WO2016088243A1 - 判定装置、観察システム、観察方法、そのプログラム、細胞の製造方法、および細胞 - Google Patents

判定装置、観察システム、観察方法、そのプログラム、細胞の製造方法、および細胞 Download PDF

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WO2016088243A1
WO2016088243A1 PCT/JP2014/082221 JP2014082221W WO2016088243A1 WO 2016088243 A1 WO2016088243 A1 WO 2016088243A1 JP 2014082221 W JP2014082221 W JP 2014082221W WO 2016088243 A1 WO2016088243 A1 WO 2016088243A1
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WO
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cell
image
nucleus
cells
undifferentiated
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Application number
PCT/JP2014/082221
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English (en)
French (fr)
Inventor
泰次郎 清田
宏昭 紀伊
美保 古江
三佳 菅
Original Assignee
株式会社ニコン
独立行政法人医薬基盤研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters

Definitions

  • the present invention relates to a determination apparatus, an observation system, an observation method, a program thereof, a cell manufacturing method, and a cell.
  • techniques for evaluating the culture state of cells are fundamental techniques in a wide range of fields including advanced medical fields such as regenerative medicine and drug screening.
  • advanced medical fields such as regenerative medicine and drug screening.
  • regenerative medicine there is a process for growing and differentiating cells in vitro. And in said process, in order to manage the success or failure of cell differentiation, the canceration of a cell, and the presence or absence of infection, it is indispensable to evaluate the culture state of a cell exactly.
  • a cancer cell evaluation method using a transcription factor as a marker has been disclosed (see Patent Document 1).
  • Stem cells such as ES (Embryonic Stem) cells or iPS (induced Pluripotent Stem) cells are theoretically infinite while maintaining the differentiation pluripotency that differentiates into almost any tissue. Because it can be proliferated, attention has been focused on pharmaceutical development and application to regenerative medicine.
  • ES Embryonic Stem
  • iPS induced Pluripotent Stem
  • the condition is good (cells that maintain an undifferentiated state, have few spontaneously differentiated cells, or have abnormal growth) It is necessary to cultivate stem cells, and the state of the stem cells during culturing must be accurately determined. Judgment is required.
  • conventionally since the culture state of the stem cell has been determined visually by a researcher, there has been a problem that the determination accuracy of the culture state cannot be improved.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and a determination device, an observation system, an observation method, a program thereof, a cell manufacturing method, and a method thereof capable of improving the determination accuracy of the state of a stem cell It is an object to provide a cell produced by the production method.
  • an aspect of the present invention provides a determination unit that determines whether or not the cell is undifferentiated based on morphological information of a cell nucleus or a cell nucleus-cytoplasm ratio in a captured cell image. It is a determination apparatus characterized by comprising.
  • one embodiment of the present invention is an observation system including an imaging unit that images a cell in culture and generates a cell image of the cell, and the above-described determination device.
  • one embodiment of the present invention shows an imaging procedure for imaging a cell in culture to generate a cell image of the cell, and the cell image captured by the imaging procedure. And a determination procedure for determining whether or not the cell is undifferentiated based on morphological information of the cell nucleus or cytoplasm-cytoplasm ratio.
  • an embodiment of the present invention provides a computer with an imaging procedure for imaging a cell in culture and generating a cell image of the cell, and a cell in the captured cell image.
  • This is a program for executing a determination procedure for determining whether or not the cell is undifferentiated based on nuclear morphology information or cell nucleus-cytoplasm ratio.
  • one embodiment of the present invention provides an imaging procedure for imaging a cell in culture to generate a cell image of the cell, and a form of a cell nucleus in the captured cell image And a determination procedure for determining whether or not the cell is undifferentiated based on information or a cell nucleus-cytoplasm ratio.
  • one embodiment of the present invention is a cell manufactured by the above-described cell manufacturing method.
  • the accuracy of determining the state of stem cells can be improved.
  • FIG. 1 is a block diagram showing an example of the configuration of an incubator 11 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram illustrating an example of the configuration of the control device 41 included in the incubator 11 according to the present embodiment.
  • FIG. 3, FIG. 4 is the front view and top view of the incubator 11 of this embodiment.
  • the incubator 11 is an apparatus for culturing cells and observing the state of the cells by imaging the cultured cells with a microscope camera.
  • the incubator 11 has an upper casing 12 and a lower casing 13. In the assembled state of the incubator 11, the upper casing 12 is placed on the lower casing 13. Note that the internal space between the upper casing 12 and the lower casing 13 is vertically divided by a base plate 14.
  • the temperature-controlled room 15 includes a temperature adjusting device 15a and a humidity adjusting device 15b, and the temperature-controlled room 15 is maintained in an environment suitable for cell culture (for example, an atmosphere having a temperature of 37 ° C. and a humidity of 90%) ( In addition, illustration of the temperature adjusting device 15a and the humidity adjusting device 15b in FIGS. 3 and 4 is omitted).
  • a large door 16, a middle door 17, and a small door 18 are arranged in front of the temperature-controlled room 15.
  • the large door 16 covers the front surfaces of the upper casing 12 and the lower casing 13.
  • the middle door 17 covers the front surface of the upper casing 12 and isolates the environment between the temperature-controlled room 15 and the outside when the large door 16 is opened.
  • the small door 18 is a door for carrying in and out a culture vessel 19 for culturing cells, and is attached to the middle door 17. It is possible to suppress environmental changes in the temperature-controlled room 15 by carrying the culture container 19 in and out of the small door 18.
  • the large door 16, the middle door 17, and the small door 18 are maintained airtight by the packings P1, P2, and P3, respectively.
  • a stocker 21, an observation unit 22, a container transport device 23, and a transport base 24 are arranged in the temperature-controlled room 15, a stocker 21, an observation unit 22, a container transport device 23, and a transport base 24 are arranged.
  • the conveyance stand 24 is disposed in front of the small door 18, and carries the culture container 19 in and out of the small door 18.
