res. 103: 331–341, auf 338.
Tatsächlich haben andere Forscher im Gegensatz zu den Ausführungen der vorliegenden Erfindung berichtet, dass mononucleare Phagocyten möglicherweise die Schädigung nach einer Verletzung des ZNS verschlimmern oder die Wiederherstellung begrenzen würden. Makrophagen des Gehirns, die durch Cytokine stimuliert wurden, zeigen eine neurotoxische Aktivität. Chamak et al., 1994, J. Neurosci. Res. 38: 221–233. Es wurde berichtet, dass eine pharmakologische Hemmung der Funktion von mononuclearen Phagocyten in einem Modell für Rückenmarkverletzungen beim Kaninchen die Wiederherstellung förderte. Giulian und Robertson, 1990, Annals Neurol. 27: 33–42. Man nahm an, dass die aus Makrophagen stammenden Cytokine möglicherweise die Bildung von Glia-Narben fördern und dadurch die Regeneration von Axons hemmen. Khan und Wigley, 1994, NeuroReport 5: 1381–1385; Vick et al., 1992; J. Neurotrauma 9: S93–S103.
Nach bestem Wissen der Erfinder gab es vor der vorliegenden Erfindung keinen Hinweis darauf, mononucleare Phagocyten in das ZNS zu verabreichen, um die Regeneration von Axons im ZNS zu fördern.
Zitate oder Angaben von Referenzen in Abschnitt 2 (oder einem anderen Abschnitt) der vorliegenden Anmeldung sollen nicht als ein Eingeständnis dafür verstanden werden, dass eine solche Referenz als bekannter Stand der Technik der vorliegenden Erfindung verfügbar ist.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Steigern der Fähigkeit von allogenen mononuclearen Phagocyten, die Regeneration von Axons im Zentralnervensystem eines Säugers zu fördern. Die allogenen mononuclearen Phagocyten können ins ZNS an der Stelle der Verletzung oder Krankheit oder in der Nähe davon verabreicht werden.
Allogene mononucleare Phagocyten, die im Verfahren der Erfindung eingesetzt werden können, umfassen allogene Monocyten, Makrophagen und dendritische Zellen sowie autologe Monocyten, Makrophagen und dendritische Zellen.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Stimulieren von allogenen mononuclearen Phagocyten bereit, um ihre Fähigkeit zur Förderung der Regeneration von Axons im Zentralnervensystem eines Säugers zu steigern. Die mononuclearen Phagocyten werden stimuliert, indem sie zusammen mit einem geeigneten Gewebe oder geeigneten Zellen gezüchtet werden, oder indem die mononuclearen Phagocyten in einem Medium gezüchtet werden, das mit einem geeigneten Gewebe oder geeigneten Zellen konditioniert wurde. Gewebe, die für diesen Zweck geeignet sind, umfassen Nervensegmente, insbesondere Segmente eines peripheren Nervs, Dermis, Synovialgewebe, Sehnenscheide, Leber und andere regenerierende Gewebe. Alternativ werden die mononuclearen Phagocyten stimuliert, indem sie in einem Medium gezüchtet werden, zu dem mindestens ein geeignetes biologisch aktives Agens zugefügt wurde. Biologisch aktive Agenzien, die für diesen Zweck geeignet sind, umfassen Neuropeptide; Cytokine, z.B. den transformierenden Wachstumsfaktor β(TGF-β); und neurotrophische Faktoren, z.B. den neurotrophischen Faktor 3 (NT-3), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und den Hirn-abgeleiteten neurotrophischen Faktor (BDNF). Ein biologisch aktives Protein oder Peptid kann in seiner nativen oder in einer rekombinanten Form verwendet werden.
Außerdem offenbart die vorliegende Erfindung einen Test zum Identifizieren von weiteren Geweben, Zellen und biologisch aktiven Agenzien, die zum Stimulieren von mononuclearen Phagocyten geeignet sind, ihre Fähigkeit zur Förderung der Regeneration von Axons zu steigern. Gemäß diesem Test werden mononucleare Phagocyten zuerst zusammen mit dem zu testenden Gewebe oder den zu testenden Zellen oder in einem Medium, das durch das zu testenden Gewebe oder die zu testenden Zellen konditioniert wurde, oder in einem Medium gezüchtet, zu dem das zu testende biologisch aktive Agens zugegeben wurde. Anschließend wird die phagocytische Aktivität der gezüchteten mononuclearen Phagocyten gemessen. Mononucleare Phagocyten mit einer erhöhten phagocytischen Aktivität weisen eine gesteigerte Fähigkeit zur Förderung der Regeneration von Axons auf.
4. Kurze Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung ist besser verständlich, wenn Bezug genommen wird auf die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung, die Beispiele spezifischer Ausführungsformen der Erfindung und die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist.
1 erläutert die Regeneration von Axons in durchtrennten Sehnerven von Ratten, die durch den retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff zu Netzhautganglienzellen (RGCs) nachgewiesen wurde. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. Kurz nach der Durchtrennung wurden an der Stelle der Verletzung 2 μl DCCM-1-Medium verabreicht, enthaltend keine Zellen (MED); 2,5 × 10³ bis 1 × 10⁵ nicht-stimulierte (NS) Monocyten; 2,5 × 10³ bis 1 × 10⁵ Sehnerv-stimulierte (OS) Monocyten; oder 2,5 × 10³ bis 1 × 10⁵ Ischiasnerv-stimulierte (SS) Monocyten. Die leeren Kreise stellen einzelne Versuchstiere dar. Die gefüllten Kreise stellen Tiere dar, die keine markierten RGCs aufwiesen (Anzahl von 7, 7 und 6 in den mit MED, NS bzw. OS behandelten Gruppen). Die waagrechten Linien stellen den Mittelwert jeder Behandlungsgruppe dar.
2 erläutert die Regeneration von Axons in durchtrennten Sehnerven von Ratten als Funktion der Zahl und des Typs von Monocyten, die an der Stelle der Verletzung kurz nach der Durchtrennung verabreicht wurden. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. Zum Zeitpunkt der Durchtrennung wurden 2 μl DCCM-1-Medium an der Stelle der Verletzung verabreicht, enthaltend Sehnerv-stimulierte Monocyten (OS) oder Ischiasnerv-stimulierte Monocyten (SS) in einer Gesamtdosis von 2,5 × 10³ Zellen; 5 × 10³ Zellen; 10⁴ Zellen; oder 10⁵ Zellen.
3 (A und B) stellt repräsentative Mikrofotografien dar, die eine retrograde Markierung von Retinaganglienzellen in Ratten zeigen, bei denen eine Durchtrennung des Sehnervs und eine anschließende Verabreichung von (A) 5 × 10³ Ischiasnerv-stimulierten Monocyten oder (B) Kontrollmedium erfolgte. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6.
4 (A bis E) stellt repräsentative Mikrofotografien dar, die eine anterograde Markierung von Sehnervfasern in Ratten zeigen, bei denen eine Durchtrennung des Sehnervs und eine anschließende Verabreichung von Ischiasnerv-stimulierten Monocyten (A bis D) oder Kontrollmedium (E) erfolgte. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. 4A stellt eine Ansicht mit geringer Vergrößerung dar, die den Punkt, an dem HRP angewendet wurde (H), die Stelle der Durchtrennung (ST) und die umgebende Dura mater (DU) zeigt. Der eingeklammerte Bereich, distal zur Stelle der Durchtrennung, ist in den 4B, 4C und 4D in stärkerer Vergrößerung dargestellt, in denen Wachstumskonus-artige Strukturen (gc) an den Spitzen der Fasern zu sehen sind.
