DE60318920T2

DE60318920T2 - Induktion von Insulin-produzierenden Zellen

Info

Publication number: DE60318920T2
Application number: DE60318920T
Authority: DE
Inventors: Susumu Chiba-shi Seino; Nobuko Chiba-shi Ishizuka; Masaaki Chiba-shi Okuno
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2003-04-16
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2023-04-17
Also published as: EP1354942B1; JP4136434B2; JP2003304878A; EP1354942A1; US20030219894A1; DE60318920D1; AU2003203799A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen aus nicht-Insulin-produzierenden Zellen und insbesondere die Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen aus Hepatozyten.
Hintergrund der Erfindung
Seit seiner Entdeckung wurde Insulin allgemein für die Behandlung diabetischer Patienten mit einem absoluten Insulinmangel verwendet. Während normale pankreatische β-Zellen die Sekretion von Insulin als Reaktion auf sich ändernde Glucosespiegel im Blut kontinuierlich anpassen, kann eine exogene Verabreichung von Insulin jedoch nicht die Glucosespiegel im Blut innerhalb eines physikalischen Bereichs, in dem der Entwicklung verschiedener diabetischer Komplikationen vorgebeugt werden könnte, einschränken. Obwohl die Transplantation von Pankreas oder pankreatischen Inselzellen Normoglykämie bei absoluter Insulininsuffizienz erreichen können [Robertson RP et al., Diabetes Care 23: 112–116 (2000)], macht insbesondere ein Mangel an transplantierbarem Pankreas oder pankreatische Inselzellen diesen Ansatz unmöglich. Aus diesem Grund wurde die Transplantation pankreatischer β-Zellen oder Inselzellen, die aus Stammzellen erzeugt wurden, zu einem vielversprechenderen therapeutischen Ansatz zum Erreichen von Normoglykämie [Soria B. et al., Diabetes 49: 157–162 (2000), Lumelsky N. et al., Science 292: 1389–1394 (2001), Assady S. et al., Diabetes 50: 1691–1697 (2001)]. Der erste Schritt einer Zelltherapie für Diabetes mellitus ist, Insulin-sekretierende Zellen zu erzeugen, die in Patienten implantierbar sind.
Während die Etablierung embryonischer Stammzell-(ES-Zell-)Linien ein nützliches System zum Untersuchen des Mechanismus der Differenzierung von Stammzellen in viele verschiedene Zelltypen bereitgestellt hat, bestehen gewaltige Hürden bei der klinischen Verwendung von ES-Zellen. Eine Allotransplantation humaner ES-Zellderivate in Patienten würde allgemein eine Immunantwort auslösen, die derjenigen ähnelt, die bei transplantierten pankreatischen Inselzellen oder transplantiertem Pankreas ausgelöst wird [Odorico JS et al., Stem Cells 19: 193–204 (2001)]. Daneben könnte die Transplantation von ES-Zellderivaten in humane Empfänger zu der Bildung von von ES-Zellen stammenden Tumoren führen [Odorico JS et al., Stem Cells 19: 193–204 (2001)]. Beim Entnehmen humaner ES-Zellderivate würden sich auch ethische Probleme ergeben [McLaren A et al., Nature 414: 129–131 (2001)].
Ein weiterer Ansatz für den Austausch von pankreatischen β-Zellen ist die Transplantation autologer β-Zellen, die ex vivo aus den eigenen Stamm- oder multipotenten Progenitorzellen eines Patienten erzeugt wurden. Vor kurzem wurde berichtet, dass die Stammzellen oder multipotenten Progenitorzellen aus adulten Geweben zu einer Differenzierung in verschiedene Typen von Zellen in der Lage sind (Clarke D et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 11: 575–580 (2001)]. Strukturen, die pankreatischen Inselchen gleichen, wurden in vitro aus pankreatischen Stammzellen von Menschen und adulten Mäusen gebildet [Bonner-Weir S et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 7999–8004 (2000), Ramiya VK et al., Nat. Med. 6: 278–282 (2000), Zulewski H et al., Diabetes 50: 521–533 (2001)]. Es wurde auch berichtet, dass der Transfer des PDX-1-Gens in die Leber Insulin-produzierende Zellen in vivo induziert [Ferber S et al., Nat. Med. 6: 568–772 (2000)]. Diese Erkenntnisse zeigen das Vorhandensein von multipotenten Progenitorzellen, die in der Lage sind, in Insulin-produzierende Zellen zu differenzieren, in adulten Geweben.
Hepatozyten besitzen mehrere Eigenschaften mit den β-Zellen gemeinsam. Zum Beispiel stammen sowohl Hepatozyten als auch β-Zellen aus dem Endoderm [Well JM et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 393–410 (1999)] und die Glucose-Transporter GLUT2 und Glucokinase, die für das Erkennen von Glucose erforderlich sind, sind sowohl in Hepatozyten als auch β-Zellen vorhanden. Daneben steuert das HNF-Transkriptionsnnetzwerk, das bei der Entwicklung von sowohl Hepatozyten als auch β-Zellen wichtig ist, die Expression von Genen, die an dem Glucose-Stoffwechsel beteiligt sind [Bell GI et al., Nature 414: 788–791 (2001)]. Diese Erkenntnisse legen die Möglichkeit nahe, Zellen mit dem Phänotyp pankreatischer β-Zellen aus hepatischen Progenitorzellen zu erzeugen.
