KR20160116024A - 인간 배아 줄기 세포의 현탁 배양 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 개시 내용은 인간 배아 줄기 세포를 배양하기 위한 개선된 시스템을 제공한다. 상기 세포는, 배양 환경의 생산 능력을 최대화하도록 현탁 배양된다. 본 발명의 신규한 배양 시스템은 더 비용 효율적인 방식으로 hES 세포을 대량 증식시킬 수 있으며, 이는 인간 치료에 사용하기 위한 중요한 제품의 상업적 생산을 용이하게 한다.
Description
다른 특허 출원
본 출원은 2005년 6월 22일 출원된 USSN 60/693,266호를 기초로 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 인간 배아 줄기 세포의 현탁 배양에 관한 것이다.
재생 의학은, 여러 가지 유형의 전구 세포의 분리, 배양 및 용도에 관련한 최근의 진보로 이득을 얻고 있다. 본 발명의 개시 내용은 인간 만능 줄기 세포 및 이의 유도체의 상업적 개발에 추가의 개선점을 제공한다.
배아 줄기 세포는 2 가지 아주 특별한 특성을 갖는다. 첫째로, 다른 보통의 포유류 세포 유형과는 달리, 이들은 배양물에서 거의 무한히 증식되면서, 사실상 무제한의 공급을 제공할 수 있다. 둘째로, 이들은, 조직 치료 또는 약제의 선별에 사용하기 위한 대용 세포 및 조직의 공급원으로서 관심있는 다양한 조직 유형을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
Thomson 등(미국 특허 5,843,780호; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995)은 최초로, 영장류로부터 만능 줄기 세포를 성공적으로 분리하고 증식시켰다. 이들은 이후 인간 배반포로부터 인간 배아 줄기(human Embryonic Stem; hES) 세포주를 유도하였다(Science 282:114, 1998). Gearhart 및 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 생식(human Embryonic Germ; hEG) 세포주를 유도하였다(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; 및 미국 특허 6,090,622호). hES 및 hEG 세포 모두는 만능 줄기 세포의 오랫동안 원했던 특성을 갖는데, 즉, 이들은 분화하지 않고 대규모로 배양될 수 있고, 보통의 핵형을 가지며, 다수의 중요한 세포 유형을 생성할 수 있다.
치료에 만능 줄기 세포를 사용하는 것에 대한 중요한 과제는, 분화를 방지하기 위해 이들을 영양 공급자(feeder) 세포의 층에 종래 방식으로 배양하는 것이다(U.S. 5,843,780호; U.S. 6,090,622호). Thomson 등(Science 282:114, 1998)에 따르면, 영양 공급자 없이 배양된 hPS 세포는, 곧 죽거나 수임 세포의 이종 집단으로 분화한다. 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor; LIF)는 마우스 ES 세포의 분화를 억제하나, 인간 ES 세포의 분화를 방지하는 데 있어서 영양 공급자 세포의 역할을 대신하지는 않는다.
미국 특허 6,800,480호(Geron Corp.)는 발명의 명칭이 "영장류에서 유도한 원시 줄기 세포의 성장을 위한 방법 및 물질(Methods and materials for the growth of primate-derived primordial Stem cells)"이다. 국제 특허 공개 공보 WO 01/51616호(Geron Corp.)는 발명의 명칭이 "인간 만능 줄기 세포의 성장 및 분화를 위한 기법(Techniques for growth and differentiation of human pluripotent stem cells)"이다. Xu 등의 논문(Nature Biotechnology 19:971, 2001)은 명칭이 "미분화된 인간 배아 줄기 세포의, 영양 공급자 무함유 성장(Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells)"이다. Lebkowski 등의 논문(Cancer J. 7 Suppl. 2:S83, 2001)은 명칭이 "인간 배아 줄기 세포: 재생 의학 적용을 위한 배양, 분화, 및 유전적 변형(Human embryonic stem cells: culture, differentiation, and genetic modification for regenerative medicine applicaions)"이다. 국제 특허 공개 공보 WO 03/020920호는 발명의 명칭이 "인간 배아 줄기 세포의 신속한 증식을 위한 배양 시스템(Culture System for Rapid Expansion of Human Embryonic Stem Cells)"이다. Li 등의 논문(Biotechnology and Bioengineering, Published Online: 21 Jun 2005)은 명칭이 "인간 배아 줄기 세포의 증식(Expansion of human embryonic stem cells)"이다. 이 공보들은 미분화된 상태로 배아 줄기 세포를 증식시키는 예시적인 배양 시약 및 기법, 그리고 인간 치료를 위한 세포의 제조에서의 이의 용도를 기재한다.
하기에 제공되는 정보는, 미분화된 만능 줄기 세포의 성장 및 조작을 용이하게 할 hES 세포 배양의 과학을 더 발전시키고, 배아 세포 치료의 충분한 상업적 잠재력을 실현하는 데 도움이 된다.
본 개시 내용은 영장류 만능 줄기(hES) 세포를 배양하고 증식시키기 위한 개선된 시스템을 제공한다. 본 발명의 현탁 배양 시스템은, 치료 및 신약 개발에 사용하기 위해, 사용자가 신속하고 부피 효율이 좋은 방식으로 고품질의 배아 줄기 세포를 제조할 수 있게 한다.
본 발명의 한 양상은 인간 배아 줄기(hES) 세포의 현탁 배양물이며, 여기서 hES 세포는 실질적으로 미분화 상태로 있다. 상기 배양물은, 고농도의 섬유아세포 성장 인자, 다른 배지 첨가제, 예컨대 TGFβ, 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor; SCF), 또는 Flt3 리간드(Flt3L), 1 종 이상의 가용성 또는 현탁형 세포외 매트릭스 성분, 예컨대 라미닌 및/또는 피브로넥틴, 또는 임의로 다공성의 성질을 갖거나 세포외 매트릭스로 코팅된, 여러 가지 종류의 고체 미립자 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, hES 세포를 영양 배지에 현탁하는 단계, 상기 세포를 상기에 설명한 바와 같은 시스템에서 배양하는 동안 현탁 상태로 유지하는 단계, 배지를 주기적으로 교환하는 단계, 임의로, 세포 밀도를 감소시키기 위해 배양물을 때때로 분할하는 단계, 및 마지막으로 배양물로부터 세포를 회수하는 단계를 포함하는, hES 세포의 배양 방법이다.
본 발명의 다른 양상은, 전술한 또는 후술하는 성분들 중 하나 이상을 포함하는, hES 세포를 현탁 배양하기 위한 시스템 또는 키트이다.
본 발명의 상기 양상들 및 다른 양상들은 후술하는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 성장 인자를 보충한 비조절 배지 중의 고체 표면 상에서 6 회 계대 배양한 후의 hES 세포의 콜로니를 도시한다. (A) mEF 조절 ES 배지(대조군) + bFGF(8 ng/mL); (B) X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL); (C) X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) + 줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자)(15 ng/mL); (D) X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) + Flt3 리간드(75 ng/mL); (E) QBSFTM-60 + bFGF(40 ng/mL). 모든 3 가지 기본 배지(ES 배지, X-VIVOTM 10, 및 QBSFTM-60)는 영양 공급자 무함유 배양물에서 hES 세포를 증식시키기 위해 이용될 수 있다. 이 도면에서, (C)에 도시된, 결합하여 성장하는 세포들은 계대 배양마다 8.2 배 증식되었으며, 조절 배지의 것들은 2.2 배 증식되었다.
도 2는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 실시간 RT-PCR로 측정한, hTERT 및 Oct3/4의 유전자 발현 프로필을 도시한다.
도 3은 비조절 배지에서 배양된 세포가 그의 다능성을 보유하고 있음을 입증한다. hES 세포는 mEF 조절 배지, 또는 bFGF 및 SCF를 함유하는 비조절 X-VIVOTM 10 배지에서 7 회 계대 배양하였다. 이어서 상기 세포를 배상체로 분화시키고, 평판에 플레이팅하여, 면역 세포 화학법으로 각각의 3 가지 배엽을 나타내는 표현형 마커에 대해 분석하였다. 상기 세포들의 α-태아단백질(내배엽에 해당함), 근육 액틴(중배엽에 해당함), 및 β-튜불린 III(외배엽에 해당함)을 염색하였다.
도 4는 스피너 플라스크(spinner flask)에서 현탁 배양으로 배양한 hES 세포(실시예 3)의 세포수를 도시한다. 배양물이 확립된 후, 세포는 동일한 밀도로 계속 증식한다(윗 그림). 표준 표면 배양으로 다시 계대 배양되었을 때, 이들은 미분화된 표현형의 전형적인 형태, 즉, 전형적인 hES 세포 형태를 갖는 세포들의 별개의 콜로니로 복귀하였다(아래 그림).
도 5는 현탁 배양한 세포(도 4)를 배상체로 분화시키고, 평판에 플레이팅한 다음, 면역 세포 화학법으로 특정 세포 유형에 대해 분석한 실험으로부터 얻은 결과이다(윗 열). 표준 표면 배양으로 내내 유지된 세포 역시 도시하였다(아랫 열). 현탁 배양된 세포는 완전한 다능성을 유지하였으며, 이는 미분화된 hES 세포의 중요한 특성을 유지하는 데 있어서의 현탁 배양 시스템의 유효성을 입증한다.
도 6은 스피너 플라스크의 다른 현탁 배양물 중의 세포수를 도시한다.
도 7은 쉐이커(shaker) 장치 상에서 현탁 배양으로 유지된 상이한 hES 세포주로부터의 세포를 도시한다. 4 주 후, 세포는 고체 표면에 다시 플레이팅되었고, 도 7에 도시된 바와 같이 전형적인 미분화 hES 세포 형태를 보였다. 배양은 이 방식으로 3 개월 이상 동안 지속되었으며, 세포가 현탁 상태로 상당히 증식하였음이 확인된다.
도 2는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 실시간 RT-PCR로 측정한, hTERT 및 Oct3/4의 유전자 발현 프로필을 도시한다.
도 3은 비조절 배지에서 배양된 세포가 그의 다능성을 보유하고 있음을 입증한다. hES 세포는 mEF 조절 배지, 또는 bFGF 및 SCF를 함유하는 비조절 X-VIVOTM 10 배지에서 7 회 계대 배양하였다. 이어서 상기 세포를 배상체로 분화시키고, 평판에 플레이팅하여, 면역 세포 화학법으로 각각의 3 가지 배엽을 나타내는 표현형 마커에 대해 분석하였다. 상기 세포들의 α-태아단백질(내배엽에 해당함), 근육 액틴(중배엽에 해당함), 및 β-튜불린 III(외배엽에 해당함)을 염색하였다.
