DE112005002530T5

DE112005002530T5 - Neue Verfahren für die in-vitro Identifikation, Isolierung und Differenzierung von vaskulogenischen Vorläuferzellen

Info

Publication number: DE112005002530T5
Application number: DE112005002530T
Authority: DE
Inventors: Sharon Gerecht-Nir; Joseph Itskovitz-Eldor
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 2002-04-16
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2008-04-30
Also published as: WO2003087296A3; JP2005522213A; AU2003226608A8; WO2003087296A2; GB2434373A; IL164588A0; CA2482713A1; US7247477B2; WO2006040755A2; AU2005293138A1; GB2434373B; WO2006040755A3; CA2584256A1; GB0709138D0; EP1495111A4; IL164588A; JP4383896B2; EP1495111A2; US20030194802A1; AU2003226608A1

Abstract

Verfahren zur Erzeugung vaskulärer Zellen der glatten Muskulatur aus vaskulogenen Vorläuferzellen umfassend, Züchten der vaskulogenen Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium, das eine Serumvolumenkonzentration von über 5% aufweist, für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, eine Differenzierung der vaskulogenen Vorläuferzellen zu vaskulären Zellen der glatten Muskulatur zu induzieren.

Description

GEBIET UND HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Isolierung und Kultivierung vaskulogenischer bzw. Blutgefäß-bildender Vorläuferzellen von Stammzellen und insbesondere Verfahren zur Verwendung von vaskulogenischen Vorläuferzellen bei der Gewebetechnik, Forschung und Diagnose.
Jüngst wurden Techniken entwickelt, welche menschlichen embryonalen Stammzellen ermöglichen in Kultur unbegrenzt zu proliferieren, wodurch eine Versuchsdurchführung mit Induktion einer Differenzierung auf eine gerichtete, gewebespezifische Art ermöglicht wird (Itskovitz-Eldor, J et al. Mol Med.; 6 (2000), 88–95, Reubinoff BE et al., Nat. Biotech.; 18 (2000), 399–404, Schuldiner M. et al., PNAS USA; 97 (2000), 11307–12). Wachstum und Entwicklung menschlicher embryonaler Stammzellen wird sorgfältig untersucht und das schnell zunehmende Wissen wird in einer Vielzahl innovativer therapeutischer Anwendungen eingesetzt, einschließlich von in-vitro Gewebetechnik, Transplantationsmedizin, Erzeugung transgener Embryos und Behandlung einer degenerativen Erkrankung. Am bedeutendsten ist, dass der Präsident der U.S. die unermeßliche Bedeutung embryonaler Stammzellen für Medizin und Forschung erkannt hat und jüngst Projekte sanktioniert hat, in welchen bereits vorliegende menschliche embryonale Stammzelllinien verwendet werden (Faktenpapier (fact sheet) des Weißen Hauses: Embryonic Stem Cell Research, Aug. 9, 2001). Eine In-vitro Manipulation der komplexen Schritte einer Entwicklung, um zuverlässig wesentliche Mengen der gewünschten Zelllinien und spezifischen Phänotypen herzustellen, verbleibt allerdings ein Ziel von entscheidender Wichtigkeit.
Blutgefäßbildung bei embryonaler Entwicklung und im Erwachsenenleben
Bei den frühen Stadien einer embryonalen Entwicklung tritt eine Gefäßbildung durch einen Vorgang auf, welcher als Vaskulogenese bezeichnet wird, in welcher mesodermal-abgeleitete Endothelzellvorläufer einer erneuten Differenzierung unterzogen werden, expandieren und zusammenwachsen, um ein Netzwerk einfacher Röhrchen zu bilden (Yancopoulos GD et al., Nature; (2000), 407:242). Diese Blutgefäße sind im Allgemeinen aus zwei Zelllinien zusammengesetzt, wobei jede einer verschiedenen Funktion dient: Innere Endothelzellen, welche die Kanäle für eine Blutleitung bilden, welche allerdings alleine keine Vaskulogenese vervollständigen können; und periendotheliale glatte Muskelzellen, welche die zerbrechlichen Kanäle vor einem Zerbrechen schützen und stabilisieren und eine haemostatische Kontrolle bereitstellen (Carmeliet P., Nature Med.; 6 (2000), 389). Eine dritte Zelllinie, die blutbildenden Zellen, teilen einen gemeinsamen Vorläufer mit den vaskulogenischen Zellen und differenzieren in die Blutzellen. In dem Embryo eines Wirbeltieres tritt Vaskulogenese in dem paraxialen und lateralen Mesoderm auf, was zur Entstehung des Vorläufers bzw. Primordia des Herzens führt, der dorsalen Aorta und großen Gefäßen des Kopfes, Lunge und gastrointestinalen Systems. Angiogenese bezieht die Reifung und Remodellierung des einfachen vaskulären Plexus in ein komplexes Netzwerk von großen und kleinen Gefäßen ein. Angiogenese führt ebenso zu einer Vaskularisierung von anfänglich nicht vaskulären Organen, wie beispielsweise Niere, Gehirn und anfänglichen Gliedmaßen (limb buds).
Angiogenese wird darüber hinaus nach einer Geburt für ein gewöhnliches Gewebewachstum benötigt und setzt sich über das Erwachsenenleben fort, beispielsweise während einer erneuten Vaskularisierung des Endometriums während des gewöhnlichen weiblichen Östrus, während Schwangerschaft in der Plazenta und während einer Gewebeheilung (Risau, et al. Nature 386 (1997), 671–674).
Darüber hinaus wurde eine Anzahl von Erkrankungen und Krankheiten mit abnormalem Endothelwachstum in Zusammenhang gebracht: Endothel-Hyperproliferation bei Arteriosklerose, eine erneute Vaskularisierung bei Tumorwachstum und Methastasis, und eine deregulierte Angiogenese bei rheumatischer Arthritis, Retionopathien, Hemangiomen und Psoriasis (Folkman et al., Nature Med. 1 (1995), 27–31; Hanahan and Folkman, Cell 86 (1996), 353–64).
Embryonale Endothelzellen In-vitro
Forschung über die Funktionen, Ursprung und Beschaffenheit von embryonalen Endothelzellen (EEC) hat gezeigt, dass EECs eine Leberorganogenese fördern (Matsumoto K. et al. Sicence 294 (2001), 559), eine Pankreasdifferenzierung induzieren (Lammert E. et al. 294 (2001), 564) und in Herzmuskelzellen bei spezifischen Bedingungen traps-differenzieren (Condorelli G. et al. 98 (2001), 10733) können. Während die Ablauf der Differenzierung und Entwicklung von Endothel-Vorläufern bis jetzt noch nicht voll verstanden ist, wird es klar, dass eine blutbildende Entwicklung und die Erzeugung von vaskulären glatten Muskelzellen (v-SMC) mit einer vaskulären Entwicklung eng verknüpft sind.
Embryonale Stammzellen sind in Kultur schwierig zu halten und tendieren zu einer spontanen Differenzierung. Für permanente Kulturen werden Zellen der inneren Masse von Blastocysten für gewöhnlich auf einer Schicht von embryonalen Fibroblast "Nähr-" ("Feeder-") Zellen der Maus wachsen gelassen, um ihren nicht differenzierten Phänotyp und Befähigung zur Proliferation beizubehalten (Keller, G.M., Curr. Opin. Cell. Biol. 7 (1995), 802–69). In Mäusen kann eine frühere Differenzierung in embryonal verschiedene Zelltypen durch Cokultivierung mit stromalen Zelllinien induziert werden (Palacios R., et al., PNAS USA, 1995; 92:7530–34), Kultivierung auf Substraten, wie beispielsweise Fibronectin, Laminin, Kollagen, usw. (Ogawa, M. et al., Blood, 93 (1999), 1168–77) oder in-vitro Aggregation embryonaler Stamm (ES) Zellen in "Embryoidkörper" (EB), welcher eine örtliche Differenzierung in drei Keimschichten zeigen (Keller, G. M., Curr. Opin. Cell. Biol. 7 (1995), 862–69).
Embryonale Stammzellen der Maus
Eine Untersuchung vaskulogenischer Ereignisse in ES-Zellen der Maus war aufschlussreich. Sowohl blutbildende als auch Endothelzellen wurden in blast cell Kolonien untersucht, die von Maus ES zellabgeleiteten Embryoidkörpern erzeugt wurden (Choi K. et al., Development 125 (1998), 725). Ebenso bei einer Arbeit mit ES-Zellen der Maus zeigten Nishikawa und Kollegen, dass eine 3-D Embryoidkörperbildung für eine Differenzierung lateraler Mesodermzellen nicht benötigt waren. Bei einer Kultivierung wurden nicht aggregierte embryonale Zellen der Maus auf einem Kollagensubstrat wachsen gelassen und von Zellen, welche vaskulares Endothelcadherin exprimieren (VE-cad+) wurde gefunden zu blutbildenden Zellen zu führen (Nishikawa SI, et al., Development 1998; 125:1747, Nishikawa SI et al. Immunity, 8 (1998), 761, und Fujimoto T. et al., Gene Cells 6 (2001), 1113). Wo Marker von Phänotyp glatter Muskelzellen (SMC) (beispielsweise Oberflächenmarker und Morphologie) beobachtet wurden, kann eine frühe periodothelielle SMCs zusammenhängend mit embryonalen Endothelröhrchen gezeigt werden, von dem Endothel- zu trans-differenzieren (Gittenberger de-Groot, AC et al., Atheroscler. Thromb. Vasc. Biol., 1999; 19:1589), und eine Differenzierung embryonaler gewöhnlicher vaskulogenischer Vorläufer (Flk1+) in Endothel- und Zellen der glatten Muskulatur kann beobachtet werden (Jamashita J. et al., Nature 408 (2000), 92). Es wurden allerdings Versuche unternommen, um direkt von Maus zu menschlichen EC Systemen zu extrapolieren, welche allerdings zu enttäuschenden Ergebnissen führten, was zeigt, dass viele Entwicklungsvorgänge und Bedürfnisse speziesspezifisch sind (siehe beispielsweise Reubinoff BE. Et al., Nat. Biotechnolog. 18 (2000), 399–404). Insbesondere wird der vaskuläre spezifische Wachstumsfaktor Rezeptor VEGFR 2 (Flk-1/KDR), im Gegensatz zu seiner Expression in embryonalen Maus Stamm (mES)-Zellen, in nicht differenzierte menschliche embryonale Stammzellen (hES) exprimiert (Kaufman, DS et al. PNAS USA, 98 (2001), 10716–21) und steigt während der ersten Woche einer Differenzierung nicht an (Levenberg, S. et al., PNAS USA 99 (2002), 4391–96), was anzeigt, dass die zeitliche Regulierung einer VEGFR 2 Expression unter Wirbeltierspezies variieren kann (ebenso von Nishikawa besprochen; Nishikawa SI et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (2001), 862–69). Levenberg et al. (Leberwerg, S. et al., PNAS USA 99 (2002), 4391–96) berichteten weiterhin, dass andere Endothelmarker, d.h. vaskuläres Endothelcadherin (VE-cad) und Blutplättchen-Endothelzelladhesionsmolekül-1 (PECAM1/CD31), während der ersten Woche einer hES-Differenzierung zunahmen. Es ist eindeutig, dass eine Koordinierung einer Expression spezifischer endothelspezifischer Faktoren, in den geeigneten Kombinationen, für eine menschliche Vaskulogenese entscheidend sind.
Menschliche embryonale Stammzellen
Menschliche embryonale Stamm (hES) Zelllinien wurden 1998 zuerst abgeleitet (Thomson, JA. et al., Science 282 (1998), 1145; US-P-6,200,806 Thomson et al.; US-P-6,331,406 Gearhart JD und Shamblott MJ), und wurden jüngst für eine Differenzierung in-vitro auf eine zelllinienspezifische Art induziert (Schuldiner M. et al., PNAS 97 (2000), 11307–312, WO02/10347 Benvenisty, N.). Da hES-Zellen den embryonalen Stammzellphänotyp während hunderten von Verdopplungszeiten beibehalten und in alle embryonalen Zelllinien differenzieren, stellen sie eine potentiell unbegrenzte Quelle von Zellen zur Untersuchung und klinischen Anwendung bereit. Sowohl blutbildende als auch Endothelzelldifferenzierung wurden in menschlichen ES-Zellen beobachtet. Bis heute benötigte eine blutbildende Differenzierung der hES-Zellen eine Cokultivierung mit entweder den S17 (Knochenmark der Maus) oder C166 (Dottersackendothel) stromalen Zelllinien, was die Erscheinung von primären menschlichen blutbildenden Gewebecharakteristika, wie beispielsweise Zelloberflächenantigenen CD34 und blutbildende Koloniebildung (Kaufman, DS. et al., PNAS USA, 98 (2001), 10716–21), induziert. In einer anderen jüngsten Untersuchung wurden Endothelzellen durch Zellsortierung (FACS) von menschlichen Embryoidkörpern (EB) unter Verwendung monoklonaler Antikörper selektiert, die gegen den endothelspezifischen Marker PECAM-1 gerichtet waren (Lebenberg, S. et al., PNAS USA, 2002; 99:4391–96). Die selektierten, PECAM-1+ Embryoidkörper-abgeleiteten (EBD) Zellen zeigten endothelspezifische Charakteristika, wie beispielsweise von Willebrand Faktor, VEGFR-2 und VE-cad Oberflächenmarker und eine einfache, gewebeähnliche Cordbildung, falls auf einem weichen Substrat (Matrigel) kultiviert. PECAM-1+ EBD Zellen wurden weiterhin beobachtet vaskuläre Strukturen nach einer Aussaat(Plazierung/Impfen (seeding) auf biologisch abbaubaren Polymermatrixschwämmen und Implantation in SCID Mause in vivo zu bilden. All die vorstehenden Verfahren für eine Differenzierung von menschlichem ES benötigen allerdings entweder eine Cokultivierung mit nicht menschlichen Zellen oder eine Embryoidkörperbildung vor einem Auftreten von Endothelphänotypen und Immunfluoreszenz-Zellsortieren für eine Selektion gemäß Endothelzellmarkern, was sie sowohl kostenintensiv als auch ungeeignet für viele klinische Anwendungen macht. Daher würde es von Vorteil sein, ein vereinfachtes, kostengünstigeres Verfahren zur Kultivierung, Selektion und Richten einer Differenzierung von menschlichen embryonalen Stammzellen bereitzustellen, ohne die Begrenzungen einer Aggregation in embryonale Körper oder Immunofluoreszenzselektion.
Im Stand der Technik sind eine Anzahl von Techniken und Verfahren für eine Herstellung und Verwendung embryonaler Stammzellen für eine Differenzierung offenbart. Frühe Techniken benötigten Zellen der innere Zellmasse (inner-cell mass cells) von Embryonen in Blastocystenstadium (frisch oder kryogelagert) als eine Quelle für Stammzellen (siehe beispielsweise WO 01/29206 Cibelli et al.; US-A. 2002/0045259 Lim et al., 2002/0004240 Wang). Viele andere beruhen auf einer Aggregation der Stammzellen in embryonale Körper für eine Initiierung einer Differenzierung (siehe beispielsweise WO 00/70021 Itskovitz-Eldor J. and Benvenisty N.).
Zahlreiche Verfahren für eine Differenzierung von Stammzellen in Kultur wurden ebenso offenbart. WO 01/34776 , US-A. 2002/0015694 und US-P. 6,280,718 , alle Kaufman, D. et al. offenbaren Verfahren für eine Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen in blutbildende Zellen durch Cokultivierung mit stromalen Zellen von Säugern. US-A. 2002/0023277 Stuhlmann, H. et al. offenbart die Identifizierung und Isolierung des mit Vaskulogenese zusammenhängenden Gens Vezfl in Mausen und Verfahren zur Selektion von Endothelzellen und Vorläufern basierend auf Vezfl Expression. Ebenso offenbart sind Verfahren für eine Modulierung von Angiogenese, und Diagnose und Behandlung einer vaskularen Erkrankung und Neoplasmie in einem Subjekt, wobei bei den Verfahren ein Nachweis, Bestimmen bzw. Messen und Modifikation von Niveaus von Vezfl in Geweben verwendet wird. Die beschriebenen transgenen ES Zellversuche waren allerdings ausschließlich auf Embryoidkörperzellen der Maus begrenzt, und weder menschliche, noch irgendwelche andere embryonale Zellen eines Primaten wurden verwendet. Darüber hinaus ist eine Selektion, gemäß der Offenbarung, auf der Grundlage einer Vezfl Expression, und kann daher die vorstehenden Begrenzungen einer Aggregation und Immunofluoreszenzsortierung nicht überwinden.
In der US-A-2002/0039724 offenbart Carpenter, M. K. Verfahren für eine Differenzierung und Selektion von menschlichen embryonalen neuralen Vorläuferzellen und therapeutische, diagnostische und forschungsgerichtete Verwendungen davon. Die offenbarten menschlichen neuralen Vorläuferzellen für eine rekonstitutive Therapie von beispielsweise einer neuralen degenerativen Erkrankung sind ebenso von menschlichen Embryoidkörpern abgeleitet und sind gemäß Expression und Nachweis von neuralen zellspezifischen Markern, NCAM und A2B5, selektiert und isoliert. Ähnlich dazu offenbart WO 01/81549 Rambhatla L. and Carpenter M. K. Verfahren für eine Behandlung Embryoidkörpern mit n-Butyrat für eine Induktion einer Differenzierung in Hepatocytzelllinien. Nicht aggregierte hES Ursprünge oder vereinfachte Verfahren einer Vorläuferisolierung werden in keiner Anwendung angemerkt.
Jüngst offenbarte Benevenisty ( WO 02/10347 Benvenisty) Verfahren für eine "gerichtete Differenzierung" von menschlichen embryonalen Stammzellen durch Behandlung aggregierter, Embryoidkörper-abgeleiteter Zellen mit exogenen Faktoren und Anreichern der Kulturen für einen spezifischen Zelllinientyp. Die verwendeten Faktoren waren bekannte Effektoren einer Differenzierung, wie beispielsweise Retinolsäure, neuronaler Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblastwachstumsfaktor, etc., und eine Differenzierung wurde durch eine erneute Genexpression und das Auftreten von gewebelinienspezifischen Zelloberflächenmarkern bestimmt.
In der US-A-2001/0041668 offenbart Baron, M. et al. die Verwendung extra embryonaler, morphogener Genprodukte, wie beispielsweise Hedgehog, TNF und WNT, für ein Modulieren einer Blutbildung und vaskularem Wachstum von einem erwachsenem Säuger und embryonal mesodermal-abgeleiteten Stammzellen. Eine Manipulierung der Niveaus von diesen extra-embryonalen Genprodukten in der Stammzellenumgebung über beispielsweise eine externe Anwendung oder genetische Technik wird für entweder eine Anreicherung oder Verringerung des blutbildenden und/oder vaskulären Potentials von Stammzellen für Behandlung und Diagnose von Erkrankungen offenbart, welche Blutabnormalitäten, Hypervaskularisierung, Neovaskularisierung und Revaskularisierung von Geweben einbeziehen. Obgleich allerdings eine Behandlung von menschlichen embryonalen Geweben vorgeschlagen wird, werden keine Beispiele für eine Verwendung menschlicher erwachsener oder embryonaler Zellen vorgelegt und keine Verfahren für eine Kultivierung oder Selektion von nicht aggregierten embryonalen Stammzellen werden offenbart, die ausgelegt sind, die vorstehend aufgeführten Begrenzungen zu bewältigen.
Daher besteht ein Bedarf an einem vereinfachten und kostengünstigen Verfahren für die in-vitro Identifikation, Isolierung und Kultivierung von menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen. Ein derartiges Verfahren und die dadurch isolierten Vorläuferzellen können für in-vitro vaskuläre Technik, Behandlung angeborener und erworbener vaskulären und blutbildenden Abnormalitäten, für eine Bewertung und Entwicklung von Arzneimitteln, welche vaskuläre und Angiogenesevorgänge beeinflussen, und für weitere Untersuchungen bei einer Gewebedifferenzierung und Entwicklung verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung vaskulogenischer bzw. Blutgefäß-Bildender Vorläuferzellen von nicht differenzierten ES-Zellen bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Kultivierung einzelner nicht differenzierter ES-Zellen auf eine Art durchgeführt wird, welche für ein Induzierung einer Differenzierung der nicht differenzierten ES-Zellen in vaskulogenische Vorläuferzellen geeignet ist, dadurch Erhalten einer gemischten Population von Zellen; und Isolierung von Zellen kleiner als 50 um von der gemischten Population von Zellen, wobei Zellen kleiner als 50 μm vaskulogenische Vorläuferzellen sind.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung Epithel-Vorläuferzellen von nicht differenzierten ES-Zellen bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Kultivieren einzelner nicht differenzierter ES-Zellen auf eine Art durchgeführt wird, welche für ein Induzieren einer Differenzierung der nicht differenzierten ES-Zellen in vaskulogenische Vorläuferzellen geeignet ist, dadurch Erhalten einer gemischten Population von Zellen; und Isolieren von Zellen größer als 50 μm der gemischten Population von Zellen, wobei die Zellen größer als 50 μm und epitheliale Vorläuferzellen sind.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung somatischer Zellen von einer Population von vaskulogenischen Vorläuferzellen bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Erhalten einer Population von vaskulogenischen Vorläuferzellen durchgeführt wird; und Kultivieren der Population von vaskulogenischen Vorläuferzellen in der Gegenwart von zumindest einem Wachstumsfaktor, der für eine Induzierung somatischer Zelldifferenzierung geeignet ist.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung vaskulärer glatter Muskelzellen und vaskulogenischen Vorläuferzellen bereitgestellt. Das Verfahren wird durch Kultivieren der vaskulogenischen Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium durchgeführt, welches eine Serumvolumen-Konzentration höher als 5% für einen Zeitraum umfasst, welcher für ein Induzieren einer Differenzierung der vaskulogenischen Vorläuferzellen in vaskuläre glatte Muskelzellen ausreichend ist.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Endothelzellen von vaskulogenischen Vorläuferzellen bereitgestellt. Das Verfahren wird durch Kultivieren der vaskulogenischen Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium durchgeführt, welches eine Serumvolumen-Konzentration geringer als 5% nach Volumen für einen Zeitraum umfasst, der für ein Induzieren einer Differenzierung der vaskulogenischen Vorläuferzellen in Endothelzellen geeignet ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erhöhen einer Differenzierung, Reifung und/oder Funktionalität vaskulogenischer Zellen bereitgestellt. Das Verfahren wird durch Aussetzen der vaskulogenischen Zellen einer Scherkraft von mindestens 1 Dyn/cm² für einen ausreichenden Zeitraum durchgeführt, um eine Differenzierung, Reifung und/oder Funktionalität der vaskulogenischen Zellen zu erhöhen.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung vaskulären Gewebes bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Erhalten einer Population vaskulogenischer Vorläuferzellen durchgeführt wird; und Kultivieren der Population vaskulogenischer Vorläuferzellen in der Gegenwart von zumindest einem vaskulogenischen und/oder angiogenen Wachstumsfaktor, unter Bedingungen, welche für ein Induzieren vaskulärer Gewebedifferenzierung geeignet sind.