Neben der Synthese von Insulin liegen andere wesentliche Merkmale pankreatischer β-Zellen, einschließlich Glucose-Responsivität, Reaktion auf elektrische Reize und regulierte Exozytose, vor. Der K_ATP-Kanal in pankreatischen β-Zellen koppelt, als metabolischer Sensor, die Signalwirkung der Glucose mit der elektrischen Aktivität [Seino S., Annu. Rev. Physiol. 61: 337–362 (1999)]. Das Schließen des K_ATP-Kanals depolarisiert die Membran der β-Zellen und öffnet die spannungsabhängigen Calciumkanäle (voltage-dependent calcium channels, VDCCs), was einen Einstrom von Calcium ermöglicht, der eine Exozytose auslöst [Wollheim CB et al., Diabetes Rev. 4: 276–297 (1996)].
Eine neuere Studie hat gezeigt, dass sowohl das Insulin 1- als auch das Insulin-2-Gen in einer Langzeitkultur in hepatischen Progenitorzellen von Mäusen in einem Medium, das Nicotinamid enthält, exprimiert werden [Suzuki A et al., J. Cell Biol. 156: 173–184 (2002)]. Es liegt jedoch kein Bericht über die Expression von Genen vor, die mit anderen wesentlichen Merkmalen von β-Zellen, d. h. Glucose-Responsivität, Reaktion auf elektrische Reize und regulierte Exozytose, assoziiert sind.
Da die Leber und der Pankreas beide endodermalen Ursprungs sind, aus dem oberen primitiven Darmrohr stammen [Well JM et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15: 393–410 (1999)], ist eine gegenseitige Umwandlung zwischen Leber- und Pankreaszellen möglich [Ferber S et al., Nat. Med. 6: 568–572 (2000), Shen CN et al., Nat. Cell Biol. 2: 879–887 (2000)]. Tatsächlich induzierte der durch Adenviren vermittelte Transfer des PDX-1-Gens in Mäuseleber in vivo die Transdifferenzierung einer Hepatozyten-Subpopulation zu dem Phänotyp pankreatischer β-Zellen [Ferber S et al., Nat. Med. 6: 568–572 (2000)]. Es existiert jedoch kein Bericht über eine Transdifferenzierung hepatischer Mauszellen in einen pankreatischen β-Zell-Phänotyp in vitro.
Die Aufgabe dieser Erfindung ist, Insulin-produzierende Zellen aus nicht-Insulin-produzierenden, fötalen Hepatozyten bereitzustellen und insbesondere Zellen, die nicht nur Insulin sondern auch andere Gene, die für β-Zellen charakteristisch sind, insbesondere das SUR1(eine Untereinheit des ATP-sensitiven K⁺-Kanals)-Gen, das α₁ 1.3 (eine Untereinheit des spannungsabhängigen Caclium-Kanals vom L-Typ)-Gen und ganz besonders das Prohormon-Konvertase PC1/3-Gen, exprimieren, bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder kultivierten murine, fötale Hepatozyten unter Bedingungen, bei denen primitive, hepatische Progenitorzellen in Hepatozyten oder biliäre Epithelzellen differenzieren [Suzuki A. et al., Hepatology 32: 1230–1239 (2000)]. Als Ergebnis wurde gefunden, dass Zellen, die sowohl das Insulin 1- oder das Insulin-2-Gen exprimieren, durch Kultivieren in einem Kultursystem, das eine hohe Konzentration an Nicotinamid enthält, hergeleitet wurden. Es wurde gefunden, dass durch Veranlassen einer Expression von NeuroD (auch BETA 2 genannt), das ein Transkriptionsfaktor ist, der für die Differenzierung von Neuronen benötigt wird, in nicht-humanen, fötalen Hepatozyten und Kultivieren der Zellen in dem oben angegebenen Kultivierungssystem, Zellen erhalten werden, die nicht nur erhöhte Expressionsmengen an SUR1 und α₁ 1.3 aufweisen, sondern auch PC1/3, einer hauptsächlichen Prohormon-Konvertase, die an der regulierten Sekretion in Neuroendokrinzellen beteiligt sind, exprimieren [Steiner DF, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 31–39 (1998)].
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen aus nicht-Insulin-produzierenden Zellen bereit, wobei die nicht-Insulin-produzierenden Zellen nicht-humane, fötale Säugetierhepatozyten sind und wobei das Verfahren das Kultivieren der nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten mit 1.50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten umfasst. Mit diesem Verfahren werden solche Zellen erhalten, die das Insulin 1- und das Insulin-2-Gen exprimieren und erhöhte Expressionsmengen an SUR1 und α₁ 1.3, die für die Regulierung der Insulinsekretion wesentlich sind, aufweisen. Das Einschleusen des NeuroD-Gens ergibt insbesondere solche Zellen, die zudem erhöhte Expressionsmengen an PC1/3, das für die Herstellung von reifem Insulin erforderlich ist, aufweisen.