도 4는 스피너 플라스크(spinner flask)에서 현탁 배양으로 배양한 hES 세포(실시예 3)의 세포수를 도시한다. 배양물이 확립된 후, 세포는 동일한 밀도로 계속 증식한다(윗 그림). 표준 표면 배양으로 다시 계대 배양되었을 때, 이들은 미분화된 표현형의 전형적인 형태, 즉, 전형적인 hES 세포 형태를 갖는 세포들의 별개의 콜로니로 복귀하였다(아래 그림).
도 5는 현탁 배양한 세포(도 4)를 배상체로 분화시키고, 평판에 플레이팅한 다음, 면역 세포 화학법으로 특정 세포 유형에 대해 분석한 실험으로부터 얻은 결과이다(윗 열). 표준 표면 배양으로 내내 유지된 세포 역시 도시하였다(아랫 열). 현탁 배양된 세포는 완전한 다능성을 유지하였으며, 이는 미분화된 hES 세포의 중요한 특성을 유지하는 데 있어서의 현탁 배양 시스템의 유효성을 입증한다.
도 6은 스피너 플라스크의 다른 현탁 배양물 중의 세포수를 도시한다.
도 7은 쉐이커(shaker) 장치 상에서 현탁 배양으로 유지된 상이한 hES 세포주로부터의 세포를 도시한다. 4 주 후, 세포는 고체 표면에 다시 플레이팅되었고, 도 7에 도시된 바와 같이 전형적인 미분화 hES 세포 형태를 보였다. 배양은 이 방식으로 3 개월 이상 동안 지속되었으며, 세포가 현탁 상태로 상당히 증식하였음이 확인된다.
영장류 만능 줄기(hES) 세포를 배양하는 종래의 기법은 고체 표면, 즉, 섬유아세포 영양 공급자 세포(미국 특허 6,200,806호) 또는 세포외 매트릭스(미국 특허 6,800,480호) 상에서 배양하는 것을 수반하였다. 영양 공급자를 이용하지 않는 기법은, 신속한 증식이 가능하도록 최적화하여(WO 03/020920호) 상업적 목적의 hES 세포 제조 비용을 상당히 감소시킬 수 있다.
하기에 개시된 정보는, hES 세포 배양 기술을 더 진보시키는 신규한 시스템을 제공한다. 구체적으로, 배양물의 생산 능력은 배양 표면의 2차원 크기에 의해 더 이상 한정되지 않으며, 전체 배양 용기의 3차원을 더 충분히 사용할 수 있게 된다. hES 세포를 3 개월 이상 동안 현탁 배양할 수 있는 배양 조건이 확인되었다(실시예 4). 현탁 배양된 hES 세포는 미분화된 세포의 표현형 특성을 유지하며, 3 가지 배엽 중 어느 것을 나타내는 조직 유형으로 분화할 수 있는 전능성을 유지한다(실시예 3).
3차원 공간에서 hES 세포를 배양하는 능력은, hES 세포의 부피를 키우는 것을 좀 더 비용 효율적 공정으로 만들고, hES 세포 배양물의 생산 능력 및 성장률을 최적화할 추가의 기회를 제공해야 한다. 또한, 현탁 배양의 이용은, 세포 및 배지가 무균 방식으로 시스템에 도입되고 회수되는 폐쇄 시스템에 hES 세포 배양 방법을 응용하는 것을 용이하게 하지만, 상기 시스템은 다른 방식으로 덜 면밀한 환경에서 취급될 수도 있다.
본 발명의 추가의 장점은 후술하는 섹션들로부터 이해될 것이다.
정의
원형 "영장류 만능 줄기 세포"(primate Pluripotent Stem cells; pPS cells)는 수정 후 임의의 시점에서의 전배아, 배아, 또는 태아 조직으로부터 유도된 만능 세포이며, 적당한 조건 하에서 몇몇의 상이한 세포 유형의 자손을 생산할 수 있는 특성을 갖는다. pPS 세포는, 적합한 숙주(host)에서 기형종을 형성하는 능력, 또는 배양물에서 3 가지 배엽 모두의 조직 유형에 대한 마커를 갖는 세포로 분화화는 능력과 같은, 당업계에서 인정되는 표준 테스트에 따라, 3 가지 배엽, 즉 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 각각의 유도체인 자손을 생산할 수 있다.
pPS 세포의 정의에는 여러 가지 유형의 배아 세포, 예를 들어, 다른 영장류로부터의 배아 줄기 세포, 예컨대 붉은털원숭이 또는 명주원숭이 줄기 세포(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995; Developmental Biology 38:133, 1998), 및 인간 배아 생식(hEG) 세포(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998)와 같은 hES 세포가 포함된다. 다른 유형의 만능 세포 역시 상기 용어에 포함된다. 3 가지 배엽 모두의 유도체들인 자손을 생산할 수 있는 영장류 기원의 임의의 세포는, 이들이 배아 조직, 태아 조직, 또는 다른 근원에서 유도되었는지 아닌지와 관계없이 포함된다. 핵형적으로 정상이고 악성 근원으로부터 유도되지 않은 pPS 세포를 사용하는 것이 유익하다.
원형 "인간 배아 줄기 세포"(hES 세포)는 Thomson 등(Science 282:1145, 1998; 미국 특허 6,200,806호)에 의해 설명되어 있다. 상기 용어의 범위는 배반포기의 인간 배아 또는 세포가 3 가지 배엽으로 실질적으로 분화되기 전의 인간 배아로부터 유도된 만능 줄기 세포를 포괄한다. 당업자들은, 명백하게 다른 의미를 요하는 경우를 제외하고는, 상기 용어가 1차 조직과 hES 세포의 표현형 특성을 지닌 확립된 세포주, 및 3 가지 배엽 각각의 자손을 여전히 생산할 수 있는 상기 세포주의 유도체를 포함한다는 것을 알 것이다.
hES 세포 배양물은, 집단 내의 줄기 세포 및 이의 유도체의 상당한 비율이 미분화된 세포의 형태학적 특성을 나타내는 경우 "미분화된" 것으로 설명되며, 배아 또는 성체 기원의 분화된 세포와는 분명하게 구별한다. 미분화된 hES 세포는, 당업자에 의해 용이하게 인식되며, 일반적으로는, 2차원적 현미경상에서 높은 핵/세포질 비 및 두드러진 인을 갖는 것으로 나타난다. 집단 내의 미분화된 세포의 콜로니는 종종 분화된 이웃 세포에 의해 둘러싸이는 것으로 이해되고 있다. 그러나, 미분화된 콜로니는, 집단이 적절한 조건 하에서 배양되거나 계대 배양되는 경우 존속하며, 개개의 미분화된 세포가 세포 집단의 상당한 비율을 구성한다. 실질적으로 미분화된 배양물은, 진행 중의 상태로 20% 이상의 미분화된 hES 세포를 함유하며, 바람직하게는 40%, 60% 또는 80% 이상(뒤로 갈수록 더 바람직함)(미분화된 동일한 유전자형을 갖는 세포의 백분율)을 함유할 수 있다.
본 발명의 개시 내용에서 배양물 또는 세포 집단이 "분화 없이" 증식한다고 기재할 때에는, 이전의 정의에 따라, 증식 후에 조성물이 실질적으로 미분화된 상태임을 의미한다. 4회 이상의 계대 배양을 통해 분화 없이 증식(약 20배)하는 집단은, 최초 배양물과 동일한 정도의 포화도(confluence)에서 평가하는 경우, 실질적으로 동일한 비율의 미분화된 세포(또는 어쩌면 더 높은 비율의 미분화 세포)를 함유한다.
"영양 배지"는 증식을 촉진하는 영양분을 함유하는 세포 배양용 배지이다. 영양 배지는 일반적으로 등장성 염수, 완충제, (1 이상의 첨가된 단백질 또는 아미노산의 형태인) 단백질원, 및 잠재적으로 다른 외생적으로 첨가된 영양분과 성장 인자를 함유한다.
"조절 배지"는 배지에서 제1 세포 집단을 배양한 다음, 그 배지를 회수함으로써 제조한다. 이어서 (세포에 의해 배지에 분비된 임의의 물질과 함께) 조절 배지는 제2 세포 집단의 성장을 지지하기 위해 사용될 수 있다. 특정 성분 또는 인자를 배지에 첨가하였다고 기재하는 것은, 인자(또는 인자를 분비하도록 조작된 세포 또는 입자)를 신중한 조작으로 배지에 혼입하였음을 의미한다.
"신선한 배지"는, 궁극적으로 지지하도록 디자인된 세포 유형과 함께 사용하기 전에 상이한 세포 유형과 함께 배양함으로써 의도적으로 조절하지 않은 배지이다. 그렇지 않으면, 제조, 보관, 또는 사용의 방식에 대해 제한이 없다. 이는 최종 배양물에 새로이 첨가(교환 또는 주입에 의함)되며, 여기서 소모되거나, 아니면 존재하는 세포 유형에 의해 처리된다.
일반적 기법
분자 유전학 및 유전 공학에서의 일반적인 방법은 문헌들[Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook et al., Cold Spring Harbor)의 최신판, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos eds.) 및 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al. eds., Wiley & Sons)]에 기재되어 있다. 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기법은 문헌들[Current Protocols in Protein Science(J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons), Current Protocols in Cell Biology(J.S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) 및 Current Protocols in Immunology(J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons.)]에서 찾아볼 수 있다. 본 개시 내용에 인용된 유전적 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 상업적 판매자, 예컨대 BioRad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech 및 Sigma-Aldrich Co.로부터 입수 가능하다.
세포 배양 방법은 일반적으로 문헌들[Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique(R.I. Freshney ed., Wiley & Sons)의 최신판, General Techniques of Cell Culture(M.A. Harrison & I. F. Rae, Cambridge Univ. Press), 및 Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols(K. Turksen ed., Humana Press)에 기재되어 있다. 다른 관심 있는 참고 문헌으로는 Culture Is Our Business(M. McLuhan, Ballantine Books, 1970) 및 Understanding Media(M. McLuhan, Signet, 1970)가 있다. 조직 배양 공급물 및 시약은 상업적 판매자, 예컨대 Gibco/BRL, Nalgene-Nunc International, Sigma Chemical Co., 및 ICN Biomedicals로부터 입수 가능하다.
줄기 세포의 공급원
배아 줄기 세포는 영장류 종의 구성원의 배반포로부터 분리할 수 있다(미국 특허 5,843,780; Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아 줄기(hES) 세포는, Thomson 등(미국 특허 6,200,806호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998) 및 Reubinoff 등(Nature Biotech. 18:399,2000)이 설명한 기법에 따라 1차 마우스 섬유아세포 영양 공급자 세포를 사용하여 인간 배반포 세포로부터 제조할 수 있다. 또한, hES 세포주는, 인간 영양 공급자(미국 특허 6,642,048호) 상에서, 또는 영양 공급자 세포를 완전히 함유하지 않는 조건(US 2002/0081724 A1호)에서 유도될 수 있다. hES 세포와 동등한 세포 유형은 WO 01/51610호(Bresagen)에 개설된 바와 같이, 이들의 만능 유도체, 예컨대 원시 외배엽형(EPL) 세포를 포함한다.