  • the stocker 21 is disposed on the left side of the temperature-controlled room 15 when viewed from the front surface of the upper casing 12 (the lower side in FIG. 4).
  • the stocker 21 has a plurality of shelves, and each shelf of the stocker 21 can store a plurality of culture vessels 19.
  • Each culture container 19 contains cells to be cultured together with a medium.
  • the stocker 21 is not essential.
  • the observation unit 22 is arranged on the right side of the temperature-controlled room 15 when viewed from the front of the upper casing 12.
  • the observation unit 22 can execute time-lapse observation of cells in the culture vessel 19.
  • the observation unit 22 is fitted into the opening of the base plate 14 of the upper casing 12 and arranged.
  • the observation unit 22 includes a sample table 31, a stand arm 32 for arranging an illumination light source protruding above the sample table 31, and a main body portion 33 incorporating an observation optical system and an imaging device 34.
  • the sample stage 31 and the stand arm 32 are disposed in the temperature-controlled room 15, while the main body portion 33 is accommodated in the lower casing 13.
  • the sample stage 31 is made of a translucent material, and the culture vessel 19 can be placed thereon.
  • the sample stage 31 is configured to be movable in the horizontal direction, and the position of the culture vessel 19 placed on the upper surface can be adjusted.
  • the stand arm 32 includes an LED light source 39.
  • the imaging device 34 can acquire the microscope image (phase contrast image) of a cell by imaging the cell of the culture container 19 permeate
  • the container transport device 23 is disposed in the center of the temperature-controlled room 15 when viewed from the front surface of the upper casing 12.
  • the container transport device 23 delivers the culture container 19 between the stocker 21, the sample table 31 of the observation unit 22, and the transport table 24.
  • the container transport device 23 is also unnecessary.
  • the container transport device 23 includes a vertical robot 38 having an articulated arm, a rotary stage 35, a mini stage 36, and an arm unit 37.
  • the rotary stage 35 is attached to the tip of the vertical robot 38 so as to be capable of rotating 180 ° in the horizontal direction via a rotary shaft 35a. Therefore, the rotary stage 35 can make the arm portions 37 face the stocker 21, the sample table 31, and the transport table 24.
  • mini stage 36 is attached to the rotary stage 35 so as to be slidable in the horizontal direction.
  • An arm part 37 that holds the culture vessel 19 is attached to the mini stage 36.
  • the control device 41 is connected to the temperature adjustment device 15a, the humidity adjustment device 15b, the observation unit 22 and the container transport device 23, respectively.
  • the control device 41 comprehensively controls each part of the incubator 11 according to a predetermined program.
  • control device 41 controls the temperature adjustment device 15a and the humidity adjustment device 15b, respectively, to maintain the inside of the temperature-controlled room 15 at a predetermined environmental condition.
  • the control device 41 controls the observation unit 22 and the container transport device 23 based on a predetermined observation schedule, and automatically executes the observation sequence of the culture vessel 19. Furthermore, the control device 41 executes a culture state evaluation process for evaluating the culture state of the cells based on the image acquired in the observation sequence.
  • FIG. 5 is a schematic diagram illustrating an example of a phase difference image in which cells Cel are imaged.
  • the image acquired by the observation sequence includes an image of the cell Cel (hereinafter also simply referred to as the cell Cel).
  • the cell Cel includes a cell nucleus Nuc (hereinafter also simply referred to as a nucleus Nuc) and a cytoplasm Cyp.
  • a method for discriminating the cell nucleus Nuc and the cytoplasm Cyp from the phase difference image obtained by imaging the cell Cel for example, a known method for discriminating based on the difference in luminance can be used.
  • a method for discriminating based on a fluorescent image for example, there is a method in which cell nuclei Nuc and cytoplasm Cyp are stained with different colors, and regions of the respective colors are discriminated. Also. A known method for discriminating from the feature or size of the form of each stained region can be used. After discriminating the cell nucleus Nuc and cytoplasm Cyp by such a known method, the area of each region is measured. As a method for measuring the area of the cell nucleus Nuc and cytoplasm Cyp, a known area measuring method can be used. For example, the area can be calculated based on the number of pixels of the image sensor.
  • the C / N ratio of the cell Cel is expressed by the following equation: It is given by (1).
  • the area Sy of the cytoplasm Cyp is the area obtained by subtracting the area Sn of the image of the nucleus Nuc from the area Sc of the image of the cell Cel.
  • the cytoplasm Cyp may be calculated assuming that the region is equal to the cell Cel that does not exclude the nucleus Nuc. That is, when determining the cytoplasmic Cyp region, it is possible to appropriately determine whether the region within the cell Cel is assumed to be a region excluding or including the nucleus Nuc.
  • the C / N ratio is smaller than when the area Sn of the nucleus Nuc is relatively small.
  • stem cells such as ES cells and iPS cells maintain an undifferentiated state without being differentiated, they exhibit a typical form. Moreover, a typical form may be exhibited immediately after sowing even if it is not a typical form as the number of days of culture passes. This is expressed as a mature colony.
  • the typical form of the undifferentiated state has a slightly rounded shape, and the boundary with adjacent cells is packed so tight that it cannot be distinguished under a phase contrast microscope.
  • the cells immediately after seeding do not exhibit a typical undifferentiated state, although they are not differentiated, and have a slightly flat cytoplasm.
  • This state is a state where the colony matures (or matures) as described above. Some cell lines exhibit a typical undifferentiated state even immediately after sowing.
  • the C / N ratio is smaller than when differentiated. Therefore, the C / N ratio is calculated based on the image of the cell Cel, and the calculated C / N ratio is compared with a predetermined threshold value (described later), so that the stem cells mature without differentiation. Can be determined.
  • the predetermined threshold value of the C / N ratio is based on the C / N ratio when the cell Cel is matured without differentiation and the C / N ratio when the cell Cel is differentiated. This is a threshold value to be determined.
  • Stem cells are characterized by a small ratio between the major axis a and the minor axis b of the nucleus Nuc when they are mature without differentiation, compared to when they are differentiated.