Das oben angegebene Verfahren ist dazu ausgelegt, eine Transdifferenzierung hepatischer Progenitorzellen, die in nicht-humanen, fötalen Säugetierzellen eingeschlossen sind, in Insulin-produzierende Zellen zu bewirken. Die vorliegende Erfindung stellt daher auch ein Verfahren zur Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen aus nicht-Insulin-produzierenden Zellen bereit, wobei die nicht-Insulin-produzierenden Zellen hepatische Säugetier-Progenitorzellen sind und wobei das Verfahren das Kultivieren der hepatischen Säugetier-Progenitorzellen mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des PDX-1-Gens oder des NeuroD-Gens in den hepatischen Säugetier-Progenitorzellen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zum Bewirken einer Transdifferenzierung nicht-fötaler, hepatischer Säugetier-Progenitorzellen in Insulin-produzierende Zellen bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren der hepatischen Säugetier-Progenitorzellen mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den hepatischen Säugetier-Progenitorzellen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem nicht-humane, fötale, von Hepatozyten stammende, NeuroD-Gen exprimierende, Insulin produzierende Zellen bereit, die mit einem Verfahren hergestellt wurde, das das Kultivieren nicht-humaner, fötaler Säugetierhepatozyten mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten erreicht wird, umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung nicht-fötale, hepatische, von Progenitorzellen stammende, NeuroD-Gen exprimierende, Insulin produzierende Zellen bereit, mit einem Verfahren hergestellt sind, das das Kultivieren nicht-fötaler, hepatischer Säugetier-Progenitorzellen mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den hepatischen Säugetier-Progenitorzellen, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die hepatischen Säugetier-Progenitorzellen erreicht wird, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die nicht-fötalen, hepatischen Säugetier-Progenitorzellen nicht-human.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Mittel zur Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen unter Verwenden von Zellen, die keine pankreatischen β-Zellen sind, bereit. Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung, Zellen mit dem Phänotyp pankreatischer β-Zellen unter Verwenden somatischer Stamm-/Progenitorzellen, die in der adulten Leber vorhanden sein können, bereit. Ohne in der vorliegenden Erfindung ES-Zellen zu verwenden, ist zudem ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass sie das Problem einer Tumorentwicklung, die durch die Verwendung von ES-Zellen veranlasst werden könnte, vermeiden kann.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt den Vergleich der Expression des Insulingens mit und ohne Ergänzung mit Nicotinamid.
2 zeigt das Ergebnis der Reaktion für den Nachweis von Insulin in den Zellen, die ohne Ergänzung mit Nicotinamid kultiviert wurden.
3 zeigt das Ergebnis der Reaktion für den Nachweis von Insulin in den Zellen, die mit Ergänzung mit Nicotinamid kultiviert wurden.
4 zeigt den Vergleich der Expression von Genen in den kultivierten Zellen. „Keine cDNA" = kein Templat für eine PCR; „MIN6" = pankreatische β-Zelllinie.
5 veranschaulicht eine Karte des pCl-neo-Vektors.
6 veranschaulicht eine Karte des Cosmidvektors pAxcw.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung meint der Begriff „nicht-humane, fötale Hepatozyten" die Zellen, die eine nicht-humane, fötale Leber bilden. Der Begriff „hepatische Progenitorzellen" meint solche Zellen, die in der Population der Zellen eingeschlossen sind, die eine Leber bilden und die das Potential besitzen, sich in Zellen zu entwickeln, die neben dem Phänotyp von Hepatozyten andere Phänotypen aufweisen.
In der vorliegenden Erfindung können die verwendeten „nicht-humanen, fötalen Hepatozyten" oder „hepatischen Progenitorzellen" solche Zellen aus jedem beliebigen Säugetier, einschließlich Menschen (für die hepatischen Progenitorzellen) und jedem beliebigen nicht-humanen Säugetier sein. Beispiele für nicht-humane Säugetiere schließen Nagetiere, wie beispielsweise Mäuse und Ähnliche, Rinder, Pferde, Schweine, Ziegen, Schafe, Hunde, Katzen und Ähnliche, und jedes Tier, das insoweit ausgewählt werden kann, weil es von der gleichen Art ist wie das Tier, das eine Implantation der Insulin-produzierenden Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, erhalten soll, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung beträgt die Konzentration von Nicotinamid in dem Kulturmedium ungefähr 1–50 mmol/l, vorzugsweise 2–30 mmol/l und besonders bevorzugt 5–20 mmol/l.
In der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zum Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in nicht-humanen, fötalen Hepatozyten oder hepatischen Progenitorzellen nicht auf ein bestimmtes Verfahren beschränkt. Es kann zum Beispiel durch Einschleusen des NeuroD-Gens in die Zellen erreicht werden. Das Einschleusen des NeuroD-Gens in nicht-humane, fötale Hepatozyten kann zum Beispiel, aber nicht ausschließlich durch Infektion der nicht-humanen, fötalen Hepatozyten mit einem NeuroD-rekombinanten Adenvirus durchgeführt werden. Für das Einschleusen des NeuroD-Gens kann jedes andere Verfahren verwendet werden, vorausgesetzt, dass das auf diese Weise eingeschleuste NeuroD-Gen in den nicht-humanen, fötalen Hepatozyten exprimiert wird.