Gemäß weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung wird die Population vaskulogenischer Vorläuferzellen in einem halbfesten, Vaskularisierungs-fördernden Medium gezüchtet.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung wird die Population eines vaskulären Vorläufers auf einem dreidimensionalen Gerüst gezüchtet.
Gemäß noch weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist der vaskulogenische und/oder angiogene Faktor ausgewählt unter der Gruppe bestehend aus vaskulärem Endothelwachstumsfaktor (VEGF), Angiopoietin (Ang), blutplättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Ephrin (Eph), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Tumorwachstumsfaktor (TGF) und Wachstumsfaktor der Plazenta (PlGF).
Gemäß einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen einer Wirkung eines Faktors auf vaskuläre Entwicklung, Wachstum und/oder Modifikation bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Erhalten einer Population von vaskulogenischen Vorläuferzellen durchgeführt wird; Aussetzen der Population vaskulogenischer Vorläuferzellen gegenüber dem Faktor; und Bestimmen einer Wirkung des Faktors auf die Population vaskulogenischer Vorläuferzellen um dadurch die Wirkung davon auf eine vaskuläre Entwicklung zu bestimmen.
Gemäß weiterer Merkmale der bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist der Faktor eine Substanz und/oder ein Umweltfaktor.
Gemäß noch weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist der Faktor ein putativer Angiogenese und/oder vaskulogenischer Herunterregulator, wobei das Verfahren weiterhin umfasst Kultivieren der Population vaskulogenischer Vorläuferzellen unter Bedingungen, welche für ein Fördern einer Angiogenese und/oder Vaskulogenese geeignet sind.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist der Faktor ein putativer Angiogenese und/oder vaskulogenischer Heraufregulator, wobei das Verfahren weiterhin umfasst Kultivieren der Population vaskulogenischer Vorläuferzellen unter Bedingungen, welche eine Angiogenese und/oder Vaskulogenese begrenzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erleichterung oder Verhinderung bzw. Vorbeugen einer vaskulären Erkrankung oder Zustands in einem Sängersubjekt bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Erhalten einer Population vaskulogenischer Vorläuferzellen bewirkt wird; und Verabreichen der vaskulogenischen Vorläuferzellen in das Subjekt unter Bedingungen, welche für ein Stimulieren einer Differenzierung der vaskulogenischen Vorläuferzellen in Endothel- und glatte Muskelzellen geeignet sind.
Gemäß weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist die vaskuläre Erkrankung oder der Zustand ausgewählt unter einer Gruppe bestehend aus angeborenen vaskulären Erkrankungen, erworbenen vaskulären Erkrankungen und der Ischämie/Wiederdurchblutung (reperfusion) Verletzung.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Vaskularisierung eines Säugergewebes bereitgestellt, wobei das Verfahren bewirkt wird durch Erhalten einer Population vaskulogenischer Vorläuferzellen, in Kontakt bringen der vaskulogenischen Vorläuferzellen mit dem Säugergewebe unter Bedingungen, welche für ein Stimulieren einer Differenzierung der vaskulogenischen Vorläuferzellen in Endothel- und Zellen der glatten Muskulatur geeignet sind.
Gemäß weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebe nen Erfindung ist das Säugergewebe ein konstruiertes, nicht vaskuläres Gewebe bei Bedarf an Vaskularisierung und/oder an embryonalem Gewebe.
Gemäß weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung wird ein in Kontakt bringen der vaskulogenischen Vorläuferzellen mit dem Säugergewebe in-vitro oder in vivo durchgeführt.
Gemäß eines noch weiteren Merkmales der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erleichtern oder Vorbeugen einer blutbildenden Erkrankung oder Zustands in einem Säugerobjekt bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Erhalten einer Population vaskulogenischer Vorläuferzellen bewirkt wird; und Verabreichen der vaskulogenischen Vorläuferzellen in das Subjekt unter Bedingungen, welche für eine Stimulierung einer Differenzierung der vaskulogenischen Vorläuferzellen in Endothel- und Blutzellen geeignet sind.
Gemäß weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist die blutbildende Erkrankung oder Zustand ausgewählt von einer Gruppe bestehend aus angeborenen Bluterkrankungen, erworbenen Bluterkrankungen, Gerinnungserkrankungen und neoplastischer Erkrankung.
Gemäß weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung wird ein Erhalten der Population vaskulogenischer Zellen durch Kultivieren einzelner nicht differenzierter ES-Zellen auf eine Art bewirkt, welche für ein Induzieren einer Differenzierung der nicht differenzierten ES-Zellen in vaskulogenische Vorläuferzellen geeignet ist, dadurch Erhalten einer gemischten Population von Zellen und Isolieren von Zellen kleiner als 50 μm von der gemischten Population von Zellen.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Stoffzusammensetzung bereitgestellt, welche ein Substrat in eine Population vaskulogenischer Vorläuferzellen umfasst, wobei die vaskulogenischen Vorläuferzellen von nicht differenzierten ES-Zellen durch ein Verfahren hergestellt sind, welches durch die Schritte bewirkt wird: Kultivieren einzelner nicht differenzierter ES-Zellen auf eine Art, welche für ein Induzieren einer Differenzierung der nicht differenzierten ES-Zellen in vaskulogenischen Vorläuferzellen geeignet ist, dadurch Erhalten einer gemischten Population von Zellen und Isolieren von Zellen kleiner als 50 μm von der gemischten Population von Zellen, wobei Zellen kleiner als 50 μm und vaskulogenische Vorläuferzellen sind.
Gemäß weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist das Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Matrigel, Kollagengel und Polymergerüst.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung werden die vaskulogenischen Vorläuferzellen mit dem Substrat auf eine Art in Kontakt gebracht, um so eine vaskuläre Entwicklung in dem Substrat zu induzieren.
Gemäß weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist die blutbildende Erkrankung oder Zustand ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus angeborenen Bluterkrankungen, erworbenen Bluterkrankungen, Gerinnungserkrankungen und neoplastischer Erkrankung.
Gemäß noch weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung wird ein Kultivieren der einzelnen nicht differenzierten ES-Zellen durch Unterziehen der nicht differenzierten ES-Zellen mindestens einem Zustand bewirkt, welcher ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Vermeiden einer Aggregation von ES Zellen, Wachstum auf Collagen, Zellsaat-Konzentration zwischen 2 × 10⁴ und 1 × 10⁵ Zellen/cm² und Anwesenheit von Differenzierungsmedium.
Gemäß noch weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung sind die nicht differenzierten ES-Zellen menschliche ES Zellen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Endothelzeilen von vaskulärem Gewebe bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Unterziehen des vaskulären Gewebes zu Bedingungen bewirkt wird, welche für ein Dissoziieren von Zellen von dem vaskulärem Gewebe ausgelegt sind, dadurch Erhalten einer gemischten Population von dissoziierten Zellen und Isolieren von Zellen kleiner als 50 μm von der gemischten Population von Zellen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Epithelzellen von vaskulärem Gewebe bereitgestellt, wobei das Verfahren durch Unterziehen des vaskulären Gewebes zu Bedingungen erzielt wird, welche für ein Dissoziieren von Zellen von dem vaskulären Gewebe ausgelegt sind, dadurch Erhalten einer gemischten Population von dissoziierten Zellen, dadurch Erhalten einer gemischten Population von einzelnen Zellen; und Isolieren von Zellen größer als 50 μm von der gemischten Population von Zellen.
Gemäß weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung ist das vaskuläre Gewebe menschliches vaskuläres Gewebe.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung werden die Zellen kleiner oder größer als 50 μm mittels Filtration, Morphometrie und Densitometrie isoliert.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung wird die Filtration mittels eines Filters bewirkt, der eine Porengröße kleiner als 50 μm aufweist.
Gemäß zu einem noch weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ist eine Zellkultur bereitgestellt, welche eine Population vaskulogenischer Vorläuferzellen umfasst, welche in einem proliferativen Zustand für zumindest 14 Tage gehalten werden können und in glatte Muskel-, Endothel- und/oder blutbildende Zellen bei Aussetzung gegenüber mindestens einem Wachstumsfaktor differenzieren können, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus vaskulärem Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Angiopoietin (Ang), Blutplättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Ephrin (Eph), Fibroblastwachstumsfaktor (FGF), Tumorwachstumsfaktor (TGF), Wachstumsfaktor der Placenta (PlGF), Cytokine, Erythropoietin, Thromboietin, Tranferrin, Insulin, Stammzellfaktor (SCF), Granulocytenkolonie stimulierender Faktor (G-CSF) und Granulocytenmacrophagenkolonie stimulierender Faktor (GM-CSF).
Gemäß weiterer Merkmale in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung kann die Population vaskulogenischer Vorläuferzellen zumindest ein exogenes Polypeptid exprimieren, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmarkern, Zelloberflächenantigenen, angiogenen Faktoren, vaskulogenischen Faktoren und blutbildenden Faktoren.
Gemäß noch weiteren Merkmalen in bevorzugten Ausführungsformen der nachstehend beschriebenen Erfindung wird das exogene Polypeptid auf eine induzierbare Art exprimiert.
Mit Ausnahme einer anderen Festlegung weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftliche Begriffe die gleiche Bedeutung auf, wie allgemein von einem Fachmann verstanden, zu welchem diese Erfindung gehört. Obgleich Verfahren und Materialen ähnlich oder äquivalent zu jenen in der Durchführung oder Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, die hierin beschrieben sind, sind geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere hierin erwähnte Bezüge sind mittels Bezug in ihrer Gesamtheit eingefügt. Im Konfliktfall wird die Patentbeschreibung, einschließlich von Definitionen, bestimmend sein. Darüber hinaus sind die Materialien, Verfahren und Beispiele ausschließlich illustrativ und nicht beabsichtigt limitierend zu sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird hier ausschließlich beispielhaft unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen ausführlich beschrieben. Mit spezifischem Bezug nun auf die Zeichnungen im Detail wird betont, dass die gezeigten Angaben nur beispielhaft sind und für Zwecke einer illustrativen Erörterung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausschließlich dienen, und als der Anlass zur Bereitstellung dargelegt sind, was angenommen wird, am meisten nützlich und am besten verständliche Beschreibung der Prinzipien und konzeptualen Gesichtspunkte der Erfindung zu sein. In diesem Hinblick wird kein Versuch unternommen, strukturelle Details der Erfindung ausführlicher zu zeigen, als es für ein grundlegendes Verständnis der Erfindung notwendig ist, wobei die Beschreibung mit den Zeichnungen genommen wird, dem Fachmann offensichtlich zu machen, wie die verschiedenen Formen der Erfindung in Praxis ausgeführt sein können.
In den Zeichnungen:
Stellen die 1A–I einen Entwurf und mikroskopische Aufnahmen dar, welche die kulturbasierte Selektion menschlicher ES Zell-Abgeleiteter vaskulogenischer Vorläuferzellen zeigen. 1A zeigt den Entwurf des Differenzierung-Selektionsvorgangs. 1B ist eine Serie von mikroskopischen Aufnahmen, welche die divergierende Morphologie der Zellen nach dem 6 Tag Kultivierung auf Collagen zeigen: Bemerke die großen, flachen, Fiber-Tragenden Zellen (Pfeile) und die kleineren, abgeflachten Zellen mit großen Nuklei (Pfeilspitzen). 1C ist eine Serie von Graphen, welche eine FACS Analyse von Endothelzelloberflächenmarkern in den filtrierten, isolierten vaskulogenischen Vorläuferzellen zeigen. Filtrierte Zellen wurden primären Antikörpern zu VE-Cadhedrin (VE-cad), VEGFR2 (VEGFR2) und Fluoreszenz markierten Anti-IgG oder dem sekundären Antikörper alleine (IgG-FITC) ausgesetzt. Bemerke den hohen Anteil von Zellen (78%), welche VE-cad exprimieren. Die 1D–E sind Fotografien, welche die indirekte immunomorphologische Analyse einer VE-cad Expression auf filtrierten, isolierten, vaskulogenischen Vorläuferzellen zeigen. Immunofluoreszenzfärbung von fixierten und ausplattierten 12-Stunden Kulturen der filtrierten Zellen zeigen eine starke Lokalisierung von VE-cad bei Zell-Zell anhaftenden Verbindungen, welche bei größerer Vergrößerung (1E) sichtbar sind. 1F ist eine Fotografie von EtBr gefärbten Gelen, welche die Expression von Endothel- und blutbildenden Markern in den isolierten vaskulogenischen Vorläuferzellen zeigen. Expression der CD31 und Tie2 Endothelmarker und den Tal1, GATA2 und AG133 frühen vaskulären Vorläufermarkern wurde in gesamt RNA von den kleineren, flachen filtrierten Zellen (filtriert) und den nicht differenzierten menschlichen embryonalen Stamm (hES) Zellen durch RT-PCR verglichen. Der Haushaltsmarker GAPDH dient als ein interner Standard einer Amplifikation. Bemerke den hervorragenden, Endothel-, glatten Muskel und blutbildende (ESH)-spezifische Expression der CD31, Tie2, Tal1 und GATA2 Marker. 1G ist eine Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der größeren, flachen Zellen, welche durch Filtration zurückgehalten wurden, und zeigt die Anwesenheit des Epitheliod-Phänotyp glatten Muskelzellmarkers α-sma, welcher in den kleineren, menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen nicht nachgewiesen wird. 1H ist eine Fotografie von EtBr gefärbten Gelen, welche die Expression von Epitheliodmarkern in den isolierten, größeren zurückgehaltenen Zellen zeigt. Expression der Calponin, Caldesmon, glatten Muskelactin (SMA) und SM-MHC Markern wurde in gesamt RNA von den größeren, flachen zurückgehaltenen Zellen (zurückgehalten), und den kleineren, menschlichen vaskulären Vorläufer (filtriert) Zellen durch RT-PCR verglichen. Der Haushaltsmarker GAPDH dient als ein interner Standard für eine Amplifikation. Bemerke die Abwesenheit einer Expression aller der glatten Muskelzellmarkern in den menschlichen vaskulären Vorläuferzellen und ihre bedeutende Expression in den zurückgehaltenen Zellen. 1I ist eine mikroskopische Aufnahme einer BrdU Aufnahme in sowohl kleinere, filtrierte (linke Tafel) als auch größere, zurückgehaltene Zellen (rechte Tafel), was die aktive Proliferation der kleineren, menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen zeigt. Bemerke die aktive Aufnahme von BrdU in die kleineren, dunkleren Zellnuklei, welche mit der minimalen Aufnahme in die größeren, nicht poliferierenden zurückgehaltenen Zellen (Pfeil) kontrastieren. Der Balken entspricht 100 μm.
Sind die 2A–M mikroskopische, Immunofluoreszenz und RT-PCR Studien von kultivierten gewöhnlichen menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen, welche eine spezifische wachstumsfaktor-mediierte Induktion von Endothel- oder glatten Muskellzellcharakteristika zeigen. 2A ist eine Fotografie von EtBr gefärbten Gelen, welche die Expression von glatten Muskelzellmarkern in gewöhnlichen menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen zeigt, welche auf Typ IV Collagen bei 2,5 × 10⁴ Zellen/cm² für 10–12 Tage mit 10 ng/ml hPDGF-BB rekultiviert sind (R und D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA). Expression der glatten Muskelzellmarkern Caldesmon, glattes Muskelactin (SMA), Calponin, SM22α und SM-MHC Markern wurde in gesamt RNA von dem mit Wachstumsfaktor behandelten Zellen (v-SMC) und den nicht behandelten menschlichen vaskulären Vorläufer (ESH Vorläufer) Zellen durch RT-PCR verglichen. Der Haushaltsmarker GAPDH dient als ein interner Standard für eine Amplifikation. Bemerke die Abwesenheit einer Expression aller der glatten Muskelzellmarker in den ESH Zellen und ihre bedeutende Expression in den hPDGF-BB behandelten Zellen. 2B–E sind fotomikroskopische Aufnahmen eines Immunofluoreszenznachweises von glatten Muskelzellmarkern, welche in dem menschlichen Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (hPDGF)-BB-behandelten menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen exprimiert sind. Fixierte Präparationen von behandelten Zellen wurden mit primären Antikörpern eingefärbt gegen: αSMA (2B); Smoothelin (2C), SM-MHC (2D) und Calponin (2E), mit fluoreszierenden sekundäre Antikörpern Immunonachgewiesen und mittels Fluoreszenzmikroskopien visualisiert. Bemerke die Färbung von sowohl Epitheliod- und spindelgeformten Zelltypen in den Wachstumsfaktor behandelten Kulturen. 2F–H sind fotomikroskopische Aufnahmen, welche den Nachweis von Endothelzellmarkern zeigen, welche in menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen exprimiert sind, die auf Typ IV Collagen bei 2,5 × 10⁴ Zellen/cm² für 10–12 Tage mit 50 ng/ml hVEGF₁₆₅ rekultiviert sind (R und D Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA). Wachstumsfaktor behandelnde Zellen wurden wie vorstehend beschrieben fixiert und mit Anti-VEcad (2F) oder Anti-von Willebrand Factor (vWF) (2G) Antikörpern immunonachgewiesen. Bemerke die Lokalisierung der Anti-vWF Färbung in den Weibel-Palade Körpern (2G). Aufnahme von Dill-markiertem ac-LDL (10 μg/ml, 4 Stunden, 37°C) (2H) wurde ebenso nachgewiesen (2H). 2I und 2J sind mikroskopische Aufnahmen einer BrdU Aufnahme in sowohl blutplättchenabgeleiteten (PDGF) (2J) als auch vaskuläres Endothel- (VEGF) (2I) Wachstumsfaktor-behandelte vaskulogenische Vorläuferzellen, welche eine aktive Proliferation (Färbung) der Zellen vom Endothel-Typ zeigen. Bemerke das Erscheinen von Stressfibern (2E, Pfeil) und die aktive Aufnahme von BrdU in die dunklen Zellnuklei der VEGF-behandelten Zellen (2I), welche zu der verringerten Aufnahme der größeren hPDGF-BB behandelten Zellen (2J) kontrastiert sind. 2K–2M sind mikroskopische Aufnahmen blutbildender Kolonien, welche von menschlichen vaskulogenischen Vorläuferzellen gebildet sind. ESH Zellen wurden selektiert und in einem halbfesten Medium kultiviert, welches mit Cytokinen supplementiert ist, um eine blut bildende Differenzierung zu fördern. Bemerke das charakteristische Erscheinen von blutbildenden Kolonien (CFU), welche nach 12 Tagen Inkubation nachgewiesen wurden.
Sind die 3A–G fotomikroskopische Aufnahmen (3A–D) und elektronenmikroskopische Aufnahmen (3E–G), welche vaskuläre Strukturbildung in Wachstumsfaktor-behandelten menschlichen vaskulären Vorläufer (ESH) Zellen zeigen. Aggregierte (24 Stunden in Differenzierungsmedium, welches mit 50 ng/ml hVEGF₁₆₅ und 10 ng/ml hPDGF-BB supplementiert bzw. unterstützt wird) ESH Zellen, welche auf Typ I Collagen (3A) oder in Matrigel (3B) platziert wurden, zeigen vaskuläre Bildung nach 7 Tagen Wachstum (Bemerke Sprießen und röhrenförmige Strukturen in beiden Histologieschnitten). Toluidinblau gefärbte Schnitte der gleichen Präparation zeigten Endothelzell-Eindringen und Bilden einer vaskulären-Netzwerkstruktur in dem Matrigel (3C) und, mit höherer Vergrößerung, eine weiße Blutzelle, welche in einem Gefäß gebildet ist (Pfeil, 3D). Der Balken entspricht 100 μm (3A–C) (3D) Die 3E–G sind elektronenmikroskopische Aufnahmen einer Gefäßbildung in Matrigel, welche gut geformte Weibel-Palade Körper zeigen (3E, X6.000 Vergrößerung, Einsatz, X12.000), typisch für Endothelzellen. 3F zeigt klar die Anwesenheit einer dunklen Färbung (aufgrund von Hämoglobin) Blutzelle (BC) in dem Mittelpunkt eines Gefäßes, welches durch verlängerte Endothelzellen (EC) in dem Matrigel (M) (X5.000 Vergrößerung) gebildet ist. Die 3G zeigt eine gewöhnliche Anordnung von Endothelzellen (N-Nucleus) in dem Matrigel (M), welche ein klar unterscheidbares Lumen (Lu) enthält, charakteristische Lipoproteinkapseln (Li), Weibel-Palade Körper (WP) und Glycogen (G) (3G, X5.000 Vergrößerung).
Sind die 4A–B fotomikroskopische Aufnahmen von Histologieschnitten, welche die in-vitro Vaskularisierung von 3-D Alginatgerüsten durch menschliche vaskulogenischen Vorläufer (ESH) Zellen zeigen. ESH Aggregate wurden auf ein 1f120 50 μl Alginatgerüste in-vitro in Differenzierungsmedium platziert, welches mit 50 ng/ml hVEGF₁₆₅ und 10 ng/ml hPDGF-BB supplementiert ist, und für 14 Tage inkubiert. Die 4A zeigt eine Gefäßbildung um zwei repräsentative Gerüstporen. Eine größere Vergrößerung (4B) zeigt gewöhnliche vaskuläre Wandstruktur von verlängerten flachen Endothelzellen mit einer angrenzenden Schicht glatter Muskelzellen. Der Balken entspricht 100 μm.