  • the longitudinal direction is referred to as the major axis a of the nucleus Nuc
  • the shorter direction is referred to as the minor axis b of the nucleus Nuc.
  • a ratio between the major axis a and the minor axis b (hereinafter, also referred to as a major / short ratio of the nucleus Nuc, or simply referred to as a major / short ratio) is calculated, and the calculated major axis a and minor axis are calculated.
  • the predetermined threshold is the ratio of the major axis a and the minor axis b when the cell Cel is matured without differentiation, and the major axis a and the minor axis b when the cell Cel is differentiated.
  • the threshold value is determined based on the ratio of.
  • Each distance between the major axis “a” and the minor axis “b” can be measured by using, for example, a two-point distance measuring technique using the number of pixels of the image sensor.
  • the predetermined threshold value of the length ratio of the nucleus Nuc may be different for each cell line of the cell Cel.
  • a predetermined threshold value of the long / short ratio is determined in advance, and the cell Cel of the determination target cell Cel is selected from the predetermined threshold values. Differentiation / undifferentiation is determined by selecting a threshold value.
  • a predetermined threshold value of a long / short ratio can be determined for this cell line. More specifically, for a cell Cel colon derived from a certain cell line, among the cells Cel contained in this colony, the differentiated cell Cel is green, and the cell is not differentiated (undifferentiated). Cel is fluorescently stained red. By observing this fluorescently-stained cell Cel image and determining the length-to-short ratio of the differentiated region and the length-to-short ratio of the undifferentiated region, the threshold of the length-to-short ratio for a cell line can be determined. Ask.
  • a threshold value of the long / short ratio can be obtained for each cell line. Also, images from phase difference observation are used.
  • the nucleus Nuc may be specified based on the luminance value, and an image for obtaining the threshold value of the long / short ratio may be acquired.
  • the differentiation / undifferentiation of the cell Cel is determined based on the ratio between the major axis a and the minor axis b of the nucleus Nuc
  • the present invention is not limited thereto.
  • the differentiation / undifferentiation of the cell Cel can also be determined based on the diameter, the major axis, or the minor axis of the nucleus Nuc. Also in this case, the determination is made by comparing the value of the nucleus Nuc, the major axis, or the minor axis for determining differentiation / undifferentiation with a threshold value measured in advance.
  • the predetermined threshold value of the C / N ratio may differ depending on the cell line of the cell Cel or the culture conditions (culture substrate, container type, medium type, etc.). In this case, a predetermined threshold value of the C / N ratio is determined in advance for each cell line of the cell Cel, and the cell line of the determination target cell Cel is selected from the predetermined threshold value. Differentiation / undifferentiation is determined by selecting a corresponding threshold value. Thereby, compared with the case where the predetermined
  • a predetermined threshold value of the C / N ratio can be determined for this cell line by fluorescently staining a cell Cel derived from a certain cell line. More specifically, for a cell Cel colon derived from a certain cell line, among the cells Cel contained in this colony, the differentiated cell Cel is green, and the cell is not differentiated (undifferentiated). Cel is fluorescently stained red. By observing this fluorescently-stained cell Cel image and determining the C / N ratio of the differentiated region and the C / N ratio of the undifferentiated region, the C / N for a certain cell line is obtained. Find the ratio threshold. By repeatedly applying this procedure for each cell line, the threshold of the C / N ratio can be obtained for each cell line.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of a cell Cel that has matured without differentiation.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an example of differentiated cells Cel.
  • a stem cell has a feature that when it is matured without differentiation, the density of cells Cel contained in the colony (particularly, the density of the nucleus Nuc) is larger than when it is differentiated.
  • the density of the nucleus Nuc contained in the colony is represented by the internuclear distance Dn between adjacent or nearby cells Cel.
  • the colony Col1 includes a plurality of cells Cel including the cells Cel11 to Cel14.
  • the area of the nucleus Nuc11 is the area Sn11
  • the area of the cytoplasm Cyp11 is the area Sy11.
  • the area of the nucleus Nuc12 is the area Sn12
  • the area of the cytoplasm Cyp12 is the area Sy12.
  • the area of the nucleus Nuc13 is the area Sn13
  • the area of the cytoplasm Cyp13 is the area Sy13.
  • the area of the nucleus Nuc14 is the area Sn14, and the area of the cytoplasm Cyp14 is the area Sy14.
  • the distance between the nucleus Nuc11 of the cell Cel11 and the nucleus Nuc12 of the cell Cel12 adjacent to the cell Cel11 is an internuclear distance Dn1.
  • the internuclear distance Dn1 is obtained as the distance between the centroid G11 in the image of the nucleus Nuc11 and the centroid G12 in the image of the nucleus Nuc12.
  • the center of gravity of the nucleus Nuc is calculated based on the determined nucleus Nuc by determining the region of the nucleus Nuc by the method described above, for example.
  • the distance between the centroids can be measured by using, for example, a technique for measuring a distance between two points using the number of pixels of the image sensor.
  • the colony Col2 includes a plurality of cells Cel including the cells Cel21 to Cel24.
  • the area of the nucleus Nuc21 is the area Sn21
  • the area of the cytoplasm Cyp21 is the area Sy21.
  • the area of the nucleus Nuc22 is the area Sn22
  • the area of the cytoplasm Cyp22 is the area Sy22.
  • the area of the nucleus Nuc23 is the area Sn23
  • the area of the cytoplasm Cyp23 is the area Sy23.
  • the area of the nucleus Nuc24 is the area Sn24, and the area of the cytoplasm Cyp24 is the area Sy24.
  • the distance between the nucleus Nuc21 of the cell Cel21 and the nucleus Nuc22 of the cell Cel22 adjacent to the cell Cel21 is an internuclear distance Dn2.
  • the internuclear distance Dn2 is obtained as a distance between the center of gravity G21 in the image of the nucleus Nuc21 and the center of gravity G22 in the image of the nucleus Nuc22.
