MXPA00011385A

MXPA00011385A - Celulas t activadas, antigenos especificos del sistema nervioso, y sus usos

Info

Publication number: MXPA00011385A
Application number: MXPA/A/2000/011385A
Authority: MX
Inventors: Michal Eisenbachschwartz; Irun R Cohen; Pierre Beserman; Alon Mosonego; Moalemgila
Original assignee: Mcinnis Patricia A; Yeda Research And Development Co Ltd
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2001-07-31

Abstract

Se proveen composiciones y métodos para tratar una lesión o una enfermedad del sistema nervioso periférico o central;en una modalidad, el tratamiento se realiza usando células T activadas que reconocen un antígeno del sistema nervioso o un péptido derivado del mismo o un derivado del mismo para promover la regeneración nerviosa o para evitar o inhibir la degeneración neuronal dentro del sistema nervioso;el tratamiento involucra la administración de un antígeno específico de SN o un péptido derivado del mismo, o un derivado del mismo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para dicho antígeno o pétido, para promover la regeneración nerviosa o para evitar o inhibir la degeneración neuronal en el sistema nervioso, ya sea en el sistema nervioso central o en el sistema nervioso periférico;las células T activadas específicas de SN pueden administrarse solas o en combinación con un antígeno específico de SN o péptido derivado del mismo o un derivado del mismo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para dicho antígeno o péptido, o cualquier combinación de los mismos.

Description

CÉLULAS T ACTIVADAS. ANTIGENQS ESPECÍFICOS DEL SISTEMA NERVIOSO, Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la promoción de la regeneración nerviosa, o prevención o inhibición de la degeneración neuronal para aminorar los efectos de lesión o enfermedad del sistema nervioso (SN). En ciertas modalidades, se pueden usar células T antipropias activadas, un antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para un antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo, para promover la regeneración nerviosa, o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal causada por lesión o enfermedad de nervios dentro del sistema nervioso central o sistema nervioso periférico de un sujeto humano. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar solas, o se pueden administrar opcionalmente en cualquier combinación deseada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema nervioso comprende el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP). El sistema nervioso central está formado del cerebro y la médula espinal; el sistema nervioso periférico consiste de todos los demás elementos neurales, a saber, los nervios y ganglios fuera del cerebro y la médula espinal. El daño al sistema nervioso puede resultar de una lesión traumática, tal como trauma penetrante o trauma brusco, o una enfermedad o trastorno incluyendo, pero no limitado a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), neuropatía diabética, demencia senil e isquemia. El mantenimiento de la integridad del sistema nervioso central es un "acto de equilibrio" complejo, en el cual los compromisos son con el sistema inmune. En la mayoría de los tejidos, el sistema inmune desempeña una parte esencial en los procesos de protección, reparación y cicatrización. En el sistema nervioso central, debido a su privilegio inmune único, las reacciones inmunológicas son relativamente limitadas (Streilein, J. W., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5:428-423; Streilein, J. W., Science 270:1158-1159. Un cuerpo de evidencia creciente indica que la falla del sistema nervioso central de mamíferos para lograr la recuperación funcional después de lesión, es un reflejo de un diálogo ineficaz entre el tejido dañado y el sistema inmune. Por ejemplo, la comunicación restringida entre el sistema nervioso central y los macrófagos llevados por la sangre, afecta la capacidad de los axones axotomizados para regenerarse; los transplantes de macrófagos activados pueden promover la regeneración del sistema nervioso central (Lazarov Spiegler, O., et al., 1996, FASEB J. 19:1296-1302; Rapalino, O. et al., 1998, Nature Med. 4:814-821 ). Se ha demostrado que las células T activadas entran al parénquima del sistema nervioso central, sin importar su carácter específico por el antígeno, pero sólo las células T capaces de reaccionar con un 5 antígeno del sistema nervioso central, parecen persistir ahi (Hickey, W. F. et al., 1991 , J. Neurosci. Res. 28:254-260; Werkele, H., 1993, en The Blood- Brain Barrier, Pardridge, Ed., Raven Press, Ltd. New York, 67-85; Kramer, R. et al., 1995, Nature Med. 1 (11 ):1162-1166)). Las células T reactivas a los antígenos de la materia blanca del sistema nervioso central, tales como la proteína básica de mielina (MBP), pueden inducir la enfermedad paralítica encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) dentro de varios días de su inoculación en ratas receptoras no afectadas (Ben Nun, A., et al., 1981 , Eur. J. Immunol. 11 :195-199). Las células T anti-MPB pueden intervenir también en la enfermedad humana esclerosis múltiple (Ota, K. et al., 1990 Nature 346:183- 15 187; Martin, R. 1997, J. Neural Transm. Suppl. 49:53-67). Sin embargo, a pesar dr su potencial patogénico, clones de células T anti-MBP están presentes en los sistemas inmunes de sujetos sanos (Burns, J., et al., 1983, Cell Immunol. 81 :435-440; Pette, M. et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:7968-7972; Martin, R. et al., 1990, J. Immunol. 145:540-548; Schiuesener, H. J. et al., 1985, J. Immunol. 135:3128-3133). Las células T activadas, las cuales normalmente patrullan el sistema nervioso central intacto, se acumulan transitoriamente en sitios de lesiones de la materia blanca del sistema nervioso central (Hirschberg, D. L., et al., 1998, J. Neuroimmunol. 89:88-96).

Una consecuencia catastrófica de lesión del sistema nervioso central es que el daño primario se complica con frecuencia por la pérdida secundaria gradual de neuronas adyacentes que aparentemente no fueron dañadas, o fueron apenas marginalmente dañadas, por la lesión inicial (Faden, A.I., et al., 1992, Trends Pharmacol. Sci. 13:29-35; Faden, A. I., 1993, Crit. Rev. Neurobiol. 7:175-186; Mclntosh, T. K., 1993, J Neurotrauma 10:215-261 ). La lesión primaria causa cambios en la concentración de iones extracelulares, elevación de cantidades de radicales libres, liberación de neurotransmisores, depleción de factores del crecimiento e inflamación local. Estos cambios desencadenan una cascada de eventos destructores en las neuronas adyacentes que escaparon inicialmente a la lesión primaria (Lynch, D. R. et al., 1994, Curr. Opin. Neurol. 7:510-516; Bazan, N. G. et al., 1995, J_ Neurotrauma 12:791-814; Wu, D. et al., 1994, J. Neurochem. 62:37-44). Este daño secundario es mediado por la activación de canales dependientes de voltaje o con compuerta para agonistas, fugas de iones, activación de enzimas dependientes de ca io tales como proteasas, lipasas y nucleasas, disfunción mitocondrial y depleción de energía, culminando en muerte celular neuronal (Yoshina, A. et al., 1991 Brain Res. 561 :106-119; Hovda, D. A. et al., 1991 , Brain Res. 567:1-10; Zivin, J. A., et al., 1991 Sci. Am. 265:56-63; Yoles, E. et al., 1992, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33:3586-3591). La pérdida generalizada de neuronas más allá de la pérdida causada directamente por la lesión primaria, ha sido denominada "degeneración secundaria". Otra consecuencia trágica de lesión del sistema nervioso central, es que las neuronas en el sistema nervioso central de mamíferos no sufren regeneración espontánea después de una lesión. De esta manera, una lesión del sistema nervioso central causa deterioro permanente de funciones sensoriales y motoras. Las lesiones de la médula espinal, sin importar la severidad de la lesión, resultan inicialmente en una parálisis funcional completa conocida como choque espinal. Se puede observar cierta recuperación espontánea del choque espinal, iniciando unos pocos días después de la lesión, y disminuyendo gradualmente dentro de tres a cuatro semanas. Cuanto menos severa es la lesión, mejor es el resultado funcional. El nivel de recuperación es una función de la cantidad de tejido no dañado, menos la pérdida debida a degeneración secundaria. La recuperación de la lesión se podría mejorar mediante tratamiento neuroprotector que podria reducir la degeneración secundaria. La cita o identificación de cualquier referencia en esta sección o cualquier otra parte de esta solicitud, no deberá ser considera como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a métodos y composiciones para la promoción de la regeneración nerviosa o la prevención o inhibición de la degeneración neuronal para aminorar los efectos de lesión o de enfermedad del sistema nervioso (SN). La presente invención se basa en parte en el descubrimiento inesperado de los solicitantes, de que las células T activadas que reconocen un antígeno del SN del paciente promueven la regeneración nerviosa o confieren neuroprotección. Como se usa en la presente, "neuroprotección" se refiere a la prevención o inhibición de efectos degenerativos de lesión o enfermedad en el SN. Hasta recientemente, se pensaba que el sistema inmune excluía a las células inmunes de participar en la reparación del sistema nervioso. Fue bastante sorprendente descubrir que las células T activadas específicas del SN se pueden usar para promover la regeneración nerviosa o para proteger al tejido del sistema nervioso de degeneración secundaria que puede resultar del daño causado por lesión o enfermedad del SNC o SNP. "Célula T activada", como se usa en la presente, incluye (i) células T que han sido activadas por exposición a un antígeno cognado o péptido derivado del mismo o derivado df I mismo, y (¡i) la progenie de dichas células T activadas. Como se usa en la presente, un antígeno cognado es un antígeno que es reconocido específicamente por el receptor de antígenos de células T de una célula T que ha sido previamente expuesta al antlgeno. En forma alternativa, la célula T que ha sido previamente expuesta al antígeno puede ser activada por un mitógeno, tal como fitohemaglutinina (PHA) o concanavalina A. En una modalidad, la presente invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de células T activadas específicas del SN, y métodos para usar dichas composiciones para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal en el SNC o SNP, en una cantidad que es efectiva para aminorar los efectos de una lesión o enfermedad del SN. "Célula T activada específica del SN", como se usa en la presente, se refiere a una célula T activada que tiene carácter específico por un antígeno del SN de un paciente. El antígeno usado para conferir el carácter específico a las células T puede ser un antígeno del SN propio del paciente, un péptido o derivado del mismo, o un antígeno del SN de otro individuo o incluso otra especie, o un péptido derivado del mismo, en tanto la célula T activada reconozca un antígeno en el SN del paciente. Las células T activadas específicas del SN se usan para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos de enfermedad. Si la enfermedad que está siendo tratada es una enfermedad autoinmune, en la cual el antígeno autoinmune es un antígeno del SN, las células T que se usan de conformidad con la presente invención para el tratamiento de daño neural o degeneración causada por dicha enfermedad, son preferiblemente no activadas contra el mismo antígeno autoinmune implicado en la enfermedad. Aunque la técnica anterior ha descrito métodos para tratar enfermedades autoinmunes administrando células T activadas para crear una tolerancia al antígeno autoinmune, las células T de la presente invención no son administradas de tal forma para crear tolerancia, sino son administradas de tal forma para crear acumulación de las células T en el sitio de lesión o enfermedad, para facilitar la regeneración neural o para inhibir la degeneración neural. La técnica anterior describe también usos de inmunoterapia contra tumores, incluyendo tumores cerebrales, administrando células T específicas para un antígeno de SN en el tumor, de modo que dichas células T puedan inducir un ataque del sistema inmune contra los tumores. La presente invención no tiene el propósito de abarcar los procedimientos de la técnica anterior. Sin embargo, la presente invención tiene el propósito de abarcar la inhibición de la degeneración neural o la mejora de la regeneración neural en pacientes con tumores cerebrales mediante medios diferentes de la inmunoterapia de tumores cerebrales de la técnica anterior. De esta manera, por ejemplo, se esperaría que las células T activadas específicas del SN, las cuales son activadas para un antígeno del SN del paciente diferente a un antígeno que interviene en el tumor, sean útiles para el propósito de la presente invención y no habrían sido sugeridas mediantf técnicas de inmunoterapia conocidas. La presente invención provee también composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo o derivado del mismo, y métodos de uso de dichas composiciones para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal en el SNC o SNP, en los cuales la cantidad es efectiva para activar las células T in vivo o in vitro, en donde las células T activadas inhiben o aminoran los efectos de una lesión o enfermedad del SN. "Antígeno específico del SN", como se usa en la presente, se refiere a un antígeno que activa específicamente células T, de modo que después de la activación de las células T activadas, se acumula en un sitio de lesión o enfermedad en el SN del paciente. En una modalidad, el péptido derivado de un antígeno específico del SN es un "epítope críptico" del antígeno. Un epítope críptico activa a células T específicas después de que un animal es inmunizado con el péptido en particular, pero no con el antígeno intacto. En otra modalidad, el péptido derivado de un antígeno específico del SN es un epítope inmunógeno del antígeno. "Derivados" de antígenos específicos del SN o péptidos derivados de los mismos, como se usa en la presente, se refiere a análogos o derivados químicos de dichos antígenos o péptidos como se describe más adelante (véase sección 5.2). La presente invención provee también composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efective de una secuencia de nucleótidos que codifica para un antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo o derivado del mismo, y métodos de uso de dichas composiciones para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir la degeneración neuronal en el SNC o SNP, en los cuales la cantidad es efectiva para aminorar los efectos de una lesión o enfermedad del SN. En la práctica de la invención, la terapia para aminorar los efectos de lesión o enfermedad, y que comprende la administración de células T activadas específicas del SN, puede ser opcionalmente en combinación con un antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo. Además, la administración oral de un antígeno específico del SN o un péptido derivado del mismo, se puede combinar con la inmunización activa para desarrollar una respuesta crítica de células T inmediatamente después de la lesión. En otra modalidad, se pueden establecer bancos de células para almacenar células T sensibilizadas del SN para el tratamiento neuroprotector de individuos en un tiempo posterior, según sea necesario. En este caso, se pueden obtener células T autólogas de un individuo. En forma alternativa, se pueden almacenar células T alogénicas o semialogénicas, de modo que esté presente un banco de células T de cada uno de los tipos de MHC clase II más comunes. En caso de que un individuo sea tratado por una lesión, de preferencia se usan células T almacenadas autólogas pero, si no están disponibles células T autólogas, entonces deben usarse células que compartan una molécula de MHC tipo II con el paciente, y se esperaría que estas sean funcionales en ese individuo. De preferencia, las células son almacenadas en un estado activado después de la exposición a un antígeno del SN o péptido derivado del mismo. Sin embargo, las células pueden ser almacenadas también en un estado en reposo, y activadas una vez que son descongeladas y preparadas para su uso. Las líneas de células del banco son preferiblemente criopreservadas. Las líneas de células se preparan en cualquier forma que sea bien conocida en la técnica. Una vez que las células son descongeladas, son de preferencia cultivadas antes de la inyección para eliminar células no viables. Durante este cultivo, las células pueden ser activadas o reactivadas usando el mismo antígeno del SN o péptido como se usa en la activación original. En forma alternativa, la activación se puede lograr mediante cultivo en presencia de un mitógeno, tal como fitohemaglutinina (PHA) o concanavalina A (de preferencia la primera). Esto colocará a las células en un estado de activación incluso mayor. Los pocos días que lleva cultivar las células no deben perjudicar al paciente en tanto el tratamiento de conformidad con la presente invención pueda ocurrir en cualquier momento hasta una semana o más después de la lesión para que sea aún efectivo. En forma alternativa, si el tiempo no es esencial, las células almacenadas se pueden administrar inmediatamente después del deshielo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una gráfica de barras que muestra la presencia de células T en nervio óptico no lesionado o en nervio óptico lesionado una semana después de la lesión. Ratas Lewis adultas fueron inyectadas con células T activadas de las líneas anti-MBP (TMBP), anti-OVA (TOVA), anti-p277 (TP277), o con PBS, inmediatamente después de lesión por aplastamiento unilateral del nervio óptico. Siete días después, los nervios ópticos lesionados y no lesionados fueron removidos, criosecccionados y analizados inmunohistoquímicamente para detectar la presencia de células T inmunomarcadas. Las células T fueron contadas en el sitio de lesión, y en áreas aleatoriamente seleccionadas en los nervios ópticos no lesionados. El histograma muestra el número promedio de células T por mm2 ± e.e.m., contadas en dos a tres secciones de cada nervio. Cada grupo contenía tres a cuatro ratas. El número de células T fue considerablemente mayor en nervios lesionados de ratas inyectadas con células T anti-MBP, anti-OVA o anti-p277; el análisis estadístico (ANOVA unidireccional) mostró diferencias significativas entre los números de células T en nervios ópticos lesionados de ratas inyectadas con células T anti-MBP, anti-OVA o anti-p277, y los números de células T en nervios ópticos lesionados de ratas inyectadas con PBS (P<0.001 ); y entre nervios ópticos lesionados y nervios ópticos no lesionados de ratas inyectadas con células T anti-MBP, anti-OVA o anti-p277 (P<0.001 ).