실시예 섹션에 제공된 예시들은 hES 세포로 실시한 작업에 기인한다. 그러나, 달리 필요한 경우를 제외하고, 본 발명은 영장류 만능 줄기 세포의 정의에 부합하는 다른 세포를 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 실시는, 본 발명의 실시를 위한 hES 또는 배아 줄기 세포를 생산하기 위해 인간 배반포를 분해하는 것을 전혀 필요로 하지 않는다. hES 세포는, 공공 보관소(예를 들어, WiCell Research Institute, Madison WI U.S.A., 또는 American Type Culture Collection, Manassas VA, U.S.A.)로부터 얻을 수 있는 확립된 세포주로부터 얻을 수 있다. 인간 배아 생식(hEG) 세포는 문헌(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:13726, 1998 및 미국 특허 6,090,622호)에 기재된 바와 같이 원시 배종 세포로부터 제조할 수 있다. 미국 특허 공개 공보 2003/0113910 A1호는 배아 또는 태아 조직을 사용하지 않고 유도한 만능 줄기 세포를 보고한다. 만능 표현형을 유도하는 인자를 사용하여 다른 전구 세포를 hES 세포로 재프로그램하는 것도 역시 가능하다(Chambers et al., Cell 113:643, 2003; Mitsui et al., Cell 113:631 , 2003). 적절한 조건 하에서, 적절한 증식 능력 및 분화 능력을 갖는 임의의 세포는, 본 발명에 따라 사용하기 위해 분화된 조직의 유도에 사용할 수 있다.
hES 세포의 증식
초기에, 이 분야의 대부분의 과학자들은, Thomson(U.S. 5,843,780호; U.S. 6,090,622호)에 의해 최초로 설명된 바와 같이, 분화를 방지하기 위해 hES 세포를 영양 공급자 세포의 층에서 배양하는 것을 선호하였다.
초기에, Geron의 과학자들은, 미분화된 표현형의 증식을 촉진하기 위해 영양 공급자 세포에 의해 제공된 성분이 다른 형태로 제공될 수 있는 배양 시스템을 발견하였다. 미국 특허 6,800,480호, WO 01/51616호(Geron Corp.), 및 Xu 등(Nature Biotechnology 19:971, 2001)은 분화 없이 증식을 돕는 영양 공급자 무함유 배양 환경을 설명한다.
영양 공급자 무함유 배양 방법의 한 양상은, 세포외 매트릭스 상에 배양함으로써 hES 세포를 원조하는 것이다. 상기 매트릭스(matrix)는 매트릭스 형성 세포주, 예컨대 STO 마우스 섬유아세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-1503) 또는 인간 태반 섬유아세포를 예비 배양하고 용해함으로써 적층시킬 수 있다(U.S. 6,800,480호). 또한 상기 매트릭스는 분리된 매트릭스 성분으로 배양 용기에서 직접 코팅될 수 있다. Matrigel®은, 실온에서 겔화되어 재구성된 기저막을 형성하는 Engelbreth-Holm-Swarm 종양 세포로부터의 가용성 제제이다. 다른 적합한 세포외 매트릭스 성분은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 엔탁틴, 황산헤파란 등을 단독으로 또는 여러 가지 조합으로 포함할 수 있다. 매트릭스 성분은, 인간으로부터의 성분 및/또는 재조합 발현으로 제조한 성분일 수 있다. 본원에 설명된 실험 절차를 사용하여 시험할 수 있는 기재는 다른 세포외 매트릭스 성분뿐만 아니라, 폴리아민, 히드로겔, 및 다른 상업적으로 입수 가능한 코팅도 포함할 수 있다.
영양 공급자 무함유 배양 시스템의 다른 양상은 영양 배지이다. 상기 배지는 일반적으로, 등장성 완충제(즉, 작용 농도로 조절되는 경우 등장성인 완충제), 필수 미네랄, 및 혈청 또는 몇몇 종류의 혈청 대체물을 비롯한, 세포 생존을 향상하기 위한 통상적인 성분을 함유할 것이다.
hES 지지성 인자를 도입하는 직접적인 방식은, 배지를 미국 특허 6,200,806호 또는 WO 01/51616호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있는 1차 마우스 배아 섬유아세포(mEF)로 미리 처리하는 것이다. 텔로머화된(telomerized) 세포주, 및 분화하는 hES 세포로부터 얻어지는 인간 세포주(미국 특허 6,642,048) 또는 다른 원시 세포 유형들이 영양 공급자 세포로서 또한 적합하다. hES 세포 배지는, 영양 공급자 세포(일반적으로 조사되거나 아니면 비활성화됨)를 배양함으로써 조작할 수 있다. 37℃에서 1∼2 시간 동안 배양하여 조작한 배지는 hES 세포 배양을 약 1∼2일간 지지하는 인자의 농축물을 함유한다. 그러나, 조작 기간은, 적당한 기간을 구성하는 것을 경험적으로 결정하면서 위아래로 조절될 수 있다.
조절 배지의 대안으로서, hES 세포는, 미분화된 세포에서 적절한 신호 전달 경로를 유발하는 첨가된 인자를 함유하는 신선한 (비조절) 배지에서 성장시킬 수 있다. 조작 없이 사용하는 적합한 기초 배지는 경험적으로 확인될 수 있다. 배지는 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유한다. 또한 배지는 일반적으로, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유한다.
다수의 적합하고 상업적으로 입수 가능한 기본 배지는, 조혈모세포와 같은 증식 세포 유형을 배양하기 위해 개발되어 왔다. X-VIVOTM 10 증식 배지(Biowhittaker) 및 QBSFTM-60(Quality Biological Inc.)(실시예 1)이 예시적이다. WO 98/30679호(Life Technologies Inc.) 및 U.S. 5,405,772호(Amgen)도 참조하라. X-VIVOTM 10 제제는 약학 등급 인간 알부민, 재조합 인간 인슐린 및 저온 살균된 인간 트랜스페린을 함유한다. 외인성 성장 인자, 세포 증식의 인공 자극제 또는 미정의 보충물은 X-VIVOTM 10 배지에 포함되지 않는다. 또한 이들은 임의의 단백질-키나아제 C 자극제가 결여되어 있다. QBSFTM-60은 재조합 또는 저온 살균된 인간 단백질을 함유하는 혈청 무함유 제제이다. 다른 잠재적 대안은 JRH Biosciences사가 제조한 Ex-Cell VPROTM 배지 및 Hyclone사가 제조한 HyQ CDM4TM이다.
기초 배지에는 분화는 억제하면서 미분화된 표현형의 증식을 촉진하는 첨가제가 보충된다. 고농도의 섬유아세포 성장 인자는, 분화 없이 hES 세포 증식을 촉진하는 데 특히 효과적이다. 염기성 FGF(FGF-2) 및 FGF-4가 예시적이나, 그 패밀리의 다른 구성원도 사용될 수 있다. 동등한 형태는 각각의 FGF 수용체에 대한 종 동족체, 인공 유사체, 항체, 및 다른 수용체 활성화 분자이다. 유전자 발현 분석으로부터, 미분화된 hES 세포가 산성 FGF(FGF-1)에 대한 수용체를 발현한다는 것이 확인되었다. 고농도에서는, FGF 단독이, 미분화된 상태로 hES 세포의 성장을 촉진하는 데 충분하다(실시예 1 및 2). 미분화된 hES 세포 성장을 단독으로 촉진하는 데 효과적인 FGF의 농도는, 통상적으로 약 20, 30, 또는 40 ng/mL의 하한을 가지며, 이때 실제적인 상한은 약 200, 500, 또는 1000 ng/mL이다. 60, 80, 또는 100 ng/mL 이상의 bFGF 농도는 신뢰성 있고 비용 효율적이다. FGF의 다른 형태 및 유사체의 동등한 농도는, 배양물을 bFGF로부터 제안된 대체물로 떼어놓고 배양물의 분화를 하기에 설명된 마커 시스템에 따라 모니터링함으로써 경험적으로 결정할 수 있다.
hES 세포의 현탁 배양
본 발명에서는, hES 세포를, 고체 기재 상에서 성장하게 하는 것이 아니라 현탁 배양으로 성장시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
다른 배양 방법으로 증식된 (또는 1차 공급원으로부터 얻은) hES 세포를 현탁 상태로 세포를 유지하기 위해 적합화된 용기에 접종한다. 용기벽은 일반적으로 미분화된 hES 세포의 부착에 대해 비활성이거나 내성이 있다. 또한, 세포가 침전하는 것을 방지하는 수단, 예컨대 자기적으로 또는 기계적으로 작동되는 교반 막대 또는 패들과 같은 교반 장치, 진탕 장치(일반적으로 용기의 외부에 부착됨), 또는 인버팅(inverting) 장치(즉, 세포 상의 중력 방향이 변화하도록 용기를 회전시키는 장치)도 있다.
공정 개발을 위한 현탁 배양에 적합한 용기는 상업적으로 입수 가능한 스피너 또는 쉐이커 플라스크의 통상적인 범위를 포함한다. 상업적 제조에 적합한 발효기는 Celligen PlusTM(New Brunswick Scientific Co.) 및 Stirred-Tank ReactorTM(Applikon Inc.)이다. 이 생물 반응기들은 배지가 연속적으로 채워지거나 유가 방식으로 사용될 수 있으며, 여러 가지 크기로 제조된다.
미분화된 표현형을 유지하는 데 조력하고 성장을 돕는 영양 배지는 필요한 만큼 교체된다(예를 들어, 세포가 떨어져 나가게 두고, 배지를 교체한 다음, 세포를 재현탁함에 의함). 성장은 모니터링되고, 배양물은 필요한 경우 분할되어 추가의 성장을 위한 장소를 내어준다. 적합한 배양 기간 후, 세포는 회수되어 의도된 목적으로 사용된다.
고체 표면에서 영양 공급자 없이 hES 세포를 성장시키기 위해 설계된 배지 및 다른 성분 역시 현탁 배양에서 사용될 수 있다. 조절 배지 또는 신선한 배지가 사용될 수 있다(실시예 4). 그러나, 현탁 배양의 역학은 사용자에게 배양 시스템의 여러 가지 성분을 최적화할 추가의 기회를 제공한다. 이론에 구속되고자 하는 바는 아니나, hES 세포가 작은 미분화 다발(고체 표면상의 미분화된 콜로니의 3차원 등가물)을 형성하게 허용되면서, 혹은 기질 세포로 부분적으로 분화된 세포에 의해 둘러싸이는 경우, 또는 hES 세포가 분산되나, 달리 분화를 야기할 수 있는 동적 유체력으로부터 보호되는 경우, 현탁 배양이 증진된다는 것이 본 발명의 가설이다.