  • FIG. 6 when the stem cell is matured without differentiation like the colony Col1 shown in FIG. 6, the stem cell is differentiated like the colony Col2 shown in FIG.
  • the C / N ratio is small compared to the case where the That is, as in the case of the colon Col1, when the stem cell is matured without being differentiated, the area Sn11 of the nucleus Nuc11 is larger than the area Sy11 of the cytoplasm Cyp. Therefore, the internuclear distance Dn1 when not differentiated is smaller than the internuclear distance Dn2 when differentiated.
  • nuclei Nuc the distance between the nuclei Nuc of other cells Cel adjacent to (or in the vicinity of) a certain cell Cel, differentiation / undifferentiation can be determined for a certain region of the colony.
  • the nucleus Nuc must always exist in the captured image used when the determination of the present invention is performed. For example, cell colonies of stem cells such as ES cells and iPS cells increase so that each cell spreads substantially on the bottom (in the XY direction) on the bottom of the culture vessel. The nucleus Nuc exists near the center of the cell Cel.
  • an image including the nucleus Nuc for example, information on the position (Z direction) of the known nucleus Nuc for each cell line is stored in advance, and imaging is performed while focusing on the stored Z position. It is possible. Also, an image obtained by shifting the imaging position in the Z direction is acquired for one or a plurality of cells, the position of the nucleus Nuc in the Z direction is detected, and an image is acquired at the detected position. Also good. Further, the morphological features of the nucleus Nuc may be automatically determined, and an image may be acquired based on the determined nucleus Nuc.
  • an image by phase difference observation is acquired while shifting the observation position in the Z direction, the position of the nucleus Nuc is determined based on the luminance information of the captured image, and based on this, the position at the Z position where the nucleus Nuc can be imaged is determined.
  • Image acquisition may be performed. According to this method, it is possible to determine differentiation / undifferentiation based on a three-dimensional image without performing differentiation / undifferentiation determination based on a two-dimensional image.
  • the control device 41 includes a control unit 42, a storage unit 43, and an input unit 44.
  • the storage unit 43 includes a non-volatile storage medium such as a hard disk or flash memory, and a volatile storage medium such as DRAM or SRAM.
  • the storage unit 43 stores management data related to each culture vessel 19 stored in the stocker 21, data of the entire observation image captured by the imaging device, and data of the microscope image.
  • This image data includes a phase difference image obtained by imaging cells in the culture vessel 19 with a phase contrast microscope. Further, this image data includes a fluorescent image captured after fluorescent staining of the cells in the culture vessel 19.
  • the storage unit 43 stores a threshold value for determining a differentiated / undifferentiated region. Further, the storage unit 43 stores a program executed by the control unit 42. The storage unit 43 temporarily stores various calculation results by the control unit 42.
  • the management data includes (a) index data indicating individual culture containers 19, (b) the storage position of the culture container 19 in the stocker 21, and (c) the type and shape of the culture container 19 (well plate, Dish, flask, etc.), manufacturer name, (d) type of cell cultured in culture vessel 19 (information identifying cell line), (e) observation schedule of culture vessel 19, (f) time-lapse observation Imaging conditions (magnification of objective lens, observation point in the container, etc.) are included.
  • index data indicating individual culture containers 19, (b) the storage position of the culture container 19 in the stocker 21, and (c) the type and shape of the culture container 19 (well plate, Dish, flask, etc.), manufacturer name, (d) type of cell cultured in culture vessel 19 (information identifying cell line), (e) observation schedule of culture vessel 19, (f) time-lapse observation Imaging conditions (magnification of objective lens, observation point in the container, etc.) are included.
  • management data is generated for each small container.
  • cell lines to be observed different types are observed as cell lines to be observed.
  • information for identifying the cell line is required, but it is necessary to identify the cell line when there is one cell line to be observed or when high-precision differentiation / undifferentiation determination is not required. If not, cell line identification information is not essential. Of course, even if one cell line is observed, information indicating the cell line may be input.
  • cell line information for identifying the cell lines of the cells in the storage unit 43 and store them in association with each information.
  • feature amount information indicating the feature amount of the area of the colony, and store the feature amount information in association with each information.
  • the input unit 44 includes input devices such as a keyboard and a mouse. Various information such as cell line information is input to the input unit 44 by user operation.
  • the control unit 42 includes an image reading unit 421, a cell image extraction unit 4221, a feature amount calculation unit 4222, an undifferentiated region extraction unit 4223, and a storage control unit 423.
  • the control unit 42 is a processor that executes various arithmetic processes of the control device 41, for example.
  • the control unit 42 also functions as an image reading unit 421, a cell image extraction unit 4221, a feature amount calculation unit 4222, an undifferentiated region extraction unit 4223, and a storage control unit 423 by executing the program. Good.
  • information indicating the type of cell line may be input by a user who knows the type of cell line to be observed, or by identifying cells such as the form and brightness of the cell to be observed, and matching technology. It is also possible to automatically create and input information indicating the type of cell line by using a technique for automatically determining the type of cell line by means of, for example. In this embodiment, a case where information (cell line ID) indicating a cell line is input from the user via the input unit 44 will be described.
  • the storage control unit 423 controls writing of information output from each unit of the control device 41 to the storage unit 43 and reading of information from the storage unit 43.
  • the image reading unit 421 reads the image data of the phase difference image captured by the imaging device 34 and supplies the read image data to each unit of the control device 41.
  • the image reading unit 421 reads the image data of the phase difference image stored in the storage unit 43 and supplies the read image data to each unit of the control device 41.
  • the cell image extraction unit 4221 extracts an image of the cell Cel from, for example, a phase difference image captured by the imaging device 34. Specifically, the cell image extraction unit 4221 uses a known method (for example, pattern matching based on luminance or saturation) or the like to show an image showing the outline of the cytoplasm Cyp included in the phase difference image or an image showing the nucleus Nuc. For each cell Cel. A specific example of the phase difference image from which the cell image extraction unit 4221 extracts an image of the cell Cel will be described with reference to FIG.