Beispiele
Herstellung nicht-humaner, fötaler Hepatozyten
Zum Herstellen der nicht-humanen, fötalen Hepatozyten wurde die Leber fötaler ICR-Mäuse (Tag des Embryos 13,5) herausgeschnitten und mit 0,1% Trypsin-Phosphatgepufferter Kochsalzlösung 5 Minuten lang bei 37°C behandelt. Dann wurde eine Lösung des Kulturmediums dazugegeben und die Mischung wurde durch eine Nylonmembran (Nr. 200) filtriert. Die so erhaltene Zellsuspension wurde 5 Minuten lang bei 50 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in einem Medium, das aus 1:1 DMEM/F12 (Sigma D6421), das mit 10% fötalem Rinderserum, L-Glutamin (2 mmol/l), β-Mercaptoethanol (β-ME), (50 μmol/l), Penicillin (100.000 U/l) und Streptomycin (100 mg/l) ergänzt worden war, bestand, suspendiert. Die Formel des 1:1 DMEM/F12 (Dulbeccos Modifiziertem Eagle-Medium/Hams-Nährmischung F-12: Sigma D6421) war wie folgt (in g/l): Ca₂Cl₂/2H₂O (0,1545), CuSO₄/5H₂O (0,0000013), Fe(NO₃)₃/9H₂O (0,00005), FeSO₄/7H₂O (0,000417), MgCl₂/6H₂O (0,0612), MgSO₄ (0,04884), KCl (0,3118), NaHCO₃ (1,2), NaCl (6,996), Na₂HPO₄ (0,07102), NaH₂PO₄ (0,0543), ZnSO₄/7H₂O (0,000432), L-Alanin (0,0045), L-Argininhydrochlorid (0,1475), L-Asparagin/H₂O (0,0075), L-Asparaginsäure (0,00665), L-Cysteinhydrochlorid/H₂O (0,01756), Cystindihydrochlorid (0,03129), L-Glutaminsäure (0,00735), Glycin (0,01875), L-Histidinhydrochlorid/H₂O (0,03148), L-Isoleucin (0,05447), L-Leucin (0,05905), L-Lysinhydrochlorid (0,09125), L-Methionin (0,01724), L-Phenylalanin (0,03578), L-Prolin (0,01725), L-Serin (0,02625), L-Threonin (0,05345), L-Tryptophan (0,00902), L-Tyrosin 2Na/2H₂O (0,05579), L-Valin (0,05285), Biotin (0,0000035), Cholinchlorid (0,00898), Folsäure (0,00265), Myoinositol (0,0126), Nicotinamid (0,00202 = 0,0165 mmol), D-Pantothensäure/1/2Ca (0,00224), Pyridoxinhydrochlorid (0,002031), Riboflavin (0,000219), Thiaminhydrochlorid (0,00217), Vitamin B12 (0,00068), D-Glucose (3,15), HEPES (3,5745), Hypoxanthin (0,0021), Linolsäure (0,000042), Phenolrot-Na (0,00863), Putrecindihydrochlorid (0,000081), Natriumpyruvat (0,055), DL-Thioctsäure (0,000105), Thymidin (0,000365).
Für den Versuch einer Infektion mit rekombinantem Adenvirus wurden die Zellen in dem obigen Medium, das mit Insulin (172 nmol/l), Dexamethason (100 nmol/l), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (20 μg/l) und Nicotinamid (10 mmol/l = 1,2 g/l) ergänzt worden war, kultiviert. Die pelletierten Zellen wurden in dem Kulturmedium suspendiert und 6 × 10⁶ Zellen wurden auf 3–5 cm großen Petrischalen, die mit Collagen Typ I beschichtet worden waren, ausplattiert und in 5% CO₂, 95% Luft bei 37°C inkubiert.
[Infektion mit rekombinanten Adenviren]
Unter Verwenden eines Adenvirus-Expressionsvektor-Kits (Produktkennzeichnung 6150, TAKARA) gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde ein rekombinanter Adenvirus aus murinem PDX-1 (AdCMVPDX-1) und ein rekombinanter Adenvirus aus humanem NeuroD (AdCMVNeuroD) konstruiert, die unter dem unmittelbar frühen Enhancer/Promotor des Cytomegalievirus (des Klonierungsvektors pCl-neo [Genbank-Zugangsnr. U47120: Promega Katalog-Nr. E1841), der in 5 gezeigt ist] entsprechend die DNA des Kodierungsbereichs von murinem PDX-1 und humanem NeuroD aufwiesen.
Das PDX-1 wurde mittels PCR unter Verwenden von CDNAs einer kultivierten, pankreatischen β-Zelllinie (MIN6) als Template und unter Bezugnahme auf die Nukleotidsequenz, der eine Genbank-Zugangsnnr. NM_008814 zugewiesen wurde, kloniert. Die verwendeten Primer waren die folgenden:
Mit dieser PCR wurde eine für PDX-1 kodierende DNA (SEQ ID NO: 25) (Kodierungsbereich: Nukleotide 59-914) erhalten, die dann in den Adenovirus eingeschleust wurde.
