JP5266297B2 - 安定な神経幹細胞系 - Google Patents
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Description
本出願は、安定な神経幹細胞系とニューロン前駆細胞系を樹立するための系統的かつ効率的方法を開示する。得られる細胞系は、正常な核型と正常なニューロン表現型を維持しながら、ヒトおよび他の哺乳動物ニューロンの強靭かつ単純で、再現性のある培養物を商業的に有用な量で提供する。
発生中の胎児脳は、発達して成体脳の細胞になるすべての細胞と、これらを組織化してニューロンの最終網状構造を作るのに必要なすべてのプログラムを含んでいる。発生の初期段階では、神経系は胚芽細胞で占められ、発生の以後の段階でここから他のすべての細胞(主に、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞)が誘導される。正常な脳の発達の前駆細胞であるそのような胚芽細胞は、これらの胚芽細胞が単離され、増殖され、成熟細胞型に分化するならば、遺伝子ベースの治療および細胞ベースの治療に理想的であろう。
ニューロンのみに対する単分化能前駆体(「約束された神経前駆細胞」または「神経芽細胞」)、
乏突起膠細胞のみに対する単分化能前駆体(「乏突起神経膠芽細胞」)、
星状細胞のみに対する単分化能前駆体(「星状芽細胞」)、
ニューロンまたは乏突起膠細胞、ニューロンまたは星状細胞、および乏突起膠細胞または星状細胞のいずれかになることができる二分化能前駆体、ならびに
3つの型の細胞のいずれかに分化する能力を維持する多分化能前駆体。
SV40プロモーター制御下にネオマイシン耐性遺伝子を含有するレトロウイルスベクターをEcoRIで線状化し、ヒトc-Myc cDNAとヒトエストロゲン受容体cDNAとの融合遺伝子をコードするDNAのEcoRI断片に連結した(Eilerら、1989, Nature 340: 60-68)。融合遺伝子を、MMLV長末端反復配列(LTR)の制御下に置いた。最終的なレトロウイルスベクターpMycERの全体的配列を、図1に示す。
MycERレトロウイルスを安定に産生する細胞系を樹立するために、両栄養性パッケージング細胞系を、pMycERプラスミドでトランスフェクションした。安定なクローンをG418(1mg/ml、Life Technology Inc.,メリーランド州)で4週間かけて選択した。常法に従ってHela細胞に対する高力価産生について、20個のクローンをスクリーニングした。ラット線条体幹細胞の感染による測定で、105pfu/mlのレトロウイルス力価を有する細胞系MycER.10を以後の実験のために選択した。
ラットとヒトのCNS幹細胞を、既に報告された方法(特許文献1)に従って調製した。継代1の細胞を、100mmのプレートにつき0.5×106細胞でプレートし、無血清N2培地+10ng/ml bFGF中でさらに3日間増殖させた。MycER.10細胞を、DMEM/10%胎児牛血清中で50〜75%コンフルエンスになるまで増殖させ、次にDMEMで3回洗浄し、レトロウイルス採取培地(IFM)中で4〜16時間インキュベートした。IFMは、DMEM中の標準的N2成分(25mg/Lヒト組換えインスリン、100mg/Lヒトアポトランスフェリン、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム)+10ng/ml bFGFと1μg/mlのヒト血漿フィブロネクチン(hFN)から成っていた。IFMを含有するレトロウイルスを、1400rpmと3000rpmで2回遠心分離して清澄化した。上清を、最終濃度がそれぞれ10ng/mlと1μg/mlの新鮮なbFGFとhFNと、1:1の比で新鮮なN2に混合させ、50〜75%コンフルエントなCNS幹細胞培養物にアプライした。感染期間は典型的には6時間であった。ヒトCNS幹細胞は、2〜3日の期間で1〜3回感染させて、その遅い分裂速度を補った。次に細胞を、Ca2+とMg2+を含まないハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で3回洗浄し、継代し、さらにN2+10ng/ml bFGFで増殖した。
MycERレトロウイルスの安定に取り込んだCNS幹細胞を、感染後1〜2日に継代し、0.5×106細胞/100mmプレートで再度プレートし、感染の2日後から0.1〜0.2mg/mlのG418(pH7.4)で選択した。完全な最適増殖培地(IGM)は、DMEM/F12(1:1)、25mg/Lヒト組換えインスリン、100mg/Lヒトアポトランスフェリン、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム、10ng/ml bFGF、0.2μM β−エストラジオール、0.1mg/ml G418、および10ng/ml EGFまたは1%胎児牛血清から成っていた。新鮮なbFGF(10ng/ml、最終濃度)を毎日加え、培地を2日毎に交換した。細胞を、HBSSで3回洗浄し、トリプシン(1×)処理して、約50〜75%コンフルエンスで継代した。トリプシン活性は、大豆トリプシンインヒビター(1mg/ml最終濃度)を加えて停止させた。
14日間のG418処理の最後に、細胞を継代し、100mmプレート当たり約200〜1000細胞を再度プレートした。プレートした24時間以内に、充分単離した1種類の細胞を、培養プレートの底に3mmの丸でマークした。時に、完全な培養培地を、細胞の生存理率を高めるために高細胞密度の同じ細胞により調整した培地の等量と混合した。マークしたクローンを、クローニングリングの使用とトリプシン処理により採取した。個々のクローンを、大量培養して増殖し、凍結保存した。