Sind die 5A–B zwei Serien von photomikroskopischen Aufnahmen, welche die Sensitivität von ESH-abgeleitetem vaskulären Gewebe auf Inhibitoren einer Angiogenese zeigen. ESH Aggregate wurden auf Matrigel platziert und für 7 Tage in Differenzierungsmedium inkubiert, welches mit 50 ng/ml hVEGF165 und 10 ng/ml hPDGF-BB allein (5A) oder mit der Zugabe von 50 μg/mg Angiogenese inhibierendem Anti-VE-cad monoklunarem Antikörper (Klon BV6, CHEMICON INTNL, Inc. Temecula CA, USA) (5B) supplementiert ist. Bemerke das Fehlen zellulärer Vorsprünge und die Abwesenheit von Röhren und Netzwerkstrukturen in den Anti-VE-cad behandelten Kulturen (5B). Balken – 100 μm.
Zeigen die 6A–B kultivierungsbasierende Anreicherung von vaskulogenischen Vorläuferzellen, welche von hES-Zellen abgeleitet sind. 6A zeigt einen Entwurf der Anreicherungsprozedur. Die 6B ist eine invertierte lichtmikroskopische Aufnahme von 6 Tage alten hES Zellaggregaten, welche auf Typ IV Collagen kultiviert sind. Diese Aufnahme zeigt nicht differenzierte hES-Zellen (Pfeile) und verschiedene Typen von differenzierten Zellen. Die 6C zeigt eine invertierte Lichtmikroskopische Aufnahme von 6 Tage alten Einzel-Zell-Suspensions-Kulturen, welche zwei Zelltypen zeigen: große flache Zellen mit Fiberanordnung (Pfeil) und kleinere flache Zellen mit großen Nuklei. Die 6D ist eine FACS Analyse der filtrierten Zellen für VE-cad, CD31 und VEGFR2. 6E ist eine indirekte Immunofluoreszenzanalyse, welche Expressionen zeigen von: (i) Punktierte (punctate) Oberfläche CD34 (wie bereits für menschliche v-SMCs Vorläufern berichtet), (ii) Nuklei Gata2 und (iii) Tal1. Die 6F zeigt Zellproliferation der kleineren und größeren Vorläufer mittels: (i und ii) BrdU Aufnahme (vorliegend in den kleineren Vorläuferzellen und nicht in größeren Zellen (Pfeil) und (iii) Ki67 Expression im Nukleus, welche in 66 ± 2% der filtrierten Zellen vorliegt. Die Nuklei sind mit Dapi (1:1000) gefärbt. Balken – 100 μm.
Zeigen die 7A–D eine Liniendifferenzierung in Vorläuferzellen. 7A – Filtratzellen, welche mit 50 ng/ml hVEGF 165 für 10–12 Tage rekultiviert wurden, wurden auf eine Dil-Ac-LDL Aufnahme untersucht (Zellen in hellem Licht auf der linken und mit Fluoreszenzbeleuchung auf der rechten). 7B – einzelne isolierte Zellen wurden untersucht auf: (i) Dil-Ac-LDL Metabolismus (ii) perinucleares vWF, (iii) sowohl (i) als auch (ii). 7C – Filtratzellen, welche mit 10 ng/ml hPDGF-BB für 10–12 Tage rekultiviert wurden, zeigten eine Heraufregulierung einer SMA Expression in den spindelähnlich geformten Zellen. 7D – RT-PCR Analyse zeigte eine Heraufregulierung in zusätzlichen v-SMC Markern. Die Nuklei wurden mit Dapi (1:1000) gefärbt. Balken – 100 μm.
Zeigen die 8Ai–Biii klonale Analyse von VE-cad+ Zellen. 8A(i) zeigt eine gewöhnliche 8 Tage alte Kolonie, welche von einer einzelnen VE-cad+ Zelle gebildet wird. Zwei verschiedene Zellformen werden beobachtet: Eine endothelzellähnliche Morphologie [8A(ii)] und spindelähnliche Morphologie (Pfeile), welche an v-SMC erinnert [8A(iii)]. Spindelförmige Zellen exprimierten SMA [8B(i)] und Calponin [8B(ii)]. Die 8B(iii) zeigt Ac-LDL Metabolismus in einer Kolonie, welche mit VEGF supplementiert ist. Die Nuklei sind mit Dapi gefärbt. Balken – 100 μm.
Sind die 9Ai–Ciii fotomikroskopische Aufnahmen von Histologieschnitten, welche Blut und Blutgefäße zeigen, welche in Alginatgerüsten gebildet sind, welche mit menschlichen ES vaskulogenischen Vorläuferzellen platziert und subkutan in SCID Mause transplantiert sind. Die 9A zeigt unreife Blutgefäße, welche eine dünne Schicht von Endothelzellen aufweisen, die in nicht platzierten (Kontrolle) Gerüsten gebildet sind. Die 9B zeigt dicke Blutgefäße, welche in zellplatzierten Gerüsten gebildet sind. Die 9C zeigt Blutgefäße menschlichen Ursprungs, welche in zellplatzierten Gerüsten gebildet sind und durch anti-human SMA Färbung identifiziert sind. Pfeile zeigen auf Mausblutfluss in der menschlichen Vaskulatur. Balken – 100 μm.
Ist die 10 eine schematische Darstellung der Flusskammer, welche für eine Bewertung der Wirkung von Scherstress auf vaskulogenische Zellen verwendet wird.
Sind die 11A–B sind fotomikroskopische Aufnahmen, welche vaskulogenische glatte Muskelzellen (v-SMC) zeigen, welche von hES vaskulogenischen Vorläuferzellen nach einem Aussetzen gegenüber flussinduziertem Scherstress abgeleitet sind. Die v-SMC Zellen wurden für aSMA (rot), Phalloidin (grün) und Nuklei in To-pro 3 (blau) gefärbt.
Zeigt die 12 RT-PCR Analysen von differenzierten Kulturen von hES-abgeleiteten vaskulogenischen Vorläuferzellen. Die Zellen wurden in geringem Serum (2%) oder hohem Serum (10%) Differenzierungsmedien kultiviert, welche mit Wachstumsfaktoren (VEGF, Ang2 oder IGF) supplementiert sind. Die Analysen wurden unter Verwendung genetischer Marker von Endothelzellen (ECs), vaskulären glatten Muskelzellen (v-SMCs) und Wachstumsfaktoren durchgeführt; – und + zeigen jeweils negative (ohne Templat) und positive Kontrollen.
Zeigt die 13 Echtzeit RT-PCR Analysen differenzierter Kulturen von hES-abgeleiteten vaskulogenischen Vorläuferzellen. Die Zellen wurden in geringem Serum (2% v/v) oder hohem Serum (10% v/v) Differenzierungsmedien kultiviert, welche mit VEGF supplementiert sind. Die Analysen wurden unter Verwendung von v-SMCs Markern (SM-MHC und α-SMA) durchgeführt.
Zeigt die 14 Echtzeit RT-PCR Analysen von differenzierten Kulturen von hES-abgeleiteten vaskulogenischen Vorläuferzellen. Die Zellen wurden in geringem Serum (2% v/v) oder hohem Serum (10% v/v) Differenzierungsmedien kultiviert, welche mit VEGF supplementiert sind. Die Analysen wurden unter Verwendung von EC Markern (Tier2 und CD31) durchgeführt.
Sind die 15A–B fotomikroskopische Aufnahmen, welche ein Sprießen und vaskulaturähnliche Organisation von differenzierten Zellen zeigen, welche von hES vaskulogenischen Vorläuferzellen abgeleitet sind und in hohem Serum Differenzierungsmedium (10% v/v; 15A) und in geringem Serum Diffenzierungsmedium (2% v/v; 15B) kultiviert sind.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung besteht aus neuen Verfahren, welche für eine einfache und kostengünstige Präparation vaskulogenischer Vorläuferzellen verwendet werden kann, und Zellkulturen und Zusammensetzungen davon, welche beispielsweise von menschlichen Stammzellen hergestellt sind. Die vorliegende Erfindung kann insbesondere für ein Isolieren vaskulogenischer Vorläuferzellen von Stammzellen verwendet werden und für ein in-vitro Wachstum und Differenzierung der isolierten vaskulogenischen Vorläuferzellen für eine Verwendung in beispielsweise Gewebetechnik, Angiogeneseforschung und therapeutischen und diagnostischen Anwendungen.
Die Prinzipien und Durchführung der vorliegenden Erfindung können mit Bezug auf die Zeichnungen und beigefügte Beschreibungen besser verstanden werden. Bevor zumindest eine Ausführungsform der Erfindung detailliert erläutert wird, sollte es klar sein, dass die Erfindung in ihrer Anwendung nicht auf die Details der Zusammensetzung und die Anordnung der Bestandteile begrenzt ist, welche in der nachstehenden Beschreibung ausgeführt oder in den Zeichnungen dargelegt sind. Die Erfindung ist zu anderen Ausführungsformen in der Lage oder kann auf verschiedene Arten praktiziert oder durchgeführt werden. Es sollte ebenso klar sein, dass die hier verwendete Ausdrucksweise und Terminologie für die Zwecke einer Beschreibung dient und nicht als limitierend angesehen werden sollte.
Jüngste Forschungsstudien haben gezeigt, dass embryonale Zellen möglicherweise als eine Quelle für pluripotente Zellen dienen können. Derartige Zellen sind bei einer Humantherapie von Nutzen, da sie die Befähigung aufweisen, in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren (R. A. Pedersen, Sci. Am. 1999, 280:68). Frühe Arbeit auf embryonale Stammzellen wurde unter Verwendung von Inzuchtmausstämmen als ein Modell durchgeführt. Im Vergleich zu Maus ES-Zellen haben sich Affen und menschliche pluripotente Zellen als wesentlich zerbrechlicher erwiesen und reagieren nicht auf die gleichen Kultivierungsbedingungen und Handhabungen.
Jüngst wurden embryonale Stammzellen (hES) und Keimlinien (hEG) Zellen isoliert und in Kultur gehalten. Sowohl menschliche embryonale hES als auch hEG Zellen weißen die lang gefragten Charakteristika von menschlichen pluripotenten Stammzellen auf, sie können in-vitro ohne Differenzierung andauernd proliferieren, sie behalten einen gewöhnlichen Karyotypen bei, und sie behalten die Befähigung bei zur Erzeugung aller erwachsener Zelltypen zu differenzieren. Eine spontane somatische Differenzierung von hES und hEG Zellen in Kultur findet allerdings ohne irgendein beständiges Muster einer strukturellen Organisierung statt, was multizelluläre Aggregate von Zellpopulationen mit einer höchst heterogenen Mischung von Phänotypen erzeugt, und ein Spektrum verschiedener Zelllinien darstellt (Reubinoff, BE, et al., Nat. Biotech 2001; 19:1134).
Untersuchungen im Stand der Technik beschreiben verschiedene Verfahren, welche für eine Isolierung von Vorläuferzellen spezifischer Zelltyplinien von ES-Zellen geeignet sind, wobei derartige Verfahren jedoch für gewöhnlich extrem komplex und kostenaufwendig sind. Anfänglich werden menschliche embryonale Stammzellen entweder auf einer Säugerstromazellschicht wachsen gelassen (siehe beispielsweise US-P. 6,280,718 Kaufman, D. S. und Thomson, J. A.), in einem lebenden Wirt wie einem Teratoma (Thomson J. A. et al., Science 1998; 282:1145-47) oder in Suspension in eine multizellulare Struktur aggregiert, welche als der Embryoidkörper (EB) bekannt ist (siehe beispielsweise WO 00/70021 Itskovitz-Eldor, J. und Benvenisty, N.; und WO 02/10347 Benvenisty, N.), und ausgesetzt gegenüber Differenzierungsfaktoren, wobei für gewöhnlich eine gemischte Population von Zelltypen und Linien erzeugt wird. Eine Isolierung von Vorläuferzellen spezifischer Linien wird anschließend auf der Grundlage eines Immunonachweises von linienspezifischen Markern durchgeführt und Trennung von Zelllinien durch Fluoreszenz oder magnetisches Sortieren (siehe beispielsweise WO 01/81549 Rambhatla, L. und Carpenter, M. K.; US-P. 6,280,718 Kaufman, D. S. und Thomson, J. A.; WO 01/29206 Cibelli, J. et al.; und WO 01/68815 Pera, M. F. und Ben-Hur, T.). Alle der vorstehend aufgeführten Verfahren leiden an ähnlichen Nachteilen: Anfängliche ES Differenzierung in Vorläuferzellen bezieht viele komplexe Handhabungen und Wechselwirkungen mit der stromalen Zellschicht, lebenden Wirtgeweben oder anderen EB Zellen ein. Darüber hinaus ist eine Selektion gemäß einer Expression oder Anzeigen bzw. Display von Zelloberflächenmarkern nicht effizient, benötigt sogar umfangreichere Handhabungen, was große Ausgaben für Reagenzien und Nachweisausrüstung nach sich zieht und die Lebensfähigkeit und Sterilität der Vorläuferzellen gefährdet.
Bei Reduzieren der vorliegenden Erfindung auf die Praxis haben die vorliegenden Erfinder enthüllt, dass vaskulogenische Vorläuferzellen einfach und kostengünstig von embryonalen Stammzellen durch Verhindern einer Aggregation, Kultivieren auf Typ IV Kollagen mit spezifischen Endotheldifferenzierungsfaktoren und Anwenden einfacher und effizienter Größenselektionsverfahren hergestellt werden können. Die vaskulären Vorläuferzellen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sind vorteilhaft dadurch, dass sie in Kultur weiter expandiert werden können, für eine Differenzierung in Endothel-, murales und blutbildendes Gewebe in-vitro induziert werden können, sowohl kleine als auch große vaskuläre Strukturen bilden, falls sie auf ein geeignetes Substrat platziert werden, und genetisch manipuliert werden können, und für Gewebetechnik, Diagnose und Forschungszwecke geeignet sind.
Daher wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung vaskulogenischer Vorläuferzellen von nicht differenzierten ES Zellen, wie beispielsweise menschlichen ES Zellen, bereitgestellt. Das Verfahren wird gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch Kultivieren einzelner nicht differenzierter ES-Zellen auf eine Art bewirkt, welche für ein Induzieren einer Differenzierung der nicht differenzierten ES-Zellen in vaskulogenische Vorläuferzellen geeignet ist, dadurch Erhalten einer gemischten Population von Zellen und Isolieren von Zellen kleiner als 50 μm von der gemischten Population von Zellen. Auf diese Art isolierte Zellen stellen vaskulogenische Vorläuferzellen dar, wie es in dem nachstehend aufgeführten Beispielsabschnitt klar gezeigt wird.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "vaskulogenische Vorläuferzellen" eine Population von Zellen, welche Nachkommen erzeugen können, welche Endothel- oder glatte Muskelvorläufer sind (wie beispielsweise Angioblasten) oder reife Endothel- oder glatte Muskelzellen, oder einen blutbildenden Vorläufer (wie beispielsweise Erythroidkolonie bildende Einheiten und Megakaryozyten) oder reife Blutzellen (wie beispielsweise Erythrocyten und Leukozyten). Für gewöhnlich exprimieren vaskulogenische Vorläuferzellen einige der phänotypischen Markern, welche für die Endothel-, glatten Muskeln und blutbildenden Linien charakteristisch sind. Für gewöhnlich erzeugen sie keine Nachkommen von anderen embryonalen Keimschichten, falls sie durch sich selbst in-vitro kultiviert werden, bis sie de-differenziert oder wieder programmiert werden. Es wird klar sein, dass es nicht impliziert ist, dass jede der Zellen in der Population die Kapazität zur Bildung mehr als eines Typs eines Nachkommens bzw. Abkömmlings aufweist, obgleich einzelne Zellen vorliegen können, welche multipotente vaskulogenische Vorläuferzellen darstellen.
Wie hier verwendet betreffen die Ausdrücke "totipotent", "pluripotent" und "multipotent" Zellen mit abnehmenden Graden einer entwicklungsmäßigen Plastizität. Totipotente Zellen können sich in alle Zelltypen oder vollständige Organismen (beispielsweise Blastomere) entwickeln, pluripotente Zellen können sich in alle Zelltypen entwickeln (beispielsweise ES Zellen) und multipotente Zellen können in zellenspezifischer Linien ausschließlich differenzieren (beispielsweise vaskulogenische Vorläuferzellen).
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "Endothelvorläuferzelle" oder "Endothelprekursorzelle" eine Zelle, welche reife Endothelzellen erzeugen kann. Diese Zellen können oder können nicht die Kapazität aufweisen, blutbildende oder glatte Muskelzellen zu bilden.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "Epithelvorläuferzelle" oder "Epithelprekursorzelle" eine Zelle, welche reife glatte Muskelzellen erzeugen kann.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "blutbildende Vorläuferzelle" oder "blutbildende Prekursorzelle" eine Zelle, welche reife Blutzellen erzeugen kann.
Embryonale Stammzellen werden als "nicht differenziert" beschrieben, falls ein wesentlicher Anteil von Stammzellen und ihrer Derivate in der Population morphologische Charakteristika nicht differenzierter Zellen zeigen, was sie eindeutig von differenzierten Zellen embryonalen oder erwachsenen Ursprungs unterscheidet. Nicht differenzierte ES-Zellen können von dem Fachmann leicht erkannt werden, und erscheinen für gewöhnlich in einer mikroskopischen Ansicht als Zellen mit hohen Nuklear/Cytoplasma Verhältnissen und bedeuteten Nukleoli. Ähnlich dazu können nicht differenzierte Zellen von differenzierten Zellen durch die Abwesenheit von linienspezifischen Markern, wie beispielsweise vaskularem Endothelwachstumsfaktor Rezeptor 2 (VEGFR2), vaskularem Endothel- Cadherin (VE-cad) oder Blutplättchen-Endothelzelladhäsionsmolekül-1 (PECAM-1) unterschieden werden.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "differenzierte Zelle" eine Zelle, welche einen entwicklungsmäßigen Weg abwärts durchlaufen ist. Pluripotente embryonale Stammzellen können daher in linienbeschränkten Vorläuferzellen differenzieren, wie beispielsweise einen neuralen Vorläufer, Hepatozytenvorläufer oder blutbildende Zellen, welche jeweils für neurale Zellen, Hepatozyten oder Blutzelltypen pluripotent sind; und die vorstehend aufgeführten Endothel-, glatte Muskel und Blutzelltypen. Diese können wiederum in andere Typen von Vorläufern weiter abwärts in den Wegen differenziert werden, oder zu einer Endstadium differenzierten Zelle, welche für einen spezifischen Gewebetyp charakteristisch ist und die Befähigung zur weiteren Proliferation beibehalten oder nicht beibehalten kann. Vaskuläres Endothel, muraler glatter Muskel und Erythrozyten sind Beispiele von zu Ende bzw. begrenzt differenzierten Zellen.
Wie vorstehend erwähnt werden einzelne, nicht differenzierte ES-Zellen auf eine Art kultiviert, welche für ein Induzieren einer Differenzierung in vaskulogenische Vorläuferzellen geeignet ist. Die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht differenzierten ES-Zellen können embryonale Stammzellen von einem Säuger sein, welche von frischen oder cryogelagerten embryonalen Zellmassen erhalten werden, Zellen von in-vitro-befruchteten Zellmassen und/oder kultivierten ES Zelllinien. Die ES-Zellen können von menschlichem oder nicht menschlichem Ursprung sein.
Wie es in dem nachstehend aufgeführten Beispielabschnitt eindeutig gezeigt wird, sind die Verfahren und Zusammensetzungen während der vorliegenden Erfindung für eine Verwendung mit menschlichen embryonalen Stammzellen geeignet. Da eine Etablierung von Verfahren zur Handhabung und Kontrolle einer menschlichen embryonalen Stammzellen differenzierung ein Hauptziel gegenwärtiger medizinischer und wissenschaftlicher Bemühungen ist, sind in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die nicht differenzierten ES-Zellen menschliche ES Zellen. Die ES-Zellen sind vorzugsweise nicht aggregierte Zellen, wie es in dem nachstehend ausgeführten Beispielsabschnitt detailliert beschrieben ist.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Differenzierung der einzelnen nicht differenzierten ES-Zellen durch Kultivieren derartiger Zellen auf Platten bewirkt, welche mit einem anhaftenden Substrat, wie beispielsweise Typ IV Collagen, Laminin oder Gelatine beschichtet sind, um eine Aggregation der ES-Zellen zu vermeiden, Platzieren der Zellen bei einer Konzentration zwischen 2 × 10⁴ und 1 × 10⁵ Zellen/cm², und Bereitstellen eines Differenzierungsmediums. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform werden einzelne nicht differenzierte ES-Zellen auf Typ IV Collagen-beschichteten Platten wachsen gelassen (verfügbar von beispielsweise Cell Cultureware, BD-Falcon, Boston, MA). Siehe den Beispielsabschnitt für eine weitere Beschreibung von Bedingungen für eine Differenzierung von ES Zellen.
Ein wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Methodik besteht in dem Zellplazierungsschritt (Zell-Aussaat-Schritt). Während die vorliegende Erfindung auf Praxis reduziert wurde, wurde beobachtet, dass eine 3-dimensionale Embryoidkörperstruktur nicht benötigt war, wie es zuvor für eine mesodermale Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen behauptet wurde. Nicht differenzierte hES Zellen, welche von ihrer Nähr-Schicht entfernt wurden und als einzelne Zellen auf Typ IV Collagen mit Differenzierungsmedium plattiert wurden, wiesen eine Expression von Indikatoren einer Endotheldifferenzierung auf (1A–G). Eine Zellplatzierungskonzentration beeinflusste drastisch die Wirksamkeit der vorliegenden Methodik: Zellen, welche gemäß Studien nach dem Stand der Technik mit Maus ES platziert wurden (Yamashita, J. et al. Nature, 2000; 408:92) waren nicht lebensfähig; wobei derartige hohe Konzentrationen (1,0–1,5 × 10⁵ Zellen/cm²) von hES-Zellen zu einer heterogenen Population führten. Geringere Zellplatzierungskonzentration (5 × 10⁴ – 1 × 10⁵ Zellen/cm²) erzeugte eine festgelegte Zellpopulation, einschließlich einer Mehrzahl von kleinen, flachen Endothelähnlichen Zellen und weniger großen, glatten muskelähnlichen Zellen (1B).
