ES2241002T3 - Metodos de uso de fagocitos mononucleares para promover la regeneracion axonal. - Google Patents
Metodos de uso de fagocitos mononucleares para promover la regeneracion axonal.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA EL USO DE FAGOCITOS MONONUCLEARES ALOGENEICOS A FIN DE PROMOVER LA REGENERACION AXONAL EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE UN MAMIFERO. EN UNA REALIZACION, SE CULTIVAN FAGOCITOS MONONUCLEARES ALOGENEICOS JUNTO CON TEJIDO ESTIMULADOR, COMO EL DE LA DERMIS O AL MENOS UN SEGMENTO NERVIOSO, ADMINISTRANDOSE POSTERIORMENTE AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE UN MAMIFERO EN EL LUGAR DE LA LESION O ENFERMEDAD, O CERCA DEL MISMO. EN UNA REALIZACION ALTERNATIVA, SE ADMINISTRAN MONOCITOS AUTOLOGOS, PREFERENTEMENTE MONOCITOS AUTOLOGOS ESTIMULADOS, AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE UN MAMIFERO EN EL LUGAR DE LA LESION O ENFERMEDAD, O CERCA DEL MISMO. SE REVELAN IGUALMENTE LOS PROCEDIMIENTOS PARA IDENTIFICAR LOS TEJIDOS Y CELULAS ESTIMULATORIOS, Y PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA FAGOCITOS MONONUCLEARES ALOGENEICOS CRIOPRESERVADOS.
Description
Métodos de uso de fagocitos mononucleares para
promover la regeneración axonal.
La presente invención se refiere a métodos
destinados a incrementar la capacidad terapéutica de fagocitos
mononucleares para promover la regeneración axonal en el sistema
nervioso central.
Después de una lesión axonal, las neuronas del
sistema nervioso central (SNC) de mamíferos tienen escasa capacidad
de regeneración axonal. Por contraste, las neuronas del sistema
nervioso periférico (SNP) de mamíferos tienen una capacidad
sustancialmente mayor de regeneración axonal. Véase Schwartz et
al., 1989, FASEB J. 3: 2371-2378.
La diferencia entre la regeneración axonal en el
SNC y el SNP se ha atribuido al medio celular de las neuronas, más
que a las propias neuronas. Después de una lesión neuronal, las
células de Schwann que rodean a las neuronas del SNP son moduladas
de forma que se hacen permisivas o susceptibles de soportar la
regeneración axonal. Por contraste, los astrocitos, oligodendrocitos
y microglía que rodean a las neuronas del SNC no muestran tal
modulación y permanecen como no susceptibles de soportar la
regeneración axonal o inhibidoras de la misma. Véase Schwartz et
al., 1987, CRC Crit. Rev. Biochem.
22:89-110.
Esta falta de modulación se ha correlacionado con
diferencias en la respuesta inflamatoria posterior a la lesión.
Véanse Perry y Brown, 1992, Bioassays
14:401-406; Lotan y Schwartz, 1994, FASEB J.
8:1026-1033. En particular, la acumulación
de fagocitos mononucleares en respuesta a la lesión del SNC se
retrasa y es limitada, en comparación con la respuesta a la lesión
en el SNP. Esta respuesta de fagocitos mononucleares del SNC
limitada puede conducir, a su vez, a (1) eliminación no eficiente
de los desechos de mielina que, según se ha descrito, inhibe la
regeneración axonal, y (2) liberación inferior a la óptima de
citoquinas derivadas de macrófagos que promoverían la modulación de
astrocitos y oligodendrocitos, a fin de soportar la regeneración
axonal.
Las observaciones anteriores han sugerido la
especulación de que la modulación apropiada de la respuesta de
macrófagos podría promover la regeneración axonal después de una
lesión del SNC. En un sistema in vitro, David et al.
mostraron que cuando secciones de criostato de nervio óptico de rata
normal se cultivan conjuntamente con fagocitos mononucleares
derivados de lesiones del SNC de rata, las secciones de nervio
óptico muestran adhesividad incrementada para células ganglionares
embrionarias de la raíz dorsal de pollo. David et al., 1990,
Neuron 5:463-469. Asimismo, medio
condicionado procedente de macrófagos peritoneales activados fue
efectivo para promover la adhesividad de secciones de nervio óptico
en este ensayo in vitro.
Sin embargo, resultados derivados de modelos
in vivo de lesión del SNC han revelado que algunas
intervenciones que incrementan la respuesta de macrófagos a la
lesión del CNS no producen una regeneración incrementada. Por
ejemplo, la inyección local, bien de factor de necrosis tumoral
alfa (TNF-\alpha) o de factor estimulante de
formación de colonias 1 (CSF-1), incrementaron la
respuesta de macrófagos a la lesión experimental del nervio óptico.
Sin embargo, sólo TNF-\alpha, pero no
CSF-1, incrementaba la permisividad de los nervios
ópticos lesionados a la adhesión neuronal, según se analizó in
vitro. Lotan et al., 1984, Exp. Neurol.
126:284-290. Se ha sugerido como explicación
posible que "sólo macrófagos estimulados apropiadamente pueden
influenciar la regeneración neuronal". Schwartz et al.,
1994, Progress Brain Res. 103:331-341, en
338.
De hecho, contrariamente a las enseñanzas de la
presente invención, otros investigadores han descrito que los
fagocitos mononucleares podrían exacerbar la lesión o limitar la
recuperación después de una lesión del SNC. Los macrófagos
cerebrales, cuando se estimulan mediante citoquinas, exhiben
actividad neurotóxica. Chamak et al., 1994, J. Neurosci.
Res. 38:221-233. La inhibición farmacológica
de la función fagocítica mononuclear se ha descrito que promueve la
recuperación en un modelo de conejo de lesión de la médula espinal.
Giulian y Robertson, 1990, Annals. Neurol.
27:33-42. Se ha sugerido que las citoquinas
derivadas de macrófagos pueden promover la formación de cicatrices
gliales y, por tanto, inhibir la regeneración axonal. Khan y Wigley,
1994, NeuroReport 5:1381-1385; Vick et
al; 1992, J. Neurotrauma 9:
S93-S103.
Según los conocimientos de los presentes
inventores, previamente a la presente invención no ha existido
ninguna sugerencia de administrar fagocitos mononucleares en el SNC
para promover la regeneración axonal.
La cita o identificación de cualquier referencia
en la Sección 2 (o cualquier otra sección) de esta solicitud, no se
debe concebir como una admisión de que tal referencia esté
disponible como estado de la técnica previo a la presente
invención.
La presente invención se refiere a métodos para
incrementar la capacidad de los fagocitos mononucleares alogénicos
para promover la regeneración axonal en el sistema nervioso central
de un mamífero. Los fagocitos mononucleares alogénicos se pueden
administrar en el SNC en un sitio de lesión o enfermedad o cerca del
mismo.
Los fagocitos mononucleares alogénicos útiles en
el método de la invención incluyen monocitos, macrófagos y células
dendríticas alogénicas y monocitos, macrófagos y células dendríticas
autólogos.