La figura 2 es una gráfica de barras que ilustra que células T especificas a MBP, pero no de OVA o p277 o hspdO, protegen a las neuronas de degeneración secundaria. Inmediatamente después de la lesión del nervio óptico, las ratas fueron inyectadas con células T anti-MBP, anti-OVA o anti-p277, o con PBS. El colorante neurotrazador 4-Di-10-Asp se aplicó a nervios ópticos distales al sitio de lesión, inmediatamente después de la lesión (para evaluación del daño primario) o dos semanas después (para evaluación de la degeneración secundaria). Cinco días después de la aplicación del colorante, las retinas fueron extirpadas y montadas extendidas. Las células ganglionares retinianas marcadas (RGCs) de tres a cinco campos aleatoriamente seleccionados en cada retina (todos localizados a aproximadamente la misma distancia del disco óptico), fueron contadas mediante microscopía de fluorescencia. La supervivencia de RGCs en cada grupo de nervios lesionados se expresó como el porcentaje del número total de neuronas disponibles después de la lesión primaria (42% de las neuronas permanecieron sin daños después de la lesión primaria). El efecto neuroprotector de las células T anti-MBP, comparativamente con aquel del PBS, fue significativo (P<0.001 , ANOVA unidireccional). Las células T anti-OVA o las células T anti-p277 no variaron significativamente del PBS en sus efectos sobre la protección de neuronas que habían escapado a la lesión primaria (P>0.05, ANOVA unidireccional). Los resultados son un resumen de cinco experimentos. Cada grupo contenía de cinco a diez ratas. Las figuras 3 (A-C) presentan microfotografías de retinas retrógradamente marcadas de nervios ópticos lesionados de ratas. Inmediatamente después de la lesión por aplastamiento unilateral de sus nervios ópticos, las ratas fueron inyectadas con PBS (fig. 3A) o con células T anti-p277 activadas (fig. 3B) o células T anti-MBP activadas (fig. 3C). Dos semanas después, el colorante neurotrazador 4-Di-10-Asp fue aplicado a los nervios ópticos distales al sitio de lesión. Después de 5 días, las retinas fueron extirpadas y montadas extendidas. Las RCGs marcadas (sobrevivientes), localizadas aproximadamente a la misma distancia del disco óptico en cada retina, fueron fotografiadas. Las figuras 4 (A-B) son gráficas que muestran que la severidad clínica de la EAE no es influenciada por una lesión por aplastamiento del nervio óptico. Para los resultados mostrados en la figura 4A, ratas Lewis no lesionadas (línea punteada) o inmediatamente después de lesión por aplastamiento del nervio óptico (línea continua), fueron inyectadas con células T anti-MBP activadas. La EAE fue evaluada de conformidad con una escala de parálisis neurológica. [Los puntos de datos representan + e.e.m.]. Estos resultados representan un resumen de tres experimentos. Cada grupo contenía de cinco a nueve ratas. La figura 4B muestra que el número de RGCs en el nervio óptico no lesionado, no es influenciado por la inyección de células T anti-MBP. Dos semanas después de la inyección de células T anti-MBP o PBS, se aplicó 4-Di-10Asp a los nervios ópticos. Después de 5 días, las retinas fueron extirpadas y montadas extendidas. Las RGCs marcadas de cinco campos (localizadas a aproximadamente la misma distancia del disco óptico) en cada retina fueron contadas, y se calculó el número promedio por mm2. No hubo diferencia entre los números de RGCs marcadas en ratas inyectadas con células T anti-MBP (TMBP) y en ratas control inyectadas con PBS. La figura 5 es una gráfica de barras que muestra que células T específicas para p51-70 de MBP protegen a las neuronas de la degeneración secundaria. Inmediatamente después de la lesión del nervio óptico, las ratas fueron inyectadas con células T anti-MBP, células T anti-p51-70, o PBS. El colorante neurotrazador 4-DM0-Asp fue aplicado a nervios ópticos distales al sitio de lesión, inmediatamente después de la lesión (para evaluación del daño primario) o dos semanas después (para evaluación de la degeneración secundaria). Cinco días después de la aplicación del colorante, las retinas fueron extirpadas y montadas extendidas. Las células ganglionares retinianas (RGCs) marcadas de tres a cinco campos aleatoriamente seleccionados en cada retina (todos localizados a aproximadamente la misma distancia del disco óptico), fueron contadas mediante microscopía de fluorescencia. La supervivencia de RGCs en cada grupo de nervios lesionados se expresó como el porcentaje del número total de neuronas excedentes después de la lesión primaria. Comparativamente con los efectos neuroprotectores del tratamiento con PBS, los efectos neuroprotectores de células T anti-MBP anti-p51-70 fueron significativos (P<0.001 , ANOVA unidireccional). Las figuras 6 (A-B) son gráficas que muestran que células T anti- MBP aumentan las amplitudes del potencial de acción mixto (CAP) de nervios ópticos lesionados. Inmediatamente después de la lesión del nervio óptico, las ratas fueron inyectadas con PBS o células T anti-MBP (TMBP) activadas. Dos semanas después, se registraron los CAPs de nervios lesionados (fig. 6A) y no lesionados (fig. 6B). No existieron diferencias significativas en las amplitudes promedio del CAP entre nervios no lesionados obtenidos a partir de ratas inyectadas con PBS y ratas inyectadas con células T (n=8; p=0.8, prueba t de Stundent). El efecto neuroprotector de las células T anti-MBP (respecto al PBS) en el nervio lesionado en el día 14 después de la lesión, fue significativo (n=8, p=0.009, prueba t de Student). Las figuras 7 (A-B) son gráficas que muestran la recuperación de la actividad motora voluntaria como una función del tiempo después de la contusión, con y sin inyección de células T antl-MBP autoinmunes. En (7A), doce ratas fueron anestesiadas profundamente y laminectomizadas, y sometidas entonces a una descarga de contusión producida por un peso de 10 gramos dejado caer desde una altura de 50 mm. Seis de las ratas, seleccionadas al azar, fueron inoculadas entonces i.p. con 107 con células T anti-MBP, y las otras seis fueron inoculadas con PBS. A los puntos de tiempo indicados, el comportamiento locomotor en un campo abierto fue evaluado por observadores quienes ignoraban el tratamiento recibido por las ratas. Los resultados se expresan como valores promedio para cada grupo. Las barras verticales indican E.E.M. Las diferencias probadas mediante ANOVA repetida, incluyendo todos los puntos de tiempo, fueron significativas (p<0.05). En (7B), en un experimento similar usando cinco animales tratados con PBS y seis animales tratados con células T anti-MBP, dichos animales fueron sometidos a una contusión más severa. A los puntos de tiempo indicados, se evaluó el comportamiento locomotor en un campo abierto. Los resultados se expresan como los valores promedio para cada grupo. Las barras verticales indican E.E.M. Las ratas d ¡l grupo tratado se representan mediante círculos claros, y las ratas del grupo control se representan mediante círculos negros. Las barras horizontales muestran los valores promedio. La inserción muestra los valores promedio de la meseta de los dos grupos. Las figuras 8 (A-C) muestran la marcación retrógrada de cuerpos celulares en el núcleo rojo en ratas tratadas con células T anti-MBP autoinmunes (8A) y en ratas control lesionadas (8B). Tres meses después de la contusión y el tratamiento con células T anti-MBP, algunas ratas de los rifa*,.. . *jjt grupos control y tratado fueron reanestesiadas, y se aplicó colorante debajo del sitio de la contusión. Después de cinco a siete días, las ratas fueron de nuevo profundamente anestesiadas y su cerebro fue extirpado, procesado y crioseccionado. Secciones tomadas a través del núcleo rojo fueron inspeccionadas y analizadas cuantitativamente y cualitativamente bajo microscopios fluorescente y confocal. En forma significativa, se observaron más núcleos marcados en los núcleos rojos de ratas tratadas con células T anti-MBP (8A) que en los núcleos rojos de ratas tratadas con PBS (8B). Las diferencias cuantitativas se muestran en la gráfica de barras (8C), y se obtuvieron de animales con puntuaciones de 10 y 11 en el grupo tratado con células T, y puntuaciones de 6 en el grupo control. La gráfica de barras muestra el promedio más + DE. La figura 9 es una sene de fotografías que muestran imágenes ponderadas por difusión de médula espinal sometida a contusión tratada con células T anti-MBP. Las médulas espinales de animales tratados con células T MBP y animales tratados con PBS (con puntuaciones de locomoción de 10 y 8, respectivamente), fueron extirpadas bajo anestesia profunda, fijadas de inmediato en solución de paraformaldehído a 4%, y colocadas en tubos para RMN de 5 mm. Se midió la anisotropía por difusión en un espectrómetro de agujero amplio DMX 400 Bruker usando una sonda de microscopio con una bobina Helmholtz de 5 mm, y gradientes de campo magnético activamente protegidos. Se llevó a cabo un experimento de eco del espín con gradiente pulsado de cortes múltiples con nueve cortes axiales, estando el corte central situado al centro de la lesión espinal. Se obtuvieron imágenes con TE de 31 ms, TR de 2000 ms, un tiempo de difusión de 15 ms, una duración de gradiente de difusión de 3 ms, campo de observación de 0.6 mm, tamaño de matriz de 128 x 128, grosor del corte de 0.5 mm y separación del corte de 1.18 mm. Se aplicaron cuatro valores de gradiente de difusión de 0, 28, 49 y 71 g/cm a lo largo de la dirección de lectura (difusión transversal) o a lo largo de la dirección del corte (difusión longitudinal). La anisotropía por difusión se manifiesta mediante una intensidad de señal incrementada en las imágenes con el gradiente de difusión transversal más alto respecto al gradiente de difusión longitudinal. Las médulas espinales extirpadas de una rata tratada con PBS y en la rata tratada con células T MBP, fueron sometidas a análisis de MRI ponderado por difusión. En el control lesionado tratado con PBS, se observó anisotropía por difusión principalmente en secciones próximas a los troncos proximal y distal de la médula espinal, con baja anisotropía en secciones tomadas a través del sitio de lesión. En contraste, en la rata tratada, se pueden observar niveles mayores de rnisotropía por difusión en secciones tomadas a través del sitio de lesión. La figura 10 es una gráfica que ilustra la inhibición de la degeneración secundaria después de lesión por aplastamiento del nervio óptico en ratas adultas. Véase el texto, sección 8, para detalles experimentales. Las ratas fueron inyectadas intradérmicamente a través de los cojinetes de las patas con un péptido de 21 elementos basado en los residuos de aminoácidos 35-55 (MOG p35-55) de la glucoproteína de oligodendrocitos/mielina (sintetizada químicamente en el Instituto Weizmann, Israel) (50 /animal) o PBS diez días antes de la lesión por aplastamiento del nervio óptico, o MOG p35-55 en ausencia de lesión por aplastamiento. Se administró MOG p35-55 con adyuvante incompleto de Freund. Las fibras sobrevivientes del nervio óptico fueron monitoreadas mediante marcación retrógrada de células ganglionares retinianas (RGCs). El número de RGCs en ratas inyectadas con PBS o MOG p35-55 se expresó como un porcentaje del número total de neuronas en ratas inyectadas con MOG p35-55 en ausencia de lesión por aplastamiento. La figura 11 es una gráfica que ilustra la inhibición en ratas adultas de la degeneración secundaria después de lesión por aplastamiento del nervio óptico mediante MBP. Véase el texto, sección 9, para detalles experimentales. Se administró oralmente MBP (Sigma, Israel) (1 mg en 0.5 ml de solución salina) a ratas adultas mediante cebadura usando una aguja despuntada. La MBP fue administrada cinco veces, es decir, cada tercer día iniciando dos semanas antes de la lesión por aplas'amiento del nervio óptico. Las fibras sobrevivientes del nervio óptico fueron monitoreadas mediante marcación de células ganglionares retinianas (RGCs). El número de RGCs en las ratas tratadas se expresó como un porcentaje del número total de neuronas en ratas no tratadas después de la lesión. Las figuras 12 (A-F) muestran la expresión de moléculas coestimuladoras B7 en nervio óptico de rata intacto y lesionado. Los nervios ópticos fueron extirpados de ratas Lewis adultas antes (12A, 12B) y tres días después de la lesión (12C, 12D, 12E), y analizados inmunohistoquímicamente para la expresión de la molécula coestimuladora B7. El sito de lesión fue delineado mediante tinción con GFAP. Usando fórceps de acción transversal calibrados, ei nervio óptico derecho fue sometido a una lesión por aplastamiento moderada 1 a 2 mm del ojo. El nervio cointralateral no lesionado se dejó intacto. El análisis inmunohistoquímico de los antígenos del nervio óptico se llevó a cabo de la manera siguiente. Por poco tiempo, criosecciones longitudinales de los nervios extirpados (20 µm de grosor), fueron colocadas sobre vidrio revestido de gelatina, y fijados con etanol durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron lavadas e incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal de ratón para GFAP de rata (BioMakor, Israel), diluido 1 :100, y con anticuerpos para molécula coestimuladora B7.2 y la molécula coestimuladora B7.1 (PHARMINGEN, San Diego, CA) diluida 1 :25. Las secciones fueron lavadas de nuevo e incubadas con IgG anti-ratón de cabra conjugada con isotiocianato de rodamina (con reacción cruzada mínima pera proteína de suero de rata, humano, bovino y caballo) (Jackson ImmunoResearch, West Grave, PA), durante 1 hora a temperatura ambiente. Todas las soluciones de lavado contenían PBS y Tween-20 a 0.05%. Todas las soluciones de dilución contenían PBS que contenía suero fetal de ternera a 3% y albúmina de suero de bovino a 2%. Las secciones fueron tratadas con glicerol que contenía 1 ,4-diazobiciclo-(2,2,2)-octano, y fueron entonces visualizadas con un microscopio Zeiss. Nótense los cambios morfológicos en las células positivas B7.2 después de la lesión, de una forma redondeada (12A, 12B) a una morfología de estrella (12C, 12D). Las células B7.2 positivas estuvieron presentes a mayor densidad más cerca del sito de lesión (12E). La expresión de B7.1 fue detectable únicamente a partir del séptimo día, y únicamente en el sitio 5 lesionado (12F). Las figuras 13 A-C muestran el análisis inmunohistoquímico de células T, macrófagos o microglia, y moléculas coestimuladoras B7.2 en los nervios ópticos lesionados de ratas alimentadas con MBP. Ratas Lewis de 6 a 8 semanas, fueron alimentadas con 1 mg de MBP de bovino (Sigma, Israel) (2 mg de MBP/ml de PBS) o 0.5 ml de PBS únicamente cada tercer día mediante intubación gástrica utilizando una aguja para alimentación de acero inoxidable (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) (Chen, Y., Kuchroo, V. K.„ Inobe, J. Hafler, D. A. & Weiner, H. L. Regulatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis. Science 265:1237- 15 1240, 1994). Diez días después del inicio con MBP, los nervios ópticos derechos fueron sometidos a lesión por aplastamiento calibrada, como se describe para la figura 12. Tres días después, los nervios fueron extirpados y preparados para análisis inmunohistoquímico de células T usando anticuerpos monoclonales de ratón para el receptor 11 de células T, diluido 1 :25, macrófagos o microglia usando anticuerpos anti-ED1 (Serotek, Oxford, Reino Unido) diluidos 1 :250, astrocitos usando anticuerpos anti-GFAP y moléculas coestimuladoras B7.2 como se describe para la figura 12. No hubieron diferencias cuantitativas significativas en células T o en células ED-1 positivas entre nervios ópticos lesionados de ratas alimentadas con PBS (13A) y ratas alimentadas con MBP (13B). Debe notarse el número de células B7.2 positivas en el sito de lesión de ratas alimentadas con MBP (13C), comparativamente con controles lesionados (fig. 12E). La figura 14 es una gráfica que muestra el retraso de la degeneración neuronal en ratas con tolerancia oralmente inducida a MBP. Ratas Lewis fueron alimentadas diariamente con 1 mg de MBP, o cada tercer día, o 4 veces al día a intervalos de 2 horas para 5 días consecutivos. Se administró a los animales control PBS o el antígeno no propio OVA (Sigma, Israel). Diez días después del inicio de la ingesta de MBP, los nervios ópticos derechos fueron sometidos a una lesión por aplastamiento moderada calibrada. Dos semanas después, las PGCs fueron marcadas retrógradamente mediante la aplicación del colorante lipófilo fluorescente yoduro de 4-(4-d¡decilamino)estiril)-N-metilpir?dinio (4-Di-10-Asp) (Molecular Probes Europe BV, Los Países Bajos), distalmente al sito de lesión, según se describe. Por poco tiempo, se llevó a cabo axotomía completa 1 a 2 mm del borde distal del sito de lesión, y se depositaron de inmediato cristales sólidos (0.2-0.4 mm de diámetro) de 4-Di-10-Asp en el sito de la lesión. La marcación retrógrada de las RGCs por el colorante, da una indicación confiable del número de neuronas aún funcionales, ya que únicamente los axones intactos pueden transportar el colorante hacia sus cuerpos celulares en la retina. Seis días después de la aplicación del colorante, la retina fue separada del ojo, preparada como un portaobjetos intacto aplanado en una solución ^^^^ paraformaldehído a 4%, y examinada para células ganglionares marcadas mediante microscopía de fluorescencia. Las RGSc fueron contadas de 3 regiones diferentes en la retina. Los resultados se expresan como porcentaje normalizado de cada retina para animal promedio lesionado no tratado del mismo experimento. La media de cada grupo se muestra como una barra (control contra MBP OTx4 " P<0.01; control contra MBP OT ** P, 0.01; control contra OVA OT ns P>0.05. La figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de proteína básica de mielina de rata, SEQ ID NO: 1 , número de acceso del banco de genes M25889 (Schaich et al., Biol. Chem. 367:825-834, 1986). La figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de proteína básica de mielina de humano, SEQ ID NO: 2, número de acceso del banco de genes M13577 (Kamholz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83(13): 4962-4966, 1986). Las figuras 17 (A-F) muestran la secuencias de nucleótidos de los exones 1-7 del gen de proteolípidos de mielina de humano, SEQ ID NOs: 3-8, respectivamente, número de acceso del banco de genes M15026-M15032, respectivamente (Diehl et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83(24):9807-9811 , 1986; la errata publicada aparece en Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86(6):617-8, 1991 ). La figura 18 muestra la secuencia de nucléotidos del gen de glucoproteína de oligodendrocitos/mielina de humano, SEQ ID NO: 9, número de acceso del banco de genes Z48051 (Roth et al., presentada el 17 de enero de 1995) Roth, CNRS UPR 8291 , CIGH, CHU Purpan, Toulouse, Francia, 31300; González et al.. Mol. Phyloaenet. Evol. 6:63-71. 1996). La figura 19 muestra la secuencia de nucléotidos de proteolípidos de rata y variante, SEQ ID NO: 10, número de acceso del banco de genes M16471 (Nave et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:600-604, 1987). La figura 20 muestra la secuencia de nucléotidos de la glucoproteína asociada a mielina de rata, SEQ ID NO: 11 , número de acceso del banco de genes M14871 (Arquint et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:600-604, 1987). La figura 21 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína básica de mielina de humano, SEQ ID NO: 12, número de acceso del banco de genes 307160 (Kamholz et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83(13):4962-4966, 1986). La figura 22 muestra la secuencia de aminoácidos de proteolípidos de humano, SEQ ID NO: 13, número de acceso del banco de genes 387028. La figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína de oligodendrocitos/mielina de humano, SEQ ID NO: 14, número de acceso del banco de genes 793839 (Roth et al., Genomics 28(2):241-250, 1995; Roth, presentada el 17 de enero de 1995), Roth' CNRS UPR 8291, CIGH, CHU Purpan, Toulouse, Francia, 31300; González et al., Mol. Phyloqenet. Evol. 6:63-71. 1996).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Solamente para facilitar la explicación, la descripción detallada de la presente invención está dividida en las siguientes subsecciones: (1 ) células T activadas específicas del SN; (2) antígenos específicos del SN, péptidos derivados de los mismos y derivados de los mismos; (3) secuencias de nucléotidos que codifican para antígenos específicos del SN y péptidos derivados de los mismos; (4) usos terapéuticos de células T activadas no recombinantes específicas del SN, antígenos específicos del SN, péptidos derivados de los mismos y derivados de los mismos, y secuencias de nucléotidos que codifican para antígenos específicos del SN y péptidos derivado de los mismos; y (5) formulaciones y vías de administración de células T activadas no recombinantes específicas del SN, antígenos específicos del SN, péptidos derivados de los mismos y derivados de los mismos, y secuencias de nucléotldos que codifican para antígenos específicos del SN y péptidos derivados de los mismos. 5.1 Células T activadas especificas del SN Se pueden usar células T activadas específicas del SN (ATCs) para aminorar o inhibir los efectos del lesión o enfermedad del SNC o SNP que resultan en la degeneración del SN, o para promover la regeneración del SN, en particular el SNC. Las células T activadas específicas del SN son preferiblemente autólogas, más preferiblemente de los fenotipos CD4 y/o CD8, pero pueden ser también células T alogénicas de donadores emparentados, por ejemplo, hermanos, padres, hijos, o donadores semialogénicos o totalmente alogénicos igualados o parcialmente igualados para HLA. Además del uso de células T autólogas aisladas del sujeto, la presente invención abarca también el uso de células T semialogénicas para neuroprotección. Estas células T se pueden preparar como líneas a corto o largo plazo, y ser almacenadas mediante métodos convencionales de criopreservación por deshielo y administración, inmediatamente o después del cultivo durante 1 a 3 días, a un sujeto que sufre de lesión del sistema nervioso central y que necesita de neuroprotección por células T. El uso de células T semialogénicas se basa en el hecho de que las células T pueden reconocer un epítope de antígeno específico presentado por células extrañas que presentan antígeno (APC), siempre que las APC expresen la molécula MHC, clases I ó II, a las cuales la población de células T específicas que muestran respuesta está restringida, junto con el epítope de antígeno reconocido por las células T. De esta manera, una población semialogénica de células T que puede reconocer por lo menos un producto alélico de las moléculas MHC del sujeto, preferiblemente una HLA-DR o una HLA-DQ u otra molécula HLA, y que sea específica para un epítope de antígeno asociado al SN, será capaz de reconocer al antígeno del SN en el área de daño del SN del sujeto, y producirá el efecto neuroprotector necesario. Existe poco o ningún polimorfismo en las moléculas de adhesión, moléculas de migración de leucocitos y moléculas accesorias necesarias para que las células T migren hacia el área de daño, se acumulen ahí y sufran activación. De esta manera, las células T semialogénicas serán capaces de migrar y acumularse en el sitio del SNC que necesita de neuroprotección, y serán activadas para producir el efecto deseado. 5 Se sabe que las células T semialogénicas serán rechazadas por el sistema inmune del sujeto, pero que dicho rechazo requiere aproximadamente dos semanas en desarrollarse. Por consiguiente, las células T semialogénicas tendrán una ventana de oportunidad de dos semanas necesaria para ejercer neuroprotección. Después de dos semanas, las células T semialogénicas serán rechazadas del cuerpo del sujeto, pero ese rechazo es ventajoso para el sujeto, puesto que librará al sujeto de las células T extrañas y prevendrá cualquier consecuencia adversa de las células T activadas. Las células T semialogénicas proveen de esta manera un factor de seguridad importante, y son una modalidad preferida. 15 Se sabe que un número relativamente pequeño de moléculas HLA cl?se II es compartido por la mayoría de los individuos en una población. Por ejemplo, aproximadamente 50% de la población judía expresa el gen HLA-DR5. De esta manera, un banco de células T específicas reactivas a los epítopes de antígeno del SN que son restringidas a HLA-DR5, sería útil en el 50% de esa población. La población completa puede ser cubierta esencialmente por un pequeño número de líneas de células T adicionales restringidas a otras cuantas moléculas HLA prevalentes, tales como DR1 , DR4, DR2, etc. De esta manera, se puede preparar y almacenar un banco funcional de líneas de células T uniformes para su uso inmediato en casi cualquier individuo en una población dada. Dicho banco de células T superaría cualquier problema técnico para obtener un número suficiente de células T específicas del sujeto que necesita neuroprotección durante la ventana abierta de oportunidad del tratamiento. Las células T semialogénicas serán rechazadas con seguridad después de lograr su función de neuroprotección. Este aspecto de la presente invención no es opuesto, y se suma al uso de las células T autólogas como se describe en la presente. Las células T activadas específicas del SN son preferiblemente no atenuadas, aunque se pueden usar células T activadas atenuadas específicas del SN. Las células pueden ser atenuadas usando métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, irradiación gamma, por ejemplo, 1.5-10.0 Rads (Ben-Nun, A., Wekerle, H. y Cohén, I. R., Nature 292:60-61 (1981); Ben-Nun, A. y Cohén, I. R., J. Inmunol. 129:303-308 (1982)); y/o mediante tratamiento con presión, por ejemplo, como se describe en la patente fr E.U.A. No. 4,996,194 (Cohén et al.); y/o mediante entrelazamiento químico con un agente tal como formaldehído, glutaraldehído y similares, por ejemplo, como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,996,194 (Cohén et al.); y/o mediante entrelazamiento y fotoactivación con luz con un compuesto de psoraleno fotoactivable, por ejemplo, como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,114,721 (Cohén et al.); y/o mediante un agente de disolución del citoesqueleto, tal como citocalasina y colchicina, por ejemplo, como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,996,194 (Cohén et al.). En una modalidad preferida, las células T activadas específicas del SN se aislan como se describe a continuación. Las células T pueden ser aisladas y purificadas de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (Mor y Cohén, 1995, J. Immunol. 155: 3693-3699). Para un ejemplo ilustrativo, véase la sección 6.1. Células T circulantes de un sujeto que reconocen la proteína básica de mielina u otro antígeno del SN, tal como la prateína precursora amiloide, son aisladas y expandidas usando procedimientos conocidos. Para obtener células T activadas específicas del SN, las células T son aisladas y las ATCs específicas del SN son entonces expandidas mediante un procedimiento conocido (Burns et al., Cell Immunol. 81 : 435, 1983; Pette et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7968, 1990; Mortin et al.., J. Immunol. 145: 540, 1990; Schluesener et al., J. Immunol. 135: 3128, 1985; Suruhan-Dires Keneli et al., Euro. J. Immunol. 23: 530, 1993, citas que se incorporan en su totalidad en la presente como referencia). Las células T rieladas pueden ser activadas exponiendo las células a uno o más de una variedad de antígenos o epítopes naturales o sintéticos específicos del SN incluyendo, pero no limitados a, proteína básica de mielina (MBP), glucoprotelna de oligodendro tos/mielina (MOG), proteolípidos (PLP), glucoproteína asociada a mielina (MAG), S-100, ß-amiloide, Thy-1 , P0, P2 y receptores de neurotransmisores. En una modalidad preferida, las células T aisladas son activadas por uno o más epítopes crípticos incluyendo, pero no limitados a, los siguientes péptidos de MBP: p11- , p51-70, p91-110, p131-150 y p-151-170. Durante la activación de las células T ex vivo, las células T pueden ser activadas cultivándolas en un medio al cual se ha añadido por lo menos un factor promotor del crecimiento adecuado. Los factores promotores del crecimiento adecuados para este propósito incluyen, sin limitación, citocinas, por ejemplo, factor de necrosis tumoral a (FNT-a), interleucina 2 (IL-2) e interleucina 4 (IL-4). En una modalidad, las células T activadas producen endógenamente una sustancia que aminora los efectos de lesión o enfermedad en el SN. En otra modalidad, las células T activadas producen endógenamente una sustancia que estimula a otras células incluyendo, pero no limitada a, factor ß transformante del crecimiento (TGF-ß), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico 3 (NT-3), factor neurotrófico 4/5 (NT-4/5), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); ¡nterferón-? (IFN-?) e interleucina-6 (IL-6), en donde las otras células, directa o indirectamente, aminoran los efectos de lesión o enfermedad. Después de su proliferación in vitro, las células T son administradas a un sujeto mamífero. En una modalidad, las células T son administradas a un sujeto humano. La expansión de células T se lleva a cabo de preferencia usando péptidos que corresponden a secuencias en una proteína propia no patogénica específica del SN. Un sujeto puede ser inmunizado inicialmente con un antígeno especifico del SN usando un péptido no patogénico de la proteína propia. Se puede obtener una preparación de células T de la sangre de dichos sujetos inmunizados, de preferencia de células T seleccionadas por su carácter específico hacia el antígeno específico del SN. Las células T seleccionadas pueden ser estimuladas entonces para que produzcan una línea de células T específica para el antígeno propio (Ben-Nun et al., J. Immunol. 129: 303, 1982). El antígeno específico del SN puede ser un antígeno purificado o una preparación cruda del SN, como se describirá más adelante. Las células T activadas con antígeno especifico del SN, obtenidas como se describió anteriormente, se pueden usar de inmediato, o se pueden preservar para su uso posterior, por ejemplo, mediante criopreservación, como se describe más adelante. Las células T activadas específicas del SN se pueden obtener también usando células T previamente criopreservadas, es decir, después de descongelar las células, las células T pueden ser incubadas con antígeno específico del SN, óptimamente junto con timrcitos, para obtener una preparación de ATCs específicas del SN. Como será evidente para los expertos en la técnica, las células T pueden ser preservadas, por ejemplo, mediante criopreservación, antes o después de su cultivo. Los agentes de criopreservación que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a, sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Lovelock y Bishop, Nature 183: 1394-1395, 1959; Ashwood-Smith, Nature 190: 1204-1205, 1961 ), glicerol, polivinilpirrolidona (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85: 576, 1960) polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature 196: 548, 1962), albúmina, dextran, sacarosa, etilenglicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol (Rowe et al., Fed. Proc. 21 : 157, 1962), D-sorbitol, i-inositol, D-lactosa, cloruro de colina (Bender et al., ___ Appl. Phvsiol. 15: 520, 1960), aminoácidos (Phan The Tran y Bender, Exp. Cell Res. 20: 651. 1960), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, Biochem. J. 56: 265, 1954), sales inorgánicas (Phan The Tran y Bender, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104: 388, 1960; Phan The Tran y Bender, 1961 , en Radiobioloav. Proceedinqs of the Third Australian Conference on Radiobioloqy, llbery, P.L.T., ed., Butterworth, Londres, página 59) y DMSO combinado con hidroxietil almidón y albúmina de suero humano (Zaroulis y Leiderman, Crvobioloqy 17: 311-317, 1980). Una velocidad de enfriamiento controlada es crítica. Diferentes agentes crioprotectores (Rapatz et al., Crvobioloqy 5(1 ): 18-25, 1968) y diferentes tipos de células tienen diferentes velocidades de enfriamiento óptimas. Véase, por ejemplo, Rowe y Rinfret, Blood 20: 636 (1962); Rowe, Crvobioloqy 3(1 ): 12-18 (1996); Lewis et al., Transfusión 7(1 ): 17-32 (1967); y Mazur, Science 168: 939-949 (1970) para efectos de la velocidad de enfriamiento sobre la sobrevivencia de células y sobre su potencial de transplante. El calor de la fase de fusión, en donde el agua se convierte en hielo, debe ser mínimo. El procedimiento de enfriamiento se puede llevar a cabo mediante el uso, por ejemplo, de un dispositivo de congelación programable o un procedimiento de baño de metanol.