현탁 배양 시스템의 최적화는 경험적 시험으로 성취할 수 있다. 이전의 표면 또는 현탁 배양으로부터 미분화된 세포는 시험 조건으로 계대 배양되고, 1 주 이상 동안 배양된다. 세포는, 예를 들어 다음 섹션에 설명할 마커 시스템을 사용하여 hES 세포의 특성에 대해 주기적으로 검사되고, 실시예 1에 예시될 수 있다. 또한, 세포는, 양호하게 확립된 배양 시스템으로 다시 계대 배양되고, 미분화된 세포의 전형적인 형태학적 특징에 대해 평가될 수 있다(실시예 3). hES 세포가 궁극적으로 특정 조직 유형으로 분화하도록 의도된 경우에는, 최종 시험은 미분화된 배양의 마커 프로필이 아니라, 필요한 만큼 분화하는 세포의 능력일 것이다. hES 현탁 배양의 다능성은, 세포를 샘플링하고 또한 SCID 마우스에서 기형종을 생성함에 의해서, 또는 3 가지 배엽 모두를 나타내는 마커를 위해 EB-유도된 세포를 염색함에 의해 확증될 수 있다(실시예 3). 사용자는 이로써 시스템을 최적화하여, 세포의 완전한 다능성(또는 적어도 의도한 관심있는 조직으로 분화하는 세포의 능력)을 보유하면서 높은 성장률을 성취할 수 있다.
추가의 최적화로 이득을 얻을 수 있는 배양 시스템의 양상은 영양 배지를 포함한다. 대안적인 기본 배지 및 대안적인 FGF 첨가제는 이전 섹션에 열거되어 있다. 또한, 1 이상의 추가의 첨가제, 예컨대 하기의 것들을 사용하는 것이 유리할 수 있다:
ㆍ 줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자), c-키트를 이량화하는 다른 리간드 또는 항체, 및 동일한 신호 전달 경로의 다른 활성제
ㆍ 다른 티로신 키나아제 관련 수용체, 예컨대 혈소판-유도된 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor; PDGF), 대식세포 콜로니-자극 인자, Flt-3 리간드 및 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)의 수용체를 위한 리간드
ㆍ 환형 AMP 농도를 높이는 인자, 예컨대 포르스콜린
ㆍ gp130을 유도하는 인자, 예컨대 LIF 또는 Oncostatin-M
ㆍ 조혈모 성장 인자, 예컨대 트롬보포이에틴(TPO)
ㆍ 변형성 성장 인자, 예컨대 TGFβ1
ㆍ 다른 성장 인자, 예컨대 표피 성장 인자(EGF)
ㆍ 뉴로트로핀, 예컨대 CNTF
세포가 서로 부착하거나, 용기벽에 부착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제(anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat # 0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.
세포는 한정된 정도로 자신의 세포외 매트릭스를 형성하는 능력을 갖긴 하나, 배지에 용해되거나 현탁된 1 종 이상의 세포외 매트릭스 성분을 포함하는 것도 유익할 수 있다. 현탁 상태로 라미닌을 유지하기 위한 적합한 작용 범위는 약 10∼33 ㎍/mL이다. 현탁 배양을 위한 다른 후보 매트릭스 성분은, 위에 열거한 것들 중 일부, 특히 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 및 이의 인공 등가물을 포함한다. 세포외 매트릭스는 세포가 적절한 크기의 작은 응집물을 형성하는 데 조력할 수 있다.
대안으로 또는 추가로, 현탁 배양물은 현탁액 중에서 표면을 형성하는 미립자 담체를 함유할 수 있으나, 3차원 공간에서 세포를 배양하는 이득을 여전히 제공한다. 세포는, 배지 교체 동안 입자들을 용기에 보유하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양되고 계대 배양되고, 세포가 분할되는 경우 더 많은 입자들이 첨가된다.
미세담체의 한 유형은, 세포 부착을 증가시키기 위해 양전하는 갖는 유리, 플라스틱, 덱스트런 등으로부터 제조한 고체 구형 또는 반구형 입자(Cytodex)이다. 다른 유형은 원반형 배양 플라스틱, 예컨대 New Brunswick Scientific Co, Inc.가 판매하는 Fibra-cel DisksTM이다. 이 원반들의 그램은 1200 cm2의 표면적을 제공한다. 고체 담체는, 부착된 세포가 고체 표면 위에 플레이팅된 세포와 동일한 미소 환경을 갖도록 hES 세포 친화적 세포외 매트릭스, 예컨대 라미닌으로 임의로 코팅한다.
미세담체의 다른 유형은, 세포가 내부뿐만 아니라 외부에도 존재하게 허용하여 보호 효과를 잠재적으로 증진하는 여러 가지 기공 크기의 거대다공성 입자이다. hES 세포를 최소로 분열되게 회수하기 위해서, 부드러운 기계적 또는 효소적 작용에 의해 용이하게 용해되거나 분산됨으로써 세포를 회수 또는 추가의 배양을 위해 방출할 수 있는 아가로스와 같은 물질로 제조된 입자를 사용함으로써 하는 것이 유익하다.
미분화된 hES 세포의 특성
본 발명에 따라 배양된 인간 ES 세포는 미분화된 줄기 세포의 특징적인 형태학적 특징을 갖는다. 2차원의 표준 현미경 화상에서, hES 세포는, 화상면에서의 높은 핵/세포질 비, 두드러진 인, 및 세포 연접의 식별이 곤란한 밀집된 콜로니 형성을 나타낸다. 세포주는 표준 G-분염 기법을 사용하여 핵형을 분석할 수 있고(일상적인 핵형 분석 편의를 제공하는 다수의 임상 진단 연구실, 예컨대 미국 캘리포니아주 오클랜드에 소재하는 Cytogenetics Lab에서 가능함), 공개된 인간 핵형과 비교될 수 있다. 세포가 정배수체임을 의미하는 "보통의 핵형"을 갖는 세포를 얻는 것이 바람직하며, 상기 핵형에서 모든 인간 염색체는 존재하고 현저하게 대체되지 않는다.
hES 세포는 항체(유세포 분석 또는 면역 세포 화학법) 또는 역전사효소 PCR에 의해 검출 가능한 발현된 세포 마커를 특징으로 할 수 있다. hES 세포는 일반적으로 항체-검출 가능한 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81을 가지나, SSEA-1는 거의 갖지 않으며, 알칼리 포스파타아제 활성을 갖는다. mRNA 수준에서 검출 가능한 적합한 마커의 패널은 출원 US 2003/0224411 A1호(Geron Corp.)에 열거되어 있다. Cripto, 가스트린-방출 펩티드(GRP) 수용체, 포도칼릭신형 단백질(PODXL), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), 및 POU 전사 인자 Oct 3/4가 예시적이다.
이미 설명한 바와 같이, 증식된 hES 세포의 중요한 특징은 모든 3 가지 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포로 분화될 잠재력이다. hES 세포의 다능성은, SClD 마우스에서 기형종을 형성하고, 모든 3 가지 배엽의 대표적인 조직에 대해 시험함으로써 확증할 수 있다. 대안으로, hES 세포가 비특이적으로 분화하게 둔 다음(예를 들어, 배상체를 형성함), 면역 세포 화학법으로 배양물에 표시된 세포 유형을 결정하여 다능성을 측정할 수 있다(실시예 3). 특정 세포주로 분화하는 hES 세포의 잠재력은 다음 섹션에 설명한 절차에 따라 측정할 수 있다.
증식된 hES 세포의 용도
본 발명은, 다수의 만능 세포를 상업적 규모로 제조할 수 있는 방법을 제공한다. 세포는 미분화된 형태에서 다수의 연구 및 상업적 목적에 유용하거나, 특정 세포 유형으로 분화하도록 유도될 수 있다.
미분화된 hES 세포는, 인자들(예컨대 작은 분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등) 또는 배양물 중의 hES 세포의 특성에 영향을 주는 조건(예컨대 배양 조건 또는 조작)을 선별하는 데 사용될 수 있다. 또한, hES 배양물은 약물 연구에서 약학적 화합물을 시험하는 데 사용될 수 있다. 후보 약학적 화합물의 활성의 평가는 일반적으로, 본 발명의 분화된 세포를 후보 화합물과 배합하고, 임의의 결과적 변화를 측정한 다음, 화합물과 관찰된 변화의 효과를 상호 관련시키는 것을 포함한다. 세포 독성 또는 대사 작용의 효과는, 세포 생존도, 형태, 특정 마커의 발현 또는 방출, 수용체 또는 효소, DNA 합성 또는 복구 등으로 측정할 수 있다.
본 발명에 따라 배양된 hES 세포는, 여러 가지 상업적으로 및 치료상으로 중요한 조직 유형의 분화된 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다.
간 세포
간세포는, 미국 특허 6,458,589호 및 PCT 공보 WO 01/81549호(Geron Corporation)에 기재된 바와 같이, 히스톤 탈아세틸화 효소의 억제제를 이용하여 hES 세포로부터 분화시킬 수 있다. 미분화된 hES 세포는 히스톤 탈아세틸화 효소의 억제제의 존재 하에 배양된다.
hES 세포를 간세포로 분화시키기 위한 단계적 프로토콜이 US 2005/0037493 A1호(Geron Corp.)에 기재되어 있다. 세포는 차례로 몇몇의 분화 및 성숙 제제와 함께 배양되면서, hES 세포가 먼저 초기의 내배엽 또는 간세포 전구체로 분화되게 한 다음, 간세포 유형 세포를 성숙시킨다. 간단히, 내배엽형 세포로의 분화는 부티르산염, DMSO 또는 우태아 혈청을, 임의로 섬유아세포 성장 인자와 함께 사용하여 개시할 수 있다. 이어서, 인자, 예컨대 간세포 성장 인자(HGF), 표피 성장 인자(EGF), 및/또는 골 형성 단백질(예를 들면, BMP-2, 4, 또는 7)을 여러 가지 조합으로 포함하는, 상업적으로 입수 가능한 간세포 배양 배지를 사용하여 분화를 지속한다. 최종 성숙은, 제제, 예컨대 덱사메타존 또는 Oncostatin M의 존재에 의해 증진될 수 있다. 아시알로당단백질, 글리코겐 보관, 사이토크롬 p450 효소 발현; 글루코스-6-포스파타아제 활성, 및 간세포의 형태학적 특징을 나타내는 세포가 얻어진다.