Eine DNA (SEQ ID NO: 27, Kodierungsbereich: Nukleotide 13-1083), die den gesamten Kodierungsbereich des humanen NeuroD-Gens enthält, der mit der Genbank-Zugangsnr. AF045152 (SEQ ID NO: 26) (Kodierungsbereich: Nukleotide 103-1173) offenbart wurde, wurde erhalten und in den Adenvirus eingeschleust.
Für die Konstruktion rekombinanter Adenoviren wurde der Cosmidvektor pAxcw verwendet, der in das Adenvirus-Expressionsvektor-Kit (TAKARA) eingeschlossen wurde. Die Struktur dieses Cosmidvektors ist in 6 gezeigt. Dieser Vektor besaß eine SwaI-Schnittstelle für das Einschleusen exogener Gene.
An der SwaI-Klonierungsstelle des Vektors pAxcw wurden auf herkömmliche Weise der unmittelbar frühe Enhancer/Promotor des Cytomegalievirus und die oben erhaltenen PDX-1 und NeuroD insertiert. In Kürze: Es wurde eine Expressionseinheit (mit stumpfen Enden) hergestellt, die den unmittelbar frühen Enhancer/Promotor des Cytomegalievirus und den Kodierungsbereich des PDX-1 oder des NeuroD enthält, hergestellt und dann zu dem vollständig mit SwaI verdauten Cosmidvektor pAxcw gegeben, mit Ethanol gefällt und einer Ligationsreaktion unterzogen. Der auf diese Weise erhaltene, rekombinante Cosmidvektor wurde λ-gepackt und dann wurden damit E. coli-Zellen infiziert. Die Cosmidklone wurden mit ClaI verdaut, um das Insert für eine Überprüfung auszuschneiden und die Klone mit der insertierten Expressionseinheit wurden ausgewählt. Jeder ausgewählte Cosmidklon, bei die zirkuläre Struktur intakt war, wurde λ-gepackt und dann wurden damit E. coli-Zellen infiziert. Durch Kultivieren der E. coli-Zellen wurde der Cosmidklon in großem Maßstab hergestellt. Die Cosmid-DNA wurde mit dem mit Restriktionsenzymen behandelten DNA-TPC (terminaler Proteinkomplex der genomischen DNA des Adenovirus), der in dem Kit enthalten war, vermischt und zum Transfizieren kultivierter 293-Zellen mit Hilfe des Calciumphosphat-Verfahrens verwendet. Die Zellen wurden kultiviert und rekombinante Adenoviren gesammelt. Mit jedem der gesammelten rekombinanten Adenvirus-Proben wurden 293-Zellen und HeLa-Zelen infiziert und es wurden nur solche Zellen ausgewählt, die 293-Zellen töteten, jedoch keine Denaturierung in HeLa-Zellen hervorriefen. Nach Bestätigen der Struktur dieser rekombinanten Viren ermöglichte eine Kultur von 293-Zellen, die mit jedem dieser Viren infiziert worden war, die angestrebten rekombinanten Adenoviren AdCMVPDX-1 und AdCMVNeuroD zu sammeln.
Als Kontrolle wurde ein rekombinanter Adenovirus auf die gleiche Weise unter Verwenden des in de Kit enthaltenen Kontrollplasmids pAxCAiLacZ hergestellt.
Nach viertägiger Kultivierung wurden isolierte, murine, fötale Hepatozyten mit jedem der rekombinanten Adenoviren AdCMVPDX-1 und AdCMVNeuroD oder mit dem Kontrollvirus mit Infektionsmultiplizität (multiplicity of infections, moi) innerhalb eines Bereichs von 1 bis 200 infiziert und für eine Bestimmung der Expression verschiedener Gene zwei Tage lang kultiviert. Die Expression von PDX-1 und NeuroD wurde mittels Immunoblot-Analyse unter Verwenden von Antikörpern, die entsprechend für humanes PDX-1 und murines NeuroD spezifisch sind (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) bestätigt.
Unter Verwenden eines Kits, RNeasy mini (Qiagen, Tokio) wurden die gesamten RNAs aus murinen, fötalen Hepatozyten isoliert. Die RNA-Proben wurden mit DNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA) behandelt. Die cDNAs wurden unter Verwenden von 3 μg der gesamten RNAs und 25 pmol pd(N)6-Primer (Invitrogen) in einer 20 μl-Lösung hergestellt. Unter Bezugnahme auf die bei der GenBank hinterlegten Sequenzen wurden für jede der zu amplifizierenden DNAs PCR-Primer konstruiert, so dass die amplifizierten Bereiche ein Intron in dem Gen, außer dem Kir6.2-Gen, das kein Intron in dem für das Protein kodierenden Bereich aufwies (Tabelle 1), umspannten.
Tabelle 1 Primersequenzen und PCR-Bedingungen

Temp., Annealing-Temperatur; GK, Glucokinase; HK 1, Hexokinase 1
*1–22, Sequenznummern 1 bis 22

Alfa-Tubulin-Primer wurden dazu verwendet, zu zeigen, dass jede Probe eine äquivalente Menge an mRNAs enthält. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung bei 94°C für 15 Sekunden, Annealing für 30 Sekunden, Extension bei 72°C für 45 Sekunden. Die Annealing-Temperatur und die Anzahl an Zyklen waren, wie in Tabelle 1 gezeigt ist [Immunhistochemie].