5 erläutert die Regeneration von Axons in durchtrennten Sehnerven von Ratten, nachdem an der Stelle der Verletzung Monocyten verabreicht wurden, die zwei bis 17 Stunden zusammen mit einem Ischiasnerv gezüchtet worden waren. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. Zum Zeitpunkt der Durchtrennung wurden 2 μl DCCM-1-Medium an der Stelle der Verletzung verabreicht, enthaltend 5 × 10³ nicht-stimulierte Monocyten (NS) oder 5 × 10³ Monocyten, die zusammen mit einem Ischiasnerv der Ratte 2 Stunden (2 Std.), 12 Stunden (12 Std.) oder 17 Stunden (17 Std.) gezüchtet worden waren.
6 erläutert die Regeneration von Axons in durchtrennten Sehnerven, nachdem an der Stelle der Verletzung Ratten-Monocyten verabreicht wurden, die mit einem Ischiasnerv der Maus oder mit einem Ischiasnerv der Ratte stimuliert worden waren. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. Zum Zeitpunkt der Durchtrennung wurden 2 μl DCCM-1-Medium an der Stelle der Verletzung verabreicht, enthaltend 5 × 10³ Monocyten, die 24 Stunden entweder zusammen mit einem Ischiasnerv der Maus (Maus) oder mit einem Ischiasnerv der Ratte (Ratte) gezüchtet worden waren.
7 erläutert die phagocytische Aktivität von Ratten-Monocyten, die zwei Stunden zusammen mit einem Ischiasnerv der Ratte gezüchtet wurden. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. 2,5 × 10⁵ Ratten-Monocyten wurden in 1 ml DCCM-1-Medium alleine (Kontrolle) oder in 1 ml DCCM-1-Medium zusammen mit zwei Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte (2SS) oder zusammen mit vier Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte (4SS) gezüchtet. Nach zwei Stunden wurden die Monocyten mit fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt gebracht und sodann die Zell-assoziierte Fluoreszenz mittels Durchflusscytometrie gemessen.
8 erläutert die phagocytische Aktivität von Ratten-Monocyten, die 24 Stunden zusammen mit einem Ischiasnerv der Ratte gezüchtet wurden. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. 2,5 × 10⁵ Ratten-Monocyten wurden in 1 ml DCCM-1-Medium alleine (Kontrolle) oder in 1 ml DCCM-1-Medium zusammen mit einem Segment eines Ischiasnervs der Ratte (1SS) oder mit vier Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte (4SS) gezüchtet. Nach 16 bis 24 Stunden wurden die Monocyten mit fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt gebracht und sodann die Zell-assoziierte Fluoreszenz mittels Durchflusscytometrie gemessen.
9 erläutert die phagocytische Aktivität von Ratten-Monocyten, die zwei Stunden zusammen mit einem Sehnerv der Ratte gezüchtet wurden. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. 2,5 × 10⁵ Ratten-Monocyten wurden in 1 ml DCCM-1-Medium alleine (Kontrolle) oder in 1 ml DCCM-1-Medium zusammen mit vier Segmenten eines Sehnervs der Ratte (4OS) gezüchtet. Nach zwei Stunden wurden die Monocyten mit fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt gebracht und sodann die Zell-assoziierte Fluoreszenz mittels Durchflusscytometrie gemessen.
10 erläutert die phagocytische Aktivität von Ratten-Monocyten, die 24 Stunden zusammen mit einem Sehnerv der Ratte gezüchtet wurden. Einzelheiten der Experimente finden sich im Text, Abschnitt 6. 2,5 × 10⁵ Ratten-Monocyten wurden in 1 ml DCCM-1-Medium alleine (Kontrolle) oder in 1 ml DCCM-1-Medium zusammen mit vier Segmenten eines Sehnervs der Ratte (4OS) gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Monocyten mit fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt gebracht und sodann die Zell-assoziierte Fluoreszenz mittels Durchflusscytometrie gemessen.
11 erläutert die phagocytische Aktivität von Ratten-Monocyten, die über Nacht zusammen mit einem Ischiasnerv der Ratte in Gegenwart von Medium gezüchtet wurden, das durch einen Sehnerv der Ratte konditioniert worden war. 5 × 10⁵ Ratten-Monocyten wurden in 1 ml DCCM-1-Medium zusammen mit sechs Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte ohne weitere Zusätze (0) oder mit Zugabe eines Sehnerv-konditionierten Mediums bei einer Gesamt-Proteinkonzentration von 0,1 μg/ml (0,1), 1,0 μg/ml (1) oder 10 μg/ml (10) gezüchtet. Nach 24 Stunden wurden die Monocyten mit fluoreszierenden Kügelchen in Kontakt gebracht und sodann die Zell-assoziierte Fluoreszenz mittels Durchflusscytometrie gemessen.
5. Genaue Beschreibung der Erfindung
5.1. Mononucleare Phagocyten
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Steigern der Fähigkeit von allogenen mononuclearen Phagocyten bereit, die Regeneration von Axons nach einer Verletzung oder Krankheit des Zentralnervensystems (ZNS) zu fördern. Die allogenen mononuclearen Phagocyten können an der Stelle der Verletzung oder der Krankheit des ZNS oder in der Nähe davon eingeführt werden.
In der Verwendung hier soll der Begriff „mononucleare Phagocyten" Monocyten, die aus zentralem oder peripherem Blut erhalten wurden, Makrophagen, die von einer beliebigen Stelle erhalten wurden, umfassend ein beliebiges Gewebe oder eine beliebige Höhle, Makrophagen, die durch Züchten von Makrophagen-Vorläufern hergeleitet wurden, welche aus Knochenmark oder Blut erhalten wurden, dendritische Zellen, die von einer beliebigen Stelle erhalten wurden, umfassend Milz, Lymphknoten, Haut und Lymphflüssigkeit, und dendritische Zellen, die durch Züchten von Vorläufern dendritischer Zellen hergeleitet wurden, welche aus Knochenmark oder Blut erhalten wurden, umfassen.
Allogene mononucleare Phagocyten können aus dem Kreislauf oder aus einem beliebigen Gewebe, in dem sie vorliegen, erhalten werden. Peripheres Blut ist eine leicht zugängliche direkte Quelle von allogenen Monocyten und dient gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung als eine Quelle. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von autologen Monocyten, die aus dem peripheren Blut eines Individuums gereinigt wurden, an welches das therapeutische Präparat verabreicht werden soll.