La presente invención proporciona además métodos
para estimular los fagocitos mononucleares alogénicos, a fin de
incrementar su capacidad para promover la regeneración axonal en el
sistema nervioso central de un mamífero. Los fagocitos mononucleares
se estimulan cultivándolos conjuntamente con tejido o células
adecuadas, o cultivando los fagocitos mononucleares en un medio que
se haya condicionado mediante tejido o células adecuados. Los
tejidos adecuados para este propósito incluyen segmentos de nervio,
especialmente segmentos de nervio periférico, dermis, tejido
sinovial, vaina de tendón, hígado y otros tejidos regeneradores.
Alternativamente, los fagocitos mononucleares se estimulan
cultivándolos en un medio al cual se ha añadido al menos una
sustancia biológicamente activa adecuada. Las sustancias
biológicamente activas adecuadas para este propósito incluyen
neuropéptidos; citoquinas, por ejemplo factor de crecimiento
transformante \beta (TGF-\beta); y factores
neurotróficos, por ejemplo factor neurotrófico 3
(NT-3), factor de crecimiento nervioso (NGF) y
factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Se puede usar una
proteína o péptido biológicamente activo, en su forma nativa o
recombinante.
Además, la presente invención describe un ensayo
para identificar tejidos, células y sustancias biológicamente
activas adicionales, que son adecuados para estimular los fagocitos
mononucleares, a fin de incrementar su capacidad para promover la
regeneración axonal. Según este ensayo, los fagocitos mononucleares
se cultivan primero conjuntamente con el tejido o células a
analizar, o en un medio que se ha condicionado por el tejido o
células a analizar, o en un medio al que se ha añadido la sustancia
biológicamente activa a analizar. A continuación, se mide la
actividad fagocítica de los fagocitos mononucleares cultivados. Los
fagocitos mononucleares con actividad fagocítica incrementada
tienen una capacidad incrementada para promover la regeneración
axonal.
La presente invención se puede entender más
completamente mediante referencia a la siguiente descripción
detallada de la invención, ejemplos de realizaciones específicas de
la invención y las figuras anexas, en las que:
La Figura 1 ilustra la regeneración axonal en
nervios ópticos de ratas cortados transversalmente, según se detectó
mediante transporte retrógrado de colorante fluorescente a las
células ganglionares retinianas (RGCs). Véase texto, Sección 6, para
detalles experimentales. Inmediatamente tras el corte transversal se
aplicaron 2 \mul de medio DCCM-1 al sitio de la
lesión que no contenía células (MED): 2,5 x 10^{3} - 1 x 10^{6}
monocitos sin estimular (NS); 2,5 x 10^{3} - 1 x 10^{5}
monocitos estimulados de nervio óptico (OS); o 2,5 x 10^{3} - 1 x
10^{5} monocitos estimulados de nervio ciático (SS). Los círculos
huecos representan animales experimentales individuales. Los
círculos rellenos representan animales que mostraban RGCs no
marcadas (computando 7, 7 y 6 en los grupos de tratamiento MED, NS
y OS, respectivamente). Las líneas horizontales representan el
valor promedio de cada grupo de tratamiento.
La Figura 2 ilustra la regeneración axonal en
nervios ópticos de ratas cortados transversalmente, en función del
número y tipo de monocitos aplicados al sitio de la lesión,
inmediatamente después del corte transversal. Véase texto, Sección
6, para detalles experimentales. En el momento de la sección
transversal, se aplicaron 2 \mul de medio DCCM-1
al sitio de la lesión que contenía los monocitos estimulados de
nervio óptico (OS) o los monocitos estimulados de nervio ciático
(SS) en una dosis total de 2,5 x 10^{3} células; 5 x 10^{3}
células; 10^{4} células; o 10^{5} células.
La Figura 3 (A-B) presenta
fotomicrográficos representativos, que muestran el marcaje
retrógrado de células ganglionares retinianas en ratas sometidas a
corte transversal del nervio óptico, seguido por administración de
(A) 5 x 10^{3} monocitos estimulados de nervio ciático o (B) medio
testigo. Véase texto, Sección 6, para detalles experimenta-
les.
les.
La Figura 4 (A-E) presenta
fotomicrográficos representativos, que muestran el marcaje
anterógrado de fibras de nervio óptico en ratas sometidas a corte
transversal del nervio óptico, seguido de administración de
monocitos estimulados de nervio ciático (A-D) o
medio testigo (E). Véase texto, Sección 6, para detalles
experimentales. La Figura 4A es una vista poco ampliada, que muestra
el punto en el que se aplicó HRP (H), el sitio del corte transversal
(ST) y la duramadre circundante (DU). La región entre paréntesis,
distal respecto al sitio de corte transversal, se muestra con una
ampliación mayor en las Figuras 4B, 4C y 4D, en las que se muestran
estructuras de crecimiento de tipo cono (gc) en los extremos de las
fibras.
La Figura 5 ilustra la regeneración axonal en
nervios ópticos de ratas cortados transversalmente, tras la
aplicación de monocitos cultivados con nervio ciático durante
2-17 horas, en el sitio de la lesión. Véase texto,
Sección 6, para detalles experimentales. En el momento del corte
transversal, se aplicaron 2 \mul de medio DCCM-1
al sitio de la lesión que contenía 5 x 10^{3} monocitos sin
estimular (NS) o 5 x 10^{3} monocitos cultivados con nervio
ciático de rata durante 2 horas (2 h), 12 horas (12 h) o 17 horas
(17 h).
La Figura 6 ilustra la regeneración axonal en
nervios ópticos cortados transversalmente tras la administración de
monocitos de rata estimulados connervio ciático de ratón o nervio
ciático de rata, en el sitio de la lesión. Véase texto, Sección 6,
para detalles experimentales. En el momento del corte transversal,
se aplicaron 2 \mul de medio DCCM-1 al sitio de la
lesión, que contenían 5 x 10^{3} monocitos cultivados durante 24
horas, bien con nervio ciático de ratón (RATÓN) o con nervio
ciático de rata (RATA).
La Figura 7 ilustra la actividad fagocítica de
monocitos de rata cultivados durante 2 horas con nervio ciático de
rata. Véase texto, Sección 6, para detalles experimentales. Se
cultivaron 2,5 x 10^{5} monocitos de rata en 1 ml de medio
DCCM-1 solo (TESTIGO) o en 1 ml de medio
DCCM-1 con 2 segmentos de nervio ciático de rata
(2SS) o con 4 segmentos de nervio ciático de rata (4SS). Después de
2 horas, los monocitos se expusieron a glóbulos fluorescentes y se
midió la fluorescencia asociada a células mediante citometría de
flujo.
La Figura 8 ilustra la actividad fagocítica de
monocitos de rata cultivados durante 24 horas con nervio ciático de
rata. Véase texto, Sección 6, para detalles experimentales. Se
cultivaron 2,5 x 10^{5} monocitos de rata en 1 ml de medio
DCCM-1 solo (TESTIGO) o en 1 ml de medio
DCCM-1 con un segmento de nervio ciático de rata (1
SS) o con 4 segmentos de nervio ciático de rata (4 SS). Tras
16-24 horas, los monocitos se expusieron a glóbulos
fluorescentes y se midió la fluorescencia asociada a células
mediante citometría de flujo.