Fötale Hepatozyten wurden mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphatpuffer fixiert und mit Hilfe des direkten Immunperoxidaseverfahrens unter Verwenden eines Meerschweinchen-Anti-Schwein-Insulin-Antikörpers (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) und eines mit Peroxidase markierten Schwein-Anti-Meerschweinchen-IgG (DAKO Japan, Tokio) gefärbt.
Sowohl das Insulin-1- als auch das Insulin-2-Gen wurden unter den Kulturbedingungen deutlich exprimiert, wie mittels RT-PCR-Analyse bestimmt wurde. Es wurde angenommen, dass einige der Ergänzungen (Nicotinamid, EGF, Insulin oder Dexamethason) zu dem Kulturmedium für die Expression der Insulingene in den Hepatozyten responsibel waren. Jede dieser Ergänzungen wurde separat zu dem DMEM/F12, das 10% FBS enthielt, gegeben und die Auswirkungen auf die Insulinexpression wurden in den so gebildeten, verschiedenen Medien bewertet. Wenn die murinen, fötalen Hepatozyten in einem Medium kultiviert wurden, das nicht mit Nicotinamid ergänzt worden war (und nur 0,0165 mmol/l Nicotinamid enthielt), exprimierten sie weder das Insulin-1- noch das Insulin-2-Gen oder exprimierten sie nur sehr schwach (1). Wenn sie dagegen in einem Medium kultiviert wurden, das mit 10 mmol/l Nicotinamid ergänzt worden war, wurde die Expression von sowohl dem Insulin-1- als auch dem Insulin-2-Gen in den fötalen Hepatozyten erheblich induziert (1). Als Negativkontrolle wurden murine, embryonische Fibroblasten (MEF) aus fötalen Gliedmaßen (ED13.5) hergestellt und unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Sowohl das Insulin-1- als auch das Insulin-2-Gen wurden in den MEF, die in dem mit Nicotinamid ergänzten Medium kultiviert worden waren, exprimiert (1). Die anderen Ergänzungen (d. g. EGF, Insulin und Dexamethason) hatten jeweils keine Auswirkung oder nur eine geringe Auswirkung auf die Induktion der Expression des Insulin-1- oder des Insulin-2-Gens. Unter Verwenden eines Anti-Insulin-Antikörpers wurde Immunhistochemie dazu verwendet, zu bestätigen, dass eine hohe Konzentration von Nicotinamid für die Differenzierung von murinen, fötalen Hepatozyten in Insulin-produzierende Zellen erforderlich war. Das Kultivieren in einem Medium, das mit Nicotinamid ergänzt worden war, führte zur Erzeugung von Insulin-positiven Zellen (2; nicht mit Nicotinamid ergänzt, 3; mit Nicotinamid ergänzt). Diese Ergebnisse zeigen, dass murine, fötale Hepatozyten Progenitorzellen enthalten, die in der Lage sind, in Insulin-produzierende Zellen zu differenzieren und dass hohe Konzentrationen von Nicotinamid für das Induzieren einer Differenzierung wesentlich sind.
[Induktion der Expression von Genen, die mit dem Phänotyp der β-Zellen assoziiert sind, mittels PDX-1]
Unter Verwenden eines durch Adenviren vermittelten Gentransfersystems wurde PDX-1 in murine, fötale Hepatozyten eingeschleust und die Expression verschiedener Gene wurde 48 Stunden nach der Infektion untersucht (4). Wenn die fötalen Hepatozyten in dem Medium des Kultursystems für hepatische Progenitorzellen kultiviert wurden, wurden sowohl das Insulin-1- als auch das Insulin-2-Gen in mock-(LacZ-)infizierte, fötale Hepatozyten (d. h. fötalen Hepatozyten als Kontrolle) exprimiert. Jedoch erhöhte PDX-1 die Expressionsmengen der Insulingene nicht signifikant.
Die Glucose erfassende Vorrichtung, die hauptsächlich aus einer spezifischen Isoform des Glucose-Transporters, GLUT2 [Thorens B, Mol. Membr. Biol. 18: 265–273 (2001)] und der Typ IV-Hexokinase, Glucokinase (GK) [Matschinsky FMet al., Diabetes 47: 307–315 (1998)] besteht, ist für pankreatische β-Zellen und Hepatozyten üblich. GLUT2 und Typ I-Hexokinase (HK1) wurden in den fötalen Hepatozyten als Kontrolle exprimiert und eine Überexpression von PDX-1 hatte keine Auswirkung auf ihre Expression (4). Unter den verwendeten Kulturbedingungen wurde Glucokinase in den fötalen Hepatozyten deutlich exprimiert.