Los aparatos de congelación programables permiten la determinación de velocidades de enfriamiento óptimas, y facilitan el enfriamiento reproducible estándar. Los congeladores programables de velocidad controlada tales como Cryomed o Planar permiten ajustar el régimen de congelación a la curva deseada de velocidad de enfriamiento. Después de la congelación, las células pueden ser transferidas rápidamente a un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo. En una modalidad, las muestras pueden ser almacenadas criogénicamente en congeladores mecánicos, tales como congeladores que mantienen una temperatura de aproximadamente -80°C a aproximadamente -20°C. En una modalidad preferida, las muestras pueden ser almacenadas criogénicamente en nitrógeno líquido (-196°C) o su vapor. Dicho almacenamiento es facilitado en gran medida por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno líquido altamente eficientes, los cuales asemejan grandes contenedores Thermos con un vacío extremadamente bajo y super aislamiento interno, de modo que las fugas de calor y las pérdidas de nitrógeno se mantienen hasta un pvnimo absoluto. Consideraciones y procedimientos para la manipulación, criopreservación y almacenamiento a largo plazo de células T, se pueden encontrar, por ejemplo, en las siguientes referencias, incorporadas en la presente como referencia: Gorin, Clinics in Haematoloqy 15 (1 ):19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation. Culture and Transplantation, Proceedinos of a Panel. Moscú. Julio 22-26. 1968.. International Atomic Energy Agency, Viena, pp. 107-186. Otros métodos de criopreservación de células viables, o modificaciones de los mismos, están disponibles y concebidos para su uso, por ejemplo, técnicas de espejo de metal en frío. Véase Livesey y Linner, Nature 327:255 (1987); Linner et al., J. Histochem, Cytochem. 34 (9):1123-1135 (1986); véase también la patente de E.U.A. No. 4,199,022 por Senken et al., patente de E.U.A. No. 3,753,357 por Schwartz, y patente de E.U.A. No. 4,559,298 por Fahy. De preferencia, las células congeladas son descongeladas rápidamente (por ejemplo, en un baño de agua mantenido a 37-47°C) y enfriadas inmediatamente después de descongelaras. Puede ser deseable tratar las células para evitar la agrupación celular después del deshielo. Para evitar la agrupación, se pueden usar varios procedimientos incluyendo, pero no limitados a, la adición antes o después de la congelación de ADNasa (Spitzer et al., Cáncer 45:3075-3085, 1980), dextran de bajo peso molecular y citrato, hidroxietil almidón (Stiff et al., Cryobiology 20:17-24, 1983), o dextrosa de citrato ácido (Zaroulis y Leiderman, Crvobioloqy 17:311-317, 1980), etc. El agente crioprotector, si es tóxico en humanos, debe ser removido antes del uso terapéutico de las células T descongeladas. Una forma de remover el agente crioprotector es mediante dilución hasta una concentración insignificante. Una vez que las células T congeladas han sido descongeladas y recuperadas, se usan para promover la regeneración neuronal como se describe en la presente con respecto a células T no congeladas. Una vez descongeladas, las células T se pueden usar de inmediato, suponiendo que fueron activadas antes de la congelación. Sin embargo, de preferencia, las células descongeladas son cultivadas antes de la inyección al paciente para eliminar células no viables. Además, en el curso de este cultivo durante un período de aproximadamente uno a tres días, se puede añadir un agente de activación apropiado para activar a las células, si las células congeladas fueron células T en reposo, o para ayudar a las células a alcanzar una velocidad de activación mayor si fueron activadas antes de la congelación. Usualmente, hay tiempo par permitir dicho paso de cultivo antes de la administración, ya que las células T pueden ser administradas hasta una semana después de la lesión, y posiblemente después de más tiempo, y mantienen aún su efecto neuroregenerativo y neuroprotector. .2 Antíqenos específicos del SN v péptidos derivados de los mismos Se pueden usar composiciones farmacéuticas que comprenden un antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo o derivado del mismo, para prevenir o inhibir los efectos de lesión o enfermedad que resultan en degeneración del SN, o para promover la regeneración nerviosa en el SN, particularmente en SNC. Además, se pueden usar antígenos específicos del SN o péptidos derivados de los mismos o derivados de los mismos para la activación de células T in vivo o in vitro. En una modalidad, el antígeno específico del SN es un antígeno aislado o purificado. En otra modalidad, los métodos para promover la regeneración nerviosa o para prevenir o inhibir los efectos de lesión o enfermedad del SNC o SNP, comprenden administrar un antígeno específico del SN o un péptido derivado del mismo o derivado del mismo a un mamífero, en donde el antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo o derivado del mismo, activa a células T in vivo pata producir una población de células T que se acumulan en un sitio de lesión o enfermedad del SNC o SNP. El antígeno específico del SN puede ser un antígeno obtenido de tejido del SN, de preferencia de tejido en un sitio de lesión o enfermedad del SNC. El antígeno específico del SN puede ser aislado y purificado mediante métodos estándar, incluyendo cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio ¡ónico, afinidad y de columna por dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de antígenos. Las propiedades funcionales se pueden evaluar usando cualquier prueba adecuada. En la práctica de la invención, los antígenos o epítopes naturales o sintéticos específicos del SN incluyen, pero no están limitados a, MBF, MOG, PLP, MAG, S-100, ß-amiloide, Thy-1 , PO, P2 y un receptor de neurotransmisores. Ejemplos ilustrativos específicos de antígenos útiles específicos del SN incluyen, pero no están limitados a, MBP de humano, mostrada en la fig. 21 (SEQ ID NO:12); proteolípido de humano, mostrado en la fig. 22 (SEQ ID NO: 13); y glucoproteína de oligodendrocitos de humano, mostrada en la fig. 23 (SEQ ID NO: 14). En una modalidad preferida, los péptidos de antígenos propios específicos del SN o derivados de antígenos específicos del SN activan a células T, pero no inducen una respuesta autoinmune. Un ejemplo de dicho péptido es un péptido que comprende los aminoácidos 51-70 de la proteína básica de mielina (residuos 51-70 de SEQ ID NO: 12). Además, un antígeno del SN puede ser una preparación cruda de tejido del SN, por ejemplo, derivada de tejido del SN obtenida del SN de mamífero. Dicha preparación puede incluir células, células vivas o muertas, fracciones de membrana de dichas células o tejido, etc. Un antígeno específico del SNC se puede obtener mediante una biopsia o necropsia del SN de un mamífero incluyendo, pero no limitado a, de un sito de lesión del SNC; de cadáveres; o de líneas de células desarrolladas en cultivo. Además, un antígeno específico del SN puede ser una proteína obtenida mediante ingeniería genética, sintetizada químicamente, etc. Además de antígenos específicos del SN, la invención se refiere también a péptidos derivados de antígenos específicos del SN o derivados que incluyen derivados químicos y análogos de antígenos específicos del SN los cuales son funcionalmente activos, es decir, son capaces de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con un antígeno específico del SN de longitud total. Dichas actividades funcionales incluyen, pero no están limitadas a, antigenicidad (capacidad para unirse (o de competir con un antígeno del SN por unión) a un anti- anticuerpo específico del SN), inmunogenicidad (capacidad para generar anticuerpos, que se unen a una proteína específica del SN) y capacidad para interactuar con células T, dando como resultado una activación comparable a la obtenida usando el antígeno correspondiente de longitud total. La prueba crucial es que el antígeno que se usa para activar a las células T, hace que las células T sean capaces de reconocer a un antígeno en el SN del mamífero (paciente) que está siendo tratado. Un péptido derivado de un antígeno específico del SNC o específico de SNP tiene de preferencia una secuencia que está comprendida dentro de la secuencia de antígeno y es: (1 ) un péptido ¡nmunógeno, es decir, un péptido que puede inducir una respuesta de células T de humano detectada mediante proliferación de células T o mediante citosina (por ejemplo, interferón (IFN-?, producción de interleucina (IL)-2, IL-4 o IL-10, o (2) un "epítope críptico" (designado también en ia presente como epítope "inmunosilencioso" o "inmunodominante"), es decir, un péptido que puede inducir por sí mismo una respuesta inmune de células T que no es inducida por la proteína de antígeno intacta (véase Moalem et al., Nature Med. 5(1 ), 1999). Los epítopes crípticos para su uso en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, péptidos de la secuencia de proteína básica de mielina: péptidos p11-30, p51-70, p91-110, p131-150 y p151-170. Es posible identificar otros péptidos por su capacidad para inducir una respuesta de células T de humano detectada mediante proliferación de células T o mediante producción de citosina (por ejemplo, IFN-?, IL-2, IL-4 o IL-10).