Allogene mononucleare Phagocyten aus anderen Quellen sind dem Fachmann bekannt und umfassen Makrophagen, die aus Serosahöhlen, z.B. aus der Peritonealhöhle oder Pleurahöhle, erhalten wurden, Alveolarmakrophagen und Makrophagen, die mit anderen Geweben assoziiert sind, wo sie unter verschiedenen Namen bekannt sein können, z.B. als Kupffer-Zellen (in der Leber) und als Mikroglia-Zellen (im ZNS). Allogene mononucleare Phagocyten umfassen weiterhin dendritische Zellen, die genauso unter verschiedenen Namen bekannt sein können, z.B. als Langerhans-Zellen (in der Haut), Schleierzellen (in Lymphflüssigkeit) und interdigitierende Zellen (in Lymphknoten). Außerdem können mononucleare Phagocyten durch Züchten aus allogenen Hirn-abgeleiteten gemischten Gliazellen oder aus allogenen Vorläuferzellen hergeleitet werden, die aus Knochenmark oder Blut gewonnen werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen, die keine mononuclearen Zellen sind, aus der Zellpopulation, die verabreicht werden soll, entzogen. Dem Fachmann sind Anreicherungstechniken bekannt, diese umfassen Elutriation; Zentrifugation durch ein Material geeigneter Dichte, z.B. einen Percoll-Gradienten (Colotta et al., 1983, J. Immunol. 132: 936–944); selektive Adhäsion an geeignete Oberflächen und anschließende Entfernung bei geringerer Temperatur oder bei herabgesetzten Konzentrationen von zweiwertigen Kationen (Rosen und Gordon, 1987, J. Exp. Med. 166: 1685–1701), mechanische Entfernung oder Entfernung in Gegenwart von Lidocain; und Verfahren zum Isolieren von dendritischen Zellen aus Blut (O'Doherty et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1067–1078), Knochenmark (Inaba et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1693–1702) und lymphoidem Gewebe (Macatonia et al., J. Exp. Med. 169: 1255–1264). Besonders bevorzugt ist ein im Wesentlichen gereinigtes Präparat von mononuclearen Phagocyten.
Sobald die mononuclearen Phagocyten erhalten wurden, können sie zu jeder gewünschten Zeit therapeutisch eingesetzt werden, wie es für den Patienten erforderlich ist. Die mononuclearen Phagocyten können gewünschtenfalls vor dem Verabreichen in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden. Vorzugsweise werden die mononuclearen Phagocyten in einem Gefäß gezüchtet, das aus einem sterilen Material besteht, an das sich diese Zellen nur begrenzt oder gar nicht anheften. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mononuclearen Phagocyten vor der Verabreichung in sterilen Teflon-Beuteln gezüchtet.
In der Verwendung hier sind „stimulierte" mononucleare Phagocyten mononucleare Phagocyten mit einer gesteigerten Fähigkeit, die Regeneration von Axons zu fördern. Vorzugsweise ist die Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten, die Regeneration von Axons zu fördern, im Vergleich zu nicht-stimulierten mononuclearen Phagocyten mindestens um das Dreifache gesteigert, stärker bevorzugt ist die Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten, die Regeneration von Axons zu fördern, im Vergleich zu nicht-stimulierten mononuclearen Phagocyten mindestens um das 15-Fache gesteigert. „Stimulatorisches" Gewebe, Zellen und biologisch aktive Agenzien sind Gewebe, Zellen und biologisch aktive Agenzien, die, wenn sie zusammen mit mononuclearen Phagocyten gezüchtet werden, die Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten steigern, die Regeneration von Axons zu fördern.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird stimulatorisches Gewebe, Zellen oder mindestens ein stimulatorisches, biologisch aktives Agens zu der Kultur zugegeben, um die Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten zu steigern, die Regeneration von Axons zu fördern. Vorzugsweise werden ein oder mehrere Segmente eines Nervs, am stärksten bevorzugt eines peripheren Nervs, z.B. des Ischiasnervs, zu der Kultur zugegeben. Für diesen Zweck ist ein xenogener Nerv geeignet, stärker bevorzugt ist ein allogener oder ein autologer Nerv geeignet. Gewünschtenfalls kann ein menschlicher Nerv aus einem beliebigen verfügbaren menschlichen Gewebe erhalten werden, z.B. einer menschlichen Leiche oder einem Operationspräparat (z.B. einer amputierten Extremität). Anderenfalls werden andere stimulatorische Gewebe oder Zellen zu der Kultur zugegeben. Dermis ist für diesen Zweck geeignet und kann aus einem Lebendspender oder einer Leiche durch Stanzbiopsie, durch chirurgische Resektion oder durch eine beliebige andere geeignete Technik gewonnen werden. Auch Synovialgewebe, Sehnenscheide und Leber sind wie andere regenerierende Gewebe für diesen Zweck geeignet. Weitere stimulatorische Gewebe und Zellen lassen sich gemäß dem nachstehend beschriebenen Test identifizieren. Gewünschtenfalls werden die stimulatorischen Gewebe oder Zellen vor Zugabe zur Kultur homogenisiert. Für den Fachmann ist es selbstverständlich, dass das Homogenisat des stimulatorischen Gewebes oder der stimulatorischen Zellen vor der Verwendung konserviert werden kann, z.B. durch Cryopräservation.
In einer anderen Ausführungsform wird mindestens ein stimulatorisches, biologisch aktives Agens zu der Kultur zugegeben; um die Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten zu steigern, die Regeneration von Axons zu fördern. Für diesen Zweck sind der neurotrophische Faktor 3 (NT3), der Nervenwachstumsfaktor (NGF), der Hirn-abgeleitete neurotrophische Faktor und der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) entweder alleine oder in Kombination geeignet, wobei sie entweder in nativer oder in rekombinanter Form vorliegen können. Weitere stimulatorische, biologisch aktive Agenzien (umfassend weitere stimulatorische Proteine und Peptide) können gemäß dem nachstehend beschriebenen Test identifiziert werden.
Vorzugsweise werden die mononuclearen Phagocyten zusammen mit einem stimulatorischen Gewebe, stimulatorischen Zellen, einem Homogenisat eines stimulatorischen Gewebes oder stimulatorischer Zellen, oder mindestens einem stimulatorischen, biologisch aktiven Agens 24 Stunden gezüchtet. Auch kürzere Züchtungszeiträume, z.B. etwa zwei Stunden, sind effektiv, außerdem auch längere Züchtungszeiträume, z.B. eine oder mehrere Wochen. In einer anderen Ausführungsform wird ein stimulatorisches konditioniertes Medium hergestellt, indem stimulatorisches Gewebe oder stimulatorische Zellen, vorzugsweise ein oder mehrere Segmente eines Nervs, am stärksten bevorzugt eines peripheren Nervs, z.B. des Ischiasnervs, in einem beliebigen Medium, das zum Züchten von mononuclearen Phagocyten geeignet ist, inkubiert werden. Nach Entfernung des Gewebes oder der Zellen werden mononucleare Phagocyten in dem stimulatorischen konditionierten Medium gezüchtet, um ihre Fähigkeit zu steigern, die Regeneration von Axons zu fördern. Nach Entfernung des Gewebes oder der Zellen kann das stimulatorische konditionierte Medium gelagert und später verwendet werden, wie es für die Stimulation von mononuclearen Phagocyten gewünscht wird. Ein solches stimulatorisches konditioniertes Medium kann in Form eines kommerziellen Kits bereitgestellt werden. Vorzugsweise wird das stimulatorische konditionierte Medium während der Lagerung konserviert, z.B. durch Einfrieren, entweder als Flüssigkeit oder als gefrorenes Medium. Andererseits kann das stimulatorische konditionierte Medium auch gefriergetrocknet werden.
Wie für den Fachmann selbstverständlich ist, können die mononuclearen Phagocyten entweder vor oder nach dem Züchten z.B. durch Cryopräservation konserviert werden.