Der nachstehende Beispielsabschnitt stellt eine weitere Beschreibung von Verfahren zur Kultivierung "einzelner nicht differenzierter ES Zellen" unter nicht aggregierenden Bedingungen bereit.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "Differenzierungsmedium" ein geeignetes Medium, welches ein Wachstum und eine Differenzierung der ES-Zellen unterstützen kann. Beispiele für geeignete Differenzierungsmedien, welche mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen eine Vielzahl von Wachstumsmedien, welche mit einer Basis von alpha MEM Medium (Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA) oder Dulbecco's minimalem wesentlichen Medium (DMEM) hergestellt sind, supplementiert mit 10% FBS (HyClone, Logan, UT, USA) und 0,1 mM β-Merapoethanol (Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA).
Wie vorstehend erwähnt wurde, wurde beobachtet, dass ein Kultivieren der nicht differenzierten ES Zellen, wie vorstehend detailliert ausgeführt wurde, eine festgelegt Population von Zellen erzeugt, umfassend eine Mehrheit von kleinen, flachen endothelähnlichen Zellen und weniger großen, glatten muskelähnlichen Zellen (1B).
Während vorherige Techniken für eine Selektion von spezifischen Linienvorläufern auf einem Immunonachweis von Indikatoren einer Differenzierung und spezifischen Zelllinien und Fluoreszenz oder magnetischem Zellsortieren abhängen (siehe beispielsweise WO 02/10347 Benvenisty, US-P. 6,280,718 Kaufman, D. S. und Thomson, J. A., WO 01/29206 Cibelli, J. et al.) sind diese Verfahren mühselig und kostenaufwendig. Die beobachteten morphologischen Eigenschaften der gemischten Population von Zellen, welche gemäß der Lehren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, ermöglichen eine einfache und schnelle Isolierung von vaskulogenischen Vorläuferzellen davon. Wie in dem nachstehend aufgeführten Beispielsabschnitt aufgeführt, ermöglicht eine Selektion von Zellen kleiner als 50 μm eine schnelle und effiziente Isolierung vaskulogenischer Vorläuferzellen von einer gemischten Population von Zellen (1C–F).
Daher wird bei der vorliegende Methodik ein Schritt einer Größen/Morphologieselektion folgend einer Differenzierung verwendet. Eine derartige Größen/Morphologieselektion kann durch Verwenden verschiedener Filtrations-, Morphometrie- und/oder Densitometriemethoden bewirkt werden, wie es weiter nachstehend beschrieben wird.
Verfahren zur Filtration sind im Stand der Technik gut bekannt, wie beispielsweise die Passage durch ein Netz, Sieb, Filter und ähnliches. Filter können eine faserartige Matrix oder poröses Material umfassen. Derartige Filter können einer von mehreren im Handel erhältlichen Filter sein, umfassend aber nicht beschränkt auf Zellkulturfilter von Pall Life Sciences (Ann-Arbor MI, USA) oder BD-Falcon (Boston, MA, USA). Ein bevorzugter Filter ist ein Nylonnetzfilter mit einer Porengröße von 40 μm (Cell Cultureware, BD-Falcon, Boston, MA), welcher den kleineren, endothelähnlichen Zellen ermöglicht, zu passieren und den größeren, glatten muskelähnlichen Zellen ausgeschlossen zu werden.
"Morphometrie" betrifft die Bestimmung bzw. Abmessung einer externen Form und kann mit Methoden durchgeführt werden, welche 2- und 3-D Bildanalyse umfassen, aber nicht darauf begrenzt sind. Fortgeschrittene Bildanalysensoftware, welche für eine Identifikation und Isolierung von Zellen kleiner als 50 μm geeignet ist, ist für den Fachmann im Handel erhältlich [siehe beispielsweise Metamorph Software (Universal Imaging Corp., Downing PA, USA), Imagic-5 (Image Science Software, Berlin, Deutschland) und Sterologer (Systems Planning and Analysis, Inc., Alexandria, VA, USA)] und können mit gut bekannter Lichtmikroskopie und Flusssortiertechniken für eine Selektion von Objekten gewünschten externer Charakteristika kombiniert werden (beispielsweise Größe) (für eine geeignete Vorrichtung siehe beispielsweise US-P. 6,249,341 Basiji et al.).
"Densitometrie" betrifft eine Bestimmung der optischen oder physikalischen Dichte eines Objekts. Da die kleineren, endothelähnlichen Zellen eine einzigartige und charakteristische Verteilung von Zellkomponenten aufweisen, können densitometrische Bestimmungen verwendet werden, um Kriterien für eine Separation und Isolierung von Zellen zu charakterisieren und bereitzustellen. Für eine densitometrische Isolierung von Endothel ähnlichen Zellen geeignete Geräte sind beispielsweise der MECOS-C1 Blutzelldensitometrische Analysegerät (MECOS Co., Moskau, Russland). Zellen können ebenso durch Sedimentierung durch einen präparativen Dichtegradienten getrennt werden, wie beispielsweise FICOLL^TM oder PERCOLL^TM (Amersham Biosciences, Inc. Piscataway, NJ USA) (für einen ausführlichen Überblick densitometrischer Fraktionierungstechniken siehe Pertoft, H. J., Biochem. Biophys. Methods; 44 (2000) 1–30). Die vorliegende Erfindung stellt daher eine einfache und schnelle Methode für eine Vorläuferzellerzeugung und Isolierung bereit. Seitherige Methoden für ein Isolieren derartiger Vorläuferzellen erzeugten Vorläuferpopulationen, welche wünschenswerte Proliferations-Befähigungen nicht aufwiesen, was ihre praktische Anwendung begrenzt (Reubinoff, B. E. et al., Nat. Biotech.; 18 (2000) 399–404, und Schuldiner, M. et al., PNAS USA; 97 (2000) 11307–312). Die vaskulogenischen Vorläuferzellen, welche durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, können große Zahlen identischer Zellen durch Proliferation durch zahlreiche Zellverdopplungen erzeugen.
Die Population an vaskulogenischen (vasculogenic) Vorläuferzellen, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung isoliert wird, ist durch eine Fülle an Zellen gekennzeichnet, die den endothelialen Vorläufermarker VE-Cadhedrin (1C–E) und endotheliale Marker (1F) exprimieren, und sich aktiv vermehren bzw. proliferieren, wie durch die Inkorporation von (BrdU) in den Kern angezeigt ist (1I). In der Abwesenheit eines zusätzlichen Stimulus für eine weitere Differenzierung, sind diese Zellen in der Lage eine große Anzahl an multipotenten, vaskulogenischen Vorläuferzellen zu erzeugen. Zusätzlich können die vaskulogenischen Vorläuferzellen über eine außerordentlich lange Zeitperiode durch Kryo-Konservierung gemäß eines beliebigen der Verfahren zum Konditionieren, Lager und Auftauen, die üblicherweise im Stand der Technik eingesetzt werden (siehe beispielsweise US-Patent 6,140,123 von Demetriou et al.), in einem lebensfähigen Zustand gehalten werden.
Aufgrund der Bedeutung differenzierter Zellen in verschiedenen therapeutischen Ansätzen stellt eine gerichtete Differenzierung von embryonalen Präkursor- bzw. Vorstufenzellen ein wichtiges Ziel auf dem Gebiet der Kultivierung von Stammzellen dar. Obwohl in Kultur gehaltene embryonale Stammzellen oftmals einer spontanen Differenzierung unterliegen (Thomson J.A. et al Science 1998; 282:1145–47), wurde eine gerichtete Differenzierung von Embryoid-Körper abgeleiteten Zellen (Shamblott MJ et al., PNAS USA 98 (2001), 113–18) und menschlichen ES-Zellen, die zusammen mit MEF-Zellen kultiviert wurden (Kaufman DS et al., PNAS USA 98 (2001), 10716–721) durch eine Manipulation von Umweltfaktoren gezeigt. Sie induzierte Kaufman et al. beispielsweise eine Blut-bildende Differenzierung in ES-Zellen durch Kultur mit stromalen Zellen des Knochenmarks von Mausen (Kaufman DS et al., PNAS, USA 2001; 98:10716–721 und US-Patent Nr. 6,280,718 von Kaufman, D et al.) und Carpenter ( US-Patentanmeldung Nr. 20020039724 A1 ) induzierte eine neuronale und Gliazell-Entwicklung in neuralen Vorläuferzellen durch Aussetzen an einen cAMP-Aktivator und/oder neurotropen Wachstumsfaktor. Benvenisty erzeugte pulsierende, kardiale Muskelzellen, und Nervenzell-ähnliche Zellen durch ein Aussetzen menschlicher Embryoid-Körper-Zellen an eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren (Itskovitz-Eldor, J et al., Mol Med 6 (2000), 88–95, Schuldiner, M et al., PNAS, USA 97 (2000), 11307–312 und Internationale Patentanmeldung Nr. WO 0210347 A2 von Benvenisty N). Jedoch setzten alle der vorstehend aufgeführten Verfahren entweder ein Co-Kultivieren, Embryoid-Körper-Bildung oder eine Selektion von Vorläufern durch Immunodetektion von Zelloberflächenmarkern ein.
Eine gerichtete Differenzierung der erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen kann durch Aussetzen an spezifische vaskuläre Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktoren für glatte Muskulatur, oder Blut-bildende Wachstumsfaktoren bewirkt werden.
Wie in dem nachfolgenden Beispiels-Abschnitt gezeigt, induziert ein Aussetzen der vaskulogenischen Vorläuferzellen, die mit einer geringen Konzentration plaziert sind, an Wachstumsfaktoren eine Differenzierung in spezifische ausgereifte Zellphänotypen. Ein Aussetzen an den Wachstumsfaktor hVEGF induzierte das Erscheinen von sowohl morphologischen als auch funktionalen Indikatoren eines endothelialen Zellphänotyps (1C–F und 2F–H), während ein Aussetzen an den Wachstumsfaktor für glatte Muskulatur hPDGF-BB Zellmarker für glatte Muskulatur hochregulierte (2A–E). In gleicher Weise stimulierte ein Aussetzen an Cytokine eine Blut-bildende Differenzierung der vaskulogenischen Vorläuferzellen (2K–M).
Somit wird, gemäß eines weiteren erfindungsgemäßen Asekts, ein Verfahren zum Herstellen somatischer Zellen aus der Population von erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen bereitgestellt, wobei das Verfahren bewirkt wird durch Erhalten einer Population vaskulogenischer Vorläuferzellen, wie vorstehend beschrieben, und Kultivieren der Population der vaskulogenischen Vorläuferzellen in der Gegenwart von mindestens einem Wachstumsfaktor, der in der Lage ist eine somatische Zelldifferenzierung zu induzieren.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "somatische Zelle" eine Zelle mit einer definierten Abstammung, die durch Zugehörigkeit zu einem spezifischen Zellphänotyp über morphologische, immunologische, biochemische und/oder funktionale Kriterien identifiziert werden kann. Somatische Zellen sind per Definition mehr differenziert und weniger multipotent, als Vorläufer- oder Stammzellen. Beispiele für somatische Zellen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind endotheliale Zellen, glatte Muskelzellen und Blutzellen.
In den komplexen Abläufen einer Vaskulogenese, Angiogenese und Blut-bildenden Differenzierung sind zahlreiche Wachstumsfaktoren einbezogen (für Übersichtsartikel siehe Carmeliet, P, Nature Med 6 (2000), 389–95 und Yancopoulus G, Nature 407 (2000), 242–48). Obwohl einige (d.h. VEGF, Ang und PDGF) in ihrer Wirkung dominanter als andere sind, ist eine wirksame Differenzierung von Vorläuferzellen in somatischen Zellen üblicherweise ein Ergebnis der kombinierten und zeitlich koordinierten Wirkung mehrerer Faktoren.
Somit wird, gemäß einer Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts eine gerichtete Differenzierung durch Verwendung von einem oder mehrerer Wachstumsfaktoren bewirkt, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Angiopoietin (Ang), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), Ephrin (Eph), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Tumor-Wachstumsfaktor (TGF), Plazenta-Wachstumsfaktor (PIGF), Cytokine, Erythropoietin, Thrombopoietin, Transferrin, Insulin, Stammzellenfaktor (SCF), Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF). Derartige Faktoren sind für den Fachmann im Handel in Ansätzen bzw. Präparationen verfügbar, die zur Verwendung in einer Zellkultur geeignet sind.
Weiterhin ist klar, dass die vorstehend aufgeführten Wachstumsfaktoren Familien von Faktoren umfassen können, die verwandte Moleküle mit unterschiedlichen und divergenten Rollen in dem Entwicklungsprozess umfassen. Somit kann ein Aussetzen an Mitglieder der VEGF-Familie (beispielsweise VEGF-A, VEGF-B...VEGF-D), GM-CSF und bFGF eine endotheliale Differenzierung stimulieren, während die PDGF- und Ang-Familien in der Entwicklung der glatten Muskulatur bzw. Lumenbildung wichtig sind.
Die Differenzierung von vaskulogenischen Vorläuferzellen kann durch Erhöhen einer Konzentration von Serum in dem Differenzierungsmedium (siehe nachstehend aufgeführtes Beispiel 9) in vaskuläre, glatte Muskelzellen (v-SMC) gerichtet werden.
Somit wird, gemäß eines weiteren erfindungsgemäßen Aspekts, ein Verfahren zum Erzeugen vaskulärer, glatter Muskelzellen aus vaskulogenischen Vorläuferzellen bereitgestellt.
Das Verfahren wird bewirkt durch ein Kultivieren vaskulogenischer Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium, welches eine Serumkonzentration höher als 5%, mehr bevorzugt höher als 9%, am meisten bevorzugt höher als 10% (Vol./Vol.) umfasst.
Zusätzlich kann die Differenzierung von vaskulogenischen Vorläuferzellen in endotheliale Zellen (EC) durch Verringern der Serumkonzentration in dem Differenzierungsmedium, siehe nachfolgend aufgeführtes Beispiel 9, erhalten werden.
Somit wird, gemäß eines weiteren erfindungsgemäßen Aspekts, ein Verfahren zum Induzieren einer Differenzierung von vaskulogenischen Vorläuferzellen in endotheliale Zellen bereitgestellt.
Das Verfahren wird bewirkt durch ein Züchten vaskulogenischer Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium, welches eine Serumkonzentration von weniger als 5%, bevorzugter weniger als 3%, am meisten bevorzugt weniger als 2% (Vol./Vol.) umfasst.
Die Differenzierung, Reifung und/oder Funktionalität von vaskulogenischen Zellen (v-SMC und/oder EC) kann ferner gefördert werden durch Aussetzen der vaskulogenischen Zellen an eine Scherkraft von mindestens 1 dyne/cm², vorzugsweise mindestens 5 dyne/cm², am meisten bevorzugt mindestens 10 dyne/cm² für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um eine Differenzierung, Reifung und/oder Funktionalität der vaskulogenischen Zellen zu fördern, (siehe nachfolgend aufgeführtes Beispiel 8). Das Aussetzen der vaskulogenischen Zellen an eine Scherkraft wird vorzugsweise durch Verwendung einer Strömungs- bzw. Durchstromkammer, wie in 10 gezeigt, bewirkt.
Indem die vorliegende Erfindung praktisch umgesetzt wurde, wurde erkannt, dass nach einem anfänglichen Aussetzen an ein Differenzierungsmedium und einer Größenselektion durch Filtration, die vaskulogenischen Vorläuferzellen, und nicht die Vorläufer der glatten Muskeln der vorliegenden Erfindung, eine kräftige Aufnahme von BrdU in den Kern zeigten, was eine Zellproliferation anzeigt.
Somit wird gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt eine Zellkultur bereitgestellt, die eine Population von vaskulogenischen Vorläuferzellen umfasst, die für 14 Tage oder länger in einem proliferierenden, undifferenzierten Zustand aufrecht erhalten werden können und in der Lage sind, nach Aussetzen an mindestens einen angiogenischen, vaskulogenischen oder Blut-bildenden Wachstumsfaktor, wie vorstehend im Detail erläutert, in glatte Muskeln, endotheliale und/oder Blut-bildende Zellen zu differenzieren. Somit kann die erfindungsgemäße Zellkultur in einem relativ undifferenzierten Zustand expandiert und beibehalten werden.
Die pluripotente und proliferierende Eigenschaft der embryonalen und adulten Stammzellen wurde natürlich für den Nutzen einer in vitro Gewebe-Herstellung und -Technik bzw. -Engineering ausgenutzt. Zur Gewebetechnik wurden Gewebe-Vorläufer oder Präkursor bzw. Vorstufen in vitro mit geeigneten Differenzierungsfaktoren kultiviert, um nicht nur eine Differenzierung auf dem Niveau der einzelnen Zellen, sondern ebenfalls auf der morphologischen, biochemischen und anatomischen Organisation in erkennbare und funktionale Gewebe- und Organstrukturen zu leisten, die als eine Quelle für Gewebe/Organtransplantate, für künstliche Organträger oder Organbioreaktoren verwendet werden können. Beispiele für Gewebe, die in vitro manipuliert bzw. technsich hergestellt (engineered) wurden sind Knorpel (Koch RJ und Gorti GK Facial Plast Surg 18 (2002), 59–68), Haut (Lee KH, Yonsei Med J 41 (2000), 774–79) urogenitale Gewebe (Atala A Curr Opin Urol 9 (1999), 517–26) und pankreatische Inseln (Maria-Engler SS et al Braz J Med Biol Res 34 (2001), 691–7). Jedoch wurden diese Gewebe von differenzierten Gewebekomponenten und nicht aus Stammzellen manipuliert. Embryonale Stammzellen wurden verwendet, um in vitro funktionale, pankreatische Insel-ähnlich Strukturen (Lemelsky, et al Science 2001; 292:1389–94) und Blutgewebe (Kaufman DS et al., PNAS, USA 2001; 98:10716–21) herzustellen.
Ebenfalls wurden in vitro gefäßähnliche Strukturen gebildet. Kaushal et al (Nat Med 7 (2001), 1035–40) berichten, dass periphere, endotheliale Vorläufer funktionale Neogefäße auf dezellularisierten Gefäßen von Schweinen bilden. Levenberg et al (PNAS USA 99: (2002), 4391–96), die mit menschlichen aus Embryoidkörper abgeleiteten endothelialen Zellen arbeiteten, zeigten eine Bildung von röhrenähnlichen (tube-like) Strukturen in Matrigel und Mikrogefäßen nach Transplantation. Jedoch fehlt diesen gefäßähnlichen Strukturen üblicherweise die normale, komplexe vaskuläre/Wand-Organisation, die für normale Blutgefäße charakteristisch ist.
Indem die vorliegende Erfindung praktisch umgesetzt wurde, wurde überraschenderweise erkannt, dass die erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen kleine, kapillarähnliche Gefäße bilden, wenn sie in Matrigel mit geeigneten Wachstumsfaktoren wachsen gelassen wurden (3A–G), und größere vaskuläre Strukturen auf Alginat-Gerüsten (4A und 4B). In beiden Fällen wurde ein normale, endotheliale Organisation und Wandorganisation beobachtet (3E–G und 4A–B) sowie eine Blutzellbildung in den vaskulären Strukturen.
Somit wird gemäß eines weiteren erfindungsgemäßen Aspekts, ein Verfahren zum Herstellen von vaskulärem Gewebe bereitgestellt. Das Verfahren wird bewirkt durch Kultivieren der Population von erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen in der Gegenwart von mindestens einem vaskulogenischen und/oder angiogenischen Wachstumsfaktor unter Bedingungen, die geeignet sind, eine vaskuläre Gewebedifferenzierung zu induzieren.
Gemäß einer Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts wird vaskuläres Gewebe durch Kultivieren der vaskulogenischen Vorläuferzellen in einem halbfesten eine Vaskularisierung forderndem Medium hergestellt. Ein derartiges Medium umfasst üblicherweise extrazelluläre Matrixkomponenten (beispielsweise Matrigen-BD Biosciences, Redford, MA USA) oder Kollagen (beispielsweise Kollagen I aus Rattenschwanz), in die mit Wachstumsfaktor behandelte, differenzierende vaskulogenische Zellen nach Aggregation gemischt werden. Die Wachstumsfaktoren können ein beliebiger der vorstehend aufgeführten vaskulogenischen und/oder angiogenischen Faktoren sein, wie vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Angiopoietin (Ang), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF), Ephrin (Eph), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Tumor-Wachstumsfaktor (TGF) und Plazenta-Wachstumsfaktor (TGF), von denen bekannt ist, dass sie vaskulogenisches und/oder angiogenisches Wachstum oder Entwicklung induzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Wachstumsfaktoren 50 ng/ml VEGF₁₆₅ und 10 ng/ml hPDGF-BB. Ein Wachstum von vaskulären Strukturen wird üblicherweise nach einer Inkubation von 7–15 Tagen offenkundig. Charakteristische endotheliale Komponenten, wie Weibel-Palade-Körper und Lipoprotein-Kapseln; Gefäßlumen und Blutzellen werden mittels Histologie und Elektronenmikroskopie nachgewiesen, wie in dem nachfolgenden Beispiels-Abschnitt im Detail erläutert.