Dichos epítopes crípticos son particularmente preferidos, puesto que las células T activadas se acumularán de esta manera en el sitio de lesión, de acuerdo con la presente invención, pero exhiben autoinmunidad particularmente débil. De esta manera, se esperaría que tengan menos efectos secundarios. En una modalidad específica de la invención, se proveen péptidos que consisten de, o que comprenden, un fragmento de un antígeno específico del SN que consiste de por lo menos 10 aminoácidos (contiguos) del antígeno específico del SN. En otras modalidades, el fragmento consiste de por lo menos 20 aminoácidos contiguos o 50 aminoácidos contiguos del antígeno específico del SN. Los derivados de un antígeno específico del SN incluyen también, pero no están limitados a, aquellas moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homologas al antígeno de longitud total o fragmentos del mismo (por ejemplo, en varias modalidades, por lo menos 60% o 70% u 80% o 90% o 95% de identidad sobre una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico, o cuando se compara con una secuencia alineada en la cual la alineación se hace mediante un programa de homología en computadora conocido en la técnica), o cuyo ácido nucleico de codificación es capaz de hibridar con una secuencia de nucleótidos de codificación del antígeno de longitud total específico del SN, bajo condiciones de alta severidad, severidad moderada o baja severidad. Los programas de computadora para determinar la homología pueden incluir, pero no están limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-8, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3): 40310, 1990; Thompson, et al., Nucleic Acids Res. 22(22): 4673-80, 1994; Higgins, et al., Methods Enzvmol 266:383-402, 1996; Altschul, et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990). Los derivados de antígeno específicos del SN de la invención se pueden producir mediante varios métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que resultan en su producción se pueden llevar a cabo al nivel de gen o proteína. Por ejemplo, una secuencia de gen clonado puede ser modificada mediante cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloninq, A Laboratorv Manual, 2a ed.. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). La secuencia puede ser cortada en sitios apropiados con endonucleasas de restricción, seguido de modificación enzimática adicional si así se desea, aislada y ligada in vitro. Además, la secuencia de ácido nucleico de codificación puede ser mutada in vitro o in vivo, pata crear y/o destruir secuencias de traducción, inicio y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones de codificación y/o formar nuevos sitios de endonucleasas de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar la modificación adicional in vitro. Se puede usar cualquier técnica para mutagénesis conocida en la materia incluyendo, pero no limitada a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida a sitio in vitro (Hutchinson, C, et al., J. Biol. Chem 253:6551 , 1978), etc.