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating an example of a phase difference image captured by the imaging device 34 of the present embodiment.
  • the phase difference image PIC01 includes a partial image of the colony Col.
  • the phase difference image PIC01 of the colony Col includes images of a plurality of cells Cel constituting the colony Col. Of this colony Col, the region Fld1 is an undifferentiated region, and the region Fld2 is a differentiated region.
  • the cell image extraction unit 4221 extracts an image of the cell Cel from the phase difference image PIC01 for each cell Cel.
  • the feature amount calculation unit 4222 calculates the feature amount of the cell Cel image extracted by the cell image extraction unit 4221.
  • the feature amount is a feature amount when determining differentiation / undifferentiation of the cell Cel with respect to the image of the cell Cel.
  • This feature amount includes the C / N ratio of the cell Cel, the length ratio of the nucleus Nuc contained in the cell Cel, and the internuclear distance Dn (or density) between the plurality of cells Cel. That is, the feature amount calculation unit 4222 is based on the cell Cel image extracted by the cell image extraction unit 4221, the length / short ratio of the nucleus Nuc included in the cell Cel, and the interval between the plurality of cells Cel.
  • the internuclear distance Dn is calculated.
  • the feature amount calculation unit 4222 summarizes a plurality of feature amounts (for example, C / N ratio, long / short ratio, internuclear distance Dn) based on the cell Cel image extracted by the cell image extraction unit 4221.
  • the feature amount calculation unit 4222 may calculate any one of the plurality of feature amounts. Further, the feature quantity calculation unit 4222 may collectively calculate any two or more feature quantities from among the plurality of feature quantities.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 extracts an undifferentiated region among the regions of the cell Cel included in the phase difference image captured by the imaging device 34 based on the feature amount calculated by the feature amount calculation unit 4222.
  • the feature amount calculated by the feature amount calculation unit 4222 is a C / N ratio.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 acquires the C / N ratio calculated by the feature amount calculation unit 4222 for a certain cell Cel. Further, the undifferentiated region extraction unit 4223 acquires the threshold value of the C / N ratio stored in the storage unit 43 via the storage control unit 423. Further, the undifferentiated region extraction unit 4223 compares the acquired C / N ratio for a certain cell Cel with a threshold value of the acquired C / N ratio. When the C / N ratio for a certain cell Cel is smaller than the threshold value, the undifferentiated region extraction unit 4223 determines that the cell Cel is an undifferentiated cell. On the other hand, when the C / N ratio for a certain cell Cel exceeds the threshold value, the undifferentiated region extraction unit 4223 determines that the cell Cel is a differentiated cell.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 when acquiring information on a cell line for a certain cell Cel, out of a plurality of C / N ratio threshold values obtained in advance for each cell line.
  • the undifferentiated region can be extracted using the threshold value corresponding to this cell line.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 can extract an undifferentiated region even when the threshold value of the C / N ratio differs for each cell line.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 can extract an undifferentiated region by changing the threshold value of the C / N ratio for each cell line, so that the extraction accuracy of the undifferentiated region can be improved. it can.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 acquires the length / shortness ratio of the nucleus Nuc calculated by the feature amount calculation unit 4222 for a certain cell Cel. Further, the undifferentiated region extraction unit 4223 acquires the threshold value of the long / short ratio stored in the storage unit 43 via the storage control unit 423. In addition, the undifferentiated region extraction unit 4223 compares the acquired length ratio of a certain cell Cel with the acquired threshold value of the length ratio.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 determines that this cell Cel is an undifferentiated cell when the length ratio of a certain cell Cel is smaller than a threshold (for example, when the flatness ratio of the nucleus Nuc is small). . On the other hand, the undifferentiated region extraction unit 4223 determines that this cell Cel is a differentiated cell when the length ratio of a certain cell Cel exceeds a threshold value.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 uses a threshold value of a plurality of long / short ratios obtained for each cell line in advance. An undifferentiated region can be extracted using a threshold corresponding to the cell line. Thereby, the undifferentiated region extraction unit 4223 can extract an undifferentiated region even when the threshold value of the long / short ratio is different for each cell line. In addition, the undifferentiated region extraction unit 4223 can extract the undifferentiated region by changing the threshold value of the long / short ratio for each cell line, thereby improving the extraction accuracy of the undifferentiated region.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 acquires the density of the cells Cel calculated by the feature amount calculation unit 4222 for a plurality of cells Cel included in a region where the colony Col is present. Further, the undifferentiated region extraction unit 4223 acquires the threshold value of the density stored in the storage unit 43 via the storage control unit 423. Further, the undifferentiated region extraction unit 4223 compares the density of the plurality of cells Cel included in the acquired certain region with the threshold value of the acquired density.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 determines that the cell Cel is an undifferentiated cell when the density of the plurality of cells Cel included in a certain region is smaller than the threshold value. On the other hand, when the density of a plurality of cells Cel included in a certain region exceeds a threshold value, the undifferentiated region extraction unit 4223 determines that the cells Cel are differentiated cells.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 when acquiring cell line information for a certain cell Cel, out of a plurality of threshold values of the density of the cell Cel obtained in advance for each cell line.
  • the undifferentiated region can be extracted using the threshold value corresponding to this cell line.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 can extract an undifferentiated region even when the threshold value of the density of the cell Cel is different for each cell line.
  • the undifferentiated region extraction unit 4223 can extract the undifferentiated region by changing the threshold value of the cell Cel density for each cell line, so that the accuracy of extracting the undifferentiated region can be improved. it can.
  • the differentiated area and the undifferentiated area may be displayed in different colors so that the differentiated / undifferentiated determination result can be clearly understood. Further, as shown in FIG. 8, a boundary line may be written at the boundary between the differentiated region and the undifferentiated region.
  • the incubator 11 determines the differentiation / undifferentiation of the cell Cel, that is, evaluates the culture state, based on the captured phase difference image.
  • FIG. 9 is a flowchart showing an example of the culture state evaluation process by the incubator 11 (observation apparatus) of the present embodiment.