100,000細胞/cm2またはより高細胞密度で細胞をプレートし、増殖培地をbFGF、血清、およびβ−エストラジオールを含まないN2で置換することにより、MycERを安定に発現するCNS幹細胞を分化させた。典型的には、免疫組織学的分析の6〜30日前に、細胞を分化させた。
1.CNS幹細胞の分裂能力を強化する追加因子の探索
唯一の分裂促進因子としてbFGFを含むN2培地中のヒトCNS幹細胞の倍加時間は約60時間であり、これは、同一培養条件下のラットCNS幹細胞の24時間よりも著しく遅い。これは、特定の細胞の自律性における種差、例えば、DNA複製速度または細胞周期の他の分裂期(G1またはG2)の差によるものかも知れない。我々は、ヒトCNS幹細胞の分裂速度を加速する他の因子を調査した。
EGF、TGFα、1% FBS、または10% FBS+bFGFは、ヒトCNS幹細胞の分裂速度を増大させたが、このような条件下でさえ、CNS幹細胞は、コンフルエントに近い細胞密度では自然分化を受けやすく、また、多回継代培養ではグリア前駆細胞状態に陥りがちである。CNS幹細胞の分裂能力の強化およびニューロン分化能力に対する安定性を向上させるために、我々は、MMLV長末端反復配列の下にヒトc-mycとヒトエストロゲン受容体遺伝子との融合タンパク質を発現するレトロウイルスベクターを構築した(図1)。
MycER改変ヒトCNS幹細胞系の分裂および分化能力の程度を確かめるために、細胞を連続80日間増殖させ、感染から12回の継代培養により増殖させた。この間その時点の細胞数の計算上の増大分を定量し、各継代時の細胞収量を測定して分裂速度の経時的安定性を測定した(図2)。全体的に、細胞は約54回の倍加を重ねて細胞数が1015倍増大した。細胞の倍加時間は、1分裂あたり約40時間と顕著に一定であり、親の初代ヒトCNS幹細胞の時間と同じである(図2)。
MycER強化CNS幹細胞を、外来因子の添加なしに、分裂促進因子とβ−エストラジオールを培地から除去することにより分化させた。ニューロンおよびグリア細胞の形態の分岐は、2日以内に起こり始めた。第3日目には、ニューロンの形態は明らかに識別可能であった。ニューロンは、そこから3〜5週間かけて完全に機能性のニューロンへ成熟し続けた。
神経幹細胞の単離に使用される無血清培養条件は、多数回の細胞分裂を通じて、領域同一性およびその関連神経伝達物質表現型の安定な遺伝を可能とした。このことは、ニューロンとグリア細胞に分化するその能力において同じではあっても、培養中の幹細胞が極めて多様であることを意味する。すなわち、培養開始時の各幹細胞を、その未変性状態で不死化することができ、かつこの方法が、単一の培養皿において何千もの幹細胞をサンプリングするのに好適であれば、多様なニューロン表現型は、細胞系の形で永久に「捕捉」することができるであろう。
c-mycによる遺伝子改変は、培養期間のいつでも行うことができる。c-myc自体の発現は分裂促進性ではなく非形質転換性であるため、特定の神経前駆細胞集団の増殖を促進する培養条件が必要である。aFGF(酸性繊維芽細胞増殖因子)、bFGF、EFGおよびTGFαのような精製した増殖因子は、種々の異なる神経細胞型を増殖させることができる。上記の説明の多くは、1つの優勢な細胞集団としての多分化能CNS幹細胞に関するものであったが、クローン分析中にいくつかの異なる細胞型が観察された。
Claims (4)
- in vitro方法で産生される、分化の前に少なくとも30回の細胞倍加を介して増殖可能な哺乳動物の神経前駆細胞系であって、前記方法は、
a)無血清培地中で神経前駆細胞の培養物を調製する工程;
b)第1の分裂促進因子の存在下で神経前駆細胞を培養する工程、
ここで、第1の分裂促進因子はaFGF、bFGF、EGF、TGFαおよびこれらの組合せよりなる群から選択されること;
c)該細胞にc-myc構築物を導入する工程、
ここで、該c-myc構築物は、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイド受容体、およびエクジソン受容体よりなる群から選択される核受容体のリガンド結合ドメインのDNAと融合したc-myc cDNAを含むこと;および
d)第1の分裂促進因子と血清とを含有する培地中で、分化の前に少なくとも30回の細胞倍加を介して該細胞を増殖させる工程、
ここで、第1の分裂促進因子と血清とを含有する前記培地が、安定な細胞系を維持するのに十分な量のc-myc活性化化学物質をさらに含み、かつc-myc活性化化学物質が核受容体のリガンド結合ドメインに結合できること;
を含んでなる上記神経前駆細胞系。 - 神経前駆細胞は多能性の胚性幹細胞のin vitro培養物に由来するものである、請求項1に記載の神経前駆細胞系。
- 前記c-myc活性化化学物質は、β−エストラジオール、RU38486、デキサメタゾン、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびエクジソンよりなる群から選択される、請求項1に記載の神経前駆細胞系。
- 前記細胞系はクローン性細胞系である、請求項1に記載の神経前駆細胞系。
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