Da sowohl K_ATP-Kanäle als auch VDCCs entscheidende Moleküle für die Glucose-Responsibilität, die Reaktion auf elektrische Reize und die regulierte Exozytose sind, die jeweils den Phänotyp pankreatischer β-Zellen kennzeichnen [Seio S, Annu. Rev. Physiol. 61: 337–362 (1999), Ashcroft FM et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 54: 87–143 (1989)], bewerteten die vorliegenden Erfinder die Expression der Ionenkanal-Untereinheiten (4). Der K_ATP-Kanal der β-Zellen umfasst zwei verschiedene Untereinheiten: die Poren-bildende Kir6.2-Untereinheit der nach innen gleichrichtenden K⁺-Kanalfamilie und die regulatorische SUR1-Untereinheit, einen Rezeptor der Sulfonylharnstoffe, die weitgehend bei der Behandlung von Diabetes Typ 2 verwendet werden [Seino S, Annu. Rev. Physiol. 61: 337–362 (1999)]. Sowohl das Kir6.2- als auch das SUR1-Gen wurden in den fötalen Hepatozyten als Kontrolle exprimiert. Die Expression des Kir6.2-Gens wurde nicht durch PDX-1 beeinträchtigt, diejenige des SUR1-Gens wurde jedoch signifikant durch eine Überexpression von PDX-1 erhöht (4). Die Expression des Gens der α₁ 1.3-Untereinheit, die die Poren-bildende Untereinheit von VDCCs des L-Typs in pankreatischen β-Zellen ist, wurde in den fötalen Hepatozyten als Kontrolle nachgewiesen und dessen Expression wurde durch die Überexpression von PDX-1 erhöht (4). Diese Ergebnisse geben an, dass PDX-1 an der Expression der K_ATP-Kanäle und der VDCCs beteiligt sind.
[Induktion der Expression von Genen, die mit dem Phänotyp von β-Zellen assoziert sind, mittels NeuroD]
Die vorliegenden Erfinder schleusten NeuroD mit Hilfe des Adenovirus-Systems in murine, fötale Hepatozyten ein (4). Die Überexpression von NeuroD erhöhte die Expressionsmengen der Insulingene nicht signifikant. Die Expression des Kir6.2-Gens wurde von NeuroD nicht beeinträchtigt und diejenige des SUR1-Gens wurde durch die Überexpression von NeuroD signifikant erhöht (4). Die Expression des Gens der α₁ 1.3-Untereinheit wurde ebenso durch eine Überexpression von NeuroD erhöht (4). Diese Ergebnisse geben an, dass NeuroD an der Expression von sowohl dem K_ATP-Kanalals auch den VDCC-Genen beteiligt ist.
Im Hirn und neuroindokrinen Zellen und endokrinen Zellen werden sowohl PC2 als auch PC1/3 exprimiert [Steiner DF, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 31–39 (1998)]. Die Expression dieser Konvertasen gibt daher die Eigenschaften neuronaler, endokriner und neuroendokriner Zellen wieder. Die Expressionsmengen von sowohl PC2 als auch PC1/3 waren in den Kontroll-Hepatozyten trotzdem sehr gering und die Überexpression von NeuroD erhöhte die Expression des PC1/3-Gens drastisch (4).
Nicotinamid beugt nicht nur einem Schaden der β-Zellen infolge der Aktivierung von Poly(ADP-Ribose)-Synthetase/-Polymerase (PARP) vor [Yamamoto H et al., Nature 294: 284–286 (1981)], sondern induziert auch die endokrine Differenzierung in kultivierten, humanen, fötalen, pankreatischen Inselzellen und eine Erhöhung der Expression des Insulingens [Otonkoski T et al., J. Clin. Invest. 92: 1459–1466 (1993)]. Die in dem vorliegenden Beispiel gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass eine hohe Konzentration von Nicotinamid für die Induktion einer Differenzierung muriner, fötaler Hepatozyten in Insulin-produzierende Zellen entscheidend ist.
Die vorliegenden Erfinder versuchten, Zellen mit dem Phänotyp pankreatischer β-Zellen aus murinen, fötalen Hepatozyten, die übermäßig viele Progenitorzellen enthalten [Dabeva MD et al., Am. J. Pathol. 156: 2017–2031 (2000)]. Die vorliegenden Erfinder stellten fest, dass Insulin-produzierende Zellen in einem in vitro-Kultursystem aus primitiven, hepatischen Progenitorzellen [Suzuki A et al., Hepatology 32: 1230–1239 (2000)] mit einer hohen Konzentration von Nicotinamid als entscheidender Faktor hergestellt werden können. Daneben wurde auch festgestellt, dass mehrere Gene, die mit dem Phänotyp pankreatischer β-Zellen assoziiert sind, unter den verwendeten Bedingungen in fötalen Hepatozyten exprimiert wurden und dass ihre Expression durch die Überexpression von PDX-1 oder NeuroD mit Hilfe eines durch Adenviren vermittelten Gentransfersystems induziert wurde. Diese Erkenntnisse geben an, dass murine, fötale Hepatozyten Progenitorzellen enthalten, die in vitro in Zellen mit einem β-Zell-ähnlichen Phänotyp differenzieren können. Die hepatischen Progenitorzellen können daher eine Quelle für die Erzeugung von transplantierbaren, Insulin-produzierenden Zellen bereitstellen.