También se pueden hacer manipulaciones a nivel de proteína. Incluidos dentro del alcance de la invención son derivados los cuales son modificados diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación o derivación mediante grupos protectores/blorqueadores, corte proteolítico, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas que incluyen, pero no están limitadas a, corte químico específico mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, V8 proteasa, NaBH ; acetilación, formilación, oxidación o reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc. Además, se pueden sintetizar químicamente derivados de un antígeno específico de SN. Por ejemplo, se puede sintetizar un péptido que corresponda a una porción de un antígeno que comprenda el dominio deseado, o el cual medie la actividad deseada mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Xdemás, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en la secuencia de aminoácidos. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no están limitados a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido a-aminoisobutírico; ácido 4-aminobutírico, Abu; ácido 2-aminobutírico, ?-Abu; e-Ahx, ácido 6-aminohexanoico; Aib, ácido 2-aminoisobutírico; ácido 3-aminopropiónico; ornitina; norleucina; norvalina; hidroxiprolina; sarcosina; citrulina; ácido cisteico; t-butilglicina; t-butilalanina, fenilglicina; ciclohexilalanina; ß-alanina; fluoro aminoácidos; aminoácidos diseñados tales como ß-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro). La actividad funcional de antígenos específicos del SN y péptidos derivados de los mismos y derivados de los mismos, se puede poner a prueba mediante varios métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, pruebas de proliferación de células T (Mor y Cohén, J. Immunol. 155:3693-3699, 1995). Un antígeno especifico del SN o péptido derivado del mismo o derivado del mismo puede ser mantenido en solución, o puede ser provisto en forma seca, por ejemplo, como un polvo o liofilizado, que será mezclado con una solución apropiada antes de su uso. .3 Secuencias de nucleótidos que codifican para antíqenos del SN, y péptidos derivados de los mismos Se pueden usar composiciones que comprendan una secuencia de nucleótidos que codifica para un antígeno específico del SN o péptido derivado del mismo para prevenir o inhibir los efectos de lesión o enfermedad que resultan en degeneración de SNC o SNP o para promover la regeneración nerviosa en el SNC o SNP. Ejemplos ilustrativos específicos de secuencias de nucleótidos útiles que codifican para antígenos específicos del SN o péptidos derivados de un antígeno específico del SN incluyen, pero no están limitados a, secuencias de nucleótidos que codifican para péptidos de proteína básica de mielina (MBP) de rata, como se muestra en la fig. 15 (SEQ ID NO: 1 ); MBP de humano, mostrada en la fig. 16 (SEQ ID NO: 2); PLP de mielina de humano, mostrada en la fig. 17 (A-F) (SEQ ID Nos: 3-8); MOG de humano, mostrada en la fig. 18 (SEQ ID NO: 9); PLP de rata y variante, mostradas en la fig. 19 (SEQ ID NO: 10); y MAG de rata, mostrada en la fig. 20 (SEQ ID NO: 11 ). .4 Usos terapéuticos Las composiciones descritas en las secciones 5.1 a 5.3 se pueden usar para promover la regeneración nerviosa, o para prevenir o inhibir la degeneración secundaria que de otra manera puede ser consecutiva a lesión primaria del SN, por ejemplo, trauma brusco, trauma penetrante, apoplejía hemorrágica, apoplejía isquémica o daños causados por cirugía, tal como extirpación de tumores. Además, dichas composiciones se pueden usar para aminorar los efectos de enfermedades q?/3 resultan en un proceso degenerativo, por ejemplo, degeneración que ocurre en la materia gris o blanca (o ambas) como resultado de varias enfermedades o trastornos que incluyen, sin limitación: neuropatía diabética, demencia fenil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (parálisis de Bell), glaucoma, corea de Huntington, esclerosis amiotrófica lateral (ALS), neuropatía óptica no arterítica, hernia de disco intervertebral, deficiencia de vitaminas, enfermedades por priones tal como enfermedad de Creutzfeldt- ^g^^^^gg Jakob, síndrome de túnel carpal, neuropatías periféricas asociadas con varias enfermedades que incluyen, pero no están limitadas a, uremia, porfiria, hipoglicemia, síndrome de Sjorgren Larsson, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, cirrosis biliar, amiloidosis primaria, enfermedades pulmonares obstructivas, acromegalia, síndromes de mala absorción, policitemia vera, gamapatías de IgA e IgG, complicaciones por varios fármacos (por ejemplo, metronidazol) y toxinas (por ejemplo, alcohol u organofosfatos), enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia telangectasia, ataxia de Friedreich, polineuropatías amiloides, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, enfermedad de Refsum, enfermedad de Fabry, lipoproteinemia, etc. En una modalidad preferida, las células T activadas específicas del SN, los antígenos específicos del SN, péptidos derivados de los mismos, derivados de los mismos, o los nucleótidos que codifican para dichos antígenos, o péptidos o cualquier combinación de los mismos de la presente invención, se usan para tratar enfermedades o trastornos en donde está indicada la promoción de la regeneración nerviosa o la prevención o inhibición de la degeneración neural secundaria, que no sean enfermedades autoinmunes o neoplasias. En una modalidad preferida, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto humano. Aunque se pudieron haber usado células T activadas específicas del SN en la técnica anterior en el curso del tratamiento para desarrollar tolerancia a antígenos autoinmunes en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, o en el curso de inmunoterapia en el tratamiento de neoplasmas del SN, la presente invención se puede usar también para aminorar el proceso degenerativo causado por enfermedades autoinmunes o neoplasmas, en tanto sea usada en una forma no sugerida por los métodos de la técnica anterior. De esta manera, por ejemplo, se ha sugerido el uso de células T activadas por un antígeno autoinmune para crear tolerancia al antígeno autoinmune y, de esta manera, aminorar la enfermedad autoinmune. Dicho tratamiento, sin embargo, no habría sugerido el uso de células T dirigidas hacia otros antígenos del SN o antígenos del SN que no inducirán tolerancia al antígeno autoinmune, o células T que son administradas de tal forma para evitar la creación de tolerancia. Del mismo modo, para neoplasmas, se pueden obtener los efectos de la presente invención sin usar procesos de inmunoterapia sugeridos en la técnica anterior, por ejemplo, mediante el uso de un antígeno del SN el cual no aparece en el neoplasma. Las células T activadas con dicho antígeno se acumularán aún en el sitio de degeneración neural, y facilitarán la inhibición de esta degeneración, aún cuando no •sirvan como inmunoterapia para el tumor per se. .5 Formulaciones v administración Las composiciones farmacéuticas para su uso de conformidad con la presente invención se pueden formular en una forma convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. El vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición, y no perjudicial para quien lo recibe. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual el agente terapéutico es administrado. Los vehículos en la composición farmacéutica pueden comprender un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona (polividona o povidona), goma de tragacanto, gelatina, almidón, lactosa o lactosa monohidratada; un agente de desintegración tal como ácido algínico, almidón de maíz y similares; un lubricante o agente tensioactivo tal como estearato de magnesio o lauril sulfato de sodio; un glidante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; y/o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja. Los métodos de administración incluyen, pero no están limitados a, vías parenteral, por ejemplo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucosa (por ejemplo, oral, intranasal, bucal, vaginal, rectal, infraocular), intratecal, tópica e intradérmica. La administración puede ser sistémica o local. Para administración oral, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o se puede presentar como un producto de fármaco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles a>--»---J?a- .. hidrogenadas); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma, por ejemplo, de tabletas o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Las tabletas pueden ser recubiertas mediante métodos bien conocidos en la materia. Las preparaciones para administración oral pueden ser formuladas adecuadamente para dar la liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas en forma convencional. Las composiciones se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de dosis múltiples, con un conservador añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. En forma alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Las composiciones se pueden formular también en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases de supositorio convencionales tales como mantequilla de cacao u otro glicéridos. Para administración mediante inhalación, las composiciones para su uso de conformidad con la presente invención son suministradas convenientemente en forma de una presentación de rocío en aerosol, a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede estar determinada proveyendo una válvula para suministrar una cantidad medida. Cápsulas y cartuchos, por ejemplo de gelatina, para usarse en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base en polvo como lactosa o almidón. En una modalidad que se prefiere, las composiciones que comprenden células T activadas específicas de SN, un antígeno específico de SN o péptido derivado del mismo, o un derivado del mismo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para tal antígeno o péptido, se formula de conformidad con procedimientos de rutina como composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración intravenosa o ¡ntraperitoneal en seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un regulador de pH acuoso ¡sotónico estéril. Cuando es necesario, la composición además puede incluir un agente solubilizador y un anestésico local como lignocaína para disminuir el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, se proveen los ingredientes ya sea por separado o mezclados. Cuando la composición se administrara por infusión puede suministrarse con una botella de infusión que contenga agua con grado farmacéutico estéril o solución salina. Cuando la composición se administra por inyección, una ampula de agua estéril o solución salina para inyección puede proveerse de manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas que comprenden antígeno específico de SN o péptido derivado del mismo o un derivado del mismo opcionalmente pueden administrarse con un auxiliar, como un auxiliar incompleto de Freund. La invención también provee un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención.

En una modalidad que se prefiere, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente un humano, poco tiempo después de la lesión o detección de una lesión degenerativa en el sistema nervioso. Los métodos terapéuticos de la invención pueden comprender la administración de una célula de activada específica de SN o un antígeno específico de SN o péptido derivado del mismo o derivado del mismo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para tal antígeno o péptido, o cualquier combinación de los mismos. Cuando se usa terapia de combinación, el antígeno específico de SN puede administrarse antes, de manera concurrente o después de la administración de las células T activadas específicas de SN, un péptido derivado de un antígeno específico de SN o derivado del mismo o una secuencia de nucleótidos que codifica para tal antígeno o péptido. En una modalidad, las composiciones de la invención se administran en combinación con uno o más de los siguientes (a) fagocitos mononucleares, preferiblemente monocitos cultivados (como se describe en la publicación de PCT No. WO 97/09985, que se incorpora a la presente por referencia por completo), que se han estimulado para mejorar su capacidad para promover la regeneración neuronal; (b) un factor neurotrófico como un factor ácido de crecimiento de fibroblastos ácido; y (c) una sustancia terapéutica antiinflamatoria (es decir, un esteroide antiinflamatorio, como dexametasona o metilprednisolona, o un péptido antiinflamatorio no esteroide, como Thr-Lys-Pro (TKP)).

En otra modalidad, las células fagocíticas mononucleares de conformidad con la publicación de PCT No. WO 97/09985 y la solicitud de patente de E.U.A. con número de serie 09/041 ,280, presentada el 11 de marzo de 1998, se inyectan en el sitio de la lesión o daño dentro del sistema nervioso central, ya sea de manera concurrente, antes, o después de la administración parenteral de células T activadas específicas de SN, un antígeno específico de SN o péptido derivado del mismo o derivado del mismo, o secuencia de nucleótidos que codifican para tal antígeno o péptido. En otra modalidad, la adm'-istración de células T activadas específicas de SN, secuencia de antígeno o péptido específico de SN que codifica para tal antígeno o péptido, puede administrarse como una sola dosis o puede repetirse, preferiblemente en intervalos de dos semanas y posteriormente en intervalos cada vez mayores una vez al mes, una vez cada trimestre, una vez cada seis meses, etc. El curso del tratamiento puede durar varios meses, varios años u ocasionalmente durante el tiempo de vida del individuo, dependiendo de la condición o enfermedad tratada. En el caso de una lesión del sistema nervioso central, el tratamiento puede variar entre diversos días a meses o incluso años, hasta que la condición se haya estabilizado y no exista riesgo alguno, o en su caso un riesgo limitado, de desarrollar una degeneración secundaria. En una enfermedad humana crónica o enfermedad de Parkinson, el tratamiento terapéutico de conformidad con la invención puede ser de por vida. Como será evidente para los expertos en la técnica, el efecto terapéutico depende algunas veces de la condición o enfermedad a tratar, de la edad del individuo y la condición de su salud, de otros parámetros físicos (por ejemplo género, peso, etc.) del individuo, así como de diversos factores, por ejemplo, si el individuo toma otros fármacos, etc. La dosis óptima de las composiciones terapéuticas que comprenden células T activadas específicas de SN de la invención es proporcional al número de fibras nerviosas afectadas por la lesión o enfermedad del sistema nervioso en el lugar que será tratado. En una modalidad que se prefiere, la dosis varía de cerca de 5 x 106 a cerca de 107 para tratar una lesión que afecta cerca de 105 fibras nerviosas, como una transección completa de un nervio óptico de rata, y varía de cerca de 107 a cerca de 108 para tratar una lesión que afecta aproximadamente 10ß -107 fibras nerviosas, como una transección completa de un nervio óptico humano. Como será evidente para los expertos en la técnica, la dosis de células T puede aumentar o disminuir en proporción al número de fibras nerviosas afectadas en la lf sión o sitio de la lesión que se tratará. .6 Establecimiento de bancos de células autóloqas para linfocitos T Para minimizar el daño secundario después de una lesión nerviosa, los pacientes pueden ser tratados mediante la administración de linfocitos T semi alogénicos o autólogos sensibilizados en por lo menos un antígeno adecuado de SN. Como aún no se define de manera precisa la ventana de oportunidad, la terapia debe administrarse tan pronto como sea posible después del daño primario para maximizar las oportunidades de buen éxito, preferiblemente dentro de una semana. Para enlazar el intervalo entre el tiempo que se requiere para la activación y el tiempo necesario para el tratamiento, puede establecerse un banco con reservas personales de linfocitos T autólogos preparados para uso futuro para la terapia neuroprotectora contra la degeneración secundaria en caso de lesión del sistema nervioso. Los linfocitos T se aislan de la sangre y posteriormente se sensibilizan a un antígeno del sistema nervioso. Entonces las células se congelan y se almacenan adecuadamente bajo el nombre de la persona, número de identificación, grupo sanguíneo, en un banco de células hasta que sea necesario. Adicionalmente, las células madre autólogas del SNC pueden procesarse y almacenarse para un uso potencial por un paciente individual en el caso de trastornos traumáticos del sistema nervioso como isquemia o daño mecánico, así como para condiciones neurodegenerativas tratadas como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson. De manera alternativa, las células T semi alogénicas o alogénicas pueden almacenarse congeladas en bancos por cualquier individuo que comparta una molécula MHC tipo II con la fuente de las células T. Los siguientes ejemplos ilustran ciertas características de la presente invención pero no tienen la intención de limitar el alcance de la presente.

EJEMPLOS Acumulación de células T activadas en el nervio óptico dañado 6.1 Materiales y métodos 6.1.1 Animales Ratas hembras de Lewis fueron proporcionadas por Animal Breeding Center de Weizmann Institute of Science (Rehovot, IL), se clasificaron por edad (de 8 a 12 semanas) y se alojaron cuatro por jaula en una habitación con temperatura y luz controlada. 6.1.2 Medio El medio de proliferación de células T contenía lo siguiente: medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Biological 15 Industries, Israel) complementado con 2mM L-glutamina (L-Glu, Sigma, E.U.A.), 5 x 10"5 M 2-mercaptoetanol (2-ME, Sigma\ penicilina (100 Ul/ml; Biological Industries), estreptomicina (100 µ/ml; Biological Industries), piruvato de sodio (1 mM; Biological Industries), aminoácidos no esenciales (1 ml/100 ml; Biological Industries) y suero de rata autólogo al 1 % (vol/vol) (Mor et al., Clin. Invest. 85: 1594, 1990). El medio de propagación contenía: DMEM, 2-ME, L-Glu, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y antibióticos en la misma concentración que se indicó anteriormente con la adición de suero fetal de ternera (FCS) al 10%, y un factor de crecimiento de células T (TCGF) al 10% obtenido del supernadante de células de baso estimuladas con concanavalina A (Mor et al., supra, 1990). 6.1.3 Antiqenos Proteína básica de mielina (MBP) de la médula espinal de conejillos de India se preparó como se describió (Hirshfeld, et al., FEBS Lett. 7: 317, 1970). Se adquirió ovoalbúmina de Sigma (St. Louis, Missouri). El p51-70 de la isoforma 18.5 kDa de rata de MBP (secuencia: APKRGSGKDSHTRTTHYG) (SEQ ID NO: 15) y el péptido p277 del hsp60 humano (secuencia: VLGGGCALLRCPALDSLTPANED) (SEQ ID NO: 16) (Elias et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 3088-3091 , 1991 ) se sintetizaron usando la técnica de 9-fluoronilmetoxicarbon?lo con un sintetizador de péptidos múltiple automático (AMS 422, ABIMED, Langenfeld, Alemania). La pureza de los péptidos se analizó mediante HPLC y composición de aminoácido. 6. .4 Líneas de células T Las líneas de células T se generaron a partir del drenado de células de nodos linfáticos obtenidas de ratas de Lewis inmunizadas con un antígeno (descrito anteriormente en la sección 6.1.3). El antígeno se disolvió en PBS (1 mg/ml) y se emulsificó con un volumen igual de un auxiliar de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) se complementó con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (Difco 15 Laboratories, Detroit, Michigan). La emulsión (0.1 ml) se inyectó en los cojinetes de las patas traseras de las ratas. Diez días después el antígeno se inyectó, las ratas fueron sacrificadas y los nodos linfáticos drenantes se removieron quirúrgicamente y se disociaron. Las células se lavaron y se activaron con el antígeno (10 µg/ml) en un medio de proliferación (descrito anteriormente en la sección 6.1.2). Después de la incubación durante 72 horas a 37°C, 90% de humedad relativa y 7% de C02, las células se transfieran al medio de propagación (descrito anteriormente en la sección 6.1.2). Las células crecieron en el medio de propagación durante 4 a 10 días antes de volver a exponerse al antígeno (10 µg/ml) en presencia de células de timo irradiadas (2000 rojo) (107 células/ml) en el medio de proliferación. Las líneas de célula T se expandieron mediante reexposición repetida y propagación. 6.1.5 Lesión por aplastamiento del nervio óptico de la rata Se realizó una lesión por aplastamiento del nervio óptico como se describió anteriormente (Duvdevani et al., Neurol. Neurosci. 2: 31-38, 1990). Brevemente, las ratas se anestesiaron profundamente mediante inyección intraperitoneal de Rompun (xilazina, 10 mg/kg; Vitamed, Israel) y Vetaler (Ketamina, 50 mg/kg; Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, lowa). Usando un microscopio de operación binocular, se realizó una cantotomía lateral en el ojo derecho y se hizo una incisión lateral en la conjuntiva a la cornea. Después de la separación de los músculos bulboretractores, el nervio óptico se expuso intraorbitalmente por disección despuntada. Usando fórceps de acción cruzada calibrada, se realizó una lesión por aplastamiento en el nervio óptico, 2 mm desde el ojo (Duvdevani et al., Instructure Neuroloov and Neurosciencie 2:31 , 1990) El nervio contralateral se dejó sin daño y se usó como control. 6.1.6 Inmunocitoquímica de células T Secciones longitudinales en el nervio crióstato (20 µm de espesor) se tomaron en portaobjetos de vidrio con gelatina y se congelaron hasta la preparación para una tinción fluorescente. Las secciones se descongelaron y se fijaron en etanol durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con agua destilada dos veces (ddH2?), y se Incubaron durante 3 minutos en PBS conteniendo 0.05% de monolaurato polioxietilen-sorbitano (Tween-20; Sigma, EUA). Entonces se incubaron las secciones durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra el receptor de células T (TCR) de rata (1 :100, Hunig et al., J. Exp. Med., 169:73, 1989), en PBS conteniendo FCS al 3% y BSA al 2%. Después de tres lavados con PBS conteniendo Tween-20, al 0.05%, las secciones se incubaron con IgG antiratón de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceina (con una sección transversal mínima a proteínas de suero de rata, humana, bobina y de caballo) (Jackson Immuno Research, West Grave, Pensilvania) durante una hora a temperatura ambiente. Entonces las secciones se lavaron con PBS que contenía Tween-20 y se trataron con glicerol conteniendo 1 ,4-diazobiciclo-(2,2,2) octano (Sigma), para inhibir la extinción de la fluorescencia. Las secciones se visualizaron con un microscopio Zeis y las células se contaron. La tinción en ausencia del primer anticuerpo fue negativa. 6.2 Resultados La figura 1 muestra la acumulación de células T medidas inmunohistoquímicamente. El número de células T fue considerablemente mayor en nervios dañados de ratas inyectadas con células anti-MBP, anti-OVA o anti-p277; el análisis estadístico (ANOVA de un solo sentido) mostró diferencias importantes entre los números de células T en los nervios ópticos dañados de ratas inyectadas con células T anti-MBP, anti-OVA, o anti-p277 y en nervios ópticos dañados de ratas inyectadas con PBS (P<0.001 ); y entre los nervios ópticos dañados y los nervios ópticos no dañados de ratas inyectadas con células T anti-MBP, anti-OVA, o anti-p277 (P<0.001 ).