La Figura 9 ilustra la actividad fagocítica de
monocitos de rata cultivados durante 2 horas con nervio óptico de
rata. Véase texto, Sección 6, para detalles experimentales. Se
cultivaron 2,5 x 10^{5} monocitos de rata en 1 ml de medio
DCCM-1 solo (TESTIGO) o en 1 ml de medio
DCCM-1 con 4 segmentos de nervio óptico de rata
(4OS). Tras 2 horas, los monocitos se expusieron a glóbulos
fluorescentes y se midió la fluorescencia asociada a células
mediante citometría de flujo.
La Figura 10 ilustra la actividad fagocítica de
monocitos de rata cultivados durante 24 horas con nervio óptico de
rata. Véase texto, Sección 6, para detalles experimentales. Se
cultivaron 2,5 x 10^{5} monocitos de rata en 1 ml de medio
DCCM-1 solo (TESTIGO) o en 1 ml de medio
DCCM-1 con 4 segmentos de nervio óptico de rata
(4OS). Tras 24 horas, los monocitos se expusieron a glóbulos
fluorescentes y se midió la fluorescencia asociada a células
mediante citometría de flujo.
La Figura 11 ilustra la actividad fagocítica de
monocitos de rata cultivados durante la noche con nervio ciático de
rata, en presencia de medio condicionado por nervio óptico de rata.
Se cultivaron 5 x 10^{5} monocitos de rata en 1 ml de medio
DCCM-1 con 6 segmentos de nervio óptico de rata sin
más adiciones (0) o con la adición de medio condicionado por nervio
óptico, con una concentración total de proteína de 0,1 \mug/ml
(0,1), 1,0 \mug/ml (1), o 10 \mug/ml (10). Tras 24 horas, los
monocitos se expusieron a glóbulos fluorescentes y se midió la
fluorescencia asociada a células mediante citometría de flujo.
La presente invención proporciona métodos para
incrementar la capacidad de loa fagocitos mononucleares alogénicos
para promover la regeneración axonal después de una lesión o
enfermedad del sistema nervioso central (SNC). Los fagocitos
mononucleares alogénicos se pueden introducir en el sitio de la
lesión o enfermedad del SNC, o cerca del mismo.
Según se usa aquí, el término "fagocitos
mononucleares" pretende comprender los monocitos obtenidos de
sangre central o periférica, macrófagos obtenidos de cualquier
sitio, incluyendo cualquier tejido o cavidad, macrófagos derivados
mediante cultivo de precursores de macrófagos obtenidos de médula
ósea o sangre, células dendríticas obtenidas de cualquier sitio,
incluyendo el bazo, nódulos linfáticos, piel y fluido linfático, y
células dendríticas derivadas del cultivo de precursores
dendríticos obtenidos de médula ósea o sangre.
Se pueden obtener fagocitos mononucleares
alogénicos de la circulación o de cualquier tejido en el que
residan. La sangre periférica es una fuente rápida y fácilmente
accesible de monocitos alogénicos y se usa como fuente según una
realización preferida de la invención. Se prefiere especialmente el
uso de monocitos autólogos purificados de la sangre periférica de
un sujeto al cual está destinada la administración de la
preparación terapéutica.
Se conocen bien en la técnica fagocitos
mononucleares alogénicos de otras fuentes e incluyen macrófagos
obtenidos de cavidades serosas, como la cavidad peritoneal o
pleural, macrófagos alveolares y macrófagos asociados con otros
tejidos, donde se pueden conocer por varios términos, como células
de Kupffer (en el hígado, y células microgliales (en el SNC). Los
fagocitos mononucleares alogénicos incluyen además células
dendríticas, que se pueden conocer asimismo mediante varios
términos, como células de Langerhans (en la piel), células veladas
("veiled cells") (en fluido linfático) y células
interdigitantes (en nódulos linfáticos). Adicionalmente, se pueden
derivar fagocitos mononucleares mediante cultivo de células gliales
mixtas alogénicas, derivadas del cerebro o de células precursoras
alogénicas, que se pueden obtener de la médula ósea o la
sangre.
En una realización preferida, se reducen las
células distintas de los fagocitos mononucleares de la población
celular a administrar. Las técnicas de enriquecimiento son bien
conocidas para los expertos en la técnica e incluyen elutriación;
centrifugación a través de material de densidad adecuada, como
gradiente de Percoll (Colotta et al., 1983, J. Immunol.
132:936-944); adhesión sobre superficies
adecuadas seguida de separación a temperatura reducida o a
concentraciones reducidas de cationes divalentes (Rosen y Gordon,
198, J. Exp. Med. 166:1685-1701), separación
mecánica o en presencia de lidocaína; y técnicas para aislar
células dendríticas procedentes de la sangre (O' Doherty et
al., 1993, J. Exp. Med. 178:1067-1078),
médula ósea (Inaba et al., 1992, J. Exp. Med.:
176:1693-1702) y tejido linfoide (Macatonia
et al., J. Exp. Med. 169:1255-1264).
Se prefiere especialmente una preparación sustancialmente
purificada de fagocitos mononucleares.
Una vez que se obtienen los fagocitos
mononucleares, se pueden usar terapéuticamente en cualquier momento
deseado, según las necesidades del paciente. Los fagocitos
mononucleares se pueden cultivar previamente a su administración en
cualquier medio de cultivo adecuado, si se desea. Preferiblemente,
los fagocitos mononucleares se cultivan en un recipiente fabricado
en material estéril, con el que estas células muestran adherencia
limitada o nula. En una realización preferida, los fagocitos
mononucleares se cultivan en bolsas de teflón estéril previamente a
su administración.
Según se usa aquí, fagocitos mononucleares
"estimulados" son fagocitos mononucleares con una capacidad
incrementada para promover la regeneración axonal. Preferiblemente,
la capacidad de los fagocitos mononucleares para promover la
regeneración axonal se incrementa al menos tres veces respecto de
los fagocitos mononucleares no estimulados, más preferiblemente, la
capacidad de los fagocitos mononucleares para promover la
regeneración axonal, se incrementa al menos 15 veces con respecto a
los fagocitos mononucleares no estimulados. El tejido, células y
sustancias biológicamente activas "estimuladores", son tejido,
células y sustancias biológicamente activos que, cuando se cultivan
conjuntamente con fagocitos mononucleares, incrementan la capacidad
de los fagocitos mononucleares para promover la regeneración
axonal.
En una realización preferida se añaden al cultivo
tejido o células estimuladores o una sustancia estimuladora
biológicamente activa, a fin de incrementar la capacidad de los
fagocitos mononucleares para promover la regeneración axonal.
Preferiblemente, se añaden al cultivo uno o más segmentos de un
nervio, con la máxima preferencia un nervio periférico como el
nervio ciático. Un nervio xenogénico es adecuado para este
propósito o, más preferiblemente, un nervio alogénico o autólogo.