신경 세포
신경 세포는, 미국 특허 6,833,269호, 문헌[Carpenter et al., Exp Neurol. 2001;172(2):383-97] 및 WO 03/000868호(Geron Corporation)에 기재된 방법에 따라 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 미분화된 hES 세포 또는 배상체 세포는 1 이상의 뉴로트로핀 및 1 이상의 마이토젠을 함유하는 배지에서 배양되어, 세포 집단을 생성하며, 상기 세포 집단에서 60% 이상의 세포가 A2B5, 폴리시알릴화 NCAM, 또는 Nestin을 발현하고, 상기 세포 집단은 배양물에서 20 이상의 배가가 가능하다. 예시적인 마이토젠은 EGF, 염기성 FGF, PDGF 및 IGF-1이다. 예시적인 뉴로트로핀은 NT-3 및 BDNF이다. TGF-β Superfamily 길항제의 이용, 또는 cAMP와 아스코르브산의 조합이 티로신 수산화효소, 도파민성 뉴런의 특성에 양성인 뉴런 세포의 비율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이어서 세포를 증식시키는 것이, 마이토젠의 존재 하에 뉴로트로핀과 배양함으로써 최종 분화를 일으키기 위해 실시될 수 있다.
희돌기교세포는 이들을 마이토젠, 예컨대 FGF, 및 희돌기교세포 분화 인자, 예컨대 트리요도티로닌, 셀레늄 및 레티노산을 함유하는 배지에 현탁된 세포 응집물로서 배양함으로써 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 이어서, 세포를 고체 표면 위에 플레이팅하며, 레티노산은 배출시키고, 집단은 증식시킨다. 최종 분화는 폴리-L-리신 위에 플레이팅하고, 모든 성장 인자를 제거함으로써 실시할 수 있다. 80% 초과의 세포가 희돌기교세포 마커 NG2 프로테오글리칸, A2B5, 및 PDGFRα에 양성이고, 뉴런 마커 NeuN에 음성인 집단을 얻을 수 있다. PCT 공보 WO 04/007696호 및 문헌[Keirstead et al., J Neurosci. 2005;25(19):4694-705]을 참조하라.
심장 세포
심근아세포(cardiomyocyte) 또는 심근아세포 전구체는, WO 03/006950호에 제공된 방법에 따라 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 세포는 우태아 혈청 또는 혈청 대체물, 및 임의로 DNA-메틸화에 영향을 주는 심장 친화성(cardiotrophic) 인자, 예컨대 5-아자시티딘과 함께 현탁 배양한다. 대안으로, 심근아세포 다발은 액티빈 A 및 골 형성 단백질 4의 조합을 사용하여 고체 기재 위에 직접 분화시킬 수 있다. 즉, 이어서 자연발생적으로 수축성이 있는 세포가 밀도 원심분리에 의해 집단 내의 다른 세포로부터 분리될 수 있다.
추가의 가공 단계는, 단일 세포를 제거하면서 cardiac bodyTM으로 공지된 다발을 형성하도록 세포를 배양한 다음, cardiac bodyTM를 연속적 반복으로 분산 및 개질하는 것을 포함할 수 있다. cTnl, cTnT, 심장 특이적 미오신 중연쇄(MHC), 및 전사 인자 Nkx2.5에 양성으로 염색되는 세포의 비율이 높은 집단을 얻는다. WO 03/006950호, 문헌[Xu et al., Circ Res. 2002;91(6):501-8] 및 PCT/US2005/009081호(Geron Corporation)을 참조하라.
기타 세포 유형
도세포는 ES 세포를, 액티빈 A, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제(예컨대 부티르산염), 마이토젠(예컨대 bFGF), 및 TGF-β Superfamily 길항제(예컨대 노긴)로부터 선택되는 몇몇의 인자들의 조합을 함유하는 배지에서 배양함으로써 분화를 개시하여 hES 세포로부터 분화시킬 수 있다. 이어서 세포는 니코틴아미드와 함께 배양함으로써 성숙시켜, 5% 이상의 세포가 Pdx1, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드를 발현하는 세포 집단을 산출할 수 있다. WO 03/050249호(Geron Corp.)를 참조하라.
조혈모세포는 hES 세포를 쥣과 골수 세포 또는 조혈모 마커를 갖는 세포를 생성하는 데 사용된 난황낭 내피 세포와 공동배양하여 제조할 수 있다(미국 특허 6,280,718호). 또한, 조혈모세포는, US 2003/0153082 A1호 및 WO 03/050251호(Robarts Institute)에 기재된 바와 같이 hES 세포를 혈행성(hematogenic) 시토킨 및 골 형성 단백질과 함께 배양하여 제조할 수 있다.
중간엽 원종은 WO 03/004605호에 기재된 방법에 따라 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 이어서 hES 유도된 중간엽 세포는, 골원성 인자, 예컨대 골 형성 단백질(특히 BMP-4), 인간 TGF-β 수용체를 위한 리간드, 또는 인간 비타민 D 수용체를 위한 리간드를 함유하는 배지에서 골아세포 계통 세포로 더 분화될 수 있다(WO 03/004605호; Sotile et al., Cloning Stem Cells 2003;5(2):149-55). 연골 세포 또는 이의 원종은, 미세응집물 중의 hES 세포를 WO 03/050250호(Geron Corp.)에 열거된 분화 인자들과 효과적으로 조합하여 배양함으로써 생성할 수 있다.
업계에 공지되거나 차후에 개발된 다른 분화 방법을 본 발명에 따라 배양된 hES 세포에 이용할 수 있다. hES 유도된 세포는 약물 선별, 약학적 조성물 제조, 연구, 및 다수의 다른 가치있는 목적에 사용할 수 있다.
상업적 유통
본 발명의 배양 시스템의 성분들은 판매용으로 제공되거나, 아니면 임의의 목적으로 다른 실재에 의해 사용되기 위해 제조지로부터 유통될 수 있다. 성분들은 여러 가지 유용한 조합, 예컨대 하기 중 2 이상으로 함께 판매 및 유통될 수도 있다:
ㆍ 현탁 인자에서 hES 세포를 배양하기에 적합한 배지
ㆍ 배지에 존재하거나 첨가될 세포외 매트릭스 성분 또는 증점제
ㆍ 배지에 존재하거나 첨가될 미세담체
ㆍ 현탁 배양에 적합화한 용기
ㆍ 배양 시스템에서 성장하거나, 다른 형태로 저장되었으나 배양 시스템에 사용하기 위한 hES 세포 자체
생산품 및 생산품 조합물은, 임의로 키트 형태로, 적합한 용기에 포장될 수 있고, 본 발명에 따른 물질의 용도에 관해 작성된 정보, 예컨대 hES 세포를 유지하거나 증식시키는 정보가 동봉될 수 있다. 상기 정보는 의도된 사용자가 접근하기 쉽고 이해할 수 있는 임의의 통신 매체에 임의의 언어로 작성될 수 있다. 용기 또는 키트 상의 라벨의 형태를 취하거나, 용기와 함께 포장되어 함께 유통되는 제품 삽입물의 형태를 취할 수 있다. 동등한 형태는, 사용자 또는 의도된 사용자에게 상업적으로 유통된 생산품과 연관된 참고 또는 방편 자료로서 입수 가능한, 하드 카피에 또는 전자 양식으로 쓰여진 설명서, 지침서, 또는 해설서이다.
이어지는 실시예들은 청구하는 발명을 한정할 의도가 아닌 예시이다.
[실시예]
실시예 1: 신속 증식 배지에서의 만능 줄기 세포의 배양
처음에 마우스 배아 섬유아세포 영양 공급자 세포 상에서 배양한 hES 세포주를 얻은 다음, 미국 특허 6,800,480호에 따라 문헌[Xu et al., Stem Cells 2005;23(3):315-23]에 상술된 바와 같이, Matrigel® 세포외 매트릭스 및 조절 배지를 포함하는 영양 공급자 무함유 환경에서 20 회의 계대 배양 동안 증식시켰다.
그 다음, 상기 hES 세포를 Biowhittaker사의 X-VIVOTM 10 증식 배지 또는 Quality Biological Inc사의 QBSFTM-60에서 배양하였다. 본 실험에서 사용하기 위해, X-VIVOTM 10 배지를 통상적인 물질, 즉, 2 mM L-글루타민, 1% 비필수 아미노산(Gibco), 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 및 8 ng/mL bFGF로 보충하였다. 상기 배지를 8 ng/mL 또는 40 ng/mL의 bFGF(Gibco); 40 ng/mL의 bFGF 및 15 ng/mL의 SCF(R & D System); 또는 40 ng/mL의 bFGF 및 75 ng/mL의 Flt3 리간드(R & D System)로 더 보충하였다. QBSFTM-60 배지는 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산(Gibco) 및 40 ng/mL의 bFGF으로 보충하였다. mEF 조절 배지에서 배양된 hES 세포들은 본 실험들에서 대조군으로 사용하였다.
hES 세포를 먼저 콜라게나제 IV를 사용하여 Matrigel® 코팅된 평판 위에 계대 배양하고, 조절 배지로 2일간 배양하였다. 2 번째 날, 조절 배지를 80% 비조절 ES 배지 + 20% 증식 배지로 교체하였다. 세포에 매일 신선하게 공급하고 매주 계대 배양하였다. 증식 배지의 비율을, 세포들을 완전히 떼어놓을 때까지 대략 2일 마다 20%까지 증가시킨 다음, 이들을 6 회 더 계대 배양될 때까지 성장시켰다.
도 1은 하기의 배지들에서의 6 회의 계대 배양(완전한 적응에 충분함)의 종결시의 hES 세포 콜로니를 도시한다: (A) mEF 조절 배지 + bFGF(8 ng/mL); (B) X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL); (C) X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) + 줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자)(15 ng/mL); (D) X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) + Flt3 리간드(75 ng/mL); (E) QBSFTM-60 + bFGF(40 ng/mL).
하기의 표는, mEF 조절 배지에서 4 회 계대 배양으로, 또는 X-VIVOTM 10 또는 QBSFTM-60에서 7 회 계대 배양으로 배양된 미분화 hES 세포에 대한, 계대 배양당 평균 총 세포 증식을 나타낸다.
배지 | 계대 배양당 평균 세포 증식 |
mEF 조절 배지 | 2.2 배 |
X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) | 6.0 배 |
X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) + SCF(15 ng/mL) | 8.2 배 |
X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) + Flt3 리간드(75 ng/mL) | 5.0 배 |
QBSFTM 60 + bFGF(40 ng/mL) | 6.4 배 |
X-V1VOTM 10 및 QBSFTM-60에서 계대 배양당 세포의 평균 증식은 mEF 조절 배지 배양물에서 배양된 세포보다 더 컸다. mEF 조절 배지의 세포는 평균 7일마다 계대 배양한 반면, X-VIVOTM 10 및 QBSFTM-60의 세포는 평균 5일마다 계대 배양하였다. 따라서, 비조절 X-VIVOTM 10 또는 QSFTM-60에서의 증식률은 mEF 조작 ES 배지에서보다 3.2∼5.2 배 더 빨랐다.