Die komplexe makroskopische Gewebearchitektur kann ebenfalls in vitro durch Platzieren bzw. Aussetzen der erfindungsgemäßen Vorläufer auf einem porösen Träger oder Gerüst nachgeahmt werden. Derartige Träger sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe US Patent Nr. 5,759,830 und 5,770,417 von Vacanti et al, und 6,379,962 von Holy et al) und wurden kürzlich vorgeschlagen als beispielsweise tubuläre Blutgefäßprothesen zur Vaskularisierung und Epithelisierung durch Wirts-Zellen zur vaskulären Regeneration ( US Patentanmeldung 20020019663 A1 von Termin, PL et al), zur Wundreparatur mit Fibroblasten ( US Patentanmeldung 20020076816 von Dai, J et al) und zur in vitro Knochentechnik ( US Patentanmeldung Nr. 20020028511 von deBruijn, JD et al). In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird vaskuläres Gewebe, das größer als eine kapillare Größe ist, durch Kultivieren der vaskulogenischen Vorläuferzellen auf einem 3-dimensionalen Gerüst hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gerüst ein poröses, biologisch abbaubares, schwammähnliches Material, wie Poly-L-Milchsäure, Polymilchsäure-Glycolsäure oder Alginat, wobei ein Differenzierungsmedium die Wachstumsfaktoren VEGF₁₆₅ (50 ng/ml) und hPDGF-BB (10 ng/ml) umfasst. Erfindungsgemäßes, vaskulares Gewebe, das auf einem derartigen Alginatgerüst wachsen gelassen wird, zeigt üblicherweise nach 14 Tagen in Kultur vaskuläre Merkmale, wie ein Lumen, endotheliale Zellen und glatte Muskelzellen, Zelleinschlüsse und von- Willebrand-Faktor (4A–B).
Lebendes, vaskuläres Gewebe, das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wird, kann zur regenerativen Therapie und zur Neovaskularisierung von nicht-vaskulärem Gewebe verwendet werden. Vaskuläres Gewebe kann in embryonale, wachsende oder adulte Organismen implantiert werden, die an einer nicht ausreichenden oder gestörten Vaskularisierung leiden, wie in der mikrovaskulären Pathologie von Diabetes, oder in Gewebe, die eine ischämische Schädigung erfahren haben oder ein Risiko dafür tragen, wie bei ischämischen Herzerkrankungen und cerebral-vaskulären Erkrankungen. In gleicher Weise kann das erfindungsgemäße vaskuläre Gewebe Blutgefäße mit einem größeren Durchmesser für eine Gewebeaustauschtherapie in Fällen eines chirurgischen Bypasses, vaskulärer Degeneration, wie Arteriosklerose und Autoimmun-Erkrankungen bereitstellen.
Es ist klar, dass differenzierende Kulturen oder vaskuläres Gewebe, das aus erfindungsgemäßen, vaskulogenischen Vorläuferzellen hergestellt ist, ebenfalls ein Modell bereitstellen, das für die Untersuchung von Prozessen, die eine vaskuläre Entwicklung und Funktion bewirken, geeignet ist. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Zellen und Gewebe in der Gegenwart von erwarteten toxischen Materialien, Antikörpern, Teratogenen, Arzneimitteln und dergleichen kultiviert werden, oder nicht standardgemäßen Umweltfaktoren, wie Temperatur, Gaspartialdruck, und pH-Wert ausgesetzt werden, oder zusammen in der Gegenwart von Zellen aus anderen Geweben oder anderen Organismen kultiviert werden. So können Veränderungen in Wachstums- und Entwicklungsparametern, wie ein Ausbleiben oder eine Verzögerung von endothelialer Markerexpression, Verlust einer proliferierenden Kapazität oder Desorganisation der in vitro Vaskularisierung beurteilt werden, um die Wirkung der verschiedenen Faktoren zu bestimmen.
Somit wird, gemäß eines weiteren erfindungsgemäßen Aspekts, ein Verfahren zum Bestimmen bzw. Erfassen einer Wirkung eines Faktors auf eine vaskuläre(s) Entwicklung, Wachstum und/oder Modifikation bereitgestellt. Das Verfahren wird bewirkt durch ein Aussetzen der Population erfindungsgemäßer, vaskulogenischer Vorläuferzellen an den Faktor und Bestimmen einer Wirkung des Faktors auf die Zellen.
So können die vaskulogenischen Vorläuferzellen einem Faktor ausgesetzt werden, von dem eine Inhibierung oder Herunter-Regulierung einer/eines vaskulären Entwicklung, Wachstum oder Modifikation erwartet wird. Derartige Assays bzw. Tests sind in der Arzneimittel-Entwicklung und -Forschung wohl bekannt und können eingesetzt werden, um nicht gewünschte Nebenwirkungen von Substanzen zu untersuchen, die zur Behandlung anderer, nicht vaskulärer Prozesse angedacht sind, oder können alternativ verwendet werden, um neue Inhibitoren der Vaskulogenese zu entdecken. Um eine Beurteilung von Wirkungen zu ermöglichen, die ein(e) vaskuläre(s) Entwicklung und Wachstum inhibieren, sollten die Kulturbedingungen der vaskulogenischen Vorläuferzellen günstig, oder noch bevorzugter optimal für eine Vaskulogenese und Angionese sein. Dies umfasst eine Optimierung der Mediumkomponenten (wie Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren), Temperatur, Substratzusammensetzung, Gaspartialdrücke und dergleichen für das spezifische Stadium einer vaskulären Entwicklung, das untersucht wird.
In der Tat haben die hier genannten Erfinder, indem die vorliegende Erfindung praktisch umgesetzt wurde, gefunden, dass eine Inkubation von erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen mit einem Angiogense-inhibierenden anti-VE-cad mAb eine Differenzierung durch hVEGF verhinderte (5A–B). In gleicher Weise konnte ein Arzneimittel, das zur Behandlung von frühen Schwangerschaftskomplikationen angedacht ist, hinsichtlich möglicher nachteiliger Wirkungen auf eine embryonale vaskuläre Entwicklung durchmustert werden, indem vaskulogenische Vorläuferzellen ausgesetzt wurden, das Arzneimittel entfernt wurde und eine Modulationen des Wachstums oder der Entwicklung der Zellen durch Verfahren, die im Stand der Technik allgemein verwendet werden, beobachtet wurden. In gleicher Weise können Faktoren, die eine Angiogenese und/oder Vaskulogenese in den vaskulogenischen Vorläuferzellen stimulieren oder hochregulieren am Besten unter suboptimalen Kulturbedingungen beurteilt werden. Substanzen, die eine Vaskulogenese und/oder Angiogenese beeinflussen, umfassen Peptide, Peptidomimetika (Peptidnachahmungen), Polypeptide, Antikörper, chemische Verbindungen und biologische Agenzien.
Da Vorläuferzellpopulationen für Gewebetechnik, Transplantation und generative Therapie sehr zugänglich sind, kann eine genetische Manipulation derartiger Zellen eine Quelle zum Entwickeln von Zellpopulationen bereitstellen, die einzigartige, vorher nicht erreichbare Merkmale hervorbringen.
Wie in Beispiel 1 des nachstehend aufgeführten Beispielabschnitts klar gezeigt, zeigt die erfindungsgemäße, vaskulogenische Vorläuferzellpopulation eine aktive Vermehrung bzw. Proliferation, wodurch derartige Zellen für genetische Manipulationen zugänglich sind, die es möglich machen, das derartige Zellen beispielsweise mindestens ein exogenes Polypeptid exprimieren. Exogene Polypeptide, die in einer derartigen Zellkultur exprimiert werden, können Zelloberflächen-Marker, Zelloberflächen-Antigene, angiogenische Faktoren, vaskulogenische Faktoren und Blut-bildende Faktoren sein. Zusätzliche Polypeptide, die exprimiert werden können, sind beispielsweise verschiedene Rezeptoren, Liganden, Zelladhesionsmoleküle, Enzyme, Peptidhormone und Proteine des Immunsystems.
Die erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen können manipuliert werden, um exogene Polypeptide zu exprimieren, indem eine Nukleotidsequenz eingeführt wird, die das exogene Polypeptid oder eine Präkursorform des exogenen Polypeptids codiert. Exogene, fremde Nukleinsäuresequenzen können in die vaskulogenischen Vorläuferzellen der Kultur durch Elektroporation, Calciumphosphat, Mikroinjektion, Lipofektion, retro- oder andere virale oder mikrobielle Vektoren oder andere, einem Fachmann wohl bekannte Mittel übertragen werden. Vorzugsweise ist die Expression der exogenen Sequenz/Sequenzen induzierbar. Zellen, die das exogene Polypetid exprimieren, können durch Techniken durchmustert und isoliert werden, die im Stand der Technik wohl bekannt sind und umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Immunoblotting, Immunofluoreszenz, ELISA und RT-PCR. Zellen, die exogene Polypetide exprimieren, können geerntet, expandiert, differenziert und verwendet werden, um beispielsweise einen Mangel zu reparieren oder zu vermehren. In dieser Art und Weise können Zellen, Gewebe oder Organe mit exogenen Haupthistokompatibilitäts-Antigenen hergestellt werden, die eine Abstoßung von transplantierten Materialien durch den Wirtsorganismus verringern werden. Zusätzlich können Zellen, die vaskulogenische Wachstumsfaktoren exprimieren und sekretieren oder Wachstumsfaktor-Rezeptoren überexprimieren, selektioniert und kultiviert werden, wodurch Kulturen von vaskulogenischen Vorläuferzellen mit geänderten zeitlichen Dynamiken und/oder Sensitivitäten auf Differenzierungsfaktoren erzeugt werden.
Die vaskulogenischen Vorläuferzellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden, können therapeutisch in einer Behandlung von vaskulären und vaskulär bedingten Erkrankungen verwendet werden. Mögliche Anwendungen umfassen Zelltransplantation, um geschädigte und ischämische Gewebe zu reparieren, Vaskularisierung von regenerierendem Gewebe und embryonale regenerative Medizin. Beispiele für derartige therapeutische Anwendungen von Stamm- und Vorläuferzellen sind die Vermehrung von Gefäßwachstum, das in Gebieten von ischämischen Geweben nach Transplantation von adulten, endothelialen Vorläufern beobachtet wird (Kawamoto A et al Circulation 103 (2001), 634–37) und die Neovaskularisierung durch adulte, endotheliale Vorläufer nach cerebraler Ischämie bei induziertem Gehirnschlag in Mausen (Zhang ZG et al Circ Res 90 (2002), 284–88).
Somit wird, gemäß eines noch weiteren erfindungsgemäßen Aspekts ein Verfahren zum Lindern oder Verhindern bzw. Vorbeugen einer/eines vaskulären Erkrankung oder Zustands in einem Säuger bereitgestellt. Das Verfahren wird bewirkt durch Verabreichen der erfindungsgemäßen, vaskulogenischen Vorläuferzellen an das Subjekt/die Testperson/das Testobjekt.
Verfahren zum Verabreichen der erfindungsgemäßen Vorläuferzellen an Testobjekte, insbesondere Menschen, umfassen Injektion oder Implantation der Zellen in Zielstellen in den Testobjekten, wobei die erfindungsgemäßen Zellen in eine Abgabe- bzw. Liefereinrichtung eingefügt werden können, welche ein Einführen durch Injektion oder Implantation der Zellen in die Testobjekte erleichtert. Derartige Abgabeeinrichtungen umfassen Röhren, beispielsweise Katheter, um Zellen und Flüssigkeiten in den Körper eines Empfängers zu injizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Röhren zusätzlich eine Nadel, beispielsweise eine Spritze, durch die die erfindungsgemäßen Zellen in das Testobjekt an eine gewünschte Stelle eingeführt werden können. Die erfindungsgemäßen Vorläuferzellen können in eine derartige Abgabeeinrichtung, beispielsweise eine Spritze, in verschiedenen Formen eingeführt werden. So können die Zellen beispielsweise in einer Lösung suspendiert werden oder in eine Trägermatrix eingebettet werden, wenn sie in einer derartigen Abgabeeinrichtung enthalten ist. Wie hier verwendet umfasst der Begriff "Lösung" einen Träger oder ein Verdünnungs- bzw. Streckmittel, in dem die erfindungsgemäßen Zellen lebensfähig bleiben. Träger und Verdünnungsmittel, die in diesem erfindungsgemäßen Aspekt verwendet werden können, umfassen Kochsalzlösung bzw. physiologische Kochsalzlösung, wässrige Pufferlösungen, Lösungsmittel und/oder Dispersionsmedien. Die Verwendung derartiger Träger und Lösungsmittel ist im Stand der Technik wohl bekannt. Die Lösung ist vorzugsweise steril und soweit flüssig, das eine leichte Spritzbarkeit existiert. Vorzugsweise ist die Lösung unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen steril und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, durch die Verwendung von beispielsweise Parabenen, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen geschützt. Erfindungsgemäße Lösungen können durch Inkorporieren Vorläuferzellen, wie hier beschrieben, in einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, und wenn nötig andere vorstehend aufgeführte Bestandteile, gefolgt von einer Sterilfiltration, hergestellt werden.
Trägermatrizen, in die die vaskulogenischen Vorläuferzellen inkorporiert oder eingebettet werden können, umfassen Matrizen, die empfängerkompatibel sind und die in Produkte abgebaut werden, die für den Empfänger nicht gesundheitsschädlich sind. Natürliche und/oder synthetische, biologisch abbaubare Matrizen sind Beispiele für derartige Matrizen. Natürliche, biologisch abbaubare Matrizen umfassen Plasmagerinnsel, beispielsweise von einem Säuger abgeleitet, polymere Gerüste, Matrigel und Kollagen-Matrizen. Synthetische, biologisch abbaubare Matrizen (Gerüste) umfassen synthetische Polymere wie Polyanhydride, Polyorthoester und Polymilchsäure. Andere Beispiele für synthetische Polymere und Verfahren zum Inkorporieren oder Einbetten der Zellen in diese Matrizen sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise US-P-4,298,002 und US-P-5,308,701 . Diese Matrizen stellen in vivo einen Träger und einen Schutz für die anfälligen Zellen dar und sind deshalb die bevorzugte Form, in der die vaskulogenischen Vorläuferzellen in die Empfänger eingeführt werden.
Eine Differenzierung der erfindungsgemäßen, implantierten vaskulogenischen Vorläuferzellen kann durch Faktoren gerichtet werden, die von dem umgebenden Gewebe abstammen, oder kann durch eine Inkubation mit abstammungsspezifischen Wachstumsfaktoren vor einer Implantation initiiert werden. Somit können beispielsweise Mangel, die eine Regeneration von glatten Muskeln benötigen, mit Zellen behandelt werden, die an PDGF-BB ausgesetzt wurden, um eine Population zu erhalten, die mit Vorläufern für glatte Muskeln angereichert ist.
Vaskuläre Erkrankungen und Zustände, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden können, umfassen angeborene und erworbene vaskuläre Störungen und Ischämie/Reperfusions-Verletzung. Wie hier verwendet betrifft der Begriff "angeborene vaskuläre Störungen" vaskuläre Störungen die von Geburt an existieren, wobei sowohl erbliche als auch Entwicklungsstörungen umfasst sind. "Erworbene vaskuläre Störungen" betreffen vaskuläre Störungen, die auf die Geburt folgen, umfassend sekundäre vaskuläre Manifestationen von systemischen oder anderen Erkrankungen, wie die mikrovaskuläre Pathologie von Diabetes. "Ischämie/Reperfusions-Verletzung" betreffen eine Zell- oder Gewebeverletzung, die von einer unterbrochenen oder verringerten Blutversorgung resultiert, und den Gewebeschaden, insbesondere die entzündliche Antwort, die mit einer Re-Etablierung der Blutzirkulation in ischämischen Geweben assoziiert ist.
Zustande, die einen Vorteil aus einer derartigen Behandlung ziehen können, umfassen ischämische Zustände (beispielsweise assoziiert mit myocardialer, peripherer vaskulärer Ischämie oder vaskulärer Ischämie im Gehirn), Wundheilung, Gewebeverpflanzung (umfassend Transplantation) und Zustände, bei denen endotheliales Zellwachstum und Proliferation beteiligt ist, beispielsweise nach Koronarangioplastie, Stent-Implantation oder verwandten Verfahren, Re-Endothelialisierung von arteriellen Transplantaten, und endotheliale Regeneration in A-V-Abzweigungen, beispielsweise in Nierendialyse-Patienten. Aufgrund der Komplikationen, auf die man stößt, wenn man Vorläufer-Heterotransplantate aus Schweinen in Primaten verwendet (Buhler L et al Transplantation 70 (2000), 1232–31), sind die erfindungsgemäßen Verfahren, die auf menschliche Stammzellen angewendet werden können, insbesondere zur Behandlung derartiger vaskulärer Zustände geeignet.
Da hier gefunden wurde, dass die erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen, wenn sie Blut-bildenden Wachstumsfaktoren und Cytokinen ausgesetzt werden, induziert werden können sich in Blutzellvorläufer und ausgereifte Blutzellen zu differenzieren (2K–M beziehungsweise 3D–F), können die erfindungsgemäßen vaskulogenischen Vorläuferzellen ebenfalls zur Behandlung oder zur Verhinderung einer/eines hämatologischen Erkrankung oder Zustands in einem Säuger verwendet werden.
Eine derartige Behandlung kann bewirkt werden durch Verabreichen der Zellen in ein Testobjekt unter Bedingungen, die geeignet sind eine Differenzierung in sowohl endotheliale als auch Blutzellen zu stimulieren. Hämatologische Erkrankungen oder Zustände, die in dieser Art und Weise behandelt oder verhindert werden können, umfassen angeborene und erworbene Blutstörungen, Gerinnungsstörungen und neoplastische Erkrankungen.
Ein Beispiel einer Gerinnungsstörung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt werden kann, ist die von-Willbrand's-Erkrankung, eine Art von Hämophilie, die durch einen Mangel an dem endothelialen von-Willebrand-Gerinnungsfaktor verursacht wird. Indem die vorliegende Erfindung praktisch umgesetzt wurde, wurde erkannt, dass differenzierte, endotheliale Zellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, von- Willebrand-Faktor umfassen (3A–G und 4A–B). Somit können erfindungsgemäße, endotheliale Zellen oder endotheliale Vorläuferzellen oder Zusammensetzungen davon verabreicht werden, die den Gerinnungsfaktor erzeugen und den Gerinnungsmangel lindern.
Zusätzlich zu den vorstehend aufgeführten therapeutischen Anwendungen können gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren isolierte und hergestellte vaskulogenische Vorläuferzellen verwendet werden, um eine Vaskularisierung von nicht-vaskulärem oder von Natur aus schwach vaskularisiertem Gewebe bereitzustellen. Es ist klar, dass eine der wichtigsten Aufgaben, die das Gebiet der Gewebetechnik betrifft, die adäquate Durchblutung von Gewebe und Organen ist, die in vitro zur Implantation hergestellt werden. Gegenwärtig sind die meisten Gewebetechnik-Verfahren auf mikroporöse Träger und eine Vaskularisierung durch den Wirt angewiesen, um ein dauerhaftes Anwachsen und eine Übertragung von Sauerstoff und Nährstoffen bereitzustellen, wobei die Ergebnisse variieren und oftmals unvorhersagbar ist, insbesondere wo dicke, komplexe Gewebe (beispielsweise Leber) betroffen sind. Ein alternativer Ansatz ist die Herstellung von "vaskulären" Kanälen aus Silikon durch Mikrobearbeitung für Populationen von gemischten Hepatozyten und endothelialert Zellen in vitro (Kaihara S et al., Tissue Eng 6 (2000), 105–07). In einem anderen Ansatz, der die normale Entwicklung näher nachahmt, wurden endotheliale Zellen zusammen kultiviert mit Haut- (Black AF et al Cell Biol Toxicol 15 (1999), 81–90) oder Fettzellen (Frerich B et al., Int J Oral Maxillofac Surg 30 (2001), 414–20), um ein vaskuläres Netzwerk für das wachsende Gewebe bereitzustellen. Jedoch war keines erfolgreich im Manipulieren von lebensfähigen, implantierfähigen, vaskularisierten Geweben.
Somit ist gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt, ein Verfahren zum Vaskularisierung von Säugergewebe bereitgestellt. Das Verfahren wird bewirkt durch Erhalten einer Population von vaskulogenischen Vorläuferzellen und Kontaktieren der Zellen mit einem Säugergewebe unter Bedingungen, die zur Differenzierung der vaskulogenischen Vorläuferzellen in endotheliale Zellen und glatte Muskelzellen geeignet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Säugergewebe ein manipuliertes bzw. technisch hergestelltes, nicht-vaskuläres Gewebe.
Beispiele für derartig manipulierte Gewebe sind Massen von in vitro erzeugten Hepatozyten, epidermalen und dermalen Zellen, pankreatische Zellen und Knochenzellen zur Implantation. Ein Kontaktieren des Gewebes mit den differenzierenden, vaskulogenischen Vorläuferzellen kann durch eine Co-Kultur in einer halbflüssigen Matrix oder auf einem porösen Gerüst erfolgen, wie es allgemein, wie hier im Detail erläutert, in der Architektur von manipuliertem Gewebe verwendet wird. Ein Kontaktieren des Säugergewebes kann in vitro vor einer Implantation in den Wirtsorganismus durchgeführt werden, oder in vivo in einem vorher implantierten oder existierendem Gewebe. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Säugergewebe ein embryonales Gewebe, das zur Implantation in einem adulten Wirtsorganismus erzeugt wird oder zur Implantation und zum Wachstum wie ein Embryo.
Indem die vorliegende Erfindung praktisch umgesetzt wurde, wurde ebenfalls beobachtet, dass Zellen, die größer als 50 μm sind, durch einen Größenselektionsschritt der gegenwärtigen Methode zurückgehalten werden, die eine Population umfassen, die mit Präcursern von glatten Muskelzellen angereichert ist, wobei sie charakteristische, epitheliale Zellmarker und ein Morphologie exprimieren (1H beziehungsweise 1G).
Somit stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Erzeugen epithelialer Vorläuferzellen von undifferenzierten ES-Zellen bereit. Das Verfahren wird bewirkt durch Kultivieren der undifferenzierten ES-Zellen in einer Art und Weise, die zur Differenzierung in vaskulogenische Vorläuferzellen geeignet ist, und ein Isolieren von Zellen, die größer als 50 μm sind. Die Kulturbedingungen für epitheliale Präkursor und deren Differenzierung in glatte Muskelzellen waren im Wesentlichen gleich zu denen, die hier für die vaskulogenischen Vorläuferzellen im Detail erläutert wurden, wobei Wachstumsfaktoren für glatte Muskeln oder epitheliale Wachstumsfaktoren, wie PDGF-BB, anstelle von endothelialen oder vaskulogenischen Wachstumsfaktoren ersetzt wurden. Jedoch wurde bemerkt, dass den epithelialen Zellen und glatten Muskelzellen die proliferierende Kapazität der kleineren, vaskulogenischen Vorläuferzellen fehlt.