  • the incubator 11 observation apparatus
  • data related to the threshold value of the characteristic amount of a specific cell line to be observed is acquired and stored in advance.
  • the incubator 11 observes the culture vessel 19 carried into the temperature-controlled room 15 in a time-lapse manner according to a registered observation schedule.
  • a plurality of specific cell lines are cultured in the culture container 19.
  • the cell line A is cultured in the culture container 19A among the culture containers 19.
  • the cell line B is cultured in the culture container 19B among the culture containers 19.
  • the incubator 11 sequentially conveys the culture vessel 19A and the culture vessel 19B to the vertical robot 38 observation unit 22 according to the observation schedule, and the entire image of the culture vessel 19 (overall observation image) and a part of the culture vessel 19 An enlarged microscope image is taken.
  • the calibration curve information of the cell line A and the calibration curve information of the cell line B are stored in the storage unit 43 in advance by the calibration curve information registration procedure described above. The operation of the time lapse observation of the incubator 11 will be described below.
  • Step S210 The control unit 42 compares the observation schedule of the management data in the storage unit 43 with the current date and time to determine whether or not the observation start time of the culture vessel 19 has come. When it is the observation start time (YES side), the control unit 42 shifts the process to step S220. On the other hand, when it is not the observation time of the culture vessel 19 (NO side), the control unit 42 waits until the time of the next observation schedule.
  • Step S220 The control unit 42 instructs the container transport device 23 to transport the culture container 19 corresponding to the observation schedule. Then, the container transport device 23 carries the instructed culture container 19 out of the stocker 21 and places it on the sample stage 31 of the observation unit 22. Note that, when the culture vessel 19 is placed on the sample stage 31, an entire observation image of the culture vessel 19 is captured by a macro imaging camera (not shown) built in the stand arm 32.
  • the observation apparatus shown in FIGS. 1, 3, and 4 is an apparatus provided with a temperature-controlled room for culturing cells to be observed. Therefore, the cells imaged in step S220 are those cultured in the temperature-controlled room of the observation apparatus. Therefore, this step can also be started from the step of culturing cells. Further, as in the present embodiment, the observation device may not be provided with a temperature-controlled room, and the temperature-controlled room for culturing cells may be a device separate from the observation device.
  • Step S230 The feature amount calculation unit 4222 acquires information (cell line ID) indicating a cell line from the management data stored in the storage unit 43.
  • Step S240 The image reading unit 421 acquires the image captured in step S220.
  • the image may be acquired by phase difference observation or by fluorescence observation. When acquiring an image by fluorescence observation, it is preferable to provide an addition device for adding a fluorescent reagent to the observation specimen before observation. This image may include an image of a colony, or may be an image of a single cell or a member region of a colony.
  • Step S250 The cell image extraction unit 4221 extracts an image of the cell Cel included in this image from the image acquired in Step S240.
  • Step S260 The feature amount calculation unit 4222 calculates the feature amount of the cell Cel image based on the cell Cel image extracted in step S250.
  • the control unit 42 may display the extracted image on the monitor.
  • Step S280 The control unit 42 instructs the container transport device 23 to transport the culture container 19 after the observation schedule is completed. Then, the container transport device 23 transports the designated culture container 19 from the sample stage 31 of the observation unit 22 to a predetermined storage position of the stocker 21. Then, the control part 42 complete
  • step S270 it is possible to remove cells determined to be in a differentiated state.
  • a device for collecting differentiated cells using image information determined to be differentiated / undifferentiated. For example, it is possible to detect the position information of undifferentiated cells using the acquired image, and move the sampling device (for example, a pipette) to the detected position and perform sampling. The collected undifferentiated details can be further transferred to a culture apparatus and matured.
  • the incubator 11 (observation apparatus) of the present embodiment includes the feature amount calculation unit 4222 that determines differentiation / undifferentiation of cells based on the phase difference image, and the undifferentiated region extraction unit 4223. Yes. Thereby, the incubator 11 can determine the differentiation / undifferentiation of cells by a non-invasive method. Moreover, since the incubator 11 can determine the differentiation / undifferentiation of cells based on a plurality of feature amounts of the image, it can improve the accuracy of the determination of the differentiation / undifferentiation region. In addition, cells determined from the use of images obtained by non-invasive observation (for example, phase contrast observation) for maturity determination and pass / fail determination continue without failure in drug discovery research and regenerative medicine, which are subsequent processes. Can be used.
  • control device 41 treats a plurality of microscope images obtained by imaging a plurality of points (for example, five-point observation or the entire culture container 19) of the same culture container 19 in the same observation time period as an image for one time-lapse observation. It may be.
  • a program for executing each process of the incubator 11 (observation apparatus) in the embodiment of the present invention is recorded on a computer-readable recording medium, and the program recorded on the recording medium is read into a computer system.
  • the various processes described above may be performed by executing.
  • the “computer system” referred to here may include an OS and hardware such as peripheral devices. Further, the “computer system” includes a homepage providing environment (or display environment) if a WWW system is used.
  • the “computer-readable recording medium” means a flexible disk, a magneto-optical disk, a ROM, a writable nonvolatile memory such as a flash memory, a portable medium such as a CD-ROM, a hard disk built in a computer system, etc. This is a storage device.
  • the “computer-readable recording medium” means a volatile memory (for example, DRAM (Dynamic DRAM) in a computer system that becomes a server or a client when a program is transmitted through a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line. Random Access Memory)), etc., which hold programs for a certain period of time.
  • the program may be transmitted from a computer system storing the program in a storage device or the like to another computer system via a transmission medium or by a transmission wave in the transmission medium.
  • the “transmission medium” for transmitting the program refers to a medium having a function of transmitting information, such as a network (communication network) such as the Internet or a communication line (communication line) such as a telephone line.