도 2는 hTERT 및 Oct3/4의 유전자 발현 프로필을 도시한다. RNA는 High Pure RNA Isolation Kit(Roche Diagnostics)를 사용하여 세포로부터 분리하고 TaqmanTM 시험(실시간 RT-PCR)으로 평가하였다. 각각의 시험 조건에서의 유전자 발현을 대조군 배양물에서의 발현과 관련하여 플롯한다. 계기 오류 및 시험 가변성을 고려하면, 시험 및 대조군 샘플 간의 발현의 차이는 오직 2 배 초과인 경우에만 현저하다. 분석은, hTERT 및 Oct-3/4의 발현이 비조절 X-VIVOTM 10 또는 QBSFTM-60 배지(각각의 세트에서 첫째 넷째 막대)에 적응시 다소 감소하나, 세포가 mEF 조절 배지(각각의 세트에서 마지막 세 막대)로 다시 계대 배양되는 경우 표준 수준으로 되돌아옴을 도시한다.
비조절 배지에서 배양된 세포가 그의 다능성을 보유하고 있음을 확증하기 위해, 배상체를 형성하고, 이를 각각의 3 가지 배엽을 나타내는 표현형 마커에 대해 면역 세포 화학법으로 분석하였다. 증식 배지에서 7회 계대 배양 후, 200 U/mL 콜라게나제 IV를 37℃에서 10 분간 사용하여 세포를 작은 덩어리로 해리시키고, 분화 배지(DMEM + 10% FBS)에서 4일간 현탁 배양으로 둔 다음, 폴리-L-오르니틴 브롬화수소산염 코팅된 평판 위에 추가의 10일간 이송하였다. 이들을 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 침투화하며, 면역 세포 화학법으로 분류하였다.
도 3은 그 결과를 도시한다. 비조절 X-VIVOTM 10 배지에서 7회 계대 배양된 hES 세포는 α-태아단백질(내배엽에 해당함), 근육 액틴(중배엽에 해당함) 및 β-튜불린 III(외배엽에 해당함)를 염색하였다.
이렇게, hES 세포는 영양 공급자 무함유 환경의 신선한 (비조절) 배지에서, 상업적 생산에 적합한 신속한 속도, 즉 2배∼5배 더 빠르게 증식시키거나, 조절 배지 또는 영양 공급자 세포에서의 성장과 더 비교할 수 있다. 세포는 미분화된 hES 세포의 형태를 보유하며, 모든 3 가지 배엽을 나타내는 유도체 세포로 분화될 수 있다.
실시예 2: 동물성 생성물을 함유하지 않는 규정 시스템에서의 hES 세포의 배양
Matrigel® 상의 MEF-CM에 배양된 hES 세포는 신선한 (비조절) 혈청 무함유 배지인, 글루타민, 비필수 아미노산 및 β-메르캅토에탄올, 게다가 80 ng/mL Matrigel® 상의 인간 염기성 FGF로 보충된 X-VIVOTM 10 에 계대 배양한 다음, 인간 라미닌으로 코팅된 표면에 적응시켰다. 대안으로, 저온 보존한 세포를 80 ng/mL hbFGF를 함유하는 동일한 배지에 직접 해동하였다. 상기 세포는 콜라게나제 IV를 사용하여 5∼6일마다 계대 배양하였다.
이 조건들에서 성장한 배양물은 Matrigel® 상의 배양물과 유사하거나 그보다 더 우수하였다. (A) mEF 조절 배지에서 성장한 세포의 형태; (B) 라미닌 상의 규정 배지의 형태; (C) mEF-CM(H1p62) 또는 규정 배지(H1p34+28)에서의 표면 마커 SSEA-4 발현; (D) mEF-CM 또는 규정 배지에서의 표면 마커 Tra-1-60의 발현. 라미닌 상의 규정 배지에서의 배양 수행이 우수하였는데, 즉, 아주 큰 ES 세포 콜로니가 관찰되었으며, 이때 콜로니는 배양물의 약 80%에 상당하였다. 마커 발현의 정도는 하기와 같았다:
계대 배양 번호 |
배양 배지 |
표면 마커 발현 | 상대적 유전자 발현 | |||
SSEA-4 | Tra-1-60 | hTERT | Oct3/4 | Cripto | ||
실험 1: H1p41 H1p31+10 |
조절 규정 |
79% 92% |
93% 87% |
1.00 2.85±0.58* |
1.00 0.74±0.04 |
1.00 1.82±0.62 |
실험 2: H1p44 H1p34+11 |
조절 규정 |
81% 77% |
91% 84% |
1.00 1.11±0.38 |
1.00 0.57±0.24 |
1.00 0.76±0.39 |
실험 3: H1p47 H1p35+12 |
조절 규정 |
78% 80% |
92% 86% |
1.00 2.00±0.15 |
1.00 0.86±0.20 |
1.00 3.12±0.91 |
* 3회 RT-PCR 측정에 대한 평균±SD |
미분화된 hES 세포의 다른 마커 특성의 발현도 비슷하였다: 실시간 PCR로 측정한 바에 의하면, hTERT 및 Cripto의 수준은 mEF-CM과 비교하여 규정 배지에서 동일하거나 더 큰 반면, Oct 3/4의 발현은 약 28%(세 실험의 평균)까지 더 낮았다. TRAP 분석은 세포가 텔로머라아제 효소 활성을 보유함을 나타냈다.
p34+11에서의 완전히 규정된 배양 시스템에서 성장한(75일) 세포를 회수하고, SCID 마우스에서 기형종을 제조하여 다능성을 평가하는 데 사용하였다. 기형종은 염색된 상피(내배엽); 신장 조직(내배엽); 중간엽 조직(중배엽); 및 신경관(외배엽)의 흔적을 보였다. 이는, 세포가 그의 다능성을 보유하였음을 확증한다.
실시예 3: hES 세포의 현탁 배양
배양물 부피당 hES 세포의 수율을 증가시킬 목적으로, 세포를 현탁 배양한 다음, 형태 및 모든 3 가지 배엽에 해당하는 분화된 세포들을 형성하는 능력을 평가하였다.
Matrigel® 상에서 성장한 H9 hES 세포를 6-웰 평판으로부터 회수하고 하기의 조건들 하에서 스피너 플라스크에 접종하였다:
ㆍ 용기: 100 mL 스피너 플라스크
ㆍ 접종(시딩) 밀도: 3.6 × 105 세포/mL
ㆍ 배지 부피: 스피너 플라스크당 50 mL
ㆍ 사용한 배지: bFGF(8 ng/mL)를 함유하는 mEF 조절 배지
ㆍ 교반 속도: 20 rpm(Bellco 캐리어 자석 교반기)
ㆍ 대기: 37℃ CO2 배양기
ㆍ 배지 교체: 격일(세포를 침전시키고 상청액을 교환함으로써 교체함)
H9 hES 세포는 스피너 플라스크에서 상기 조건들 하에 6일간 유지하였다.
도 4(위 그림)는 그 결과를 도시한다. 배양물이 확립되는 동안의 초기 감소에 이어서, 세포수는 2일째부터 6일째까지 증가하기 시작하였다.
이 시점에서, 세포를 Matrigel®로 코팅된 6웰 평판에 다시 플레이팅하여, 이들이 미분화된 세포의 표현형을 여전히 갖는지 여부를 확인하였다. bFGF(8 ng/mL)를 함유하는 mEF-CM 배지를 사용하여 배양을 지속하였다.
도 4(아래 그림)는 그 결과를 도시한다. 단일 계대 배양 후, 세포는 성장하고 미분화된 세포의 형태를 나타냈다.
세포의 다능성을 배상체를 형성함으로써 평가하였다. 콜라게나제 IV를 사용하여 컨플루언트 배양물로부터 세포를 회수하고, DMEM + 20% FBS 중 저부착 6웰 평판으로 옮겼다. EB가 형성되었고, 이를 4일간 유지하였다. 이어서 EB를 폴리오르니틴 코팅된 챔버 슬라이드에 재플레이팅하였다. 추가의 11일 후, EB 증식물의 α-태아단백질(내배엽), 근육 액틴(중배엽) 및 뉴런 형태를 갖는 β-튜불린(외배엽)을 염색하였다.
도 5는 그 결과를 도시한다. 상부 열은, 현탁 배양으로 유지된 hES 세포로부터 분화된 다음, 표준 조건 하에 라미닌 상에 다시 플레이팅된 세포들을 도시한다. 하부 열은 플레이팅된 세포로서 내내 유지된 동일한 hES 세포주로부터 분화된 세포들을 도시한다. 이 도면에서 도시된 바와 같이, 현탁 상태로 유지된 hES 세포는 모든 3 가지 배엽의 유도체로 분화하는 전능성을 유지하였다.
다른 실험에서는, H9 hES 세포를 하기의 조건들 하에서 배양하였다:
ㆍ 용기: 100 mL 스피너 플라스크
ㆍ 접종(시딩) 밀도: 3.5 × 105 세포/mL
ㆍ 배지 부피: 스피너 플라스크당 50 mL
ㆍ 사용한 배지: mEF-CM + bFGF(8 ng/mL)
ㆍ 교반 속도: 20 rpm(전과 같음)
ㆍ 배지 교환: 3일에 1회
도 6은 그 결과를 도시한다. 일단 배양물이 확립되면, 세포는 완전한 12일의 기간 동안 순조롭게 유지되었다.
실시예 4: 장기 현탁 배양
이 실험은 다른 hES 세포주로 실시하였다. 세포를 몇몇의 상이한 배양 조건 하에서 스피너 플라스크 대신에 쉐이커 플라스크를 사용하여 배양하고, 배양을 2 개월 이상 동안 연장하였다.
ㆍ H1 hES 세포는 6-웰 평판으로부터 회수하고(mEF 조절 배지 중 Matrigel® 상에서 성장함), 하기의 조건들 하에서 쉐이커 플라스크에 접종하였다:
ㆍ 용기: 100 mL 쉐이커 플라스크
ㆍ 접종(시딩) 밀도: 5.0 × 105 세포/mL
ㆍ 배지 부피: 쉐이커 플라스크당 15 mL
ㆍ 교반 속도: 80 rpm(37℃ CO2 배양기에서의 Labline 회전자/쉐이커)
ㆍ 배지 교환: 처음에는 격일로, 이후에는 2∼3일에 1회
사용한 배지 및 배양 기간은 하기와 같았다:
A: mEF-CM + bFGF(8 ng/mL). 98일간 유지함.