Si se desea, se puede obtener un nervio humano de cualquier tejido
humano disponible, como un cadáver humano o un espécimen quirúrgico
(p.ej. un miembro amputado). Alternativamente, se añaden al cultivo
otros tejidos o células estimuladores. La dermis es adecuada para
este propósito y se puede obtener de un donante vivo o de un
cadáver, mediante biopsia por punción, resección quirúrgica o
cualquier otra técnica adecuada. El tejido sinovial, la vaina de
tendón y el hígado son adecuados también para este propósito, como
lo son otros tejidos regeneradores. Se pueden identificar tejidos y
células estimuladores adicionales, según el ensayo descrito más
adelante. Si se desea, el tejido o células estimuladores se
homogeneizan antes de su adición al cultivo. Como será evidente para
los expertos en la técnica, el homogeneizado de tejido o célula
estimuladores se puede conservar, p.ej. mediante crioconservación,
antes del uso.
En una realización alternativa, se añade al
cultivo al menos una sustancia estimuladora biológicamente activa, a
fin de incrementar la capacidad de los fagocitos mononucleares para
promover la regeneración axonal. El factor neurotrófico 3 (NT3), el
factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrófico
derivado del cerebro y el factor transformante \beta
(TGF-\beta) son adecuados para este propósito,
bien individualmente o en combinación, sea en forma nativa o
recombinante. Se pueden identificar sustancias estimuladoras
biológicamente activas adicionales (incluyendo proteínas y péptidos
estimuladores adicionales), según el ensayo descrito más
adelante.
Preferiblemente, los fagocitos mononucleares se
cultivan conjuntamente con tejido estimulador, células
estimuladoras, homogeneizado de tejido estimulador o células
estimuladoras, o al menos una sustancia estimuladora biológicamente
activa, durante 24 horas. Períodos de cultivo más cortos, p.ej.
aproximadamente 2 horas, son también efectivos, como lo son
períodos más largos de cultivo, como una semana o más. En una
realización alternativa, se prepara medio condicionado estimulador
incubando tejido o células estimuladoras, preferiblemente uno o más
segmentos de un nervio, con la máxima preferencia un nervio
periférico como el nervio ciático, en cualquier medio que sea
adecuado para cultivar fagocitos mononucleares. Tras la retirada del
tejido o células, el medio condicionado estimulador se puede
almacenar y usar posteriormente si se desea para estimular fagocitos
mononucleares. Tal medio condicionado estimulador se puede
proporcionar en forma de un kit comercial. Preferiblemente, el medio
condicionado estimulador se conserva durante el almacenamiento, por
ejemplo mediante refrigeración, como medio líquido o congelado.
Alternativamente, el medio condicionado estimulador se
liofiliza.
Como será evidente para los expertos en la
técnica, los fagocitos mononucleares se pueden conservar, p.ej.
mediante crioconservación, bien antes o después del cultivo.
Las sustancias de crioconservación que se pueden
usar incluyen, pero no están limitadas a
dimetil-sulfóxido (DMSO) (Lovelock y Bishop, 1959,
Nature 183:1394-1395;
Ashwood-Smith, 1961, Nature
190:1204-1205), glicerol,
poli(vinil-pirrolidona) (Rinfret, 1960, ann.
N.Y. Acad. Sci. 85:576), polietilenglicol (Slovier y Ravdin,
1962, Nature 196:548), albúmina, dextrano, sacarosa,
etilenglicol, i-eritritol,
D-ribitol, D-manitol (Rowe et
al., 1962, Fed. Proc. 21:157),
D-sorbitol, i-inositol,
D-lactosa, cloruro de colina (Bender et al.,
1960, J. Appl. Physiol. 15:520), aminoácidos (Phan The Tran
y Bender, 1960, Exp. Cell Res. 20:651), metanol, acetamida,
monoacetato de glicerol (Lovelock, 1954, Biochem. J. 56:265),
sales inorgánicas (Phan The Tran y Bender, 1960, Proc. Soc. Exp.
biol. Med. 104:388; Phan The Tran y Bender, 1961 en
Radiobiology, Proceedings of the Third Australian conference on
Radiobiology, Ilbery, P.L.T., ed. Butterworth, Londres, pág. 59), y
DMSO combinado con hidroxyetil-almidón y albúmina de
suero humano (Zaroulis y Leiclerman, 1980, Cryobiology
17:311-317).
Una velocidad de enfriamiento controlada es
crítica. Diferentes sustancias crioprotectoras (Rapatz et
al., 198, Cryobiology 5(1):18-25) y
diferentes tipos de células tienen diferentes velocidades de
enfriamiento óptimas. Véase, p.ej., Rowe y Rinfret, 1962, Blood
20:636; Rowe, 1966, Cryobiology 3(1):12-18;
Lewis et al., 1967, Transfusion /(1):17-32;
y Mazur, 1970, Science 168:939-949, para efectos de
la velocidad de enfriamiento sobre la supervivencia de células
madre de la médula y sobre su potencial de transplante. El calor de
la fase de fusión cuando el agua se vuelve hielo, debería ser
mínimo. El procedimiento de enfriamiento se puede llevar a cabo
usando, p.ej., un dispositivo de congelación programable o un
procedimiento de baño de metanol.
Los aparatos de congelación programables permiten
la determinación de velocidades de enfriamiento óptimas y facilitan
en enfriamiento reproducible estándar. Los congeladores
programables de velocidad controlada como Cryomed o Planar,
permiten adaptar el régimen de congelación a la curva de velocidad
de enfriamiento deseada.
Tras la congelación completa, las células se
pueden transferir rápidamente a un recipiente de almacenamiento
criogénico a largo plazo. En una realización, las muestras se
pueden almacenar criogénicamente en congeladores mecánicos, como
congeladores que mantienen una temperatura de aproximadamente -80ºC
o aproximadamente
-20ºC. En una realización preferida, las muestras se pueden almacenar criogénicamente en nitrógeno líquido (-196ºC) o su vapor. Tal almacenamiento se facilita considerablemente por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno líquido altamente eficientes, que parecen grandes contenedores de Thermos con un vacío extremadamente bajo y un superaislamiento interno, de forma que las pérdidas de calor y nitrógeno se mantienen en un mínimo absoluto.
-20ºC. En una realización preferida, las muestras se pueden almacenar criogénicamente en nitrógeno líquido (-196ºC) o su vapor. Tal almacenamiento se facilita considerablemente por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno líquido altamente eficientes, que parecen grandes contenedores de Thermos con un vacío extremadamente bajo y un superaislamiento interno, de forma que las pérdidas de calor y nitrógeno se mantienen en un mínimo absoluto.