Der Transkriptionsfaktor der Homeodomäne PDX-1, der bei der Entwicklung des Pankreas benötigt wird, reguliert die Expression von Genen, die an der Glucose-Responsibilität beteiligt sind, sowie des Insulingens [Edlund H, Diabetes 47: 1817–1823 (1998), Watada H et al., Diabetes 45: 1478–1488 (1996)]. Obwohl in den mock-infizierten, fötalen Hepatozyten jeweils Insulin, GLUT2 und Glucokinase exprimiert wurden, erhöhte jedoch eine Überexpression von PDX-1 die Expression von Insulin, GLUT2 oder Glucokinase in der vorliegenden Studie unter den verwendeten Kulturbedingungen nicht wesentlich. Die obige Feststellung der Expression des GLUT2-Gens in fötalen Hepatozyten mit hohen Mengen bestätigt einen vorherigen Bericht [Postic C et al., Am. J. Physiol. 266: E548–559 (1994)]. Während Glucokinase vorwiegend in der adulten Leber exprimiert wird, wird Typ I-Hexokinase in der fötalen Leber exprimiert [Postic C et al., Am. J. Physiol. 266: E548–559 (1994)]. Obwohl wir zeigten, dass die Expression des Glucokinase-Gens in einem Kultursystem primitiver, hepatischer Progenitorzellen induziert wird, ist dessen Mechanismus unbekannt.
Der basische Helix-Loop-Helix (bHLH) Transkriptionsfaktor NeuroD ist bei der neuronalen Differenzierung sowie der Entwicklung des Pankreas wichtig [Edlund H, Diabetes 47: 1817–1823 (1998)]. Da pankreatische β-Zellen und Neuronen solche Merkmale wie Reaktion auf elektrische Reize und regulierte Exozytose gemeinsam haben, stellten die vorliegenden Erfinder die Hypothese auf, dass NeuroD die Expression von Genen, die an einer solchen Funktion beteiligt sind, gut induzieren könnte. Aktuell wurden die Expressionsmengen der SUR1-Untereinheit des K_ATP-Kanals und des α₁ 1.3-Gens der VDCC-Untereinheit, von denen beide in Neuronen und pankreatischen β-Zellen exprimiert werden [Miki T et al., Nat. Neurosci. 4: 507–512 (2001), Seino S et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 584–588 (1992)], in fötalen Hepatozyten durch die Überexpression von NeuroD erhöht. PC2 und PC1/3 sind die hauptsächlichen Konvertasen bei der regulierten Sekretion in neuroendokrinen Zellen [Steiner DF, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 31–39 (1998)]. Wie von den vorliegenden Erfindern festgestellt wurde, induzierte NeuroD die Expression von PC1/3, das das Proinsulin zum Erzielen von Insulin spalten kann, erheblich, was anzeigt, dass die Expression von NeuroD für die Verarbeitung von Proinsulin erforderlich ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen aus nicht-Insulin-produzierenden Zellen, wobei die nicht-Insulin-produzierenden Zellen nicht-humane, fötale Säugetierhepatozyten sind und wobei das Verfahren das Kultivieren der nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten erreicht wird, umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Insulin-produzierenden Zellen aus nicht-Insulin-produzierenden Zellen, die aus nicht-fötaler Säugetierleber entnommen wurden, wobei die nicht-Insulin-produzierenden Zellen hepatische Säugetier-Progenitorzellen sind und wobei das Verfahren das Kultivieren der hepatischen Säugetier-Progenitorzellen mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den hepatischen Säugetier-Progenitorzellen, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die hepatischen Säugetier-Progenitorzellen erreicht wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die hepatischen Säugetier-Progenitorzellen nicht-humane, hepatische Säugetier-Progenitorzellen sind.
Verfahren zum Bewirken einer Transdifferenzierung nicht-humaner, fötaler Säugetierhepatozyten in Insulin-produzierenden Zellen, wobei das Verfahren das Kultivieren der nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten mit 1–50 mmol/l Nicotoinamid und das Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten erreicht wird, umfasst.
Verfahren zum Bewirken einer Transdifferenzierung nicht-fötaler, hepatischer Säugetier-Progenitorzellen in Insulin-produzierende Zellen, wobei das Verfahren das Kultivieren der nicht-fötalen, hepatischen Säugetier-Progenitorzellen mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den nicht-fötalen, hepatischen Säugetier-Progenitorzellen, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die nicht-fötalen, hepatischen Säugetier-Progenitorzellen erreicht wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die hepatischen Säugetier-Progenitorzellen nicht-humane, hepatische Säugetier-Progenitorzellen sind.
Nicht-humane, fötale, von Hepatozyten stammende, NeuroD-Gen exprimierende, Insulin produzierende Säugetierzellen, hergestellt mit einem Verfahren, das das Kultivieren nicht-humaner, fötaler Säugetierhepatozyten mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die nicht-humanen, fötalen Säugetierhepatozyten erreicht wird, umfasst.
Nicht-fötale, hepatische, von Progenitorzellen stammende, NeuroD-Gen exprimierende, Insulin produzierende Säugetierzellen, hergestellt mit einem Verfahren, das das Kultivieren nicht-fötaler, hepatischer Säugetier-Progenitorzellen mit 1–50 mmol/l Nicotinamid und das gleichzeitige Veranlassen der Expression des NeuroD-Gens in den hepatischen Säugetier-Progenitorzellen, wobei die Expression des Gens durch Einschleusen des Gens in die hepatischen Säugetier-Progenitorzellen erreicht, wird, umfasst.
Zellen nach Anspruch 8, wobei die nicht-fötalen, hepatischen Säugetier-Progenitorzellen nicht-human sind.