B: mEF-CM + bFGF(8 ng/mL) + 라미닌(개시에는 33 ㎍/mL, 그 이후 나머지 배양에는 10 ㎍/mL 이하). 49일간 유지함.
C: X-VIVOTM 10 + FGF(40 ng/mL) + Flt-3(75 ng/mL). 11일간 유지함.
D: X-VIVOTM 10 + FGF(40 ng/mL) + Flt-3(75 ng/mL) + 라미닌(개시에는 33 ㎍/mL, 그 후 나머지 배양에는 10 ㎍/mL 이하). 11일간 유지함.
배양 기간에 걸친 세포수를 하기의 표에 기재한다.
배양 일수 |
배지 A (105 세포/mL) |
배지 B (105 세포/mL) |
배지 C (105 세포/mL) |
배지 D (105 세포/mL) |
0 1 3 11 32 98 |
5.0 (세지 않음) 5.9 2.7 0.3 14 |
5.0 7.5 5.0 2.3 0.15 - |
5.0 6.9 2.8 2.5 - - |
5.0 7.3 2.8 2.4 - - |
세포가 미분화된 표현형을 유지하였는지 여부를 확인하기 위해, 배지 A에서 4 주간 배양된 세포를, bFGF를 함유하는 mEF 조절 배지 중 Matrigel® 위에 다시 플레이팅하였다.
도 7은 그 결과를 도시한다. 계대 배양 후, 현탁 배양으로부터 유도된 세포는 성장하고 특징적인 미분화 hES 세포 콜로니를 나타내는 것으로 보였다.
이 데이터들은 hES 세포가 3 개월 이상 동안(잠재적으로는 배양물이 완전히 확립된 후에는 3∼40 배 증대될 수 있음) 현탁 배양으로 유지될 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: 신선한 배지를 사용하는 현탁 배양
다음의 실험은, 현탁 배양에서 신선한 (비조절) 배지와 함께 사용하는 대안 첨가제를 평가한다.
hES 세포는 표준 조건(6-웰 평판에 2 ㎍/cm2으로 코팅된, Sigma로부터의 인간 라미닌의 기재; 80 ng/mL bFGF 및 0.5 ng/mL TGFβ1을 함유하는 X-VIVO 10TM 배지) 하에 신선한 배지 중 표면 배양물로부터 회수한다. 회수된 세포는, 5 × 105 세포/mL 이하의 초기 밀도로 플라스크당 50 mL를 사용하여, 100 mL 스피너 플라스크에서 현탁 배양으로 계대 배양한다. 하기의 배지 대체물을 평가한다:
1) X-VIVOTM 10 + bFGF(80 ng/mL)
2) X-VIVOTM 10 + bFGF(80 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL)
3) X-VIVOTM 10 + bFGF(40 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL)
4) X-VIVOTM 10 + bFGF(80 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL) + 10 ㎍/mL 인간 라미닌
5) X-VIVOTM 10 + bFGF(80 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL) + 50 ㎍/mL 인간 혈청 알부민
각각의 스피너 플라스크를, 37℃ CO2 배양기 내의 Bellco 캐리어 자석 교반기(미국 뉴저지주 Vineland 소재의 Bellco Biotechnology사) 위에, 20 rpm까지의 초기 교반 속도로 둔다. 교반 속도는, 전단력을 최소로 하면서 세포가 현탁 상태를 유지하도록 조절하고 충분한 통기를 제공한다. 배지를 전과 같이 2∼3일 마다 교체하고, 세포수를 모니터링하며, 플라스크를 필요한 만큼 분할한다.
규칙적인 간격으로, 세포를 각각의 플라스크로부터 샘플링하고, 라미닌 코팅된 표면에 다시 플레이팅하여 형태를 평가한다. 표면 배양물로 되돌아온 세포 및 현탁 배양으로부터 직접 취한 세포는, 실시예 3에서와 같이, EB 유도된 세포의 면역 세포 화학적 염색에 의해 다능성에 대해서 시험한다.
상기에 설명한 조성물 및 절차는, 청구된 본 발명 및 그의 등가물에서 벗어남 없이 유효하게 변형할 수 있다.
Claims (12)
- 인간 배아 줄기(human Embryonic Stem; hES) 세포의 현탁 배양물로서, hES 세포는 고체 기재 상에서 증식하는 것이 아니고, 현탁액 내에서 실질적으로 미분화 상태로 유지되고 증식하는 것인 배양물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포 성장 인자를 40 ng/mL 이상의 농도로 함유하는 배지에서 배양되는 것인 배양물.
- 제2항에 있어서, 상기 배지는 변형성 성장 인자 베타(Transforming Growth Factor beta; TGFβ), 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor; SCF) 또는 Flt3 리간드(Flt3L)를 더 함유하는 것인 배양물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 1 종 이상의 가용성 세포외 매트릭스 성분을 함유하는 배지에서 배양되는 것인 배양물.
- 제4항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스 성분은 인간 라미닌, 인간 피브로넥틴, 또는 인간 라미닌과 인간 피브로넥틴을 포함하는 것인 배양물.
- hES 세포를 현탁 배양하고 증식시키기 위한 키트로서, 상기 hES 세포는 고체 기재 상에서 증식하는 것이 아니고, 상기 키트는 40 ng/mL 이상의 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 영양 배지를 포함하는 것인 키트.
- 제6항에 있어서, 배지에 첨가하기 위한 세포외 매트릭스 성분을 더 포함하는 키트.
- hES 세포를 현탁 배양하고 증식시키기 위한 용기로서, 상기 hES 세포는 고체 기재 상에서 증식하는 것이 아니고, 상기 용기는 40 ng/mL 이상의 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 영양 배지를 포함하는 것인 용기.
- 제8항에 있어서, 배지에 첨가하기 위한 세포외 매트릭스 성분을 더 포함하는 용기.
- 제2항에 있어서, 상기 세포가 40 ng/mL∼1,000 ng/mL의 농도 범위로 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 배지에서 배양되는 것인 배양물.
- 제6항에 있어서, 상기 영양 배지가 40 ng/mL∼1,000 ng/mL의 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 것인 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 영양 배지가 40 ng/mL∼1,000 ng/mL의 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 것인 용기.
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US8372643B2 (en) | 2007-12-06 | 2013-02-12 | Agency For Science, Technology And Research | Method for extracellular matrix mediated differentiation and proliferation of stem cells |
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US8093053B2 (en) | 2008-03-17 | 2012-01-10 | Uti Limited Partnership | Methods and compositions for culturing of neural precursor cells |
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US8716018B2 (en) * | 2008-03-17 | 2014-05-06 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
GB2460552B (en) * | 2008-06-05 | 2011-09-07 | Iti Scotland Ltd | Stem cell culture media and methods |
PL2942392T3 (pl) | 2008-06-30 | 2019-02-28 | Janssen Biotech, Inc | Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych |
US20100120142A1 (en) | 2008-07-11 | 2010-05-13 | Suomen Punainen Risti Veripalvelu | Culture of human embryonic cells |
EP2346988B1 (en) | 2008-10-31 | 2017-05-31 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
MX349178B (es) | 2008-10-31 | 2017-07-17 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciación de células madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreático. |
CA2907326A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Chad Green | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
US8895300B2 (en) | 2008-11-04 | 2014-11-25 | Viacyte, Inc. | Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof |
MX2011005289A (es) | 2008-11-20 | 2011-06-01 | Centocor Ortho Biotech Inc | Metodos y composiciones para union y cultivo celular sobre sustratos planares. |
KR101774546B1 (ko) | 2008-11-20 | 2017-09-04 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양 |
EP2456862A4 (en) | 2009-07-20 | 2013-02-27 | Janssen Biotech Inc | DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
EP2499236B1 (en) * | 2009-11-12 | 2020-01-01 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state |
RU2701335C2 (ru) | 2009-12-23 | 2019-09-25 | Янссен Байотек, Инк. | Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета |
SG183535A1 (en) | 2010-03-01 | 2012-10-30 | Janssen Biotech Inc | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
CN102933704A (zh) | 2010-04-08 | 2013-02-13 | 爱丁堡大学管理处 | 软骨祖细胞、用于细胞衍生的方案和其用途 |
EP2569419B1 (en) | 2010-05-12 | 2019-03-20 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
JP5876045B2 (ja) | 2010-07-12 | 2016-03-02 | ユニバーシティー オブ サザン カリフォルニア | 幹細胞と標的組織の相互接続を促進する生体適合性基材およびそれを埋め込む方法 |
EP3372672A1 (en) | 2010-08-31 | 2018-09-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9181528B2 (en) | 2010-08-31 | 2015-11-10 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
EP2611910B1 (en) | 2010-08-31 | 2018-01-17 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
CN102212460B (zh) * | 2011-04-27 | 2013-06-05 | 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 | 干细胞筛选系统、其制备方法及干细胞的筛选方法 |
US8877489B2 (en) | 2011-12-05 | 2014-11-04 | California Institute Of Technology | Ultrathin parylene-C semipermeable membranes for biomedical applications |
WO2012149468A2 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | University Of Southern California | Instruments and methods for the implantation of cell-seeded substrates |
EP2784153B1 (en) | 2011-11-25 | 2018-01-03 | Kyoto University | Method for culturing pluripotent stem cell |
US9248013B2 (en) | 2011-12-05 | 2016-02-02 | California Institute Of Technology | 3-Dimensional parylene scaffold cage |
MX2014007744A (es) | 2011-12-22 | 2015-01-12 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionicas humanas en celulas individuales positivas de insulina hormonal. |
SG11201405052RA (en) | 2012-03-07 | 2014-10-30 | Janssen Biotech Inc | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
CA2875786C (en) | 2012-06-08 | 2022-12-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells |
RU2665793C2 (ru) * | 2012-07-24 | 2018-09-04 | Ниссан Кемикал Индастриз, Лтд. | Композиция культуральной среды и способ культивирования клетки или ткани с использованием указанной композиции |
USD1009775S1 (en) | 2014-10-15 | 2024-01-02 | Maxeon Solar Pte. Ltd. | Solar panel |
USD933584S1 (en) | 2012-11-08 | 2021-10-19 | Sunpower Corporation | Solar panel |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
US10138465B2 (en) | 2012-12-31 | 2018-11-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using HB9 regulators |
EP2938722B1 (en) | 2012-12-31 | 2021-12-08 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells |
CN105008518B (zh) | 2012-12-31 | 2020-08-07 | 詹森生物科技公司 | 在空气-液体界面处培养人胚胎干细胞以用于分化成胰腺内分泌细胞 |
WO2014136581A1 (ja) | 2013-03-06 | 2014-09-12 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞の培養システム及び多能性幹細胞の継代方法 |
KR102232650B1 (ko) | 2013-06-11 | 2021-03-29 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법 |
JP2014036660A (ja) * | 2013-10-09 | 2014-02-27 | Viacyte Inc | 幹細胞集合体懸濁液組成物、その分化方法 |
KR102162138B1 (ko) | 2014-05-16 | 2020-10-06 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 췌장 내분비 세포에서 mafa 발현을 향상시키기 위한 소분자의 용도 |
USD896747S1 (en) | 2014-10-15 | 2020-09-22 | Sunpower Corporation | Solar panel |
USD933585S1 (en) | 2014-10-15 | 2021-10-19 | Sunpower Corporation | Solar panel |
USD999723S1 (en) | 2014-10-15 | 2023-09-26 | Sunpower Corporation | Solar panel |
USD913210S1 (en) | 2014-10-15 | 2021-03-16 | Sunpower Corporation | Solar panel |
WO2016088243A1 (ja) * | 2014-12-05 | 2016-06-09 | 株式会社ニコン | 判定装置、観察システム、観察方法、そのプログラム、細胞の製造方法、および細胞 |