EJEMPLO Neuroprotección por células T anti-MBP con inmunidad propia 7.1 Material v métodos Los animales, medios, antígenos, lesión de aplastamiento del nervio óptico de rata, disección de nervios, líneas de células T e inmunomarcación de secciones de nervio se describen en la sección 6, arriba. 7.1.1 Marcación retrograda v medición de daño primario y degeneración secundaria El daño primario de los axones de los nervios ópticos y sus células ganglionares retiniana (RGC) se midieron después de la aplicación inmediata posterior a la lesión del colorante lipofílico fluorescente de ioduro 4-(4-(didecilamino)estiril)-N-metilpiridinio (4-di-Asp (Molecular Probes Europe BV, Países Bajos) distal al sitio de la lesión. Únicamente los axones que están intactos son capaces de transportar nuevamente el colorante a sus cuerpos celulares; por lo tanto, el número de cuerpos de células marcadas es una medición del número de axones que sobrevivieron a la lesión primaria. La degeneración secundaria también se midió mediante la aplicación del colorante distal al sitio de la lesión, pero dos semanas después la lesión primaria se infligió. La aplicación del colorante neurotrazador distal al sitio del aplastamiento primario después de dos semanas asegura que únicamente los axones que sobrevivieron a la lesión primaria y a la degeneración secundaria se contaran. Este enfoque hace posible diferenciar entre neuronas que aún están intactas funcionalmente y las neuronas en donde los axones resultaron dañados, pero los cuerpos de la célula aún son viables, ya que únicamente aquellas neuronas cuyas fibras están intactas morfológicamente pueden absorber el colorante aplicado de manera dlstal al sitio de la lesión y transportarlo a sus cuerpos celulares. Al usar este método, el número de células ganglionares marcada reflejan de manera confiable el número de neuronas que aún funcionan. La marcación y medición se realizó mediante exposición del nervio óptico derecho por una segunda vez, nuevamente sin dañar el suministro de sangre a la retina. Se realizó una axotomía completa 1-2 mm desde el límite distal del sitio de la lesión y se depositaron cristales sólidos (0.2-0.4 mm de diámetro) de 4-Di-10-Asp en el sitio de la axotomía recién formada. Los nervios ópticos sin daño se marcaron de manera similar en aproximadamente la misma distancia desde el globo. Cinco días después de la aplicación del colorante, las ratas fueron sacrificadas. La retina se separó del ojo, se preparó montada completa en plano en una solución de paraformaldehído al 4% y se examinó para obtener las células ganglionares marcadas por microscopio de fluorescencia. El porcentaje de RGC que sobrevivieron a la degeneración secundaria se calculó usando la siguiente fórmula: (número de neuronas disponibles después de la degeneración secundaria) / (número de neuronas disponibles después del daño primario) x 100. 7.1.2 Registros Electrofisiolóqicos Se seccionaron nervios y sus potenciales de acción mixtos (CAP) se registraron in vitro usando un electrodo de succión experimental (Yoles et al., J. Neurotrauma 13:49-57, 1996). En ocasiones diferentes, después de la lesión y la inyección de células T o PBS, las ratas fueron sacrificadas por inyección intraperitoneal de pentobarbitona (170 mg/kg) (CTS Chemical Industries, Israel). Ambos nervios ópticos se retiraron mientras aún estaban unidos al quiasma óptico, e inmediatamente se transfirieron a un envase que contenía una solución salina recién elaborada que consistía en 1266 mM NaCI, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2P02 26 mM NaHC03 2 mM MgS04, 2 mM CaC y 10 mM glucosa-D, se expusieron al aire con 02 al 95% y CO2 al 5% a temperatura ambiente. Después de 1 hora, se elaboraron registros electrofisiológicos. En el nervio dañado, se realizaron registros en un segmento distal al sitio de la lesión. Este segmento contiene axones de células ganglionares retiniana viables que han escapado del daño primario y secundario, así como los troncos distales de las células ganglionares retiniana no viables que aún no se han sometido a una degeneración walleriana. Los extremos de los nervios se conectaron a dos electrodos de succión Ag-AgCl inmersos en la solución de inmersión a 37°C. Un pulso de estímulo se aplicó a través del electrodo, y se registró el CAP mediante el electrodo distal. Se usó un estimulador (SD9; Grass Medical Instrument, Quincy, Massachusetts) para obtener una estimulación eléctrica supramaximal a una velocidad de 1 pps para asegurar la estimulación de todos los axones que se propagan en el nervio. La señal medida se transmitió a un microelectrodo amplificador de CA (modelo 1800; A-M Systems, Everett, Washington). Los datos se procesaron usando la adquisión de datos LabView 2.1.1 y el sistema de manejo (National Instruments, Austin, Texas). Para cada nervio, la diferencia entre la amplitud pico y la meseta promedio de ocho CAP se calculó y se consideró como proporcional al número de axones de propagación en el nervio óptico. Los experimentos se realizaron mediante experimentadores que no tenían conocimiento del estudio, para mostrar la identidad. En cada experimento, los datos se normalizaron con relación a CAP medio de los nervios no dañados de las ratas inyectadas con PBS. 7.1.3 Evaluación clinica de encefalomielitis con inmunidad propia experimental Se evaluó la enfermedad clínica cada 1 a 2 días de conformidad con la siguiente escala neurológica: 0, sin anormalidad; 1 , atonía de la cola; 2, parálisis de extremidades traseras; 3, parálisis extendiéndose a la espina torácica, parálisis de extremidades delanteras ; 5 estado moribundo. 7.2 Resultados 7.2.1 Neuroprotección por células T anti-MBP con inmunidad propia Se realizaron análisis morfológicos para evaluar el efecto de las células T en la respuesta de los nervios al daño, y específicamente en la degeneración secundaria. Se inyectaron ratas intraperitonealmente inmediatamente después de la lesión del nervio óptico con PBS o con células T activadas 1 x 107 diversas líneas celulares. El grado de daño primario a los axones de nervio óptico y sus RGC anexas se midió mediante la inyección del colorante 4-Di-10-Asp distal al sitio de la lesión inmediatamente después de la lesión. Un lapso de tiempo de 2 semanas entre una lesión por aplastamiento moderada y la aplicación del colorante es óptima para demostrar el número de neuronas marcadas aún viables como medida de generación secundaria, y como la respuesta a la degeneración secundaria al tratamiento. Por lo tanto, la degeneración secundaria se cuantificó mediante inyección del colorante inmediatamente o 2 semanas después de la lesión primaria, y calculando la pérdida adicional de RGC entre la primera y segunda inyecciones del colorante. El porcentaje de RGC que sobrevivió a la degeneración secundaria entonces se calculó. El porcentaje de RGC marcadas (reflejando las neuronas aún viables) fue significativamente mayor en las retinas de las ratas inyectadas con células T anti-MBP que en las retinas de las ratas de control inyectadas con PBS (fig. 2). En contraste, el porcentaje de 30 RGC marcadas en las retinas de las ratas inyectadas con células T anti-OVA o anti-p277 no fue significativamente mayor que aquellas en las retinas de control. De esta manera, aunque las tres líneas de células T acumuladas en el sitio de lesión, únicamente las células T con inmunidad propia específicas MBP presentaron un efecto sustancial en el límite del grado de la degeneración secundaria. Las RGC marcadas de los nervios ópticos dañados de ratas inyectadas con PBS (Fig. 3A), con células T anti-p277 (fig. 3B) o con células T anti-MBP (fig. 3C) se compararon morfológicamente usando micrógrafos. 7.2.2 Gravedad clínica de EAE Se inyectaron i. p. animales con 107 células TMBP con o sin lesión por aplastamiento de nervio óptico concurrente. El curso clínico de las ratas inyectadas con las células TMBP se evaluó de conformidad con una escala de parálisis neurológica. Cada grupo contenía de 5 a 9 ratas. La inmunidad propia funcional de las células T anti-MBP inyectada se demostró mediante el desarrollo de EAE transitorio en los receptores de estas células. Como puede observarse en la figura 4A, el curso y gravedad de EAE no se vio afectado por la presencia del daño por aplastamiento de nervio óptico. 7.2.3 Supervivencia de RGC en nervios no dañados Se inyectaron i. p. animales 107 con células TMBP O PBS. Dos semanas después se aplicó 4-Di-10-Asp a los nervios ópticos. Después de cinco días, la retina se extirpó y se montaron extendidas. Las RGC marcadas de cinco campos (ubicadas aproximadamente a la misma distancia desde el disco óptico), en cada retina se contaron y se calculó su número promedio por área (mm2). Como puede observase en la figura 4B, no existe diferencia en el número de RGC sobrevivientes por área (mm2) en nervios ópticos no dañados de ratas inyectadas con células T anti-MBP en comparación con las ratas inyectadas PBS. 7.2.4. Neuroprotección por células T reactivas a un epítope críptico Para determinar si el efecto neuroprotector de las células T anti-MBP está relacionado con su virulencia, el efecto de células T reactivas a un epítope "críptico" de MBP, se examinó el péptido 51-70 (p51-70) los epítopes "crípticos" activan células T específicas después de que un animal se inmuniza con el péptido particular, pero no con todo el antígeno (Mor et al., J. Inmmunol. 155:3693-3699. 1995). La línea de células T reactivas al MBP completo y la línea de células T reactivas al epítope críptico p51-70 se compararon para obtener la gravedad de EAE que indujeron, y para obtener sus efectos en la degeneración secundaria. En ratas inyectadas con la línea de células T reactivas al epítope críptico, la gravedad de la enfermedad (como se manifestó por la graduación EAE máxima) fue de significativamente menor que en las ratas inyectadas con la línea de células T reactivas a la proteína completa (cuadro 1 ). Mientras las células T anti-MBP ocasionaron una parálisis clínica de las extremidades, las ratas inyectadas con las células T anti-p51-70 desarrollaron únicamente una atonía de cola, no parálisis de extremidades traseras, y casi ninguna mostró debilidad en las extremidades traseras. A pesar de estas diferencias en la gravedad de EAE, el efecto neuroprotector de las células T (anti-p51-70) menos virulento fue similar al de las células T más virulenta-; (anti-MBP) (figura 5). El porcentaje de RGC que sobrevivieron a la degeneración secundaria en las retinas de las ratas inyectadas con alguna de las líneas fue significativamente mayor que en las retinas de las ratas inyectadas con PBS. De esta manera, no se presentó una relación entre el efecto neuroprotector de las células T con inmunidad propia y su virulencia. Es posible que las células T anti-p51-70 encuentren algo de antígeno en el sistema nervioso central intacto, y por lo tanto ocasionan únicamente una EAE leve. Sin embargo, su antígeno objetivo puede volverse más disponible después de la lesión, permitiendo que estas células T ejerzan un efecto neuroprotector.

CUADRO 1 Células T Anti-MBP y anti-p51-70 varían en patogenicida Linea de células T EAE Clinico Puntuación máxima media MBP completa Moderado a agrave 2.00 + 0.2 P51-70 de MBP Leve 0.70 + 0.2 Inmediatamente después de la lesión por aplastamiento del nervio óptico las ratas Lewis se inyectaron con células T anti-MBP activadas o células T anti-p51-70. El curso clínico de EAE se evaluó de conformidad con la escala de parálisis neurológica. La puntuación maximal media (max.) ± s.e.m. se calculó como la puntuación maximal promedio de todas las ratas enfermas en cada grupo. El cuadro es una suma de nueve experimentos. Cada grupo contiene de 5 a 10 ratas. Los análisis estadísticos demostraron una diferencia importante entre la puntuación maximal media de ratas inyectadas con células T antí-MBP y las de las ratas inyectadas con células T anti-p51-70 (P=0.39, prueba T de Student). 7.2.5 Actividad electrofisiolóqica. Para confirmar el efecto neuroprotector de las células T anti-MBP, se realizaron estudios electroflsiológicos. Inmediatamente después de la lesión del nervio óptico, las ratas se iryectaron intraperitonealmente con PBS o con células T anti-MBP o anti-OVA activadas 1 x 107. Los nervios ópticos se extirparon 7, 11 ó 14 días después y los potenciales de acción mixto (CAP), una medida de conducción de nervios, se registraron desde los nervios dañados. En el día 14, las amplitudes medias CAP de los segmentos distales registrados desde los nervios dañados obtenidos de las ratas de control inyectadas PBS fueron de 33% a 50% de las registradas de las ratas inyectadas con las células T anti-MBP (figura 6A, cuadro 2). Como el segmento distal del nervio dañado contiene neuronas que se escaparon del primer daño en neuronas dañadas que no se han degenerado, el efecto neuroprotector observado puede reflejar el rescate de neuronas disponibles, o un retraso de la degeneración walleriana de las neuronas dañadas (lo que normalmente se presenta en el tronco distal), o ambos. No se observó efectos de la inyección de células T anti-MBP en las amplitudes de CAP medio de los nervios no dañados (figura 6B cuadro 2). Es poco probable que el efecto neuroprotector observado en el día 14 pudiera deberse a un nuevo crecimiento de las fibras nerviosas, ya que el tiempo fue muy corto para esto. El fuerte efecto neuroprotector de las células de anti-MBP que se observó en el día 14 se asoció con una amplitud CAP significativamente disminuida registrada en el día 7 (cuadro 2). Las células T anti-MBP no manifestaron efectos sustanciales en el nervio dañado en el día 7, indicando que la reducción en la actividad electrofisiológica observada en el nervio dañado en el día 7 podría reflejar el número mayor de células T presentes en el sitio de daño con relación al nervio sin de?o (figura 1 ). La reducción observada en la amplitud CAP en el nervio dañado en el día 7 reflejó un estado de reposo transitorio en el nervio dañado. Este efecto transitorio no únicamente desapareció, también se invirtió para el día 14 (cuadro 2). Los primeros signos del efecto neuroprotector fácilmente pudieron detectarse en el día 11 en las ratas inyectadas con células T anti-OVA, no pudo detectarse reducción alguna en la amplitud CAP en el día 7 ni en los nervios con daño ni en los nervios no dañados, y no se observó efecto neuroprotector en el día 14 (cuadro 2). De esta manera, aparentemente la reducción temprana en CAP y la neuroprotección tardía mostrada específicamente en las células T anti-MBP están relacionadas.