Las consideraciones y procedimientos para la
manipulación, crioconservación y almacenamiento a largo plazo de
células madre hematopoyéticas, particularmente para células de
médula ósea o células sanguíneas periféricas, son aplicables
extensamente a los fagocitos mononucleares obtenidos por el método
de la invención. Tal análisis se puede encontrar, por ejemplo, en
las siguientes referencias, incorporadas aquí mediante referencia:
Gorin, 1986, Clinics in Haematology
15(1):19-48; Bone Marrow Conservation,
Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscú, julio
22-26, 1968, International Atomic Energy Agency,
Viena, págs. 107-186.
Otros métodos de crioconservación de células
viables o sus modificaciones, están disponibles y se prevé su uso,
p.ej. técnicas de metal frío-espejo. Véase Livesey
y Linner, 1987, Nature 327:255; Linner et al., 1986, J.
Histochem. Cytochem. 34(9):1123-1135; véanse
también la patente de EE.UU. Nº 4.199.022 de Senken et al,
la patente de EE.UU. Nº 3.753.357 de Schwartz, y la patente de
EE.UU: Nº 4.559.298 de Fathy.
Las células congeladas se descongelan
preferiblemente rápidamente (p.ej. en un baño de agua mantenido a
37-41ºC) y se templan inmediatamente después de la
descongelación. Puede ser deseable tratar las células a fin de
evitar la aglutinación celular tras la descongelación. Para evitar
la aglutinación, se pueden usar varios procedimientos, incluyendo,
pero no limitados a la adición, antes o después de la congelación,
de DNAsa (Spitzer et al., 1980, Cancer
45:3075-3085); dextrano de bajo peso
molecular y citrato, hidroxietil-almidón (Stiff
et al., 1983, Cryobiology 20:17-24), o
dextrosa de citrato ácida (Zaroulis y Leiderman, 1980, Cryobiology
17:311-317), etc.
La sustancia crioprotectora, si es tóxica en
seres humanos, se debería eliminar antes del uso terapéutico de los
fagocitos mononucleares descongelados. Una forma en que se puede
eliminar la sustancia crioprotectora es mediante dilución hasta una
concentración significativa.
Una vez que los fagocitos mononucleares
congelados se han descongelado y recuperado, se pueden usar para
promover la regeneración axonal, según se describe aquí con
respecto a los fagocitos mononucleares no congelados.
Los fagocitos mononucleares obtenidos según la
presente invención se pueden poner en suspensión en un vehículo
estéril, farmacéuticamente aceptable, y se pueden administrar al
SNC de un mamífero, incluyendo un sujeto humano, en el sitio de la
lesión o enfermedad, o en un sitio próximo.
En una realización preferida, el vehículo
farmacéuticamente aceptable es PBS o un medio de cultivo. Sin
embargo, vehículos alternativos farmacéuticamente aceptables serán
fácilmente aparentes para los expertos en la técnica.
En una realización preferida, los fagocitos
mononucleares se pueden administrar inmediatamente después de una
lesión del SNC y se introducen en el sitio de la lesión del SNC,
por ejemplo con una micropipeta de vidrio. Sin embargo, la
administración de los fagocitos mononucleares puede producirse en
cualquier momento tras la lesión o enfermedad del SNC, mediante
introducción de los fagocitos mononucleares en el sitio de la
lesión o enfermedad del SNC o en un sitio próximo, mediante
cualquier técnica neuroquirúrgicamente adecuada.
Los fagocitos mononucleares obtenidos mediante el
método de la presente invención son útiles para tratar cualquier
lesión o enfermedad del SNC que produzca o esté acompañada de daño
axonal. La lesión o enfermedad puede estar situada en cualquier
porción del SNC, incluyendo el cerebro, la médula espinal o el
nervio óptico. Un ejemplo de tal lesión o enfermedad es el
traumatismo, incluyendo lesión por golpe o contragolpe, traumatismo
penetrante y traumatismo prolongado durante una operación
neuroquirúrgica u otro procedimiento. Otro ejemplo de tal lesión o
enfermedad es el ictus, incluyendo el ictus hemorrágico y el ictus
isquémico. Otro ejemplo adicional de tal lesión o enfermedad es la
lesión del nervio óptico que acompaña a la neuropatía óptica o
glaucoma. Otros ejemplos adicionales de lesión o enfermedad del SNC
serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta
descripción. Los fagocitos mononucleares obtenidos por el método de
la presente invención, son útiles para tratar lesiones o
enfermedades del SNC que originan daño axonal, padezca o no el
sujeto otras enfermedades del sistema nervioso central o
periférico, como enfermedad neurológica de origen genético,
metabólico, tóxico, nutricional, infectivo o autoinmunológico.
La dosis óptima de fagocitos mononucleares es
proporcional al número de fibras nerviosas afectadas por la lesión o
enfermedad del SNC en el sitio que se está tratando. En una
realización preferida, la dosis varía desde aproximadamente 2,5 x
10^{3} hasta aproximadamente 10^{5} fagocitos mononucleares
para tratar una lesión que afecte a aproximadamente 10^{5} fibras
nerviosas, por ejemplo un corte completo de nervio óptico de rata,
y varía desde aproximadamente 2,5 x 10^{4} hasta aproximadamente
10^{6} fagocitos mononucleares para tratar una lesión que afecte a
aproximadamente 10^{6} fibras ópticas, por ejemplo un corte
completo de un nervio óptico humano. Más preferiblemente, la dosis
varía desde aproximadamente 2,5 x 10^{3} hasta aproximadamente 5
x 10^{4} fagocitos mononucleares para tratar una lesión que
afecte a aproximadamente 10^{5} fibras nerviosas y varía desde
aproximadamente 2,5 x 10^{4} fagocitos mononucleares hasta
aproximadamente 5 x 10^{5} fagocitos mononucleares para tratar
una lesión que afecte a aproximadamente 10^{6} fibras nerviosas.
Se prefiere especialmente una dosis de aproximadamente 5 x 10^{3}
fagocitos mononucleares para tratar una lesión que afecte a
aproximadamente 10^{3} fibras nerviosas, y una dosis de
aproximadamente 5 x 10^{4} fagocitos mononucleares para tratar una
lesión que afecte a aproximadamente 10^{6} fibras nerviosas.
La presente invención describe un ensayo para
identificar tejidos y células estimuladores y sustancias
biológicamente activas estimuladoras. Se cultivan fagocitos
mononucleares conjuntamente con el tejido o células a analizar, en
medio condicionado por el tejido o células a analizar, o en medio al
cual se han añadido la sustancia o sustancias biológicamente
activas en diversas concentraciones. Después de esto, se mide la
actividad fagocítica de los fagocitos mononucleares. Los fagocitos
mononucleares con actividad fagocítica incrementada tienen una
capacidad incrementada para promover la regeneración axonal.
Preferiblemente, la capacidad fagocítica de los
fagocitos mononucleares se incrementa en al menos 10 por ciento, más
preferiblemente en al menos 25 por ciento, aún más preferiblemente
en al menos 50 por ciento.