Mittel zur Cryopräservation, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Dimethylsulfoxid (DMSO) (Lovelock und Bishop, 1959, Nature 183: 1394–1395; Ashwood-Smith, 1961, Nature 190: 1204–1205), Glycerin, Polyvinylpyrrolidon (Rinfret, 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85: 576), Polyethylenglykol (Sloviter und Ravdin, 1962, Nature 196: 548), Albumin, Dextran, Saccharose, Ethylenglykol, i-Erythrit, D-Ribit, D-Mannit (Rowe et al., 1962, Fed. Proc. 21: 157), D-Sorbit, i-Inosit, D-Lactose, Cholinchlorid (Bender et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15: 520), Aminosäuren (Phan The Tran und Bender, 1960, Exp. Cell Res. 20: 651), Methanol, Acetamid, Glycerinmonoacetat (Lovelock, 1954, Biochem. J. 56: 265), anorganische Salze (Phan The Tran und Bender, 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104: 388; Phan The Tran und Bender, 1961, in: Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery, P.L.T., Hrsg., Butterworth, London, S. 59), und DMSO, kombiniert mit Hydroxyethylstärke und menschlichem Serumalbumin (Zaroulis und Leiderman, 1980, Cryobiology 17: 311–317).
Eine kontrollierte Abkühlungsrate ist kritisch. Verschiedene cryoprotektive Mittel (Rapatz et al., 1968, Cryobiology 5 (1): 18–25) und verschiedene Zelltypen haben unterschiedliche optimale Abkühlungsraten. Vgl. z.B. Rowe und Rinfret, 1962, Blood 20: 63.6; Rowe, 1966, Cryobiology 3 (1): 12–18; Lewis et al., 1967, Transfusion 7 (1): 17–32; und Mazur, 1970, Science 168: 939–949, für Effekte der Abkühlungsgeschwindigkeit auf das Überleben von Mark-Stammzellen und auf ihr Transplantationspotential. Die Wärme der Schmelzphase, in der Wasser zu Eis wird, sollte minimal sein. Die Abkühlungsprozedur kann durchgeführt werden, indem z.B. eine programmierbare Gefriervorrichtung oder ein Methanolbad-Verfahren verwendet wird.
Programmierbare Gefrierapparaturen erlauben die Bestimmung von optimalen Abkühlungsraten und erleichtern eine reproduzierbare Standardkühlung. Mit programmierbaren Gefrierschränken mit kontrollierter Rate, z.B. Cryomed oder Planar, lassen sich die Gefrierschemata auf die gewünschte Abkühlungsrate-Kurve einstellen.
Nach dem vollständigen Einfrieren können die Zellen rasch in ein Gefäß für die langfristige Tieftemperatur-Lagerung überführt werden. In einer Ausführungsform können die Proben in mechanischen Gefrierschränken bei tiefen Temperaturen gelagert werden, z.B. in Gefrierschränken, die eine Temperatur von etwa –80°C oder von etwa –20°C halten. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Proben in flüssigem Stickstoff (–196°C) oder seinem Dampf tieftemperatur-gelagert werden. Eine solche Lagerung wird dadurch deutlich erleichtert, dass hochwirksame Kühlschränke mit flüssigem Stickstoff verfügbar sind, die ähnlich gebaut sind wie große Thermosbehälter mit einem extrem niedrigen Vakuum und einer sehr guten Innenisolierung, so dass Wärmedurchlässigkeit und Stickstoffverluste bei einem absoluten Minimum gehalten werden.
Die Überlegungen und Verfahren zur Manipulation, Cryopräservation und langfristigen Lagerung von hämatopoetischen Stammzellen, insbesondere aus Knochenmark oder peripherem Blut, lassen sich größtenteils auf die mononuclearen Phagocyten anwenden, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. Eine solche Diskussion findet sich z.B. in den folgenden Referenzen, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind: Gorin, 1986, Clinics in Haematology 15 (1): 19–48; Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moskau, 22. bis 26. Juli, 1968, Internationale Atomenergie Organisation, Wien, S. 107–186.
Auch andere Verfahren zur Cryopräservation von lebenden Zellen oder Modifikationen davon sind verfügbar und werden für die Verwendung in Betracht gezogen, z.B. „Cold Metal-Mirrow" Verfahren. Vgl. Livesey und Linner, 1987, Nature 327: 255; Linnen et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34 (9): 1123–1135; vgl. auch US Patent Nr. 4 199 022 von Senken et al., US Patent Nr. 3 753 357 von Schwartz, US Patent Nr. 4 559 298 von Fahy.
Gefrorene Zellen werden vorzugsweise rasch aufgetaut (z.B. in einem Wasserbad, das bei 37 bis 41°C gehalten wird) und unmittelbar nach Auftauen abgeschreckt. Es kann wünschenswert sein, die Zellen so zu behandeln, dass ein Verklumpen der Zellen beim Auftauen verhindert wird. Das Verklumpen kann anhand von verschiedenen Verfahren verhindert werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf den Zusatz, vor und/oder nach dem Einfrieren von DNAse (Spitzer et al., 1980, Cancer 45: 3075–3085), niedermolekularem Dextran und Citrat, Hydroxyethylstärke (Stift et al., 1983, Cryobiology 20: 17–24) oder saurer Citrat-Dextrose (Zaroulis und Leiderman, 1980, Cryobiology 17: 311–317) usw..
Das cryoprotektive Mittel sollte, falls es für Menschen toxisch ist, vor der therapeutischen Verwendung der aufgetauten mononuclearen Phagocyten entfernt werden. Eine Art, wie das cryoprotektive Mittel entfernt werden kann, besteht darin, es auf eine nicht signifikante Konzentration zu verdünnen.
Sobald die gefrorenen mononuclearen Phagocyten aufgetaut und gewonnen wurden, können sie eingesetzt werden, um die Regeneration von Axons zu fördern, wie hier mit Bezug auf nicht-eingefrorene mononucleare Phagocyten beschrieben wird.
5.2. Verfahren
Die mononuclearen Phagocyten, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, können in einem sterilen, pharmazeutisch verträglichen Träger suspendiert und in das ZNS eines Säugers, einschließlich eines Menschen, an der Stelle einer Verletzung oder Krankheit oder in der Nähe davon verabreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der pharmazeutisch verträgliche Träger PBS oder ein Kulturmedium. Jedoch sind dem Fachmann auch andere pharmazeutisch verträgliche Träger geläufig.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die mononuclearen Phagocyten unmittelbar nach der Verletzung des ZNS verabreicht werden, wobei sie an der Stelle der Verletzung des ZNS z.B. mit einer Mikropipette aus Glas eingeführt werden. Jedoch kann die Verabreichung der mononuclearen Phagocyten auch zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Verletzung oder Erkrankung des ZNS erfolgen, indem die mononuclearen Phagocyten an der Stelle der Verletzung oder Erkrankung des ZNS oder in der Nähe davon durch ein neurochirurgisch geeignetes Verfahren eingeführt werden.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen mononuclearen Phagocyten eignen sich zur Behandlung einer beliebigen Verletzung oder Krankheit des ZNS, die zu einer Schädigung der Axons führt oder davon begleitet wird. Die Verletzung oder Krankheit kann in einem beliebigen Teil des ZNS liegen, umfassend Gehirn, Rückenmark oder Sehnerv. Ein Beispiel einer solchen Verletzung oder Krankheit ist ein Trauma, umfassend eine Coup- oder Contrecoup-Verletzung, eine penetrierende Verletzung und eine Verletzung, die während einer neurochirurgischen Operation oder eines anderen Eingriffs erlitten wurde. Ein anderes Beispiel einer solchen Verletzung oder Krankheit ist ein Schlaganfall, umfassend einen hämorrhagischen oder ischämischen Schlaganfall. Noch ein weiteres Beispiel einer solchen Verletzung oder Krankheit ist eine Schädigung des Sehnnervs, die bei optischer Neuropathie oder Glaukom auftritt. Für den Fachmann sind aus der vorliegenden Beschreibung noch weitere Beispiele von ZNS-Verletzungen oder Krankheiten ersichtlich. Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen mononuclearen Phagocyten eignen sich zur Behandlung einer Verletzung oder Krankheit des ZNS, die zu einer Schädigung der Axons führt, wobei das Individuum auch an einer anderen Krankheit des zentralen oder peripheren Nervensystems leiden kann, z.B. einer neurologischen Krankheit genetischen, metabolischen, toxischen, ernährungsbedingten, infektiösen oder autoimmunen Ursprungs.