CUADRO 2 Reducción transitoria en la actividad electrofisiolóqica del nervio óptico dañado inducida por células T anti-MBP. seguida por un efecto neuroprotector Nervio óptico sin daño Nervio óptico dañado Día 7 Día 14 Día 7 Día 14 Relación (%) 89.9±9.4 101.2±22.7 63.8*±14.9 243.1**±70.8 TM P B/PBS (n=22) (n=10) (n=17) (n=8) Relación (%) 109.7±13.2 92.5+12.6 125.5±24.4 107.3±39.8 TQ A/PBS (n=11 ) (n=3) (n=11 ) (n=4) Inmediatamente después del daño al nervio óptico, las ratas se inyectaron con PBS o con células T activadas anti-MBP o anti-OVA. Después de 7 ó 14 días, se registró el CAP de los nervios dañado y no dañado. Se calcularon las relaciones de los nervios no dañados (como CAP medio de nervios no dañados de ratas inyectadas con células T/CAP medio en nervios no dañados de ratas inyectadas con PBS) x 100, o para nervios dañados (como CAP medio de nervios dañados de ratas inyectadas con células T CAP de nervios dañados de ratas inyectadas con PBS) x 100. El valor P se calculó por la comparación de logaritmos CAP normalizadas de los nervios a partir de ratas inyectadas con PBS y ratas inyectadas con células T, usando la prueba t de Student no apareada, *P<0.05; **P<0.001 n=tamaño de muestra. 7.3 Neuroprotección en lesión de médula espinal 7.3.1. Materiales y métodos Los animales, antígenos (MBP, OVA) y líneas de células T fueron como se describió anteriormente en 6.1.1 , 6.1.3 y 6.1.4, respectivamente. Contusión: Se anestesiaron ratas adultas (de 300 a 350 g) y se expuso la médula espinal mediante laminectomía a un nivel de T7-T8. Una hora después de la inducción de la anestesia, una barra de 10 gramos se dejó caer sobre la médula laminectomizada desde una altura de 50 mm. El dispositivo de impacto (diseñado por el profesor Wise Young) permitió, para cada animal, la medición de la trayectoria de la barra y su contacto con la médula espinal para permitir una lesión uniforme. En la hora posterior a la contusión, las ratas se inyectaron ¡ntraperitonialmente, sobre una base aleatoria, ya sea con células 107 (específicas ya sea MBP o OVA, dependiendo en el diseño de experimento) o con PBS. La expresión de vejiga se realizó por lo menos dos veces al día (particularmente durante las primeras 48 horas después de la lesión, cuando se realizó tres veces al día) hasta finalizar la segunda semana, momento para el cual las ratas habían desarrollado un vaciamiento de vejiga autónomo. Aproximadamente dos veces por semana, la actividad locomotora (del tronco, cola y extremidades posteriores) se evaluó en un campo abierto colocando a la rata durante 4 minutos en medio de un espacio circular hecho de plástico moldeado con un piso suave no deslizante (90 cm de diámetro, con una pared con 7 centímetros de altura). 7.3.2 Resultados El presente estudio de neuroprotección de la médula espinal indicó mediante el ejemplo anterior que el daño parcial a un nervio óptico puede aminorarse administrando células T dirigidas a un antígeno propio del sistema nervioso central. La pregunta fue si las células T con inmunidad propia podrían presentar un efecto benéfico sobre la recuperación de la lesión traumática en la médula espinal con su masa mayor del tejido de sistema nervioso central dañado y el choque espinal consiguiente. Ratas adultas Lewis se sometieron a una contusión de médula espinal calibrada producida dejando caer una pesa de 10 gramos desde una altura de 50 mm sobre la médula laminectomizada a un nivel de T7-T8 (véase la descripción incluida en Basso et al., Exp-Neurol 139. 244-256, 1996). Entonces las ratas se inyectaron intraperitonealmente con células T autoinmunes específicas a MBP. Ratas de control se dañaron de manera similar pero no recibieron células T ni células T específicas a ovoalbúmina de antígeno no propio (OVA). La recuperación de las ratas se evaluó cada 3 a 4 días en términos de su conducta en una prueba de movimiento de campo abierto, en donde los resultados varían de 0 (paraplejía completa) a 21 (movimiento normal). El rendimiento locomotor de las ratas se evaluó por observadores que no conocían la identidad del tratamiento recibido por las ratas. Se incluyó en el estudio un grupo de ratas no dañadas operadas con placebo (laminectomizadas pero sin contusión) las cuales recibieron una inyección con células T anti-MBP para verificar la actividad de las células T.

En todas las ratas operadas con placebo, las células T anti-MBP indujeron una encefalomielitis con inmunidad propia clínica experimental (EAE), la cual se desarrolló para el día 4, llegó a un pico en el día 7 y se resolvió espontáneamente para el día 11. Por lo tanto, debe observarse que en la etapa temprana post traumática, cualquier efecto de las células T con inmunidad propia sobre la médula espinal dañada, ya sea positivo o negativo, estará cubierto de manera transitoria tanto por el golpe espinal como por la parálisis de EAE. De hecho, ninguna de las ratas con médulas espinales contusionadas mostró ninguna actividad locomotora en los primeros días después de la contusión (figura 7A). Sin embargo, de manera interesante las ratas tratadas con células T anti-MBP tuvieron una recuperación más rápida del choque espinal; en el día 11 , por ejemplo, cuando no podía aún detectarse ninguna recuperación en ninguna de las ratas de control no tratadas, una mejora importante se observó en las ratas tratadas con células T (figura 7A). En todo momento a partir de entonces, las ratas que recibieron las células T con inmunidad propia mostraron una mejor recuperación locomotora que las ratas dañadas sin tratamiento (figura 7A). De esta manera, las células T con inmunidad propia, a pesar de ser encefalitogénicas, no confirieron una neuroprotección importante. Adicionalmente, la fase de actividad neuroprotectora coincidió con la fase de parálisis inmune, dando apoyo a la sugerencia de que la neuroprotección puede estar relacionada con la parálisis transitoria.

Para un mes después del trauma, las ratas en ambos grupos alcanzaron un resultado de conducta máxima, que entonces permaneció en meseta por lo menos durante 3 meses de seguimiento. En las ratas sin tratamiento, la recuperación máxima de la conducta locomotora, como se observa en informes anteriores de contusiones con una gravedad similar (Basso et al., supra), estuvo marcada por algunos movimientos ineficaces de las articulaciones de las extremidades posteriores, sin embargo las ratas no mostraron capacidad alguna para soportar el peso de su cuerpo y caminar, y obtuvieron un resultado de 7.3 ± 0.8 (media ± SEM). En contraste, los resultados promedio de las ratas que se habían tratado con las células T anti-MBP fue de 10.2 + 0.8, y en algunas ratas el valor fue tan alto como 13. Todas las ratas del grupo con tratamiento pudieron soportar su peso corporal y algunas pudieron con frecuencia caminar de manera coordinada. Las diferencias entre los dos grupos, con base en ANOVA repetido con 2 factores, fueron importantes estadísticamente (p<0.05). La curva de recuperación con base en la actividad locomotora es no lineal. El incremento descrito anteriormente en la actividad motora observada después del tratamiento con células T anti-MBP podría ser el resultado de un porcentaje mucho mayor de tejido dañado con base en una curva de regresión lineal en donde la puntuación de comportamiento está correlacionada con la cantidad de tejido de médula espinal neural (por ejemplo, una diferencia entre 11 y 7) en la puntuación de locomoción que se leería como una diferencia entre 30% y menos de 10% del tejido disponible).

En otro juego de experimentos, las ratas se sometieron a una agresión más grave, dando como resultado una graduación funcional de 1.9 ± 0.8 (media + SEM) en el grupo sin tratamiento y 7.7 ± 1.4 en el grupo con tratamiento (figura 7B). Esta diferencia de más de 3 veces en la graduación de conducta se manifestó por la falta casi total de actividad motora en las ratas de control al compararlas con la capacidad de las ratas tratadas con células T con inmunidad propia para mover todas sus articulaciones. El efecto benéfico fue específico al tratamiento con células T anti-MBP; no se observó efecto después del tratamiento con células T específicas al antígeno OVA no propio (no se muestran los datos). El efecto positivo de las células T con inmunidad propia aparentemente se expresa en la conservación del tejido del sistema nervioso central que escapó a la lesión inicial, es decir, en la neuroprotección. Por lo tanto, la magnitud de la agresión, a una lesión más grave, menor cantidad de tejido dañado calificable para neuroprotección. Para determinar si la recuperación clínica podría explicarse en términos de conservación de los axones espinales, realizamos una marcación retrograda de los tractos espinales descendientes mediante la aplicación del colorante dextranamina rodamina (Brandt et al, J-Neurosci-Methods 45:35-40, 1992) en T12, debajo del sitio de la lesión. El número de células teñidas con el colorante que pudieron contarse en los núcleos rojos del cerebro constituyó una medición cuantitativa del número de axones intactos que atraviesan el área de contusión. Las secciones de los núcleos rojos de las ratas dañadas tratadas con células T anti-MBP (figura 8) contenía células marcadas de 5 veces más que las secciones tomadas de las ratas dañadas sin tratamiento. Los fotomicrógrafos de los núcleos rojos tomados de ratas tratadas con células de anti-MBP (con una graduación de campo abierto de 10) y desde ratas tratadas con PBS (con una graduación de 6) se muestran en la figura 8. Estos hallazgos indican que la reducción en el déficit funcional inducido por el daño observado en las ratas tratadas con células T puede atribuirse al daño de los tractos espinales, dando como resultado un mayor grado de viabilidad neuronal. Después de un seguimiento de más de 3 meses, cuando los resultados de la actividad locomotora habían llegado a una meseta, el sitio de la lesión de los tres animales tratados con PBS y los tres animales tratados con células T anti-MBP se analizaron por MRI ponderada por difusión. Las médulas se extirparon en una sola pieza desde la parte superior hasta la parte inferior e inmediatamente se colocaron en fijador (para formaldehído al 4%). Entonces se analizaron las secciones axiales a lo largo de la médula con contusión extirpada. La figura 9 muestra la anisotropía por difusión en las secciones axiales a lo largo de la médula contusionada de una rata tratada con células T con inmunidad propia, en comparación con la de una rata de control tratada con PBS. Las imágenes muestran anisotropía en la materia blanca que rodea la materia gris en el centro de la médula. Secciones tomadas de los sitios de lesiones de las ratas de control tratadas con PBS muestran área limitadas de anisotropía, que fueron significativamente menores que las observadas en sitios comparables en las médulas de las ratas tratadas con las células de anti-MBP. Análisis cuantitativos de anisotropía, que reflejan el número de fibras dañadas, se muestran en la figura 9. Los resultados de la imagen muestran ¡nequivocadamente que, como resultado de tratamiento con las células de anti-MBP, algunos tractos de médula espinal han escapado a la degeneración que de otra manera se hubiese presentado. 7.3.3 Análisis de los resultados Aún no se ha encontrado cura para las lesiones de la médula espinal, una de las lesiones más traumáticas y devastadora más comunes en las sociedades industriales. Se ha sabido por más de 40 años que las neuronas en el sistema nervioso central, a diferencia de las neuronas en el sistema nervioso periférico, poseen únicamente una capacidad limitada para regenerarse después de la lesión. Durante las dos últimas dos décadas, se han realizado intentos para promover la regeneración y se han producido enfo ues que llevan a una recuperación parcial. En los últimos años ha sido evidente que, aunque la mayor parte de las lesiones traumáticas que sufre la médula espinal humana son parciales, no obstante la pérdida funcional resultante es mucho peor que la misma gravedad de la lesión inicial; el proceso de autopropagación de la degeneración secundaria aparentemente es decisivo. Un esfuerzo en investigación sustancial se ha dirigido recientemente para contrarrestar la degeneración secundaria inducida por la lesión. Todos los intentos hasta ahora se han basado en la farmacología, y algunos han dado como resultado una recuperación mejorada del choque espinal. El presente estudio, en contraste, describe una terapia celular que aumenta lo que parece ser un mecanismo natural de automantenimiento y conlleva, después de un sólo tratamiento, a una recuperación perdurable. El grado de esta recuperación aparentemente excede los informes logrados usando métodos farmacológicos. En la mayoría de los tejidos, el daño inducido por la lesión activa una respuesta inmune celular que actúa para proteger el tejido y conservar su homeostasis. Esta respuesta se ha atribuido a los macrófagos y otras células que comprenden las armas innatas del sistema inmune. Los linfocitos, que son los responsables de inmunidad de adaptación, no se cree que participen en el mantenimiento de tejido. La inmunidad de adaptación, de conformidad con las enseñanzas tradicionales, está dirigida contra los agresores extraños. Sin embargo, ahora estos estudios demuestran que la respuesta inmune de la célula T de ad aptación puede ser de protección incluso cuando no hay invasión por patógenos externos. En el caso del mantenimiento de tejido, la especificidad de las células T es hacia los antígenos propios del tejido. La observación realizada sobre mantenimiento postraumático del SNC por las células con inmunidad propia sugiere que se debe evaluar nuevamente algunos conceptos básicos de inmunidad propia. Las células T que son específicas a los antígenos propios del SNC en general, y a MBP en particular, se han considerado durante mucho tiempo como únicamente perjudiciales para la salud. Sin embargo, en el presente estudio, se descubrió que la misma preparación de células T que puede producir EAE en el sistema nervioso central sin daño es neuroprotector en la médula espinal lesionada, sugiriendo que el contexto del tejido juega una parte importante en la determinación del resultado de su interacción con las células T. Se observará que el tejido despliega señales específicas para inducir comportamientos especiales de células T. Entre tales señales están las moléculas coestimuladoras, particularmente elementos de la familia B7 (Lenchow et al., Annu. Rev. Immunol. 14:233-258, 1996). Como se muestra en adelante, el nervio óptico de la rata dañado transitoriamente expresa niveles elevados de la molécula coestimuladora B7.2, la cual se expresa constitutivamente en niveles más bajos en la materia blanca del sistema nervioso central de la rata y que se cree está asociado con la regulación del perfil de citocina de la célula T que responden (H. L. Weiner, Annu. Rev. Med. 48:341-51 , 1997). La disponibilidad temprana posterior a la lesión de las células T anti-MBP exógenas, que coinciden en el incremento temprano observado posterior a la lesión de B7.2 soportará la ¡dea de que las señales expresadas por los tejidos pueden modular la respuesta de las células T. Por lo tanto puede concebirse que las células T anti-MBP que ocasionan una enfermedad con inmunidad propia monofásica al interactuar con un nervio del sistema nervioso central saludable, puede ¡mplementar un programa de mantenimiento cuando actúan con tejido del sistema nervioso central dañado expresando cantidades incrementadas de B7.2 y probablemente otras moléculas coestimuladoras.

Los efectos neuroprotector de las células T pueden estar mediados, por lo menos en parte, por una regulación dependiente del antígeno de citocinas específicas o factores neurotróficos (M. Kerschensteiner et al., J. Exp. Med. 189:865-870, 1999) producidas localmente en el sitio de la lesión. De esta manera, la presente invención también está dirigida a la manipulación de la molécula coestimuladora B7.2 para evitar o inhibir la degeneración de neuronas y aminorar los efectos de las lesiones o enfermedades del sistema nervioso. La molécula B7.2 puede sobreregularse para éste propósito, usando fármacos o mediante manipulación genética, sin experimentación indebida. En un estudio reciente, se informó que la lesión a la médula espinal activa una respuesta con inmunidad propia transitoria a MBP (Popovich et al., J. Neurosci. Res. 45:349-63, 1996). Sin embargo, si la respuesta es benéfica o perjudicial aún permanece como pregunta abierta (Popovich et al., J. Comp. Neurol. 377:443-464, 1997). A partir de los datos que presentamos, aparecerá que la activación de células T anti-MBP podría ser benéfica de hecho. Sin embargo, un complemento de células T con inmunidad propia exógenas puede requerirse para vencer las restricciones sobre la reactividad inmune impuesta por el privilegio inmune del SNC (J. W. Streilein, Science 270:1158-1159, 1995). El hallazgo de que la respuesta autoinmune puede ser útil sugiere que las células T autoinmunes naturales pueden someterse a una selección positiva durante la ontogenia, como lo propone la teoría del homunculus inmunológico (I. R. Cohén, Immunol. Today 13, 490-494 (1992), y no son meramente una omisión resultante del escape de la selección negativa de células T que reconoce antígenos propios (C. A. Janeway, Jr., Immunol. Today 13:11-6, 1992). Tal respuesta entonces puede ser considerada como un mecanismo de automantenimiento del sistema nervioso central fisiológico potencial, lo que, sin embargo, no es suficiente para este propósito, debido al carácter inmunoppvilegiado del SNC. Una sola inyección de células T autoinmunes duró por lo menos 100 días. De esta manera, este procedimiento ofrece una forma de automantenimiento. Esta respuesta autoinmune específica, cuando se controla adecuadamente, es útil como parte de un remedio autoderivado para la lesión de médula espinal.