Adultes, vaskuläres Gewebe umfasst endotheliale und epitheliale Zellen, die hinsichtlich Größe, Morphologie und Zellmarker sowie hinsichtlich Lokalisation und Funktion unterschieden werden können. Gegenwärtige Verfahren zum Isolieren von vaskulären Zelltypen sind auf einen Nachweis von Zelloberflächenmarkern, Immunofluoreszenz und Flusszytometrie (siehe beispielsweise Kevil EG und Bullard DC Acta Physiol Scand 173 (2001), 151–57) angewiesen, was das Herstellen bzw. Präparieren bzw. Aufbereiten von vaskulären Zellen für Experimente und eine primäre Kultur mühsam, teuer und ineffizient macht. Somit ist klar, dass die erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden könne, um Zellen aus vaskulärem Gewebe sowie von undifferenzierten Stammzellen zu isolieren und zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen von dem vaskulären Gewebe durch mechanische oder enzymatische Mittel, wie Trypsin- oder Kollagenase-Verdau, dissoziiert, um eine gemischte Population aus dissoziierten Zellen zu erhalten, wobei die kleineren (kleiner als 50 μm) endothelialen Zellen durch Größenselektion, wie hier im Detail erläutert, für die vaskulogenischen Vorläuferzellen isoliert werden. In gleicher Weiser können adulte, epitheliale Zellen durch ein gleichartiges Verfahren von einem vaskulären Gewebe isoliert werden, wobei die zurückgehaltene Zellpopulation (größer als 50 μm), die reich an epithelialen Zellen ist, gesammelt wird.
Weitere Gegenstände, Vorteile und neue Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann nach Betrachtung der folgenden Beispiele offensichtlich, die nicht beabsichtigt sind begrenzend zu sein. Zusätzlich findet jede der verschiedenen Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung, wie hier vorstehend geschildert, und in dem Anspruchsabschnitt nachfolgend beansprucht, in den folgenden Beispielen eine experimentelle Unterstützung.
Beispiele
Es wird jetzt auf die folgenden Beispiele Bezug genommen, die zusammen mit der vorstehend aufgeführten Beschreibung die Erfindung in einer nicht beschränkenden Art und Weise erläutern.
Im Allgemeinen umfassen die hier verwendete Nomenklatur und die Laborverfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, molekulare, biochemische mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken. Derartige Techniken sind in der Literatur genau erläutert. Siehe beispielsweise "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Bande I–III, Ausubel, R.M:, Herausgeber (1994); Ausubel et al., "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley und Söhne, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley und Söhne, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Girren et al. (Herausgeber) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series" Bande. 1–4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988); Methoden, wie aufgeführt in den US-P-4,666,828 ; 4,683,202 ; 4,801,531 ; 5,192,659 und 5,272,057 ; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Bande I–III, Cellis, J.E., Herausgeber (1994); "Current Protocols in Immunology" Bände I–III Coligan J.E. Herausgeber. (1994); Sites et al (Herausgeber), "Basic and Clinical Immunology" (8. Auflage), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell und Shiigi (Herausgeber), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman und Co., New York (1980); verfügbare Immunoassays sind ausführlich in der Patentliteratur und der wissenschaftlichen Literatur erläutert, siehe beispielsweise US-P-3,791,932 ; 3,839,153 ; 3,850,752 ; 3,850,578 ; 3,853,987 ; 3,867,517 ; 3,879,262 ; 3,901,654 ; 3,935,074 ; 3,984,533 ; 3,996,345 ; 4,034,074 ; 4,098,876 ; 4,879,219 ; 5,011,771 und 5,281,521 ; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., Herausgeber (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Harnes, B.D., und Higgins S.J., Herausgeber (1985); "Transcription and Translation" Harnes, B.D., und Higgins S.J., Herausgeber (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., Herausgeber (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986), "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) und "Methods in Enzymology" Bande 1–317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization – A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); wobei alle unter Bezugnahme aufgenommen sind, als ob sie hier vollständig dargelegt sind. Andere allgemeine Quellen werden in diesem Dokument bereitgestellt. Es wird angenommen, dass die hier aufgeführten Verfahren im Stand der Technik wohl bekannt sind und sie werden zur Einfachheit für den Leser bereitgestellt.
Soweit nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie im Allgemeinen durch einen Fachmann verstanden werden, auf den diese Erfindung gerichtet ist. Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu den hier beschriebenen sind, in der Praxis und im Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nachstehend geeignete Verfahren und Materialien beschrieben.
Materialien und Methoden
Zellkultur
Undifferenzierte, menschliche embryonale Stammzellen (hES) (H9.2, H13) wurden, wie kürzlich beschrieben (Amit M. et al., Dev Biol 227 (2000), 271–78), auf einer inaktivierten embryonalen Feeder-Schicht von Maus (MEF) in 80% knock-out DMEM-Medium wachsen gelassen (kein Pyruvat, hohe Glucose-Formulierung; Life Technologies Inc., Rockville, Maryland USA) ergänzt mit 20% FBS (HyClone, Logan, Utah, USA) oder Serum-Ersatz und bFGF, 1 mM L-Glutamin, 0,1 mM Mercaptoethanol und 1% Ausgangsmaterial von nicht essentiellen Aminosäuren (Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA). hES-Zellen wurden von der Feeder-Schicht unter Verwendung von EDTA 5 mM, ergänzt mit 1% fetalem bovinen Serum (FBS; HyClone, Logan, Utah, USA) entfernt, und unter Verwendung eines Siebs mit einer 40 μm Maschenweite (Genton, Dickinson und Co, Discovery Labware, Redford, MA, USA) in einzelne Zellen dispergiert.
Zur Differenzierung wurden undifferenzierte hES-Zellen auf mit Kollagen Typ IV beschichtete (Becton Dickinson und Co, San Jose, CA, USA) oder auf mit 0,1% Gelatine beschichtete (Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) Platten mit 6 Vertiefungen bei einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/cm² in Differenzierungsmedium ausplattiert, welches aus alpha-MEM-Medium (Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA) bestand und mit 10% FBS (HyClone, Logan, UT, USA) und 0,1 mM β- Mercaptoethanol (Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA) ergänzt war. Am Tag 6 der Züchtung wurden die Zellen durch ein 40 μm Filtersieb (Becton, Dickinson und Co, Discovery Labware, Redford, MA, USA) filtriert und analysiert, und zur weiteren Differenzierung gezüchtet. Zur erneuten Züchtung wurden die Zellen auf die mit Kollagen Typ IV beschichteten Schalen (Becton Dickinson und Co, San Jose, CA, USA) bei 2,5 × 10⁴ Zellen/cm² in Differenzierungsmedium (siehe vorstehend) mit 50 ng/ml hVEGF₁₆₅ oder 10 ng/ml hPDGF-BB (beide von R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) für weitere 10–12 Tage ausgesät.
Kollagengel und Matrigel 3-D Vaskularisierungs Assays
Vor der dreidimensionalen Kultur wurden für 6 Tage in Differenzierungsmedium gezüchtete, filtrierte Zellen mit EDTA (5 mM) geerntet wobei 0,3–0,5 × 10⁶ Zellen pro ml in Differenzierungsmedium mit 50 ng/ml VEGF₁₆₅ und 10 ng/ml hPDGF-BB auf nicht beschichtete Petrischalen (Ein-Shemer Industries, Israel) für maximal 24 Stunden zur Induzierung der Aggregation inkubiert wurden. Für den Kollagengel-Assay wurden Aggregate in 2 × Differenzierungsmedium re-suspendiert und mit einem gleichen Volumen an Rattail-Kollagen I (3 mg/ml) (Fa. Hoffman-La Roche Ltd. Basel, Schweiz) vermischt. Anfänglich wurden 250 μl dieses Gemisch in Schalen mit 24 Vertiefungen ausplattiert und für 15 Minuten bei 37°C polymerisieren gelassen, bevor 500 μl Differenzierungsmedium, welches mit den gleichen Wachstumsfaktoren ergänzt war, zugesetzt wurden. Für den Matrigel-Assay wurden Schalen mit 24 Vertiefungen mit 380 μl Matrigel (Becton Dickinson und Co, San Jose, CA, USA) beschichtet, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wobei Aggregate auf dem Matrigel in Differenzierungsmedium, welches hVEGF (50 ng/ml) und hPDGF-BB (10 ng/ml) enthielt ausgesät wurden. In einigen Assays wurden Aggregate in dem Matrigel (Becton Dickinson und Co, San Jose, CA, USA) re-suspendiert, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann mit Differenzierungsmedium, welches hVEGF (50 ng/ml) und hPDGF-BB (10 ng/ml) enthielt, in die Vertiefungen gegeben. Bei allen Assays wurde für 7–12 Tage inkubiert und diese unter Verwendung eines Kontrast-Phasenmikroskops (Olympus Optical Co. Ltd., Hamburg GmbH) analysiert.
Gerüst-Vaskularisierung
50 μl LF120 Alginat-Gerüst (Shapiro L. und Cohen S. Biomaterial 1997; 18:583) wurden freundlicherweise von Professor Smadar Cohen (Ben Gurion Universität, Beer Sheba, Israel) zur Verfügung gestellt. Wie vorstehend erläutert wurden die Gerüste mit 24 Stunden alten ESH-Zellaggregaten, welche wie hier beschrieben hergestellt wurden, gesät, wobei ca. 0,5– 1,0 × 10⁶ Zellen pro Gerüst ausgesät wurden. Die Zell-enthaltenden Gerüste wurden dann in Differenzierungsmedium gezüchtet, welches mit 50 ng/ml VEGF₁₆₅ und 10 ng/ml hPDGF-BB ergänzt war.
Hematopoetischer Kolonie Assay
Die Fähigkeit hematopoetischer Vorläufer wurde gezeigt, indem filtrierte, mit VEGF behandelte VE-cad+ ESH-Zellen als einzelne Zellen bei 1–2 × 10⁵ Zellen pro Platte in halbfestem Medium, das mit Cytokinen (Methokult GF+ Medien; StemCell Technologies, Vancouver BC) (für Details des Assays siehe Kaufmann DS et al., PNAS 98 (2001), 10716–21) ergänzt war, ausgesät wurden. Nach 14 Tagen Inkubation wurden die Platten auf Kolonie formende Einheiten (CFU) gemäß Standardkriterien (Eaves C und Lambie, K Atlas of Human Hematopoietic Colonies (1995); StemCell Technologies, Vancouver, BC) bewertet.
Immunfärbung, Dil-Ac-LDL und BrdU-Inkorporierung
Gezüchtete Zellen wurden in situ durch Inkubation von 4% Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen gemäß den Anweisungen des Lieferanten mit entsprechenden primären Antikörpern gefärbt: Ziegen-anti-Mensch KDR (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA), Maus-anti-hCD31, Maus-anti-hSMA, Maus-anti-hCalponin, Maus-anti-h-Myosin schwere Kette der glatten Muskulatur (alles von DAKO Corp, Carpenteria, CA, USA), Ziegen-anti-VE-Cadherin (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA), (DAKO Corp, Carpenteria, CA, USA), Maus-anti-Smoothelin (CHMEICON, Intn'1, Inc. Temecula, CA, USA). Die Kontrollen bestanden aus Zellen, die allein mit sekundären Antikörpern inkubiert wurden. Immungefärbte Kulturen wurden untersucht und unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops (Olympus Optical Co., Ltd. Hamburg GmbH) photographiert.
Zur Aufnahme von Dill-markiertem ac-LDL wurden gezüchtete ESH- Zellen mit 10 μg/ml Dill-markierten ac-LDL (Biomedical Technologies Inc. Stoughton, MA, USA) für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen 3 mal mit PBS gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten fixiert, untersucht, und unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops (Olympus Optical Co., Ltd. Hamburg, GmbH) photographiert.
Eine BrdU-Inkorporierung/-Aufnahme in ESH-Kulturen und in differenzierende Zellen wurde unter Verwendung eines BrdU-Kits (Zymed Labs Inc. South San Francisco, CA, USA) in situ gemäß den Aweisungen des Herstellers untersucht. In Kürze, eine BrdU-Lösung wurde in Kulturmedium 1:100 verdünnt und den Zellen über Nacht zugesetzt, gefolgt von 2 Waschungen mit PBS, Fixierung mit 75% Ethanol und spezifischem BrdU-Immunofärben.
Immun-Phenotyp
Zellen wurden unter Verwendung von Immunofluoreszenz-Färben wie vorstehend erläutert (Reubinoff BE et al., Nat Biotech 19 (2001), 1134) charakterisiert. Über Filter abgetrennte ESH-Zellen wurden wie vorstehend erläutert erneut in Differenzierungsmedium (Alpha-MEM, 10% FBS und 0,1 β-Mercaptoethanol) auf Kollagen Typ IV Platten für 12–20 Stunden gezüchtet, fixiert und mit anti-Mensch-VE-Cadherin (Santa Cruz Biotechnology., Santa Cruz, CA, USA) und anti-Mensch KDR (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) auf Expression bestimmter Zelltyp-Marker untersucht. Mindestens 150 Zellen wurden in zufälligen Feldern (× 100) auf die Expression eines jeden dieser Marker bewertet und die Experimente wurden mindestens 3 mal wiederholt.
Histolomorphology und immunhistochemische Analyse
Matrigel oder Kollagengel enthaltende Zellen (wie für die vorstehenden Kollagengel und Matrigel 3-D Vaskularisierungs-Assays beschrieben) wurden wie vorstehend erläutert auf Glasplättchen in Schalen mit 24 Vertiefungen ausplattiert. Nach Beendigungen der Behandlungen wurden Zell-enthaltende Gelblöcke auf Abdeckplättchen in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, in abgestuften Alkoholbädern (70%–100%) dehydriert, und in Paraffin eingebettet. Bei Verwendung wurden Alginat-Gerüste direkt in abgestuftem Alkohol dehydriert. Für eine allgemeine Histomorphology wurden 1–8 μm Schnitte mit Hera toxylin/Eosin oder Toluidin-Blau gefärbt. Entparaffinierte Schnitte wurden mit den relevanten primären Antikörpern unter Verwendung des LSAB + Färbe Kits (DAKO Corp, Carpenteria, CA, USA) oder Zell and Tissue Färbe Kit (R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) gemäß den Instruktion des Herstellers immungefärbt. Gefärbte Bereiche wurden gesichtet und mikroskopisch bei einer Vergrößerung von x100–x400 photographiert.
FACS Analyse
Zellen, welche die Endothel-Vorläufer-Marker VEGFR2 (KDR) und VE-cad exprimieren, wurden nachgewiesen und nach Filtration und erneuter separater Züchtung auf Kollagen Typ IV, wie vorstehend erläutert, aus den abgetrennten humanen ES-Zellpopulationen mit 2 Größen quantitativ erfaßt. Für eine FACS-Analyse wurden filtrierte ESH-Zellen mit PBS gewaschen, welches 5% FBS enthielt, mit humanen VE-Cadherin (Santa Cruz Biotechnologe, Inc., Santa Cruz, CA, USA) oder humanem KDR (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) inkubiert, gewaschen und 30 Minuten mit geeigneten zweiten Antikörpern inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines FACSCalibur (Genton Dickinson und Co., San Jose, CA, USA) mittels der CELLQUEST Software analysiert. In beiden Assays dienten Zellen, die nur mit zweiten Antikörpern umgesetzt wurden, als Kontrollen.
Elektronenmikroskopie
Zellen, welche in Matrigel oder Kollagengel ausgesät wurden, wurden für eine Stunde in 3% Glutaraldehyd, in 0,1M Natriumcacodylat fixiert und dann anschließend 0,1% OsO₄ in Veronal-Acetat-Puffer für eine Stunde fixiert. Eine Herstellung für eine Mikroskopie-Analyse wurde gemäß den Standardverfahren der Pathologieabteilung des Rambam Medical Center, Haifa, Israel durchgeführt. In Kürze, die Zellen wurden mit Bleicitrat gefärbt, dehydriert und im Epon-Harz eingebettet. Schnitte wurden in einer Dicke von 600 Å unter Verwendung eines Diamantmessers erstellt, überprüft und unter Verwendung eines JEM-100SX Elektronen-Mikroskops photographiert.
Reverse Transkriptions(RT)-PCR Analyse
Aus Vorläufern und Zellen unterschiedlicher Linien wurden unter Verwendung des TriReagent (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) gemäß den Instruktionen des Herstellers Gesamt-RNA extrahiert. Die Gesamt-RNA wurde mittels UV-Spektrophotometrie quantifiziert, wobei 1 μg für jede RT-Probe eingesetzt wurde. RNA wurde mit der Reversen Transkriptase M-MLV (Promega Corp., Madison, WI, USA) und Oligo(dT)-Primern (Promega Corp., Madison, WI, USA) gemäß den Instruktionen des Herstellers rücktranskribiert. Eine PCR-Amplifizierung bestimmter Transkripte wurde mit BIOTAQTM DNA-Polymerase (BIOLINE, Ltd. GmbH Luckenwalde, Deutschland) unter Verwendung von 1 μl an RT-Produkt pro Reaktion gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. In einigen Fällen wurde die MgCL₂-Konzentration (normalerweise 1,5 mM) eingestellt (nachstehend gezeigt). Um in den RT-PCR-Assays halb-quantitative Ergebnisse sicher zu stellen wurde sichergestellt, dass sich die Anzahl an PCR-Zyklen für jeden Primer in dem linearen Bereich der Amplifikation bewegte. Darüber hinaus wurden alle RNA-Proben derart eingestellt, dass für das Housekeeping-Gen GAPDH als interner Standard die gleiche Amplifizierung erhalten wurde. Die PCR- Bedingungen und das Protokoll bestand aus: 5 min bei 94°C (heißer Start); gefolgt von 30–40 Zyklen (tatsächliche Anzahl nachstehend gezeigt) von: (a) 94°C für 30 sec; (b) Annealing-Temperatur (Ta, nachstehend gezeigt) für 30 sec; und (c) 72°C für 30 sec, abschließend mit einer schlussendlichen 7 minütigen Verlängerung bei 72°C am Ende. Die Oligonukleotid-spezifischen Bedingungen waren wie folgt: α-sma, 32 Zyklen, Ta 60°C (Yamamura, H et al., Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 79 (1998), 245); Calponin, 35-Zyklen, Ta 60°C (Yamamura, H et al. Int. J. Cancer (Pred Oncol) 79 (1998), 245); SM-MHC, 35 Zyklen, Ta 62°C, 1 mM MgCl₂ (Boreham et al., Am J. Obsetet. Gynyocol. 185 (2001), 9444–52); SM22α, 35Zyklen, Ta 60°C (Dupla, C. et al., Circ. Res. 80 (1998), 159); GATA2, 35Zyklen, Ta 55°C (Kaufmann DS et al PNAS; 98 (2001), 10716); AC133, 32Zyklen, Ta 60°C (Shamblott MJ et al, PNAS 98 (2001), 113); Tie2, 35 Zyklen, Ta 60°C (Ahmad, S et al, Cancer 92 (2001) 1138); CD31, 32 Zyklen, Ta60°C (Quarmby, S et al., Arterio Thrombo Vas Biol; 19 (1999), 588–97); Tall, 40 Zyklen, Ta 53 °C (Kaufmann DS et al PNAS; 98 (2001), 10716); GAPDH, 32 Zyklen, Ta 60°C (Itskovitz-Eldor J et al Mol Med; 6 (2000), 88)
Oligonukleotid-Primer:
Für die PCR Reaktionen wurden die folgende spezifischen Oligonukleotid-Primer eingesetzt:

(a) [α]-sma: 5' CCAGCTATGTGAAGAAGAAGAGG 3' (SEQ. ID. NO: 1) (sense) und 5' GTGATCTCCTTCTGCATTCGGT 3' (SEQ. ID. NO: 2) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 965 Basenpaare;
(b) Calponin: 5' GAGTGTGCAGACGGAACTTCAGCC 3' (SEQ. ID. NO: 3) (sense) und 5' GTCTGTGCCCAACTTGGGGTC 3' (SEQ. ID. NO: 4) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 671 Basenpaare;
(c) SM-MHC: 5' CTACAGGAGCATGCTGCAGGATCG 3' (SEQ. ID. NO: 5) und 5' GCTTGCAGAAGCTGCTTCTCCAGC 3' (SEQ. ID. NO: 6), entsprechend Nucleotiden 579 (sense) bzw. 758 (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 179 Basenpaare;
(d) SM22[α]: 5' CGCGAAGTGCAGTCCAAAATCG 3' (SEQ. ID. NO: 7) (sense) und 5' GGGCTGGTTCTTCTTCAATGGGG 3' (SEQ. ID. NO: 8) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 928 Basenpaare;
(e) Caldesmon: 5' AACAACCTGAAAGCCAGGAGG 3' (SEQ. ID. NO: 9) und 5' GCTGCTTGTTACGTTTCTGC 3' (SEQ. ID. NO: 10), entsprechend Nucleotiden 244 (sense) bzw 792 (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 530 Basenpaare;
(f) GATA2: 5' AGCCGGCACCTGTTGTGCAA 3' (SEQ. ID. NO: 11) (sense) und 5' TGACTTCTCCTGCATGCACT 3' (SEQ. ID. NO: 12) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 242 Basenpaare;
(g) AC 133: 5' CAGTCTGACCAGCGTGAAAA 3' (SEQ. ID. NO: 13) (sense) und 5' GGCCATCCAAATCTGTCCTA 3' (SEQ. ID. NO: 14) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 200 Basenpaare;
(h) Tie2: 5' ATCCCATTTGCAAAGCTTCTGGCTGGC 3' (SEQ. ID. NO: 15) (sense) und 5' TGTGAAGCGTCTCACAGGTCCAGGATG 3' (SEQ. ID. NO: 16) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 512 Basenpaare;
(i) CD31: 5' CAACGAGAAAATGTCAGA 3' (SEQ. ID. NO: 17) (sense) und 5' GGAGCCTTCCGTTCTAGAGT 3' (SEQ. ID. NO: 18) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 260 Basenpaare;
(j) Tall: 5' ATGGTGCAGCTGAGTCCTCC 3' (SEQ. ID. NO: 19) (sense) und 5' TCTCATTCTTGCTGAGCTTC 3' (SEQ. ID. NO: 20) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 331 Basenpaare;
(k) GAPDH: 5' AGCCACATCGCTCAGACACC 3' (SEQ. ID. NO: 21) (sense) und 5' GTACTCAGCGGCCAGCATCG 3' (SEQ. ID. NO: 22) (antisense). Die vorhergesagte Grösse der Bande ist 302 Basenpaare.