Die optimale Dosis mononuclearen Phagocyten ist proportional zur Zahl der Nervenfasern, die durch die Verletzung oder Krankheit des ZNS an der Stelle, die behandelt wird, betroffen sind. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Dosis für die Behandlung einer Läsion, die etwa 10⁵ Nervenfasern betrifft, z.B. einer vollständigen Durchtrennung des Sehnervs der Ratte, im Bereich von etwa 2,5 × 10³ bis etwa 10⁵ mononuclearen Phagocyten, und sie liegt für die Behandlung einer Läsion, die etwa 10⁶ Nervenfasern betrifft, z.B. einer vollständigen Durchtrennung des Sehnervs des Menschen, im Bereich von etwa 2,5 × 10⁴ bis etwa 10⁶ mononuclearen Phagocyten. Stärker bevorzugt liegt die Dosis für die Behandlung einer Läsion, die etwa 10⁵ Nervenfasern betrifft, im Bereich von etwa 2,5 × 10³ bis etwa 5 × 10⁴ mononuclearen Phagocyten, und sie liegt für die Behandlung einer Läsion, die etwa 10⁶ Nervenfasern betrifft, im Bereich von etwa 2,5 × 10⁴ mononuclearen Phagocyten bis etwa 5 × 10⁵ mononuclearen Phagocyten.
Besonders bevorzugt ist eine Dosis von etwa 5 × 10³ mononuclearen Phagocyten für die Behandlung einer Läsion, die etwa 10⁵ Nervenfasern betrifft, und eine Dosis von etwa 5 × 10⁴ mononuclearen Phagocyten für die Behandlung einer Läsion, die etwa 10⁶ Nervenfasern betrifft.
5.3. Test auf stimulatorische Gewebe, Zellen und biologisch aktive Agenzien
Die vorliegende Erfindung offenbart einen Test zum Identifizieren von stimulatorischen Geweben und Zellen und stimulatorischen, biologisch aktiven Agenzien. Mononucleare Phagocyten werden zusammen mit dem Gewebe oder den Zellen, das/die getestet werden soll/sollen, in einem Medium, das durch das Gewebe oder die Zellen, das/die getestet werden soll/sollen, konditioniert wurde, oder in einem Medium gezüchtet, zu dem das biologisch aktive Agens oder die biologisch aktiven Agenzien, das/die getestet werden soll/sollen, in verschiedenen Konzentrationen zugefügt wurde/wurden. Danach wird die phagocytische Aktivität der mononuclearen Phagocyten gemessen. Mononucleare Phagocyten mit einer erhöhten phagocytischen Aktivität besitzen eine gesteigerte Fähigkeit, die Regeneration von Axons zu fördern. Vorzugsweise ist die phagocytische Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten um mindestens 10%, stärker bevorzugt um mindestens 25% und noch stärker bevorzugt um mindestens 50% erhöht.
In einer bestimmten Ausführungsform wird die phagocytische Aktivität gemessen, indem die mononuclearen Phagocyten mit markierten Partikeln in Kontakt gebracht werden und anschließend die Menge der Markierung bestimmt wird, die mit den Zellen assoziiert ist. Für diesen Zweck kann eine große Vielfalt von Partikeln eingesetzt werden, umfassend Latex- oder Polystyrol-Kügelchen und natürlich vorkommende Zellen, z.B. rote Blutkörperchen, Hefen und Bakterien. Gegebenenfalls können die Partikel opsoniert sein, z.B. mit Immunglobulin oder Komplement. Die Partikeln können mit einem beliebigen löslichen Marken markiert sein, umfassend ohne Einschränkung einen fluoreszierenden Marken (z.B. Fluorescein oder Rhodamin), einen radioaktiven Marken (z.B. ein radioaktives Isotop von Iod, Kohlenstoff oder Wasserstoff) und ein Enzym. Alternativ kann der Test mit nicht-markierten Partikeln (z.B. roten Blutkörperchen oder Hefen) durchgeführt werden; die nicht-markierten Partikel werden durch ein beliebiges geeignetes Verfahren nachgewiesen, z.B. mikroskopisch, mit oder ohne Färbung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mononuclearen Phagocyten zuerst mit fluoreszierenden Polystyrol-Kügelchen in Kontakt gebracht; anschließend wird die Zell-assoziierte Fluoreszenz mittels Durchflusscytometrie gemessen.
Der Test stellt außerdem ein Verfahren bereit, mit dem der Züchtungszeitraum bestimmt werden kann, der erforderlich ist, um die mononuclearen Phagocyten zu stimulieren. Mononucleare Phagocyten werden verschiedene Zeiträume zusammen mit stimulatorischem Gewebe oder stimulatorischen Zellen in einem Medium, das durch stimulatorisches Gewebe oder stimulatorische Zellen konditioniert wurde, oder in einem Medium gezüchtet, zu dem mindestens ein stimulatorisches, biologisch aktives Agens zugefügt wurde. Danach wird die phagocytische Aktivität der mononuclearen Phagocyten gemessen. Ein Züchtungszeitraum, der ausreichend ist, um die phagocytische Aktivität der mononuclearen Phagocyten um mindestens 10%, vorzugsweise um mindestens 25% und stärker bevorzugt um mindestens 50% zu erhöhen, ist ausreichend, um ihre Fähigkeit zur Steigerung der Regeneration von Axons zu stimulieren.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich der Erläuterung dienen.
6. Beispiel: Verwendung von Monocyten zur Förderung der Regeneration von Axons
6.1 Material und Methoden
6.1.1 Isolation und Züchtung von Monocyten
Peripheres Blut von erwachsenen Sprague-Dawley- (SPD-) Ratten wurde vereinigt. Die Monocyten wurden durch Fraktionierung auf einem einstufigen Percoll-Gradienten wie früher beschrieben isoliert. F. Colotta et al., 1984, J. Immunol. 132: 936–944. Die mit Monocyten angereicherte Fraktion wurde aus der Percoll-Grenzschicht gewonnen, einmal mit PBS gewaschen, um Spuren von Percoll zu entfernen, und bei 1 × 10⁶ Zellen/ml in DCCM-1-Medium resuspendiert (Beit Ha'emek Ltd., Kibbutz Beit Ha'emek, Israel). Die Zellen wurden in Teflon-Beuteln bei 37°C wie früher beschrieben gezüchtet. Andreesen et al., 1983, J. Immunolog. Meth. 56: 295–304. Üblicherweise enthielt jeder Beutel 10 ml, umfassend 1 × 10⁷ Zellen.