  • the program may be for realizing a part of the functions described above. Furthermore, what can implement

Abstract

　判定装置は、撮像された細胞画像中の、細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定部を備える。

Description

判定装置、観察システム、観察方法、そのプログラム、細胞の製造方法、および細胞
　本発明は、判定装置、観察システム、観察方法、そのプログラム、細胞の製造方法、および細胞に関するものである。
　一般的に、細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。例えば、再生医療分野では、in vitroで細胞を増殖、分化させるプロセスが存在する。そして、上記のプロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、細胞の培養状態を的確に評価することが不可欠である。一例として、マーカーとして転写因子を用いたがん細胞の評価方法が開示されている（特許文献１参照）。
　ＥＳ（Embryonic Stem、胚性幹）細胞またはｉＰＳ（induced Pluripotent Stem、誘導多能性幹）細胞などの幹細胞は、理論上、ほぼすべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させる事ができるため、医薬開発および再生医療への応用に注目が集まっている。
米国特許第７０６０４４５号明細書
　そのような幹細胞を創薬研究や再生医療に応用する際には、状態が良い（未分化状態を維持し、自発的に分化した細胞が少ない状態、または異常な増殖をするような細胞集団が存在しない、コロニーの大きさが適度の大きさであり、コロニー内に存在する細胞の密度が適度な密度）幹細胞を培養する必要があり、そのためには、培養中の幹細胞の培養状態を正確に判定することが求められる。しかしながら、従来、研究者の目視によって幹細胞の培養状態を判定していたため、培養状態の判定精度を向上させることができないという問題があった。
　そこで本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、幹細胞の状態の判定精度を向上することを可能とする判定装置、観察システム、観察方法、そのプログラム、細胞の製造方法、および、その製造方法によって製造された細胞を提供することを課題とする。
　上記問題を解決するために、本発明の一態様は、撮像された細胞画像中の、細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定部を備えることを特徴とする判定装置である。
　また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像部と、上述の判定装置とを備える観察システムである。
　また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像手順と、前記撮像手順によって撮像された前記細胞画像が示す、前記細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定手順とを有する観察方法である。
　また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、コンピュータに、培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像手順と、撮像された細胞画像中の、細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定手順とを実行させるためのプログラムである。
　また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像手順と、撮像された細胞画像中の、細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定手順とを有することを特徴とする細胞の製造方法である。
　また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、上述の細胞の製造方法により製造された細胞である。
　本発明によれば、幹細胞の状態の判定精度を向上することができる。
本発明の実施形態による観察装置の構成の一例を示すブロック図である。 本実施形態の観察装置が備える制御装置の構成の一例を示すブロック図である。 本実施形態の観察装置の正面図である。 本実施形態の観察装置の平面図である。 細胞が撮像された位相差画像の一例を示す模式図である。 分化せずに成熟している細胞の一例を示す模式図である。 分化している細胞の一例を示す模式図である。 本実施形態の撮像装置が撮像した位相差画像の一例を示す模式図である。 本実施形態の観察装置による培養状態評価処理の一例を示すフローチャートである。
　［実施形態］
　以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。初めに、図１～図４を参照して、本発明の実施形態によるインキュベータ（観察装置）の構成の概要について説明する。図１は、本発明の実施形態によるインキュベータ１１の構成の一例を示すブロック図である。図２は、本実施形態のインキュベータ１１が備える制御装置４１の構成の一例を示すブロック図である。また、図３、図４は、本実施形態のインキュベータ１１の正面図および平面図である。
　このインキュベータ１１とは、細胞を培養するとともに、培養した細胞を顕微鏡カメラによって撮像して、細胞の状態を観察するための装置である。インキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。
　まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂを有しており、恒温室１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図３、図４での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。
　恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８は、パッキンＰ１、Ｐ２、Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。
　また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培養容器１９を小扉１８から搬出入する。
　ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図４の下側）からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚には培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対象となる細胞が培地とともに収容されている。ストッカー２１は、必須のもではない。
　観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置される。この観察ユニット２２は、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行することができる。
　ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出した照明光源を配置するスタンドアーム３２と、観察光学系および撮像装置３４を内蔵した本体部分３３とを有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
　試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することができる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３９が内蔵されている。そして、撮像装置３４は、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像（位相差画像）を取得できる。