Beispiel 1
Isolierung und Anreicherung von humanen vaskulogenen Vorläuferzellen aus humanen Stammzellen
Trotz der überragenden Bedeutung der humanen Stammzell-Technologie für die Forschung und Medizin war die Anwendung von bei der Forschung mit nicht-humanen Spezien gewonnen Erkenntnisse auf humane Stammzellen äußerst schwierig und erforderte großen Scharfsinn und erhebliche Anstrengungen. Obwohl beispielsweise embryonale Stammzell-Linen (mES) in Kultur ihre Pluritpotenz beibehalten und voraussagbar manipuliert werden können um sich in vitro Zellen der mesodermalen, endodermalen und ectodermale Linie auszudifferenzieren, war eine in vitro Differenzierung humaner und anderer Primaten ES-Zelllinien durch Inkonsistenz, Desorganisierung und fehlender Synchronie gekennzeichnet, was eine erfolgreiche in vitro Gewebe-Organisation verhinderte (siehe beispielsweise Thompson et al Curr Top Dev Biol 38 (1998), 133–165). Bei der Isolierung vaskulogener Vorläufer-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen wurde anfänglich eine humane mesodermale ES-Differenzierung in einem neuen zweidimensionalen (2D) anstelle des dreidimensionalen (3D) Modells, welches gewöhnlich im Stand der Technik eingesetzt wird, versucht, basierend auf der Beobachtung, dass die embryode 3D-Körperstruktur für eine mesodermale Differenzierung von Maus-Stammzellen nicht erforderlich ist (Nishikawa S-I., et al., Development 125 (1998) 1747).
Undifferenzierte humane embryonale Stammzelllinien H9,2 und H13 wurden wie vorstehend erläutert gezüchtet (Amit M et al Dev Biol 227 (2000), 271–78) von der Feeder-Schicht (NährzellenSchicht) entfernt und als einzelne Zellen auf mit Kollagen Typ IV beschichtete Schalen mit Differenzierungsmedium, das für Maus CCE-ES-Zellen beschrieben wurde (Yamashita J, et al, Nature 408 (2000), 92) ausplattiert. Kürzlich durchgeführte Experimente mit Maus-Stammzellen zeigte, dass eine bestimmte Zellsaat-Konzentration für die Induzierung endothelialer Differenzierung wichtig ist. Eine Aussaat humaner ES-Zellen in der empfohlenen Zell-Konzentration (1 × 10⁴ Zellen(cm²) führte jedoch zum Zelltod. Es wurden daher mehrere Zellsaat-Konzentrationen untersucht. Eine Aussaat der Zellen bei höheren Konzentrationen einer Vielzahl von Anheftungssubstraten (1,0–1,5 × 10⁵ Zellen/cm²) führte zu einer Inkonsistenz, gemischten Population undifferenzierter mit differenzierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Überaschenderweise führte eine Aussaat der Zellen bei geringer Konzentration (5–10 × 10⁴ Zellen/cm²) auf Kollagen Typ IV Substrat zu einer Förderung der Differenzierung, welche zu zwei unterschiedlichen Populationen an Zelltypen (1B) führte. Ein erheblicher Anteil der Zellpopulation umfaßte kleinere flache Zellen mit großen Kernen, welche der enodthelialen Vorläufer-Morphologie (1B, Pfeile) ähnelte, die zuvor bei Maus-Zellen erkannt wurde (Yamashita J, et al. Nature 408 (2000) 92), während der Rest große flache Zellen mit einer offensichtlichen fibrösen Struktur (1B, Pfeilköpfe) waren.
Um die zwei Zellpopulationen zu trennen und die kleineren humanen vaskulogenen Vorläufer zu isolieren, wurden die Zellen durch ein 40 μm Sieb filtriert, wodurch die Endothel-ähnlichen Zellen von den großen flachen Zellen getrennt wurden. Um den Anteil an Endothel-Vorläufern in den Kulturen zu bewerten, wurden die filtrierten Zellpopulationen durch Erfassen spezifischer Zelltyp-Marker charakterisiert, wie zuvor für die Bewachung der Differenzierung an neuronalen Vorläufernq, welche von hES-Zellen abgeleitet wurden, beschrieben wurde (Reubinoff BB et al., Nat Biotech 19 (2001), 1134). Filtrierte Zellen wurden plattiert, fixiert und immunologisch auf Expression des humanen vaskulären endothelialen Endothelrezeptor 2 (VEGFR2, KDR) und vaskulären endothelialen Cadherin VE-cad, untersucht, die beide bei der Entwicklung endothelialer Maus-Vorläufer eine wichtige Rolle spielen (Nishikawa S-I., et al., Development 125 (1998), 1747).
Unerwarteter Weise wurde bei Quantifizierung der Expression dieser Marker bei zwei Populationen mittels Erfassung und FACS-Analyse (1C–E) gefunden, dass ein erheblicher Anteil der kleineren Endothel-ähnlichen Zellen VE-cad (78%, 1C) exprimierte, und ein kleinerer Anteil VEGFR2 (28%, 1C). Wenn die kleineren filtrierten Zellen für 12 Stunden ausplattiert, fixiert und mit dem fluoreszierenden anti-VE-cad Antikörper auf Immunmorphologie untersucht wurde (1D–E), wurde eine bedeutend größere Expression an VE-cad nachgewiesen (90,55 + 5,20%) was höchstwahrscheinlich auf die geringe Fluoreszenzintensität zurück geht, die verzeichnet wird, wenn VE-cad an den Zell-Zell-Verbindungen exprimiert wird (1E). Untersuchungen einer Vielzahl von Zellsaat-Dichten zeigte eine optimale VE-cad Expression bei 5 × 10⁴ Zellen/cm².
Bei weiterer Charakterisierung der RT-PCR Amplifizierung der RNA wurde gefunden, dass die endothelialen- ähnlichen Zellen die Endothel-Marker CD31 und Tie2; AC133/CD133, GATA2 und Ta11, frühe Endothel/hematopoeitische Vorläufer-Zell-Marker (Peichev, M et al., Blood 95 (2000), 952 und Kaufman DS et al PNAS 98 (2001), 10716) (1F, filtriert) exprimierten. RT-PCR von RNA aus nicht differenzierten humanen Stammzellen (1F, hES) zeigte keine CD31-, Tie2-, Tal1- oder GATA2-Expression und nur eine geringe Expression von AC133. Es ist festzustellen, dass die Intensitäten der GAPDH- Banden für sowohl die nicht differenzierten als auch differenzierten Zellpopulationen (1F) identisch sind, und die spezifische Natur der Änderung des Zell-Phenotyps beider Differenzierung anzeigt.
Eine Immunofluoreszenz-Färbung der größeren, ausgeschlossenen Zellen (1G) zeigte die Existenz von Zell-Merkmalen eines Epithel-Phenotyps der glatten Muskel (erläutert von Gittenberger-de Groot A.C. et al PNAS 97 (2000), 11307) und von Markern (AlphaSMA), die in dem kleineren filtrierten Zellen nicht erfaßt wurden. Bei weiterer Charakterisierung mittels RT-PCR Amplifizierung von RNA wurden gefunden, dass die ausgestoßenen Zellen aktiv die Epithel-Marker Calponin und Caldesmon, Actin des glatten Muskels (SMA) und SM-MHC (1H, zurückgehalten) exprimerten. RT-PCR von RNA der kleineren, Endothel-ähnlichen Zellen zeigte keine Expression irgendeiner der Epithel-Zell-Marker (1H, filtriert). Es ist festzustellen, dass die Intensitäten der GAPDH- Banden für beide Zellpopulationen (1H) identisch sind, was die spezifische Natur des Wechsels des Phänotyps mit Differenzierung zeigt.
Wenn die zwei, aus der Aussaat bei geringer Saatdichte und Züchten der humanen Stammzellen (hES) hervorgehenden zwei Zellpopulationen auf Zell-Proliferations-Fähigkeiten untersucht wurden, zeigte der BrdU-Inkorporierungs-Assay, dass die epitheloiden, ausgeschlossenen, großen, zu der glatten Muskulatur-ähnlichen Zellen nicht profilieren können (1I, Pfeil) während die kleineren, Endothel-ähnlichen Vorläufer-Zellen die Färbung klar inkorporieren, was einen Erhalt der Profilerations-Fähigkeit anzeigt (1I). Diese Ergebnisse zeigen insgesamt, dass humane Stammzellen, welche als einzelne Zellen und nicht als embryoide Körper ausgesät und in vitro auf einer Zell-freien, zweidimensionalen Matrix gezüchtet wurden, proliferierende, Endothel-ähnliche Vorläufer-Zellen ergeben können, welche durch Filtration von glatten Muskulatur- ähnlichen Vorläufern getrennt werden können.
Beispiel 2
In vitro Induzierung endothelialer Zellen der glatten Muskulatur und hematopoetischer Zellen
Differenzierung von humanen vaskulären Vorläufer-Zellen
Um das Differenzierungspotential der vaskulogenen Vorläufer-Zellen zu studieren, wurden die Zellen auf mit Kollagen Typ IV beschichteten Schalen bei einer geringeren Saat-Konzentration (2,5 × 10⁴ Zellen/cm²) erneut gezüchtet. Eine Differenzierung glatter Muskelzellen wurde durch Zusatz des von Platelets-abgeleiteten Wachstumsfaktors BB (hPDGF-BB) induziert, wobei gefunden wurde, dass dies in der Maus (mES) jedoch nicht in humanen Stammzellen (Gittenberger de Groot A.C. et al., PNAS 97 (2000), 11307) eine SMT-Differenzierung induziert,. Nach 10–12 Tagen Züchten wurden in der Kultur sowohl schrauben-/Spindel-förmig geformte Zellen, als auch Zellen mit einem epithelioiden Phänotyp nachgewiesen, zusammen mit einer gleichzeitigen Induktion der Expression von Marker glatter Muskelzellen. Mit einer RT-PCR-Analyse wurde eine Hochregulierung von Markern des spezifischen glatten Muskels erfasst, wie α-Actin des glatten Muskels (SMA), der schweren Myosinkette des glatten Muskels (SM-MHC), Calponin, SM22 und Caldesmon (2A, v-SMC), welche jedoch in der RNA aus nicht hPDGF-BB behandelten Zellen nicht erfasst wurden (2A, ESH-Vorläuferzellen). Eine immunofluoreszente Erfassung von Markerproteinen humaner glatter Muskelzellen (αSMA, 2B; Smoothelin, ein Marker der frühen Entwicklung der glatten Muskulatur, 2C; SM-MHC 2D und Calponin 2E) bestätigt die Fähigkeit zu einer weiteren in vitro Differenzierung humaner vaskulogener Vorläuferzellen durch Aussetzen an hPDGF-BB.
Um das Potential der Differenzierung zu Endothelzellen zu überprüfen, wurden humane vaskulogene Vorläuferzellen an hVEGF₁₆₅ ausgesetzt, das in der Maus, jedoch nicht bei der Induktion humaner Endothelzellen (Yamashita J. et al., Nature 408 (2000) 92) als wirksam befunden wurde. Diese Manipulation führte zu der Induktion der Endothelzell-spezifischen Marker: eine kontinuierliche Expression von VE-cad und das Auftreten des Willebrand Faktors (vWF), der in Weibel-Palade-Körperchen gespeichert wird, erfasst durch Immunfluoreszenz (2F bzw. 2G), Dill-Ac-LDL-Aufnahme in reifere Zellen (2H) und gleiche Beanspruchungsfaser-Anordnung in einigen reifen Zellen (2I). So induzierte insbesondere eine Wachstumsfaktor-induzierte Differenzierung mit hPDGF-BB oder hVEGF₁₆₅ keine linienspezifische Festlegung, d. h. es wurden sowohl endotheliale als auch Zelltypen der glatten Muskulatur bei Verabreichung eines jeden der Wachstumsfaktoren verzeichnet. Darüber hinaus zeigte eine BrdU-Inkorporierung in die differenzierten Zellen einen Erhalt der proliferativen Fähigkeit in den mit dem vaskulären Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) behandelten Zellen (2I) an und insbesondere in jenen Zellen mit kleinerer Morphologie, während mit hPDGF-BB behandelte Zellen eine verschlechtete Proliferationsfähigkeit (2J) zeigten. Die hematopoietische Fähigkeit der isolierten Vorläuferzellen wurde ebenfalls gezeigt. Wenn die VE-cad-exprimierende Population filtrierter, vaskulogener Vorläuferzellen in einem halb festen Medium mit Cytokinen gezüchtet wurde, wurden CFUs verzeichnet, die hematopoietische Kolonien anzeigten (2K–M). Eine Differenzierung isolierter humaner vaskulogener Vorläuferzellen kann daher durch spezifische Wachstumsfaktoren in vitro in einem zellfreiem Medium ohne linienspezifische Festlegung oder Verlust der proliferativen Fähigkeit induziert und gesteuert werden.
Beispiel 3
In-vitro Vaskulogenese und Blutzellbildung durch ESH-Zellen
Wichtige Abläufe, welche für die Vaskulogenese charakteristisch sind, wurden in vitro unter Verwendung von embryoiden Körperchen, welche von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitet waren (siehe beispielsweise Feraud O et al., Lab Investig 81 (2001), 1661–89) induziert, wobei jedoch Anstrengungen zum Nachahmen vaskulogener Prozesse in vitro unter Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen im Großen und Ganzen nicht erfolgreich waren. Zum Studium des Vaskularisierungspotentials in vitro humaner vaskulogener Vorläuferzellen (ESH) wurden zwei unterschiedliche 3-dimensionale Modelle eingesetzt: Kollagen Typ I und Matrigel, welche verwendet wurden, um eine 3D Gefäß-ähnliche Bildung aus Endothelzellen zu fordern (Mardi JA und Pratt BM, B.M.J. Cell Biol. 106 (1988), 1375; Kubota Y et al. J. Cell. Biol. 107 (1988), 1589).
Die Aggregation der ESH-Zellen in Anwesenheit von mit hVEGF und hPDGF-BB ergänztem Differenzierungsmedium vor Aussaat in Kollagen Typ I (3A) oder auf Matrigel (3B) zeigte in sowohl dem Kollagen als auch dem Matrigel-Substrat klar ein Keimen/eine Sprossenbildung und Röhren-ähnliche Strukturen, welche mit der frühen Vaskulogenese und Vaskularisierung assoziiert sind,. Histologische Schnitte zeigen ein Eindringen der Endothelzellen in das Matrigel, welche eine röhrenähnliche Netzwerkstruktur bilden, die für die vaskuläre Bildung charakteristisch ist (3C). Überraschenderweise und insbesondere von Bedeutung zeigte eine Beobachtung bei größerer Vergrößerung Blutzellen in diesen in-vitro gezüchteten Gefäßen (3D, Pfeil). Die Elektronenmikroskopie offenbarte weiter gut geformte, endothelspezifische Weibel-Palade-Körperchen (WP) in dem Zellcytoplasma, Lipoproteinkapseln (Li), Endothelzellen, die in den Strängen ein Lumen (Lu) bilden und hematopoietische (BC) Entwicklung in den durch die Endothelzellen (EC) in dem Matrigel (M) (3E–3G) gebildeten Gefäßen. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass isolierte humane vaskulogene Vorläuferzellen die Fähigkeit zur Differenzierung zu funktionalen Endothelzellen mit Lipoprotein Methabolismus, Faktor VIII (vWF) Produktion, Blutzellen und allen Komponenten vaskulärer Strukturen in vitro unter definierten Bedingungen aufweisen.
Beispiel 4
3-dimensionale Gerust-Vaskularisierung
Eine in vitro Vaskularisierung manipulierter Gewebe ist ein wichtiger Aspekt regenerativer Medizin und für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit des gezüchteten Gewebes vor und nach Implantation entscheidend. Vaskuläre Strukturen mit großem Durchmesser, welche für eine Implantation geeignet sind, erfordern einen Trägerrahmen, beispielsweise ein Gerüst, zur wirksamen Entwicklung und zum Wachstum. Das therapeutische Potential humaner vaskulogener (ESH) Vorläuferzellen wurde daher unter Verwendung eines in-vitro manipulierten Gewebemodells, dem 3-dimensionalen Alginat-Gerüst, untersucht, wobei gezeigt werden konnte, dass dieses in vitro die Gewebebildung aus Fibroblasten und Hepatocyten unterstützt (Shapiro L, und Cohen S., Biomaterials 18 (1997), 583; und Gicklis R, et al., Biotechnol Bioeng 67 (2000), 344), jedoch nicht aus humanen vaskulogenen Vorläufern.
Wenn humane vaskulogene Vorläufer wie beschrieben aggregieren und in poröse Alginat-Gerüste ausgesät wurden, dann wurde nach 14 Tagen Inkubation im Differenzierungsmedium, das mit hVEGF und hPDGF-BB ergänzt war, eine bestimmte Gefäßbildung um die Gerüstporen (4A, rot gefärbte Strukturen), verzeichnet. Eine Überprüfung der vaskulären Wandstruktur bei höherer Vergrößerung zeigt flache, längliche Endothelzellen, die von glatten Muskelzellen umgeben sind, was für die vaskuläre Morphologie typisch ist (4B). Ein Züchten humaner vaskulogener Vorläufer (ESH)-Zellen auf 3-D-Gerüsten zeigte zum ersten Mal die Fähigkeit zur direkten in-vitro Vaskulogenese mit differenzierten humanen Stammzellen, die eine normale angiogenische Entwicklung anzeigen.
Beispiel 5
Humane vaskulogene Vorläuferzell-Differenzierung als Modell für die Angiogenese
Kürzlich durchgeführte Studien zeigten, dass einige embryonale Maus-Stammzell (mES) – Systeme in der Lage sind, Schlüsselabläufe und die Chronologie des angiogenischen Prozesses zu reproduzieren und, was ein möglicherweise nützliches Werkzeug liefert, mit dem der Mechanismus der Angiogenese untersucht werden kann (Feraud O et al., Invest 81 (2001), 1669). Von weiterer Bedeutung war die Beobachtung, dass von VE-cad defizienten Mäusestämmen (VE-cad –/–) abgeleitete mES-Zellen keine Endothel-Keimungen entwickelten. Nur embryoidale Körper (mEB), jedoch nicht Einzelzellen waren in der Lage vaskulogene Abläufe in vitro zu beginnen.
Um zu überprüfen, ob eine in vitro durchgeführte vaskuläre Entwicklung aus isolierten humanen vaskulogenen Vorläuferzellen physiologische Abläufe der Angio- und Vaskulogenese reflektieren, wurde der Effekt inhibitorischer Antikörper unter Verwendung von BV6 untersucht, ein monoklonaler hVE-cad-spezifischer Antikörper, der in vitro die Röhrenbildung humaner Endothelzellen inhibieren kann (Corada M et al., Blood 97 (2001), 1679).
Überraschenderweise zeigte der monoklonale anti-VE-cad starken inhibitorischen Effekt auf die in vitro Vaskularisierung durch ESH-Zellen. 7 Tage nach Inkubation von ESH-Zellen, die auf Matrigel in Differnezierungsmedium ausgesäät worden waren, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt war, waren die Gefäße und Netzwerkstrukturen, die für eine frühe Vaskulogenese typisch sind, in dem Gel klar erkennbar (5). Ein Zusatz von 50 μg/ml des anti-hVE-cad Antikörpers BV6 zu dem Medium störte klar die Vaskulogenese und inhibierte im wesentlichen Zellkeimung und die Bildung von Röhren- und Netzwerkstrukturen (5B). Eine gesteuerte in vitro Differenzierung isolierter humaner vaskulogener Vorläufer (ESH)-Zellen zeigte gegenüber bekannten Inhibitoren humaner Angiogenese-Vaskulogenese Sensitivität und liefert als solche ein Model zum Studium und zur Bewertung vaskulärverwandter Effektoren und Therapien
Beispiel 6
Anreicherung von vaskulogenen Vorläufern
MIt hES-Zellen, die bei den von Yamashita et al. gelehrten Zell Konzentrationen (Yamashita J. et al Nature 408 (2000), 92–96) ausgesät wurden, durchgeführte Experimente führten zum Zelltod (Daten nicht gezeigt). Als solche wurden mehrere 2D Differenzierungs- Experimente, bei denen unterschiedliche Zell-Konzentrationen auf Gelatine, Laminin oder Typ IV Kollagen beschichtete Schalen eingesetzt wurden, entworfen und durchgeführt.
Material und Methoden
Nicht differenzierende hES- Zellen (119.2 Passagen 29 + 36 + 29 + 60; H13 Passagen 31–57; I6 Passagen 35–50) wurden auf einer inaktivierten embryonalen Maus-feeder-Schicht (MEF) gezüchtet. Alle Experimente wurden unter Verwendung von der Linien H9.2 und H13 durchgeführt, während Vorläufer- Anreicherung und Charakterisierung- Experimente auch unter Verwendung von der Linie I6 durchgeführt wurden. Die hES- Zellen wurden unter Verwendung von Kollagenase Typ IV geteilt, was zu kleinen Aggregaten führte. Die Zellen wurden mit 5mM EDTA in PBS, das mit 1% (Vol./Vol.) fötalem Kälberserum (FBS; HyClone) ergänzt war, behandelt und unter Verwendung eines 40 μm Sieb-Filters (Falcon) zur Erleichterung der Differenzierungsstudien und der FACS-Analyse getrennt. Nicht differenzierte hES-Zell-Suspensionen wurden auf mit Kollagen Typ IV beschichteten Schalen (6 Vertiefungen, Becton Dickinson) oder auf mit 0,1% Gelatine (Sigma) beschichteten Schalen in einer Zelldichte von 5 × 10⁴ Zellen/cm² in einem Differenzierungsmedium aufplattiert, das aus Alpha MEM-Medium (Gibco-BRL) bestand, das mit 10% FBS (HyClone) und 0,1 mM β- Mercaptoethanol (Gibco-BRL) ergänzt war. Nach 6 Tagen Züchten wurden differenzierte Zellen durch einen 40 μm Sieb-Filter (Falcon) filtriert, analysiert oder zur Differenzierung auf mit Kollagen Typ IV beschichteten Schalen (Becton Dickinson) in einem Differenzierungsmedium mit 50 ng/ml hVEGF₁₆₅ oder 10 ng/ml hPDGF-BB (beide von R&D Systems Inc.) für weitere 10–12 Tage erneut gezüchtet.