6.1.2 Stimulation von Monocyten
Nicht-stimulierte Monocyten (NS) wurden hergestellt, indem isolierte Monocyten in einem Teflon-Beutel wie vorstehend beschrieben zwei bis 24 Stunden gezüchtet wurden. Ischiasnerv-stimulierte Monocyten (SS) wurden hergestellt, indem Monocyten in einem Teflon-Beutel zwei bis 24 Stunden zusammen mit mindestens einem Segment eines Ischiasnervs der Ratte gezüchtet wurden. Sehnerv-stimulierte Monocyten (OS) wurden hergestellt, indem Monocyten in einem Teflon-Beutel zwei bis 24 Stunden zusammen mit mindestens einem Segment eines Sehnervs der Ratte gezüchtet wurden. Jedes Nervensegment war in den Experimenten 6.2.1 und 6.2.2 1,0 bis 1,5 cm lang, und es war in den Experimenten 6.2.3 bis 6.2.7 0,5 bis 1,0 cm lang; ein konstantes Verhältnis von einem Nervensegment zu 5 × 10⁶ gezüchteten Monocyten wurde verwendet, sofern nichts anderes angegeben ist.
Nach zwei bis 24 Stunden in Kultur wurden die Monocyten drei Minuten bei 1000 × g abzentrifugiert, einmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in DCCM-1-Medium bei 1,25 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die Monocyten waren zu 95% rein, dies wurde anhand von Morphologie und durch Immuncytochemie mit dem monoclonalen Antikörper ED1 (Serotec, Oxford, England) wie beschrieben bestimmt. Hirschberg et al., 1994, J. Neuroimmunol. 50: 9-16.
6.1.3 Durchtrennung des Sehnervs
Bei anästhesierten erwachsenen SPD-Ratten wurde im Alter von 8 bis 9 Wochen eine Durchtrennung des Sehnervs wie beschrieben durchgeführt. Eitan et al., 1994, Science 264: 1764–1768. Der linke Sehnerv wurde durch eine kleine Öffnung in der Hirnhaut freigelegt. Ein gebogener Dissektor aus Glas mit einer Spitze von 200 μm und einer glatten abgestumpften Schneidkante wurde durch den Nerv geführt, so dass eine vollständige Durchtrennung 2 bis 3 mm distal des Augapfels erfolgte, wobei darauf geachtet wurde, dass die peripheren Blutgefäße nicht beschädigt wurden. Der hier verwendete Begriff „distal" bedeutet weg vom Augapfel und in Richtung Gehirn. Kurz nach der Durchtrennung wurden 2 μl Medium, das gezüchtete Monocyten enthielt, oder 2 μl Medium alleine an der Stelle der Verletzung mit Hilfe einer gebogenen Mikropipette aus Glas mit einem Lumen von 25 μm eingeführt. Die Öffnung in der Hirnhaut wurde etwa 200 μm von der Stelle der Transfektion durchgeführt, um ein Auslecken der Zellen von der Stelle der Verabreichung aus zu vermeiden.
6.1.4 Test auf Regeneration von Axons
6.1.4.1 Retrograde Markierung von Axons
Sieben bis acht Wochen nach der Durchtrennung wurde der lipophile Neurotracer-Farbstoff 4-(4-(Didecylamino)styryl)-N-methylpyridiniumiodid (4Di-10ASP) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) am verletzten Sehnerv 2 mm distal zur Stelle der Verletzung verabreicht. Eine Woche nach der Anwendung des Farbstoffs wurde die Retina entfernt, als flaches Gesamtpräparat in 4 Formaldehydlösung eingebettet und durch ein Fluoreszenzmikroskop untersucht, um die Zahl der markierten Netzhautganglienzellen (RGCs) in der gesamten Retina nachzuweisen und zu zählen. Nur diejenigen Axons, die an der Stelle der Verletzung vorbei zu der Stelle, an der der Farbstoff aufgetragen worden war, gewachsen waren, konnten den Farbstoff aufnehmen und ihn retrograd zu den Netzhautganglienzellen transportieren.
Wenn man dieses Verfahren bei Sehnerven von Ratten anwendet, die vorher nicht durchtrennt wurden, werden hierdurch durchschnittlich 21 623 RGCs pro Retina angefärbt. Die Ergebnisse für Sehnerven, die durchtrennt wurden, sind als Prozentsatz dieses Standards angegeben, so dass die Effizienz des 4Di-10ASP-Markierungsverfahrens kontrolliert werden kann.
6.1.4.2 Anterograde Markierung von Axons
Sieben bis acht Wochen nach der Durchtrennung wurde in dem vorher durchtrennten Sehnerv ein frischer Einschnitt 1 mm proximal zur Stelle der Durchtrennung durchgeführt. Der hier verwendete Begriff „proximal" bedeutet zum Augapfel hin und weg vom Gehirn. Meerrettich-Peroxidase (HRP) (Typ VI-A, Sigma, Tel Aviv, Israel) wurde mittels eines sterilen Tupfers, der in einer 50% (Gew./Vol.) Lösung von HRP in PBS getränkt war, durch den Einschnitt eingeführt. Acht bis zwölf Stunden nach Anwendung von HRP wurden die Ratten durch die Karotis mit PBS perfundiert, worauf 4% Paraformaldehyd in PBS als Fixierung folgte. Die Sehnerven wurden exzidiert, 50 μm längsgerichtete Cryoschnitte wurden entnommen und zum Sichtbarmachen der HRP-Aktivität unter Verwendung von Diaminobenzidin und Kobalt-Verstärkung wie beschrieben bearbeitet. Lavie et al., 1992, Brain Res. 575: 1–5.
6.1.5 Test der phagocytischen Aktivität
Ratten-Monocyten wurden in DCCM-1-Medium (2,5 × 10⁵ Zellen in 1 ml) suspendiert und ohne weitere Zusätze oder zusammen mit der angegebenen Zahl von Segmenten des Ischias- oder Sehnervs der Ratte gezüchtet. Um die phagocytische Aktivität zu testen, wurde eine Arbeitslösung von fluoreszierenden nicht-carboxylierten Mikrokügelchen (FLUORESBRITE^TM, Polysciences, Warrington, Pennsylvania, USA, Katalog Nr. 17152) hergestellt, indem 1 Tropfen einer Vorratslösung in 10 ml DCCM-1-Medium verdünnt wurde, und diese Arbeitslösung wurde dann zu der Monocytensuspension mit einer weiteren Verdünnung von 1:100 zugegeben. Nach drei Stunden bei 37°C wurden die Zellen einmal mit DCCM-1-Medium oder mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und sodann die Zell-assoziierte Fluoreszenz mittels Durchflusscytometrie (FACS) gemessen.
6.2. Ergebnisse
6.2.1 Förderung der Regeneration von Axons durch stimulierte und nicht-stimulierte Monocyten
Bei Ratten wurde eine Durchtrennung des Sehnervs durchgeführt, zum Zeitpunkt der Verletzung wurden sie mit Kontrollmedium oder mit 2,5 × 10³ bis 1 × 10⁵ nicht-stimulierten (NS) Monocyten, 2,5 × 10³ bis 1 × 10⁵ Ischiasnerv-stimulierten (SS) Monocyten oder mit 2,5 × 10³ bis 1 × 10⁵ Sehnerv-stimulierten (OS) Monocyten behandelt.
Die Zahl der markierten Netzhautganglienzellen (RGCs) in den Ratten aus jeder Behandlungsgruppe ist in 1 als Prozentsatz der in normalen Sehnerven markierten RGCs dargestellt. Die Ratten, die keine Zellen erhielten, zeigten fast keine Markierung von RGCs. Die Ratten, die NS-Monocyten erhielten, zeigten eine Markierung von mäßigen Zahlen von RGCs, während bei der Behandlung mit OS- Monocyten eine größere Zahl von RGCs markiert wurde. Bei den Ratten, die SS-Monocyten erhalten hatten, war die mittlere Zahl der markierten RGCs mehr als fünfmal höher als bei den Ratten, die mit OS-Monocyten behandelt worden waren, und etwa 15-mal höher als bei den Ratten, die mit NS-Monocyten behandelt worden waren.