En una realización, la actividad fagocítica se
mide poniendo en contacto los fagocitos mononucleares con partículas
marcadas y, posteriormente, determinando la cantidad de marcaje
asociado con las células. Se puede usar una amplia variedad de
partículas para este propósito, incluyendo glóbulos de látex o
poliestireno y células existentes en la naturaleza, como glóbulos
rojos sanguíneos, levaduras y bacterias. Opcionalmente, las
partículas se pueden opsonizar, por ejemplo con inmunoglobulina o
complemento. Las partículas se pueden marcar con cualquier marcador
adecuado, incluyendo sin limitación un marcador fluorescente (como
fluoresceína o rodamina), un marcador radioactivo (como un isótopo
radioactivo de yodo, carbono o hidrógeno), y una enzima.
Alternativamente, el ensayo se puede realizar con partículas sin
marcar (p.ej. glóbulos rojos o levaduras); las partículas sin marcar
se detectan mediante cualquier método adecuado, como
microscópicamente, con o sin tinción.
En una realización preferida, los fagocitos
mononucleares se ponen en contacto primero con glóbulos de
poliestireno fluorescentes; posteriormente, se mide la fluorescencia
asociada a las células mediante citometría de flujo.
El ensayo proporciona también un medio para
determinar el período de cultivo requerido, a fin de estimular a los
fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares se cultivan
durante diversos períodos con tejido o células estimuladoras, en
medio condicionado por tejido o células estimuladores, o en medio
al cual se ha añadido al menos una sustancia biológicamente activa
estimuladora. después de esto, se mide la actividad fagocítica de
los fagocitos mononucleares. Un período de cultivo suficiente para
incrementar la actividad fagocítica de los fagocitos mononucleares
en al menos 10 por ciento, preferiblemente en al menos 25 por
ciento, más preferiblemente en al menos 50 por ciento, es suficiente
para estimular su capacidad para incrementar la regeneración
axonal. Los siguientes ejemplos se presentan sólo con fines de
ilustración.
Se reunió sangre periférica de ratas
Sprague-Dawley (SPD) adultas. Se aislaron los
monocitos mediante fraccionamiento sobre un gradiente de Percoll de
una etapa, como se describió previamente. F. colotta et al.,
1984, J. Immunol. 132:936-944. La fracción
enriquecida en monocitos se recuperó de la fase de contacto del
Percoll, se lavó una vez con PBS para eliminar los restos de
Percoll, y se volvió a poner en suspensión en medio
DCCM-1, a razón de 1 x 10^{6} células/ml (Belt
Ha'emek Ltd., Kibbutz Beit Ha'emek, Israel). Las células se
cultivaron en bolsas de teflón a 37ºC, según se describió
previamente. Andreesen et al., 1983, J. Immunolog. Meth.
56:295-304. Normalmente, cada bolsa recibió
10 ml, que contenían 1 x 10^{8} células.
Se prepararon monocitos sin estimular (NS)
cultivando monocitos aislados en una bolsa de teflón, según se
describió anteriormente, durante 2-24 horas. Se
prepararon monocitos estimulados por nervio ciático (SS) cultivando
monocitos en una bolsa de teflón durante 2-24 horas
conjuntamente con al menos un segmento de nervio ciático de rata.
Se prepararon monocitos estimulados por nervio óptico (OS),
cultivando monocitos en una bolsa de teflón durante
2-24 horas, conjuntamente con al menos un segmento
de nervio óptico de rata. Cada segmento de nervio era de
1,0-1,5 cm de longitud en los experimentos 6.2.1 y
6.2.2, y era de 0,5-1,0 cm de longitud en los
experimentos 6.2.3 a 6.2.7; se usó una proporción constante de 1
segmento de nervio a 5 x 10^{6} monocitos cultivados, excepto
cuando se indicaba otra cosa.
Tras 2-24 horas en cultivo, los
monocitos se centrifugaron durante 3 minutos a 1000 x g, se lavaron
una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se
volvieron a poner en suspensión en medio DCCM-1 a
razón de 1,25 x 10^{6} - 5 x 10^{6} células/ml. Los monocitos
tenían un 95% de pureza, según se determinó mediante monfología e
inmunocitoquímica con el anticuerpo monoclonal ED1 (Serotec,
Oxford, Inglaterra), según se describe. Hirschberg et al.,
1994, J. Neuroimmunol. 50:9-16.
Se sometieron ratas SPD adultas anestesiadas, de
8-9 semanas de edad, a corte transversal del nervio
óptico, según se describe. Eitan et al., 1994, Science
264:1764-1768. El nervio óptico izquierdo se
expuso a través de una pequeña abertura en las meninges. Se movió
un disector de cristal curvo con un extremo de 200 \mum y un
borde romo liso, a través del nervio, para crear un corte completo,
distal 2-3 mm del globo óptico, teniendo cuidado de
no dañar los vasos sanguíneos periféricos. Según se usa aquí, el
término "distal" significa separado del globo óptico y hacia
el cerebro. En seguida después del corte transversal, se
introdujeron 2 \mul del medio que contenía los monocitos
cultivados, o 2 \mul del medio solo, en el sitio de la lesión, por
medio de una micropipeta de cristal curva con un lumen de 25
\mum. La abertura meníngea se realizó a aproximadamente 200
\mum del sitio de corte transversal, a fin de minimizar la
pérdida de células procedentes del sitio de aplicación.
Entre siete y ocho semanas después del corte
transversal, se aplicó el colorante neurotrazador lipófilo, yoduro
de
4-(4-(didecil-amino)estiril)-N-metil-piridinio
(4Di-10ASP) (Molecular Probes, Eugene, Oregon,
EE.UU) al nervio óptico lesionado, distal 2 mm del sitio de la
lesión. Una semana después de la aplicación del colorante, se
extirpó la retina, se preparó como un montaje total aplanado en una
solución de paraformaldehído al 4%, y se examinó mediante
microscopía de fluorescencia para detectar y contar el número de
células ganglionares retinianas marcadas (RGCs) en la retina
completa. Sólo los axones que habían vuelto a crecer después del
sitio de la lesión hasta el sitio en el que se aplicó el colorante,
podían absorber el colorante y transportarlo retrógradamente hasta
las células ganglionares retinianas. Cuando se aplicó a nervios
ópticos de rata que no se habían cortado transversalmente
previamente, este procedimiento marcó un promedio de 21.623 RGCs por
retina. Los resultados para nervios ópticos que se sometieron a
corte transversal se expresan como un porcentaje de este estándar,
para controlar la eficiencia de la técnica de marcaje
4Di-10ASP.
Entre siete y ocho semanas después del corte
transversal, se realizó una incisión nueva en el nervio óptico
previamente cortado transversalmente, 1 mm proximal al sitio del
corte transversal. Según se usa aquí, el término "proximal"
significa hacia el globo óptico y separado del cerebro. Se introdujo
peroxidasa de rábano (HRP) (tipo VI-A, Sigma, Tel
Aviv, Israel) a través de la incisión, mediante un bastoncillo
estéril empapado en una solución al 50% (p/v) de HRP en PBS. Entre
ocho y doce horas tras la aplicación de la HRP, las ratas se
perfundieron a través de la arteria carótida con PBS, seguido de
paraformaldehído al 4% en PBS como fijador. Los nervios ópticos se
extirparon, se tomaron criosecciones longitudinales de 50 \mum y
se trataron para visualizar la actividad HRP, usando
diamino-benzidina e intensificación de cobalto,
según se describe. Lavie et al., 1992, Brain Res.