Klonale Analyse
Eine angereicherte Endothel-Zellpopulation wurde zur FACS-Analyse mit anti-VE-Cadherin-FITC (Santa Cruz) immun-markiert und einzelne Zellen wurden unter Verwendung einer IVF Mikropipette (Cook) isoliert. Jede Zelle wurde in einer Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Kollagen Typ IV) in einem geeignete Differenzierungsmedium ausplattiert. Nach einer Stunde Züchten wurde jede Vertiefung visuell untersucht (sowohl mit Licht- als auch Fluoreszenz-Mikroskop) um die Anzahl an ausplattierten Zellen festzustellen. Eine einzelne mechanischen Zell-Isolierung wurde anstelle von FACS eingesetzt, da hES-Einzel-Zellen das FACS-Sortierungs-Verfahren normalerweise nicht überleben (Daten nicht gezeigt). Nach einer Woche Züchten geernteter einzelner Zellen konnten Einzelzell-Kolonien verzeichnet werden. Im Monat Eins nach Züchten wurde jede Kolonie mit Kollagenase Typ IV verdaut und in einer Vertiefung mit einer Platte von 20 Vertiefungen (Kollagen Typ IV) transferiert. Konfluente Figuren wurden verdaut und für kontinuierliches Züchten oder der Immunphänotyp Analyse eingesetzt.
Ergebnisse
Isolierung und Charakterisierung von endothel und SMC Vorläufern
Die vorliegende Vorgehensweise bei der Forschung (1A) basierte auf der Erkenntnis, dass zur Differenzierung von lateralen Mesoderm-Zellen (Yamashita J, et al Nature; 408 (2000) 92–96) keine embryoide 3D-Körperstruktur erforderlich ist.
Versuche die von Yamashita et al vorgeschlagene Zellkonzentration zu verwenden (1 × 10⁵ – 1,5 × 10⁵ Zellen/cm²) führte zu einer gemischten Population, welche sowohl undifferenzierte Kolonien als auch mehrere daraus differenzierte Zelltypen beinhaltete (6B).
Unter Verwendung von mit Kollagen Typ IV beschichteten Schalen und geringeren Zell-Saatkonzentrationen (5 × 10⁴ – 7 × 10⁴ hES-Zellen/cm²) konnten die hier genannten Erfinder eine einheitlicherer Population erzeugen, welche als Quelle für spezifische Vorläufer Populationen besser dienen kann. Die zuletzt genannte Population beinhaltete zwei Typen Zellen, kleiner flache Zellen mit großen Kernen vergleichbar mit endothelialen Vorläufern (Yamashita J, et al; Nature 408 (2000) 92–96) und große flache Zellen mit Faseranordnung (6C).
Die aus den zweiten Saat- Experiment erhaltene Zellpopulation (d.h., 5 × 10⁴ – 7 × 10⁴ Zellen/cm², ausgesät auf mit Kollagen Typ IV beschichteten Schalen) wurde daher in weiteren Experimenten eingesetzt, bei denen die Gewinnung bestimmter Vorläuferpopulationen versucht wurde.
Da die zwei dominanten Subpopulationen hinsichtlich der Größe erhebliche Unterschiede zeigten, wurde die gemäß der erfindungsgemäßen Lebre erzeugte Population durch einen 40 μm Filter filtriert, so dass die Endothel-ähnlichen Zellen von den großen flachen Zellen getrennt wurden. Eine Analyse der Endothel-ähnlichen Zellfraktion zeigte ein präferentielles Überleben einer VE-cad angereicherten Population (~35%) welche durch wiederholte Filtration weiter angereicht wurde (~75%). Die Endothel-ähnliche Zellfraktion beinhaltete CD31 exprimierende Zellen (~60% der Zellen) und Flk-1 (~30% der Zellen) (6D). Eine RT-PCR- Analyse, welche an beiden Zellfraktionen durchgeführt wurde zeigte, dass die Endothel-ähnliche Zellfraktion keinen der v-SMCs Marker exprimierte. Eine Immunphänotypische Analyse der Endothel-ähnlichen Zellfraktion zeigte eine Hochregulierung der CD34- (17 ± 3%; n = 3), Tal1- (75 ± 8%; n = 3) und Gata2- (42 ± 10%; n = 3) Proteine (6E), welche zuvor als frühe Endothel/hematopoetische-Vorläufer-Zellmarker erkannt wurden (Kaufman DS et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 98 (2001), 10716–10721; Peichev M, et al Blond 95 (2000), 952–958; Robertson SM, et al., Development 127 (2000), 2447–2459).
Um das proliferative Potential zu bewerten wurden die vorstehend beschriebenen Zellfraktionen auf BrdU-Inkorporierung und Ki-67-Expression analysiert. Eine Puls-Markierung mit BrdU für 12 Stunden zeigte, dass einige der Endothel-Vorläuferzellen BrdU inkorporierten, während keine der SMC-ähnlichen Zellen diese Fähigkeit zeigte (6Fi–ii). Beide isolierten Fraktionen wurden darüber hinaus auf die Expression von Ki-67 untersucht, ein typisches, in teilenden Zellen gefundenes Antigen. Dieses Experiment zeigte, dass 66 ± 2% (n = 3) der erneut gezüchteten, endothel ähnlichen Zellen Ki-67 exprimierten (6Fiii) während inaktivierte embryonale Maus-Fibroblasten, die als Kontrolle dienten, für Ki-67 nicht färbten (Daten nicht gezeigt).
Linien-Differenzierung
Ein Studium des Differenzierungspotentials der angereicherten Vorläuferfraktion erforderte ein erneutes Züchten auf mit Collagen Typ IV beschichteten Schalen bei geringerer Zell-Saatkonzentration (2,5 × 10⁴ Zellen/cm²). Das Potential derartiger Zellen zur kontinuierlichen Differenzierung zu Endothelzellen wurde in der Anwesenheit von hVEGF 165, einem wohlbekannten Mitogen für Endothelzellen untersucht. Die Anwesenheit dieses Mitogens induzierte die Aufnahme von Dil-acetyliertem Lipoproteinen geringer Dichte (Ac-LDL) (7A) und die Produktion des Willebrand Faktors (vWF) der in Weibel-Palade-Körperchen (7B) gespeichert wird. Zur Induzierung der v-SMC Differenzierung wurde ein bekannter "Rekrutierungsfaktor" für Pericyten verwendet, der von Platelets abgeleitete Wachstumsfaktor BB (PDGF-BB), wobei dieser Faktor sich bei der Differenzierung von Maus ES-Zellen zu der SMC-Linie als wirksam erwiesen hat (Yamashita J, et al., Nature 408 (2000), 92–96). Nach 10–12 Tagen Züchten in PDGF-BB erschienen schraubenartige Zellen in der Kultur. Diese Zellen exprimierten a-Actin der glatten Muskulatur (SMA) (7C). Andere spezifische v-SMCs-Marker, wie die schwere Kette von Myosin der glatten Muskulatur (SM-MHC), SM22 und Caldesmon wurden von diesen Zellen ebenfalls exprimiert, wie durch RT-PCR-Analyse gezeigt (7D). Diese Ergebnisse zeigen das Potential der hier isolierten Zellen zur Differenzierung in einem SMC-Phenotyp.
Clonale Analyse
Einzelne VE-cad+-Zellen, die aus hES-Zellen erzeugt wurden, wurden untersucht, um festzustellen, ob diese Zellen gemeinsame Vorläufer für Endothel und murale Zellen enthielten. Einzelne VE-cad+-Zellen, die aus einer angereicherten vaskulogenen Population isoliert worden waren, wurden auf einer mit Collagen Typ IV beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen gezüchtet. Eine Stunde nach Ausplattieren wurde jede Vertiefung visuell untersucht (sowohl Licht als auch Fluoreszenz), um die Anzahl an plattierten Zellen festzustellen. Um deren Differenzierungsfähigkeit zu untersuchen, wurden Einzelzellen in Differenzierungsmedium gezüchtet, das mit hVEGF oder mit hPDGF-BB ergänzt war. Einzelne Zellkolonien konnten nach 8 Tagen Züchten unter jeder Kulturbedingung (8Ai) verzeichnet werden. Die Plattierungseffizienz betrug 8%, geringer als die für das mES-System überlieferte (Yamashita J, et al., Nature 408 (2000), 92–96), was die Schwierigkeit des Züchtens einzelner hES-Zellen zeigt (Amit et al., Dev. Biol. 227 (2000), 271–278).
Mit VEGF ergänzte Zellkulturen enthielten hauptsächlich Zellen mit Endothelzell-Morphologie (8Aii), während PDGF-BB ergänzte Kulturen hauptsächlich spindelartige Zellen, welche v-SMCs ähneln (8Aiii), enthielten. Diese spindelartigen Zellen exprimierten SMA und Calponin (8Bi–ii). In den mit VEGF ergänzten Kulturen waren die meisten Zellen durch eine vWF-Produktion und Dil-Ac-LDL Metabolismus (8Ciii) gekennzeichnet, was daher einen Endothelzell-Phänotyp anzeigt. Aussetzen von VE-cad+-Zellen an spezifischen Wachstumsfaktoren führte nicht zu einer Gesamtzell-Ausrichtung in eine Linie. Die mit PDGF-BB ergänzten Kulturen beinhalteten Zellen, welche v-SMC-Marker exprimierten und Zellen, die als VE-cad+-Zellen klassifiziert wurden.
Beispiel 7
Humane Vaskulatur in der Maus
Materialien und Methoden
Um zu bestimmen, ob hES-abgeleitete, vaskulogene Vorläuferzellen zur Bildung von Vaskulatur in vivo eingesetzt werden können, wurden Alginat-Gerüste mit den Zellen (wie vorstehend erläutert) vor-ausgesät und subkutan in SCID Mäuse transplantiert. Nicht ausgesäte Gerüste dienten als negative Kontrollen. Zwei Wochen nach Transplantation wurden die Gerüste und das Umgebungsgewebe aus den Mausen entfernt und histologisch untersucht.
Ergebnisse
Wie in den 9A–B ersichtlich, waren vaskuläre Röhren, welche in den mit Zellen ausgesäten, transplantierten Gerüsten gebildet wurden, wesentlich dicker als die vaskulären Röhren, die sich in den nicht ausgesäten Kontroll-Gerüsten bildeten. Eine Färbung transplantierter Gerüst-Schnitte mit anti-Mensch-SMA zeigte die Bildung funktionaler Vaskulatur menschlichen Ursprungs, welche Mausblutstrom enthielt (9C). Vergleichbare Ergebnisse wurden nach subkutanem Injizieren von Matrigel-Stopfen, welche hES-abgeleitete vaskulogene Vorläuferzellen enthielten, verzeichnet.
Beispiel 8
Auswirkung von Scher-Beanspruchung auf hES-abgeleitete vaskulogene Zellen
Materialien und Methoden
Humane, von ES abgeleitete vaskulogene Zellen, hauptsächlich vaskulogene Zellen der glatten Muskulatur (v-SMCs) wurden in einer Strömungskammer (wie in 10 gezeigt) gezüchtet und einer strömungsinduzierten Scher-Beanspruchung für 24 Stunden ausgesetzt. Ein geschlossener Strömungskreislauf zirkulierte steriles EC-Differenzierungsmedium durch die zusammengesetzte Strömungskammer, welcher eine stetige, laminare Scher-Beanspruchung von 10 dyne/cm², die auf die Zellen wirkte, mit sich brachte. Jedes Experiment wurde von einem statischen Kontroll-Aufbau begleitet. Nach 24 Stunden Aussetzen an Scherbeanspruchung wurden die Zellen von der Kultur entfernt und histologisch analysiert.
Ergebnisse
Wie in den 11A–B ersichtlich, zeigt die Phalloidin-Expression eine typische senkrechte Organisation, was reife funktionale vaskulogene Zellen, die von einer Scher-Beanspruchung herrühren, anzeigt. Darüber hinaus war die Expression von α-SMA (ein spezifischer Marker, der frühe vaskuläre Zellen der glatten Muskulatur zeigt) auch im Wesentlichen von der Scher-Beanspruchung beeinträchtigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Scher-Beanspruchung die Expression und Organisationsgenetik von Stressfasern wirksam induziert, wodurch eine Differenzierung und Reifung und Funktionalität von ES-abgeleiteten vaskulogenen Zellen erhöht wird.
Beispiel 9
Gesteuerte Differenzierung von hES vaskulogenen Vorläuferzellen
Materialien und Methoden

Humane ES-Zellen wurden für sechs Tage, wie vorstehend beschrieben, auf mit Collagen Typ IV beschichteten Platten gezüchtet. Die so erhaltenen vaskulogenen Vorläuferzellen wurden in Differenzierungsmedien transferiert, welche hohe Mengen an Serum (10%, Vol./Vol.) oder geringe Serummengen (2%, Vol./Vol.) enthielten und bei 37°C inkubiert. Die gezüchteten Zellen wurden proliferieren gelassen, wobei routinemäßig jede 5–6 Tage passagiert wurde. Nach einer Inkubationszeitspanne von 15 Tagen wurden die Zellen aus der Kultur entnommen und mittels RT-PCR und Real-time RT-PCR unter Verwendung spezifischer Marker analysiert, welche für Endothelzellen (ED) und vaskuläre Zellen der glatten Muskulatur (v-SMC) anzeigend sind. Primersequenzen unter den Reaktionsbedingungen, die bei der PCR zum Einsatz kamen, sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Länge (bp)	Reaktionsbedingungen	Primer SEQ ID NO:	Primer	Marker-Gen
Länge (bp)	32 Zyklen, Annealen bei 60 °C, in 1.mnM MgCl₂	2324	F:TGAAGCCTAGCCTGTCACCT R:CGCACAGCTGGAGGTCTTAT	CD34
331	40 Zyklen, Annealen bei 55°C, in 1.5 mM MgCl₂	2526	F:ATGGTGCAGCTGAGTCCTCC R:TCTCATTCTTGCTGAGCTTC	Tal-1
362	35 Zyklen, Annealen bei 60 °C, in 1.5 mM MgCl₂	2728	F:GGGGGAGGTTGGACTGTAAT R:AGGGCACATTTGCACATACA	Ang1
535	35 Zyklen, Annealen bei 60°C in 15 mM MgCl₂	2930	F:GGATCTGGGGAGAGAGGAAC R:CTCTGCACCGAGTCATTCGTA	Ang2
512	35 Zyklen, Annealen bei 60°C, in 1.5 mM MgCl₂	1516	F:ATCCCATTTGCAAAGCTTCTGGCTGGCC R:TGTGAAGCGTCTCACAGGTCCAGGATG	Tie2

596	35 Zyklen, Annalen bei 60°C, in 1.5 mM MgCl₂	3132	F:ACGGGATGACCAAGTACAGC R:ACACACTTTGGGCTGGTAGG	VE-cad
790	35 Zyklen, Annalen bei 60°C, in 1.5mM MgCl₂	3334	F:CTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCA R:AATACCAGTGGATGTGATGGCGG	KDR
200	32 Zyklen, Annalen bei 60 °C,n 1.5 mM MgCl₂	1314	F:CAGTCTGACCAGCTGAAAA R:GGCCATCCAAATCTGTCCTA	AC133
700	35 Zyklen, Annalen bei 60 °C, in 1.5 mM MgCl₂	3536	F:GAAGCCAGCTTCCACATAAC R:AGTGGTGGCCTCGTGAATGG	VCAM
965	35 Zyklen, Annalen bei 60°C, in 1.5 mM MgCl₂	1 2	F:CCAGCTATGTGAAGAAGAAGAGG R:GTGATCTCCTTCTGCATTCGGT	aSMA
671	35 Zyklen, Annalen bei 60 °C, in 1 mM MgCl₂	34	F:GAGTGTGCAGACGGAACTTCAGCC R:GTCTGTGCCCAACTTGGGGTC	Calpon in
179	35 Zyklen, Annalen bei 62 °C, in 1 mM MgCl₂	56	F:AAGCCAAGAGCTTGGAAGC R:TCCTCCTCAGAACCATCTGC	SM-MHC
302	27 Zyklen, Annalen bei 60°C, in 1.5 mM MgCl₂	2122	F:AGCCACATCGCTCAGACACC R:GTACTCAGCGCCAGCATCG	GAPDH
595	35 Zyklen, Annalen bei 55 °C, in 1.5 mM MgCl₂	1920	F:CAAGCGTCGTGAATGACAC R:CACTGCCTTGACTGTCTTAAG	mCD8 1

Ergebnisse
Wie in den 12–13 ersichtlich, wurden grosse Mengen an v-SMC Markern (α-SMA, Calponin und SM-MHC) in Zellen nachgewiesen, die in Medien mit hohen Serumgehalt gezüchtet wurden, während die Expression von EC-Markern im Wesentlichen herunterreguliert war. Andererseits zeigten Zellen, die in Medien mit geringem Serumgehalt gezüchtet wurden, hohe Mengen an EC-Markern (Tie2, CD31, KDR (VEGFR2), VCAM und VE-Cad, während die Expression von v-SMC-Markern im Wesentlichen herunterreguliert war (12 und 14).
Darüber hinaus zeigten vaskulogene Vorläuferzellen, die auf mit Matrigel beschichteten Platten erzeugt und in Differenzierungsmedium mit geringem Serum Mengen gezüchtet wurden, hauptsächlich eine Morphologie vaskulärer Zellen der glatten Muskulatur (15A). Andererseits proliferierten sie bei erneuter Züchtung in Differenzierungsmedium mit hohen Serummengen kontinuierlich und zeigten eine hohe Rate an Vaskulatur-Sprossung zusammen mit intensivem röhrenähnlichen Netzwerk von Endothelzellen (15B).
Die Ergebnisse zeigen daher klar, dass von hES abgeleitete vaskulogene Vorläuferzellen induziert werden können, um zu EC oder v-SMC zu differenzieren, in dem sie in Differenzierungsmedium mit geringem (12%) oder hohem (10%) Serum Volumenkonzentrationen gezüchtet werden.
Es ist klar, dass bestimmte Merkmale der Erfindung, die zur Klarheit im Zusammenhang mit bestimmten Ausführungsformen beschrieben wurden, auch in Kombination einer einzelnen Ausführungsform bereitgestellt werden können. Andererseits können verschiedene erfindungsgemäße Merkmale, die zur Kürze im Zusammenhang mit einer einzelnen Ausführungsform beschrieben wurden, auch separat oder in jeder geeigneten Unterkombination bereitgestellt werden.
Obwohl die Erfindung mit bestimmten Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist klar, dass dem Fachmann viele Alternativen, Modifikationen und Variationen offensichtlich sein werden. Es ist daher beabsichtigt, alle derartige Alternativen, Modifikationen und Variationen, die in den Geist und den breiten Bereich der anliegenden Ansprüche fallen, als umfasst anzusehen. Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung aufgeführt wurden, werden hier in ihrer Gesamtheit durch Inbezugnahme in die Beschreibung mitaufgenommen, so dass jede einzelne Veröffentlichung, Patent oder Patentanmeldung spezifisch und individuell hier durch Bezugnahme mit aufgenommen ist. Darüber hinaus sollen Zitate oder Identifizierungen jedes Dokuments in dieser Anmeldung nicht dahingehend ausgelegt werden, dass dieses Dokument als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung verfügbar ist.
Zusammenfassung
Ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur in vitro Identifizierung, Isolierung und Züchtung humaner vaskulogener Vorläuferzellen wird bereitgestellt. Das hier bereitgestellte Verfahren und die hier gelieferten Vorläuferzellen können für eine vaskuläre in vitro Manipulationsbehandlung kongenitaler und erworbener vaskulärer und hämatologischer Abnormalitäten, für die Bewertung und Entwicklung von Arzneimitteln, die vaskuläre und angiogenische Prozesse beeinflussen, eingesetzt werden, und zur weiteren Untersuchung bei Gewebe-Differenzierung und -Entwicklung.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Erzeugung vaskulärer Zellen der glatten Muskulatur aus vaskulogenen Vorläuferzellen umfassend, Züchten der vaskulogenen Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium, das eine Serumvolumenkonzentration von über 5% aufweist, für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, eine Differenzierung der vaskulogenen Vorläuferzellen zu vaskulären Zellen der glatten Muskulatur zu induzieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die vaskulogenen Vorläuferzellen von ES-Zellen abgeleitet sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die ES-Zellen humane ES-Zellen sind.
Verfahren zur Erzeugung von Epithelzellen aus vaskulogenen Vorläuferzellen umfassend, Züchten der vaskulogenen Vorläuferzellen in einem Differenzierungsmedium, das eine Serumvolumenkonzentration von unter 5% aufweist, für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, eine Differenzierung der vaskulogenen Vorläuferzellen zu Endothelzellen zu induzieren.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die vaskulogenen Vorläuferzellen von ES-Zellen abgeleitet sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die ES-Zellen humane ES-Zellen sind.
Verfahren zur Förderung der Differenzierung, Reifung und/oder Funktionalität vaskulogener Zellen, umfassend Aussetzen der vaskulogenen Zellen an eine Scherkraft von mindestens 1 dyne/cm² für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, eine Differenzierung, Reifung und/oder Funktionalität vaskulogener Zellen zu fördern.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die vaskulogenen Zellen vaskuläre Zellen der glatten Muskulatur sind oder von ES-Zellen abgeleitete Endothelzellen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die ES-Zellen humane ES-Zellen sind.