6.2.2 Regeneration von Axons nach Behandlung mit verschiedenen Dosen von Ischiasnerv- oder Sehnerv-stimulierten Monocyten
Die Regeneration sollte als Funktion der Dosis der verabreichten Monocyten untersucht werden, hierzu wurde bei den Ratten eine Durchtrennung des Sehnervs durchgeführt, und sie wurden zum Zeitpunkt der Verletzung mit OS-Monocyten oder mit SS-Monocyten in einer Gesamtdosis von 2,5 × 10³; 5 × 10³; 1 × 10⁴ oder 1 × 10⁵ Zellen behandelt.
Die durchschnittliche Zahl der markierten Netzhaut-RGCs in jeder Behandlungsgruppe ist in 2 als Prozentsatz der in normalen Sehnerven markierten RGCs dargestellt. Nach der Behandlung mit 5 × 10³ SS-Monocyten war die RGC-Markierung am höchsten. Höhere oder niedrigere Dosen von SS-Monocyten förderten zwar die Regeneration von Axons, sie waren jedoch weniger wirksam. Die Behandlung mit OS-Monocyten förderte genauso die Regeneration von Axons, jedoch weniger effektiv. Der Peak-Effekt trat sowohl bei OS- als auch bei SS-Monocyten bei einer Dosis von 5 × 10³ Monocyten auf; bei höheren oder niedrigeren Dosen war die positive Wirkung auf die Regeneration von Axons weniger stark ausgeprägt.
In 3 sind repräsentative Fluoreszenz-Mikrofotografien von markierten RGCs in Retinas nach der Behandlung mit SS-Monocyten oder mit Kontrollmedium dargestellt. Das Fehlen von markierten RGCs nach der Behandlung mit Kontrollmedium zeigt, dass die Durchtrennung vollständig war und dass die markierten RGCs regenerierende Axons darstellen, welche die Stelle der Durchtrennung überbrückt haben, und dass sie nicht bloß Fasern darstellen, die der experimentellen Verletzung entgangen waren.
Die Mikrofotografien in 4 bestätigen weiterhin, dass ein erneutes Wachstum stattgefunden hat. In den mit Kontrollmedium behandelten Nerven (E) waren keine markierten Fasern distal zur Stelle der Anwendung von HRP zu sehen. In den Nerven, die mit SS-Monocyten behandelt worden waren (A bis D), waren markierte Fasern zu sehen, die vom proximalen Teil des Nervs aus hervortraten, die Stelle der Durchtrennung (ST) überquerten und sich nach distal verlängerten. An den Spitzen dieser markierten Fasern wurden Strukturen festgestellt, die einem Wachstumskonus (gc) gleichen.
6.2.3 Regeneration von Axons nach Behandlung mit Monocyten, die mit Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte verschiedene Zeiträume stimuliert worden waren
Die Fähigkeit von Monocyten, die Regeneration von Axons nach einer verschiedene Zeiträume dauernden Stimulation mit Ischiasnerv-Segmenten zu fördern, sollte untersucht werden, hierzu wurde bei Ratten eine Verletzung des Sehnervs durchgeführt und die Ratten zum Zeitpunkt der Verletzung mit 5 × 10³ Monocyten behandelt, die zwei Stunden (2 Std.), zwölf Stunden (12 Std.) oder 17 Stunden (17 Std.) zusammen mit Segmenten des Ischiasnervs der Ratte gezüchtet worden waren. In 5 ist die Zahl der markierten RGCs in den einzelnen Ratten aus jeder Behandlungsgruppe als Prozentsatz der in normalen Sehnerven markierten RGCs dargestellt. Die Monocyten zeigten eine gesteigerte Fähigkeit, die Regeneration von Axons zu fördern; nachdem sie mit Ischiasnerv-Segmenten gezüchtet worden waren, und zwar bei allen getesteten Zeiträumen.
6.2.4 Regeneration von Axons nach Behandlung mit Monocyten, die mit Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte oder der Maus stimuliert worden waren
Die Fähigkeiten von Ischiasnerv-Segmenten, die von der Ratte und der Maus stammten, zur Stimulation der Fähigkeit von Monocyten, die Regeneration von Axons zu fördern, sollten verglichen werden, hierzu wurde bei Ratten eine Durchtrennung des Sehnervs durchgeführt und die Ratten zum Zeitpunkt der Verletzung mit 5 × 10³ Ratten-Monocyten behandelt, die 24 Stunden entweder zusammen mit einem bis acht Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte (RATTE) oder mit zwei bis 16 Segmenten eines Ischiasnervs der Maus (MAUS) behandelt worden waren. Die Zahl der markierten RGCs in den einzelnen Ratten aus jeder Behandlungsgruppe ist in 6 als Prozentsatz der in normalen Sehnerven markierten RGCs dargestellt. Sowohl der Ischiasnerv der Ratte als auch der Ischiasnerv der Maus stimulierte die Fähigkeit von Monocyten, die Regeneration von Axons zu fördern.
6.2.5 Phagocytische Aktivität von Monocyten nach Züchten mit Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte
Ratten-Monocyten wurden bei 2,5 × 10⁵ Zellen in 1 ml DCCM-1-Medium suspendiert und 2 bis 24 Stunden ohne weitere Zusätze (Kontrolle), zusammen mit einem Segment eines Ischiasnervs der Ratte (1SS), mit zwei Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte (2SS) oder mit vier Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte (4SS) gezüchtet.
Die phagocytische Aktivität der 2SS- und 4SS-Präparate nach zwei Stunden in Kultur ist in 7 im Vergleich zur phagocytischen Aktivität der Kontroll- Monocyten dargestellt. Nach zwei Stunden Züchten zusammen mit zwei Ischiasnerv-Segmenten zeigten die Monocyten eine erhöhte phagocytische Aktivität; nach zwei Stunden Züchten zusammen mit vier Ischiasnerv-Segmenten zeigten die Monocyten einen größeren Anstieg der phagocytischen Aktivität.
Die phagocytische Aktivität der 1SS- und 4SS-Präparate nach 24 Stunden in Kultur ist in 8 im Vergleich zur phagocytischen Aktivität der Kontroll-Monocyten dargestellt. Nach 24 Stunden Züchten zusammen mit einem Ischiasnerv-Segment zeigten die Monocyten eine erhöhte phagocytische Aktivität; nach 24 Stunden Züchten zusammen mit vier Ischiasnerv-Segmenten war der Anstieg der phagocytischen Aktivität noch größer. Das 4SS-Präparat zeigte einen größeren Anstieg der phagocytischen Aktivität nach 24 Stunden als nach zwei Stunden.
6.2.6 Phagocytische Aktivität von Monocyten nach Züchten mit Segmenten eines Sehnervs der Ratte
Ratten-Monocyten wurden bei 2,5 × 10⁵ Zellen in 1 ml DCCM-1-Medium suspendiert und 2 bis 24 Stunden ohne weitere Zusätze (Kontrolle) oder zusammen mit vier Segmenten eines Sehnervs der Ratte (4OS) gezüchtet. Die phagocytische Aktivität der 4OS-Präparate nach zwei Stunden in Kultur ist in 9 im Vergleich zur phagocytischen Aktivität der Kontroll-Monocyten dargestellt. Nach zwei Stunden Züchten zusammen mit vier Sehnerv-Segmenten zeigten die Monocyten eine Abnahme der phagocytischen Aktivität.