EJEMPLO Efectos neuroprotectores del antíqeno específico de SN 8.1 Materiales v métodos Los animales, la lesión por aplastamiento del nervio óptico de la rata, y la marcación retrograda se describen anteriormente en las secciones 6 y 7. Un péptido con base en los aminoácidos 35-55 de glucoproteína oligodendrocitos/mielina (MOG p35-55) se sintetizó químicamente en el Weizmann Institute, Israel. 8.1.1 Inhibición de degeneración secundaria Se inyectaron intradérmicamente rata en los cojinetes de las patas con MOG p35-55 (50 µg/animal) e IFA, o PBS diez días antes de la lesión por aplastamiento del nervio óptico. Células ganglionares retinianas se evaluaron dos semanas después de la lesión usando marcado retrógrado como el descrito anteriormente. El número de RGC en ratas inyectadas con PBS o MOG p35-55 se expresó como un porcentaje del número total de neuronas en las ratas inyectadas con MOG p35-55 en ausencia de lesión por aplastamiento. 8.2 Resultados Como se muestra en la figura 10, el número de células ganglionares retinianas marcadas (indicando acciones viables) fue de aproximadamente 12.5 veces mayor en animales inyectados con MOG p35-55 en comparación con los animales que recibían PBS.

EJEMPLO Efectos neuroprotectores de MBP administrado oralmente 9.1 Materiales y métodos Animales, la lesión por aplastamiento del nervio óptico de rata, y marcación retrógrada de RGC se describió anteriormente en las secciones 6 y 7. 9.1.1 Inhibición de degeneración secundaria MBP de bovino (Sigma, Israel) (1 mg/dosis) se administró a ratas por cebadura usando una aguja despuntada. El MBP se administró 5 veces cada tercer día, comenzando 2 semanas antes de la lesión por aplastamiento del nervio óptico. El número de RGC en los animales tratados se expresó como porcentaje del número total de neuronas en animales sometidos a una lesión por aplastamiento del nervio óptico, pero que no recibieron MBP. 9.2 Resultados Como se muestra en la figura 11 , el número de RGC marcadas fue de aproximadamente 1.3 veces mayor en animales tratados con MBP en comparación con los animales sin tratamiento. 9.3 La molécula coestimuladora B7.2 se asocia con el mantenimiento postraumático del nervio óptico mediante administración oral de MBP 9.3.1 Introducción Células T con inmunidad propia pueden bajo ciertas condiciones ser benéficas a los axones traumatizados del SNC. El efecto de tales células T en el tejido dañado puede estar influido por la naturaleza y cantidad de las moléculas coestimuladoras que expresa. En la presente se muestra que la molécula coestimuladora B7.2 está expresada constitutivamente en el nervio óptico de la rata intacto, y después de la lesión se sobreregula en los márgenes del sitio de la lesión. La inducción previa a la lesión de tolerancia oral a MBP dio como resultado un incremente posterior a la lesión adicional en B7.2 en los márgenes y en el sitio de lesión, así como una mejor conservación del nervio traumatizado. De esta manera, la expresión B7.2 en el cerebro y su sobreregulación posterior al trauma parecen estar relacionados directamente con el mantenimiento postraumático mostrado por las células T autoinmunes.

La lesión neuronal en el SNC ocasiona degeneración de las fibras dañadas directamente, así como de las fibras que escaparon de la lesión primaria. También activa una respuesta sistémica de células T con inmunidad propia a MBP, que pueden afectar el curso de la degeneración del nervio dañado. Ya sea que el efecto de estas células T sobre el nervio sea dañino o benéfico puede depender, en parte en la naturaleza y nivel de las moléculas coestimuladoras expresadas por los tejidos dañados. Diversas moléculas coestimuladoras recientemente se han identificado, incluyendo las moléculas B7 y CD40 (Caux et al., "Activation of Human Dendritic Cells Through CD40 Cross-Linking", J. Exp. Med. 180:1263-1272, 1994; y Lenschow et al., "CD28/B7 System of T cell Costimulation", Annu. Rev. Immuno. 14:233-258, 1996). La CD40 aparentemente es dominante durante la diferenciación celular en los nodos linfáticos y B7 durante la activación de la células T en el órgano objetivo (Grewal et al., "Requirement for Cd40 Ligan in Costimulation Induction, T Cell Activation, and Experimental Allergic Encephalomyelitis", Science 273:1864-1687, 1996). Las moléculas coestimuladoras B7 se expresan sobre células que presentan antígenos (APC) como B7.1 o B7.2, lo que preferentemente puede dar soporte a la activación del tipo Th1 o Th2 de la respuesta inmune, respectivamente (Kuchroo et al., "B7-1 and B7-2 coestimulatori molecules actívate differentially 5 the Th1/Th2 developmental pathways: aplication to autoimmune disease therapy", CeJI 80:707-718, 1995; y Karandikar et al., "Targeting the B7/CD28: CTLA-4 costimulatori system in CNS autoimmune disease", J. Neuroimmunol. 89:10-18, 1998). Por lo tanto se tiene interés en la determinación de la identidad del subtipo B7 expresado en la materia blanca del SNC intacto y 10 dañado, y su posible influencia en el curso de la respuesta a la lesión. 9.3.2 Resultados La molécula coestimuladora expresada constitutivamente en los nervios ópticos intactos de ratas Lewis adultas se identificó como B7.2 (figuras 12A, 12B). para examinar los efectos del neurotrauma sobre la expresión de las moléculas coestimuladoras B7, se indujo una lesión de aplastamiento leve sobre los nervios ópticos de las ratas de Lewis y se evaluó la expresión neural de B7 mediante análisis inmunoistoquímico. El efecto de lesión más notable se observó en la expresión B7.2 manifestada en el día 3 posterior a la lesión por su elevación en los límites del sito de la lesión (figuras 12C, D, E). En contraste, la expresión de B7.1 no se detectó en el nervio óptico ya sea antes de la lesión o 3 días después. Sin embargo, en el dia 7, B7.1 puede detectarse en el sito de la lesión, presentando un patrón reminiscente del observado para los macrófagos en icróglia (figura 12F). Posteriormente, se intentó determinar si la respuesta degenerativa a la lesión del nervio óptico podría modificarse por manipulación periférica del sistema inmune. La manipulación elegida fue la inducción de tolerancia oral, y se sabe que ocasiona un efecto inmunosupresor de células T "espectadoras" (Weiner et al., "Tolerance Immune Mechanisms and Tetratment of Autoimmune Diseases", Immunol. Todav 18:335-343, 1997). La ingestión de bajas dosis de MBP da como resultado la activación de células T las que, con base en el reconocimiento de antígeno, secretan TGF como la citosina dominante y de esta manera favorecen una respuesta inmune del tipo Th2/3 (Chen, Y., "Regulatory T Cell Clones Induced by Oral Tolerance: Suppresslon of Autoimmune Encephalomyelitis", Science 265:1237-1240, 1994). Ratas de Lewis se alimentaron con comida a la que se añadió 1 mg MBP bovino cinco veces diariamente cada tercer día. Diez días después de recibir por primera vez el complemento, las ratas se sometieron a una lesión de aplastamiento del nervio óptico unilateral leve. Este intervalo de tiempo entre el inicio de la tolerancia oral y la lesión se eligió para permitir una acumulación adecuada de respuestas de células T sistémica. Como se muestra en la figura 13A y B, los números de macrófagos o macróglia activa (indicada por la marca ED-1 ) y células T (indicadas por la inmunomarcación del receptor de células T), evaluada 3 días después de la lesión, no difirió de la observada en las ratas lesionadas de control que no recibieron tratamiento ni se alimentaron PBS. En las ratas con tolerancia oral inducida a MBP, sin embargo, las cantidades de B7.2 se aumentaron adicionalmente en los límites del sito de lesión (figura 13C) al compararla con los controles (figura 12E). Además, B7.2 en las ratas con tolerancia oral inducida a MBP también se elevó al sito de lesión con relación a los nervios de control (figura 13C). Parece razonable asumir que las células T expuestas a MBP mediante absorción intestinal, al invadir el CNS dañado, contribuyó al incremento en la expresión de B7.2 por el nervio lesionado. Entonces se hizo el intento de determinar si los cambios observados a la expresión B7.2 en las ratas dañadas estaban correlacionados con el grado de degeneración neuronal. Una lesión aguda del nervio óptico de rata fue seguida por un proceso de degeneración nerviosa, que puede calificarse por marcación retrógrada de las neuronas sobrevivientes y el contéo de los cuerpos celulares correspondientes. Dos semanas después de la lesión de nervio óptico, el número de células ganglionares retinianas sobrevivientes (RGC), representando las neuronas aún viables, en el grupo de ratas alimentadas con MBP fue significativamente mayor que aquél en el grupo de control, o aquél en el grupo de ratas con nervios lesionados que se alimentaron con ovoalbúmina. De manera interesante, el beneficio de la tolerancia oral inducida a MBP se incrementó mediante la alimentación de las ratas con un horario más intenso (figura 14).

Análisis de los resultados experimentales Los resultados de los experimentos descritos en las secciones 6 y 7 muestran que las células T activadas se acumulan en el sito de la lesión en el SNC. Adicionalmente, los resultados también demuestran que la acumulación de células T en el sito de lesión es un proceso no específico, es decir, las células T que se acumularon en el sitio de lesión incluyeron células T que están activadas por exposición a un antígeno presente en el sito de la lesión, así como células T que están activadas por un antígeno que no está presente normalmente en el individuo. Los resultados de los experimentos descritos en la sección 7 demuestran que los efectos benéficos de las células T en la disminución del daño debido a las lesiones del SNC se asocian con autoantígeno especifico de SN como se ilustra por MBP. Específicamente, la administración de células T no recombinantes que se activaron por exposición a un antígeno que puede ocasionar una enfermedad con inmunidad propia (TM B P), en lugar de agrabar la lesión conlleva a un grado importante de protección de la degeneración secundaria. De esta manera, la activación de células T por exposición a un fragmento de un antígeno específico de SN fue benéfica en el límite de la diseminación de la lesión en el SNC. Los hallazgos presentes muestran que la degeneración secundaria puede inhibirse mediante la transferencia en el individuo de células T no recombinantes que reconocen un autoantígeno específico del sistema nervioso que está presente en un sitio de lesión. Las células T pueden reconocer epítopes críticos o no patógenos de antígenos propios del sistema nervios. Además, los estudios descritos en las secciones anteriores muestran que la activación de células T mediante la administración de un antígeno inmunogénico (por ejemplo MBP) o epítope inmunogénico de un antígeno (por ejemplo MOG p35-55), puede usarse para evitar o inhibir la degeneración secundaria del SNC posterior a la lesión. La descripción anterior de las modalidades específicas también revelará completamente la naturaleza general de la invención que otros podrán, aplicando conocimiento actual, modificar fácilmente y/o adaptar para diversas aplicaciones como modalidades específicas sin experimentación y sin separarse del concepto genérico, y, por lo tanto tales adaptaciones y modificaciones deben estar y estarán comprendidas dentro del significado y alcance de los equivalentes de las modalidades descritas. Debe comprenderse que la fraseología o terminología empleada en la presente es para propósitos de descripción y no limitantes. Los significados, materiales y pasrs para desarrollar las diversas funciones descritas pueden tomar una variedad de formas alternativas sin separarse de la invención. De esta manera, la expresión "significa", o cualquier el lenguaje en la descripción del método, como puede encontrarse en la descripción detallada anterior y/o en las reivindicaciones a continuación, seguida por una afirmación funcional, se crearon con la intención de definir y cubrir cualesquiera elementos estructurales, físicos, químicos o eléctricos, o estructuras, y cualesquiera pasos del método, que puede ahora o en el futuro existir que desarrolle la función descrita, ya sea equivalente precisamente a la modalidad o modalidades descritas en la descripción detallada anterior, es decir, otros significados o pasos para llevar a cabo la misma función pueden usarse; y se tiene la intención de que tales expresiones estén dadas en su interpretación más amplia. Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan por referencia por completo.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición para evitar o inhibir la degeneración en el sistema nervioso central o en el sistema nervioso periférico para aminorar los efectos de una lesión o enfermedad, que comprende: a) células T activadas específicas del sistema nervioso, b) antígeno especifico del SN; c) un péptido derivado de un antígeno específico del SN, d) una secuencia de nucleótidos que codifica para un antígeno específico del SN; e) una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido derivado de un antígeno específico del SN, o f) cualquier combinación de (a) - (e).

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , para promover la regeneración nerviosa en el sistema nervioso central o en el sistema nervioso periférico para aminorar los efectos de una lesión o enfermedad.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha lesión comprende una lesión de la medula espinal, trauma brusco, trauma penetrante, apoplejía hemorrágica c apoplejía isquémica

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha enfermedad es neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (parálisis de Bell), glaucoma, corea de Huntington, esclerosis amiotrófica lateral, neuropatía óptica no arterítica, o deficiencia de vitaminas.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha enfermedad no es una enfermedad autoinmune o neoplasma.

6.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones es de la 1 a la 5, en donde dichas células T activadas específicas del SN de (a) son células T autólogas, o células T alogénicas de donadores relacionados, o igualados o parcialmente igualados para HLA, donadores alogénicos completamente o semihalogénicos.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, en donde dichas células T autólogas se han almacenados o se derivan de células del SNC autólogas.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, en donde dichas células son células de semialogénicas.

9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde dicho antígeno específico de SN de (b) se selecciona de proteína básica de mielina (MBP), glucoproteína de oligodendrocitos/mielina (MOG), proteína proteolípida (PLP), glucoproteína asociada con mielina (MAG), S-100, ß-amilolde, Thy-1 , PO, P2 y receptores neurotransmisores.

10.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde dicho péptido derivado de un antígeno específico de SN es un epítope inmunogénico o un epítope críptico de dicho antígeno.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicho péptido es un epítope inmunogénico o un epítope críptico derivado de MBP.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , en donde dicho péptido corresponde a las secuencias p11 , p51-70, p91-110, p131-150 ó p151-170 de MBP.

13.- Las composiciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 y de la 11 a 12, en donde dicho antígeno específico de SN o un péptido derivado del mismo se administra de manera intravenosa, oral, intranasal, intratecal, intramuscular, intradérmica, tópica, subcutánea, mucosa (por ejemplo oral, intranasal, vaginal, rectal) o bucal.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, que comprende MBP para la administración oral.

15.- El uso de: (a) células T activadas específicas de SN; (b) un antígeno específico de SN; (c) un péptido derivado de un antígeno específico de SN; (d) una secuencia de nucleótidos quf codifican para un antígeno específico de SN; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido derivado de un antígeno específico de SN; o (f) cualquier combinación de (a) - (e), para la preparación de una composición para evitar o inhibir la generación neuronal en el sistema nervioso central o en el sistema nervioso periférico para aminorar los efectos de una lesión o enfermedad.

16.- El uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13 para la elaboración de un fármaco para evitar o inhibir la degeneración neuronal en el sistema nervioso central o en el sistema nervioso periférico en un individuo, en donde dicho individuo está inmunizado activamente para acumular una respuesta celular T crítica.

17.- El uso de una composición para la elaboración de un fármaco para evitar o inhibir la degeneración neuronal en el sistema nervioso central o en el sistema nervioso periférico en un individuo, en donde dicho fármaco es para sobrerregular la molécula coestimulante B7.2 o manipular genéticamente la molécula coestimulante B7.2 en dicho individuo.