575:1-5.
Se pusieron en suspensión monocitos de rata en
medio DCCM-1 (2,5 x 10^{5} células en 1 ml) y se
cultivaron sin más adiciones, o conjuntamente con el número
indicado de segmentos de nervio ciático o nervio óptico de rata.
Para analizar la actividad fagocítica, se preparó una solución de
trabajo de microesferas no carboxiladas fluorescentes
("FLUORESBRITE"^{TM}, Polysciences, Warrington,
Pennsylvania, EE.UU., Nº de catálogo 17152), diluyendo 1 gota de una
solución de reserva en 10 ml de medio DCCM-1, y
añadiendo esta solución de trabajo a la suspensión de monocitos, a
una nueva dilución de 1:100. Después de 3 horas a 37ºC, las células
se lavaron una vez con medio DCCM-1 o con solución
salina tamponada con fosfato, y se midió la fluorescencia asociada a
las células mediante citometría de flujo (FACS).
Se sometió a las ratas a corte transversal del
nervio óptico y se trataron en el momento de la lesión con medio
testigo o con 2,5 x 10^{3} - 1 x 10^{5} monocitos no
estimulados (NS), 2,5 X 10^{3}-1 X 10^{5}
monocitos estimulados de nervio ciático (SS), o 2,5 x
10^{3}-1 x 10^{5} monocitos estimulados de
nervio óptico (OS).
El número de células ganglionares retinianas
(RGCs) marcadas en ratas de cada grupo de tratamiento se muestra en
la Figura 1 como porcentaje de RGCs marcadas en nervios ópticos
normales. Las ratas que no recibían células no mostraban
prácticamente marcaje de RGCs. Las ratas que recibían monocitos NS
mostraban marcaje de números modestos de RGCs, mientras que el
tratamiento con monocitos OS producía el marcaje de números mayores
de RGCs. En ratas que recibían monocitos SS, el número promedio de
RGCs marcado era más de 5 veces superior que en las ratas tratadas
con monocitos OS, y era aproximadamente 15 veces superior que en
las ratas tratadas con monocitos NS.
Para estudiar la regeneración como una función de
la dosis de monocitos administrada, las ratas se sometieron a corte
transversal del nervio óptico y se trataron en el momento de la
lesión con monocitos OS o monocitos SS, a una dosis total de 2,5 x
10^{-3}; 5 x 10^{3}; 1 x 10^{4}; o 1 x 10^{5} células.
El número promedio de RGCs marcadas en cada grupo
de tratamiento se muestra en la Figura 2, como porcentaje de RGCs
marcadas en nervios ópticos normales. El marcaje de RGC fue máximo
después del tratamiento con 5 x 10^{3} monocitos SS. Dosis
superiores o inferiores de monocitos SS promovían la regeneración
axonal, pero eran menos efectivas. El tratamiento con monocitos OS,
de forma similar, promovía la regeneración axonal, aunque de forma
menos efectiva. El efecto máximo, tanto con monocitos OS como SS,
se producía a una dosis de 5 x 10^{3} monocitos; a dosis
superiores o inferiores el efecto beneficioso sobre la regeneración
axonal era menos notable.
En la Figura 3 se muestran micrográficos de
fluorescencia representativos de RGCs marcadas en retinas, tras
tratamiento con monocitos SS o medio testigo. La ausencia de RGCs
marcadas tras tratamiento con medio testigo, indica que el corte
transversal fue total y que las RGCs marcadas representan axones que
se están regenerando, que atravesaban el sitio de corte y no
meramente fibras que escaparon a la lesión experimental.
Los fotomicrográficos en la Figura 4, verifican
además que se ha producido el nuevo crecimiento. En nervios tratados
con medio testigo (E), no se podían ver fibras marcadas distales al
sitio de aplicación de HRP. En nervios tratados con monocitos SS
(A-D), se veían fibras marcadas emergiendo desde la
zona proximal del nervio, cruzando el sitio de corte transversal
(ST) y extendiéndose distalmente. Se observaron estructuras
similares a conos de crecimiento (gc), en los extremos de estas
fibras marcadas.
Para estudiar la capacidad de los monocitos para
promover la regeneración axonal tras estimulación durante diversos
intervalos con segmentos de nervio ciático, se sometió a ratas a
lesión del nervio óptico y se trataron en el momento de la lesión
con 5 x 10^{3} monocitos cultivados con segmentos de nervio
ciático de rata durante dos horas (2 h), doce horas (12 h) o
diecisiete horas (17 h). El número de RGCs marcadas en ratas
individuales de cada grupo de tratamiento se muestra en la Figura
5, como porcentaje de RGCs marcadas en nervios ópticos normales.
Los monocitos mostraban una capacidad incrementada para promover la
regeneración axonal tras cultivo con segmentos de nervio ciático
para cada intervalo analizado.
Para comparar la capacidad de los segmentos de
nervio ciático derivados de rata y ratón para estimular la capacidad
de los monocitos para promover la regeneración axonal, se sometió a
las ratas a corte transversal del nervio óptico y tratamiento en el
momento de la lesión con 5 x 10^{3} monocitos de rata cultivados
durante 24 horas, bien con 1-8 segmentos de nervio
ciático de rata (RATA) o con 2-16 segmentos de
nervio ciático de ratón (RATÓN). El número de RGCs marcadas en
ratas individuales procedentes de cada grupo de tratamiento se
muestra en la Figura 6, como porcentaje de RGCs marcadas en nervios
ópticos normales. El nervio ciático, tanto de rata como de ratón,
estimulaba la capacidad de los monocitos para promover la
regeneración axonal.
Se pusieron en suspensión monocitos de rata a
razón de 2,5 x 10^{5} células en 1 ml de medio
DCCM-1 y se cultivaron durante 2-24
horas sin más adiciones (TESTIGO), con 1 segmento de nervio ciático
de rata (1SS), con 2 segmentos de nervio ciático de rata (2SS) o
con 4 segmentos de nervio ciático de rata (4SS).
La actividad fagocítica de las preparaciones 2SS
y 4SS tras 2 horas en cultivo se muestra en la Figura 7, en
relación con la actividad fagocítica de los monocitos TESTIGO. Tras
cultivo durante 2 horas con dos segmentos de nervio ciático, los
monocitos mostraban una actividad fagocítica incrementada; tras
cultivo durante 2 horas con cuatro segmentos de nervio ciático, los
monocitos mostraban un incremento superior en la actividad
fagocítica.
La actividad fagocítica de las preparaciones 1SS
y 4SS tras 24 h en cultivo se muestra en la Figura 8, en relación
con la actividad fagocítica de los monocitos TESTIGO. Tras cultivo
durante 24 horas con un segmento de nervio ciático, los monocitos
mostraban una actividad fagocítica incrementada; tras cultivo
durante 24 horas con cuatro segmentos de nervio ciático, el
incremento de actividad fagocítica era aun mayor. La preparación
4SS mostraba un incremento superior de la actividad fagocítica tras
24 horas que tras 2 horas.