Die phagocytische Aktivität der 4OS-Präparate nach 24 Stunden in Kultur ist in 10 im Vergleich zur phagocytischen Aktivität der Kontroll-Monocyten dargestellt. Nach 24 Stunden Züchten zusammen mit vier Sehnerv-Segmenten zeigten die Monocyten eine Abnahme der phagocytischen Aktivität, die ähnlich war wie die nach zwei Stunden.
6.2.7 Phagocytische Aktivität von Monocyten nach Züchten mit Ischiasnerv-Segmenten in Gegenwart von Sehnerv-konditioniertem Medium
Sehnerv-konditioniertes Medium wurde hergestellt, indem zehn Segmente eines Sehnervs der Ratte zwei Stunden in 1 ml DCCM-1-Medium gezüchtet wurden. Während frisches DCCM-1-Medium frei von Protein ist, enthielt das Sehnerv-konditionierte Medium Protein. Ratten-Monocyten wurden bei 2,5 × 10⁵ Zellen in 1 ml DCCM-1-Medium suspendiert und 24 Stunden zusammen mit einem bis sechs Segmenten eines Ischiasnervs der Ratte ohne weitere Zusätze (0) oder mit einem Sehnerv-konditionierten Medium in einer Gesamt-Proteinkonzentration von 10 μg/ml (10), 1 μg/ml (1) oder 0,1 μg/ml (0,1) gezüchtet.
11 zeigt die phagocytische Aktivität von Monocyten, die zusammen mit Ischiasnerv in Gegenwart von Sehnerv-konditioniertem Medium gezüchtet wurden, im Vergleich zur phagocytischen Aktivität von Monocyten, die mit Ischiasnerv in Abwesenheit von Sehnerv-konditioniertem Medium gezüchtet wurden. Die Zugabe von Sehnerv-konditioniertem Medium schwächte die durch Züchten mit Ischiasnerv verursachte Steigerung der phagocytischen Aktivität ab. Diese Abschwächung trat in dem Präparat am deutlichsten auf, zu dem 0,1 μg/ml Sehnerv-konditioniertes Medium zugegeben worden war.
6.3 Diskussion
Diese Beispiele machen deutlich, dass Monocyten, die an der Stelle einer ZNS-Verletzung verabreicht wurden, die Regeneration von Axons förderten. Alle getesteten Monocyten bewirkten eine Förderung der Regeneration von Axons. Jedoch wurden Monocyten durch Züchten zusammen mit einem Nervensegment, insbesondere mit einem Segment eines peripheren Nervs, z.B. eines Ischiasnervs der Ratte oder der Maus, stimuliert (d.h. sie zeigten eine gesteigerte Fähigkeit, die Regeneration von Axons zu fördern). Diese Stimulation trat nach allen Züchtungszeiträumen auf, d.h. von zwei bis 24 Stunden. Bei der Behandlung einer vollständigen Durchtrennung eines Sehnervs der Ratte, der etwa 10⁵ Nervenfasern enthält, wurden optimale Ergebnisse erhalten, indem etwa 5 × 10³ Monocyten verabreicht wurden. Jedoch zeigte jede getestete Dosis eine positive Wirkung auf die Regeneration von Axons.
Diese Beispiele machen außerdem deutlich, dass Monocyten nach Züchten mit einem oder mehreren Segmenten eines Ischiasnervs eine erhöhte phagocytische Aktivität zeigen. Somit stellt die Messung der phagocytischen Aktivität ein schnelles und wirksames Verfahren bereit, mit dem Gewebe und Zellen auf ihre Fähigkeit durchgemustert werden können, Monocyten zu stimulieren, die Regeneration von Axons zu fördern.

Claims

In-vitro-Verfahren zum Steigern der Fähigkeit mononuclearer Phagocyten von Säugern, die Regeneration von Axons im ZNS zu fördern, umfassend das Züchten der mononuclearen Phagocyten von Säugern zusammen mit zumindest einem stimulatorischen Gewebe, stimulatorischen Zellen, einem Medium, das mit zumindest einem stimulatorischen Gewebe oder Zellen konditioniert wurde, oder mit Medium, dem zumindest ein stimulatorisches biologisch aktives Agens zugesetzt wurde, wobei das stimulatorische Gewebe, die Zellen oder das biologisch aktive Agens in der Lage ist, die Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten zur Förderung der Regeneration von Axons zu steigern.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mononuclearen Phagocyten von Säugern gemeinsam mit zumindest einem stimulatorischen Gewebe gezüchtet werden, wobei das stimulatorische Gewebe ausgewählt ist aus Haut, Dermis und einem Nervensegment, oder mit stimulatorischen Zellen, die von Haut, Dermis oder einem Nervensegment abgeleitet sind, oder mit Medium, das mit Haut, Dermis und/oder einem Nervensegment konditioniert ist.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mononuclearen Phagocyten aus Säugern gemeinsam mit einem Segment eines menschlichen peripheren Nervs gezüchtet wurden.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 3, wobei der menschliche periphere Nerv der Ischiasnerv oder Sehnerv ist.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mononuclearen Phagocyten aus Säugern gemeinsam mit einem Medium gezüchtet werden, das mit Haut, Dermis und/oder einem Nervensegment konditioniert wurde.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 5, wobei die mononuclearen Phagocyten aus Säugern gemeinsam mit einem Medium gezüchtet werden, das mit einem Segment des Ischiasnervs oder des Sehnervs konditioniert wurde.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mononuclearen Phagocyten aus Säugern gemeinsam mit einem Medium gezüchtet werden, dem zumindest ein stimulatorisches biologisch aktives Agens hinzugefügt wurde, wobei das Agens ausgewählt ist aus neurotrophischem Faktor 3 (NT-3), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Hirn-abgeleiteter neurotrophischem Faktor (BDNF) und transformierendem Wachstumsfaktor β (TGF-β).
In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die mononuclearen Phagocyten aus Säugern autologe menschliche Monocyten, Makrophagen oder dendritische Zellen sind.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 8, wobei die autologen menschlichen Monocyten von zentralem oder peripherem Blut stammen.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 8, wobei die autologen Makrophagen aus einer Serosahöhle stammen, oder alveoläre Makrophagen, Makrophagen aus der Leber oder Makrophagen sind, die durch Züchten von Makrophagen-Vorstufen aus dem Knochenmark oder Blut erhalten wurden, und die dendritischen Zellen aus Milz, Lymphknoten, Haut oder lymphatischer Flüssigkeit stammen oder dendritische Zellen sind, die durch Züchten von Vorläufern dendritischer Zellen aus dem Knochenmark oder Blut erhalten wurden.
In-vitro-Verfahren zum Steigern der Fähigkeit mononuclearer Phagocyten aus Säugern, die Regeneration von Axons im ZNS bei einer Verletzung oder Krankheit des Gehirns, des Rückenmarks oder des Sehnervs, die begleitet ist von einer Schädigung von Axons, zu fördern, umfassend das Züchten der mononuclearen Phagocyten aus Säugern gemeinsam mit zumindest einem stimulatorischen Gewebe, stimulatorischen Zellen, einem Medium, das mit zumindest einem stimulatorischen Gewebe oder Zellen konditioniert wurde, oder mit einem Medium, dem zumindest ein stimulatorisches biologisch aktives Agens hinzugesetzt wurde, wobei das stimulatorische Gewebe, die Zellen oder das biologisch aktive Agens in der Lage sind, die Fähigkeit der mononuclearen Phagocyten zur Förderung der Regeneration von Axons zu steigern.