US10443042B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-10-15 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
DK3234110T3 (da) | 2014-12-18 | 2024-05-13 | Harvard College | FREMGANGSMÅDER TIL GENERERING AF STAMCELLE-AFLEDTE ß-CELLER OG ANVENDELSER DERAF |
US10253298B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-04-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof |
JPWO2016104541A1 (ja) * | 2014-12-24 | 2017-10-05 | 国立大学法人京都大学 | 内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイス |
US9944894B2 (en) | 2015-01-16 | 2018-04-17 | General Electric Company | Pluripotent stem cell expansion and passage using a rocking platform bioreactor |
MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
WO2019099725A1 (en) | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Semma Therapeutics, Inc. | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
WO2019181999A1 (ja) * | 2018-03-20 | 2019-09-26 | 富士フイルム株式会社 | 多能性幹細胞を三次元培養する方法 |
AU2019320072A1 (en) | 2018-08-10 | 2021-02-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
CN110257332A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-09-20 | 广东省赛莱拉干细胞研究院 | 一种诱导间充质干细胞分化成为多巴胺能神经元的培养基以及方法 |
JP2022158092A (ja) * | 2019-08-20 | 2022-10-17 | 昭和電工マテリアルズ株式会社 | 馴化細胞作製方法 |
US11001810B1 (en) | 2019-11-11 | 2021-05-11 | Lancell AB | Serum-free human pluripotent stem cell culture medium |
US20230116083A1 (en) * | 2020-03-10 | 2023-04-13 | Life & Brain Gmbh | Up-scaled production of microglia-like/-precursor cells and macrophage cells using mesh macrocarriers |
CN111808807B (zh) * | 2020-07-21 | 2021-07-30 | 生物岛实验室 | 一种无需预先包被的间充质干细胞无血清培养基及其应用 |
CN113249303B (zh) * | 2021-05-07 | 2022-07-29 | 华中农业大学 | 血管内皮细胞生长因子在促进鸡原始生殖细胞增殖和迁移中的应用 |
Family Cites Families (61)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US264713A (en) | 1882-09-19 | Neck-strap buckle and rein-ring | ||
US17589A (en) | 1857-06-16 | Improvement in bending sheet-metal pans | ||
JP2740320B2 (ja) * | 1988-08-04 | 1998-04-15 | アムラド・コーポレイション・リミテッド | 胚幹細胞のインビトロ増殖 |
US5332672A (en) * | 1991-12-02 | 1994-07-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Prevention of ES cell differentiation by ciliary neurotrophic factor |
AU6136394A (en) | 1992-10-06 | 1994-04-26 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Long-term proliferation of primordial germ cells |
US5453357A (en) * | 1992-10-08 | 1995-09-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
US7153684B1 (en) * | 1992-10-08 | 2006-12-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
GB9308271D0 (en) | 1993-04-21 | 1993-06-02 | Univ Edinburgh | Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method |
US5405772A (en) * | 1993-06-18 | 1995-04-11 | Amgen Inc. | Medium for long-term proliferation and development of cells |
US5583016A (en) * | 1994-07-07 | 1996-12-10 | Geron Corporation | Mammalian telomerase |
US5914268A (en) * | 1994-11-21 | 1999-06-22 | National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine | Embryonic cell populations and methods to isolate such populations |
US5874301A (en) | 1994-11-21 | 1999-02-23 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine | Embryonic cell populations and methods to isolate such populations |
US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
WO1997018298A1 (en) * | 1995-11-14 | 1997-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Ex vivo culture of stem cells |
AU3392697A (en) | 1996-06-14 | 1998-01-07 | Regents Of The University Of California, The | (in vitro) derivation and culture of primate pluripotent stem cells and therapeutic uses thereof |
WO1998030678A1 (en) | 1997-01-07 | 1998-07-16 | Steindler Dennis A | Isolated mammalian neural stem cells, methods of making such cells, and methods of using such cells |
WO1998030679A1 (en) | 1997-01-10 | 1998-07-16 | Life Technologies, Inc. | Embryonic stem cell serum replacement |
US6331406B1 (en) | 1997-03-31 | 2001-12-18 | The John Hopkins University School Of Medicine | Human enbryonic germ cell and methods of use |
US6090622A (en) | 1997-03-31 | 2000-07-18 | The Johns Hopkins School Of Medicine | Human embryonic pluripotent germ cells |
US5922567A (en) | 1997-06-03 | 1999-07-13 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Two new human DNAJ-like proteins |
US5968829A (en) * | 1997-09-05 | 1999-10-19 | Cytotherapeutics, Inc. | Human CNS neural stem cells |
US6800480B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-10-05 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
EP1056468A1 (en) | 1998-02-19 | 2000-12-06 | University Of Southern California | Method of promoting embryonic stem cell proliferation |
WO1999043785A1 (en) | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Medical College Of Hampton Roads | Derivation of cells and tissues from embryonic pre-stem cells for transplantation therapies |
JP4709382B2 (ja) | 1998-09-22 | 2011-06-22 | ニューラルステム バイオファーマシューティカルズ、リミテッド | 安定な神経幹細胞系 |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7413904B2 (en) * | 1998-10-23 | 2008-08-19 | Geron Corporation | Human embryonic stem cells having genetic modifications |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
WO2000027995A1 (en) * | 1998-11-09 | 2000-05-18 | Monash University | Embryonic stem cells |
US6280718B1 (en) | 1999-11-08 | 2001-08-28 | Wisconsin Alumni Reasearch Foundation | Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells |
US7455983B2 (en) * | 2000-01-11 | 2008-11-25 | Geron Corporation | Medium for growing human embryonic stem cells |
EP1254211A4 (en) | 2000-01-14 | 2003-07-16 | Bresagen Ltd | PRODUCTION OF CELLS |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
US7473555B2 (en) * | 2000-04-27 | 2009-01-06 | Geron Corporation | Protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
US7250294B2 (en) | 2000-05-17 | 2007-07-31 | Geron Corporation | Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells |
JP5943533B2 (ja) | 2000-05-17 | 2016-07-06 | アステリアス バイオセラピューティクス インコーポレイテッド | 神経前駆細胞の集団 |
US6576464B2 (en) * | 2000-11-27 | 2003-06-10 | Geron Corporation | Methods for providing differentiated stem cells |
GB2392674B (en) | 2001-07-06 | 2005-08-10 | Geron Corp | Mesenchymal cells and osteoblasts from human embryonic stem cell |
KR20040022448A (ko) | 2001-07-12 | 2004-03-12 | 제론 코포레이션 | 인간 다분화능 줄기 세포로부터 제조된 심근 세포 계통의세포 |
RU2291703C2 (ru) * | 2001-08-23 | 2007-01-20 | Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт., Лтд | ВЫДЕЛЕНИЕ ВНУТРЕННЕЙ КЛЕТОЧНОЙ МАССЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА (hESC) |
JP4148897B2 (ja) | 2001-10-31 | 2008-09-10 | 旭化成株式会社 | 胚性幹細胞培養用基材および培養方法 |
JP4666567B2 (ja) | 2001-12-07 | 2011-04-06 | ジェロン・コーポレーション | ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞 |
KR100973453B1 (ko) | 2001-12-07 | 2010-08-02 | 제론 코포레이션 | 인간 배아 줄기 세포에서 유래되는 연골세포 전구체 |
CN1630716A (zh) * | 2001-12-07 | 2005-06-22 | 杰龙公司 | 人胚胎干细胞衍生的造血细胞 |
US20030113910A1 (en) | 2001-12-18 | 2003-06-19 | Mike Levanduski | Pluripotent stem cells derived without the use of embryos or fetal tissue |
US7285415B2 (en) | 2002-07-11 | 2007-10-23 | The Regents Of The University Of California | Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury |
CN1483817A (zh) * | 2002-09-18 | 2004-03-24 | 李建远 | 一种克隆无动物成分的人胚胎干细胞的方法 |
AU2003303071B2 (en) * | 2002-12-16 | 2009-04-23 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Methods of preparing feeder cells-free, xeno-free human embryonic stem cells and stem cell cultures prepared using same |
CN1424394A (zh) * | 2003-01-08 | 2003-06-18 | 中山大学附属第二医院 | 人胚胎干细胞系建立的方法 |
US20030224411A1 (en) | 2003-03-13 | 2003-12-04 | Stanton Lawrence W. | Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells |
US7727762B2 (en) | 2003-10-03 | 2010-06-01 | Keiichi Fukuda | Method of inducing the differentiation of stem cells into myocardial cells |
CN100376670C (zh) * | 2003-12-10 | 2008-03-26 | 财团法人工业技术研究院 | 人类胚干细胞的培养系统及其培养方法 |
WO2005065354A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
EP1725654B1 (en) | 2004-03-19 | 2019-05-01 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Method for making high purity cardiomyocyte preparations suitable for regenerative medicine |
DE102004043256B4 (de) * | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
EP1844136B1 (en) * | 2004-12-29 | 2014-08-27 | Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. | Stem cells culture systems |
DE102005009751A1 (de) | 2005-03-03 | 2006-09-07 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von S-Adenosyl-Methionin |
GB2441488C (en) * | 2005-06-22 | 2011-10-05 | Geron Corp | Suspension culture of human embryonic stem cells |
GB2454386B (en) | 2006-07-06 | 2011-07-06 | Es Cell Int Pte Ltd | Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface |
DK3441459T3 (da) | 2006-08-02 | 2021-06-07 | Technion Res & Dev Foundation | Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur |
-
2006
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