Se pusieron en suspensión monocitos de rata a
razón de 2,5 x 10^{5} células en 1 ml de medio
DCCM-1, y se cultivaron durante 2-24
horas sin más adiciones (TESTIGO) o con 4 segmentos de nervio
óptico de rata (4OS). La actividad fagocítica de las preparaciones
4OS tras 2 horas en cultivo, se muestra en la Figura 9, en relación
con la actividad fagocítica de los monocitos TESTIGO. Tras cultivo
durante 2 horas con cuatro segmentos de nervio óptico, los monocitos
mostraban una reducción en la actividad fagocítica.
La actividad fagocítica de las preparaciones 4OS
tras 24 horas en cultivo se muestra en la Figura 10, en relación con
la actividad fagocítica de los monocitos TESTIGO. Tras cultivo
durante 24 horas con cuatro segmentos de nervio óptico, los
monocitos mostraban una reducción en la actividad fagocítica similar
a la observada tras 2 horas.
Se preparó medio condicionado por nervio óptico,
cultivando 10 segmentos de nervio óptico de rata durante 2 horas en
medio DCCM-1. Mientras que el medio
DCCM-1 puro está exento de proteínas, el medio
condicionado por nervio óptico contiene proteína. Los monocitos de
rata se volvieron a poner en suspensión a razón de 2,5 x 10^{5}
células en 1 ml de medio DCCM-1, y se cultivaron
durante 24 horas con 1-6 segmentos de nervio
ciático sin más adiciones (0) o con medio condicionado por nervio
óptico a una concentración total de proteína de 10 \mug/ml (10),
1 \mug/ml (1) o 0,1 \mug/ml (0,1).
La Figura 11 presenta la actividad fagocítica de
monocitos cultivados con nervio ciático, en presencia de medio
condicionado por nervio óptico, en relación con la actividad
fagocítica de monocitos cultivados con nervio ciático en ausencia
de medio condicionado con nervio óptico. La adición de medio
condicionado por nervio óptico atenuaba el incremento de la
actividad fagocítica producido por el cultivo con nervio ciático.
Esta atenuación era más marcada en la preparación que recibía 0,1
\mug/ml de medio condicionado por nervio óptico.
Estos ejemplos demuestran que los monocitos
administrados en el sitio de la lesión del CNS promovían la
regeneración axonal. Todos los monocitos analizados eran efectivos
para promover la regeneración axonal. Sin embargo, los monocitos se
estimulaban (es decir, mostraban una capacidad incrementada para
promover la regeneración axonal) mediante cultivo con un segmento de
nervio, especialmente con un segmento de un nervio periférico,
p.ej. nervio ciático de rata o ratón. Esta estimulación era
evidente una vez analizados todos los períodos de cultivo, es
decir, de 2-24 horas. Para tratar un corte
transversal completo de nervio óptico de rata, que contiene
aproximadamente 10^{5} fibras nerviosas, se obtenían resultados
óptimos administrando aproximadamente 5 x 10^{3} monocitos. Sin
embargo, cada dosis analizada mostraba un efecto beneficioso sobre
la regeneración axonal.
Estos ejemplos también demuestran que los
monocitos muestran una actividad fagocítica incrementada tras
cultivo con uno o más segmentos de nervio ciático. Por tanto, la
medición de la actividad fagocítica proporciona un método rápido y
eficiente de escrutinio de tejidos y células para su capacidad de
estimular monocitos para promover la regeneración axonal.
Claims (11)
1. Un método in vitro destinado a
incrementar la capacidad de fagocitos mononucleares de mamíferos
para promover la regeneración axonal en el SNC, que comprende
cultivar dichos fagocitos mononucleares de mamíferos junto con al
menos un tejido estimulador, células estimuladoras, un medio
condicionado por al menos un tejido o células estimuladores, o con
medio al cual se ha añadido al menos una sustancia estimuladora
biológicamente activa, siendo capaces dicho tejido, células o
sustancia biológicamente activa estimuladores, de incrementar la
capacidad de los fagocitos mononucleares para promover la
regeneración axonal.
2. Un método in vitro según la
reivindicación 1, en el que dichos fagocitos mononucleares de
mamíferos se cultivan junto con al menos un tejido estimulador
seleccionado de piel, dermis y un segmento de nervio, o con células
estimuladoras derivadas de piel, dermis y un segmento de nervio, o
con medio condicionado por piel, dermis y/o un segmento de
nervio.
3. Un método in vitro según la
reivindicación 2, en el que dichos fagocitos mononucleares de
mamíferos se han cultivado junto con un segmento de un nervio
periférico humano.
4. Un método in vitro según la
reivindicación 3, en el que dicho nervio periférico humano es nervio
ciático o nervio óptico.
5. Un método in vitro según la
reivindicación 2, en el que dichos fagocitos mononucleares de
mamífero se cultivan junto con un medio condicionado por piel,
dermis y/o un segmento de nervio.
6. Un método in vitro según la
reivindicación 5, en el que dichos fagocitos mononucleares de
mamífero se cultivan junto con un segmento de nervio ciático y
medio condicionado por nervio óptico.
7. Un método in vitro según la
reivindicación 1, en el que dichos fagocitos mononucleares de
mamífero se cultivan junto con un medio al cual se la ha añadido al
menos una sustancia biológicamente activa estimuladora seleccionada
de factor neurotrófico 3 (NT-3), factor de
crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del
cerebro (BDNF) y factor de crecimiento transformante \beta
(TGF-\beta).
8. Un método in vitro según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos fagocitos
mononucleares de mamíferos son monocitos humanos autólogos,
macrófagos o células dendríticas.
9. Un método in vitro según la
reivindicación 8, en el que dichos monocitos humanos autólogos
proceden de sangre central o periférica.
10. Un método in vitro según la
reivindicación 8, en el que dichos macrófagos autólogos proceden de
una cavidad serosa, macrófagos alveolares, macrófagos del hígado o
macrófagos derivados del cultivo de precursores de macrófagos de
médula ósea o sangre, y dichas células dendríticas proceden del
bazo, nódulo linfático, piel o fluido linfático, o son células
dendríticas derivadas de cultivar precursores de células
dendríticas de médula ósea o sangre.
11. Un método in vitro para incrementar la
capacidad de fagocitos mononucleares de mamíferos para promover la
regeneración axonal en el SNC en una lesión o enfermedad del
cerebro, médula espinal o nervio óptico acompañada por daño axonal,
que comprende cultivar dichos fagocitos mononucleares de mamífero
junto con al menos un tejido estimulador, células estimuladoras, un
medio condicionado por al menos un tejido o células estimuladores,
o con medio al cual se ha añadido al menos una sustancia
biológicamente activa, siendo capaces dicho tejido, células o
sustancia biológicamente activa estimuladores, de incrementar la
capacidad de los fagocitos mononucleares para promover la
regeneración axonal.
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