　容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置される。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。上記のようにストッカー２１を有しない場合、容器搬送装置２３も不要である。
　図４に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３８と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３８の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。
　また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。
　次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の本体部分３３や、インキュベータ１１の制御装置４１が収納されている。
　制御装置４１は、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、観察ユニット２２および容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。
　一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４１は、観察シーケンスで取得した画像に基づいて、細胞の培養状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。
［幹細胞の分化／未分化の判定］
　ここで、図５を参照して、幹細胞の分化／未分化の判定について説明する。まず、幹細胞のＣ／Ｎ比に基づいて、分化／未分化を判定する場合ついて説明する。このＣ／Ｎ比は、細胞質／核比、核細胞質比、または細胞核細胞質比とも称する。
　図５は、細胞Ｃｅｌが撮像された位相差画像の一例を示す模式図である。観察シーケンスで取得した画像には、細胞Ｃｅｌの画像（以下、単に細胞Ｃｅｌとも記載する。）が含まれている。この細胞Ｃｅｌは、細胞核Ｎｕｃ（以下、単に核Ｎｕｃとも記載する。）と、細胞質Ｃｙｐとを含む。細胞Ｃｅｌが撮像された位相差画像から細胞核Ｎｕｃと細胞質Ｃｙｐとを判別する方法として、例えば輝度の差異をもとに判別する既知の方法を用いることができる。また蛍光画像により判別する方法としては、例えば細胞核Ｎｕｃと細胞質Ｃｙｐとを各々異なる色で染色し、各々の色の領域を判別する方法がある。また。染色した各領域の形態の特徴や大きさから判別する既知の方法が利用可能である。このような既知の方法で細胞核Ｎｕｃと細胞質Ｃｙｐとを判別したのち、各々の領域の面積を測定する。
　細胞核Ｎｕｃと細胞質Ｃｙｐの面積の測定方法は既知の面積測定方法が利用できる。例えば、撮像素子のピクセル数を基に面積を算出可能である。
　ここで、細胞Ｃｅｌの画像の面積を面積Ｓｃ、核Ｎｕｃの画像の面積を面積Ｓｎ、細胞質Ｃｙｐの画像の面積を面積Ｓｙとするとき、この細胞ＣｅｌのＣ／Ｎ比は、次に示す式（１）で与えられる。
　なお、細胞質Ｃｙｐの面積Ｓｙであるが、細胞Ｃｅｌの画像の面積Ｓｃから核Ｎｕｃの画像の面積Ｓｎを除いた面積である。また、細胞質Ｃｙｐは核Ｎｕｃを除かない細胞Ｃｅｌと等しい領域と仮定し算出しても良い。つまり、細胞質Ｃｙｐの領域を決定する場合、細胞Ｃｅｌ内の領域において、核Ｎｕｃを除く領域とするか含む領域と仮定するかは適宜決定することが可能である。
　Ｃ／Ｎ比＝　（細胞質Ｃｙｐの面積Ｓｙ）／（核Ｎｕｃの面積Ｓｎ）　　…（１）
　すなわち、細胞Ｃｅｌの面積Ｓｃに対して、核Ｎｕｃの面積Ｓｎが比較的大きい場合には、核Ｎｕｃの面積Ｓｎが比較的小さい場合に比べて、Ｃ／Ｎ比は小さくなる。
　ここで、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞において、分化せずに未分化状態を維持している場合には、典型的な形態を呈する。また、播種直後には典型的な形態でなくとも培養日数を経るにつれて典型的な形態を呈してくる場合もある。これをコロニーが成熟すると表現する。例えば、ヒトＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の場合、未分化状態の典型的な形態はやや丸みを帯びた形状となり、隣接する細胞との境界は位相差顕微鏡下では判別できないほどタイトにパックされている。しかし、播種直後の細胞では分化状態ではないにも関わらず典型的な未分化状態の形態を呈せず、やや扁平な細胞質を持つ形態を呈する。そして、培養を継続すると典型的な未分化状態の形態となってくる。この状態が上記の様にコロニーが成熟する（または熟する）状態である。また、細胞株の種類によっては播種直後であっても典型的な未分化状態の形態を呈するものもある。成熟している場合には、分化した場合に比べて、Ｃ／Ｎ比が小さいという特徴がある。したがって、細胞Ｃｅｌの画像に基づいて、Ｃ／Ｎ比を算出し、この算出したＣ／Ｎ比と、所定のしきい値（後述）とを比較することにより、幹細胞が、分化せずに成熟しているか、分化しているかを判定することができる。ここで、Ｃ／Ｎ比の所定のしきい値とは、細胞Ｃｅｌが分化せずに成熟している場合のＣ／Ｎ比と、細胞Ｃｅｌが分化した場合のＣ／Ｎ比とに基づいて定められるしきい値である。
　次に、幹細胞の核Ｎｕｋの形状に基づいて、分化／未分化を判定する場合ついて説明する。幹細胞には、分化せずに成熟している場合、分化している場合に比べて、核Ｎｕｃの長軸ａと短軸ｂとの比が小さいという特徴がある。ここで、核Ｎｕｃの画像のうち、長手方向を核Ｎｕｃの長軸ａと、短手方向を核Ｎｕｃの短軸ｂと称する。細胞Ｃｅｌの画像に基づいて、長軸ａと短軸ｂとの比（以下、核Ｎｕｃの長短比、または単に、長短比とも記載する。）を算出し、この算出した長軸ａと短軸ｂとの比と、所定のしきい値とを比較することにより、幹細胞が、分化せずに成熟しているか、分化しているかを判定することができる。ここで、所定のしきい値とは、細胞Ｃｅｌが分化せずに成熟している場合の長軸ａと短軸ｂとの比と、細胞Ｃｅｌが分化した場合の長軸ａと短軸ｂとの比とに基づいて定められるしきい値である。
　長軸ａと短軸ｂの各距離は、例えば撮像素子のピクセル数を用いた２点間距離の測定技術を用いて測定することができる。
　なお、この核Ｎｕｃの長短比の所定のしきい値は、細胞Ｃｅｌの細胞株毎に異なる場合がある。この場合には、細胞Ｃｅｌの細胞株毎に、長短比の所定のしきい値を予め定めておき、予め定めた所定のしきい値の中から、判定対象の細胞Ｃｅｌの細胞株に応じたしきい値を選択することによって分化／未分化を判定する。これにより、判定対象の細胞Ｃｅｌの細胞株に応じた所定のしきい値を選択しない場合に比べて、細胞Ｃｅｌの分化／未分化の判定の精度を向上させることができる。ここで、ある細胞株に由来する細胞Ｃｅｌを蛍光染色することにより、この細胞株について、長短比の所定のしきい値を定めることができる。より具体的には、ある細胞株に由来する細胞Ｃｅｌのコロニーに対して、このコロニーに含まれる細胞Ｃｅｌのうち、分化している細胞Ｃｅｌを緑色に、分化していない（未分化の）細胞Ｃｅｌを赤色に蛍光染色する。この蛍光染色された細胞Ｃｅｌの画像を観察して、分化している領域の長短比と、未分化の領域の長短比とを求めることにより、ある細胞株についての、長短比のしきい値を求める。この手順を各細胞株について繰り返し適用することにより、細胞株毎に長短比のしきい値を求めることができる。
　また、位相差観察による画像を用い。輝度値を基に核Ｎｕｃを特定し、長短比のしきい値を求めるための画像を取得してもよい。
　また、ここでは、核Ｎｕｃの長軸ａと短軸ｂとの比に基づいて、細胞Ｃｅｌの分化／未分化を判定する例について説明したが、これに限らない。たとえば、核Ｎｕｃの直径や、長径、または短径に基づいて、細胞Ｃｅｌの分化／未分化を判定することもできる。この際も分化／未分化を判断するための核Ｎｕｃの直径や、長径、または短径の値を予め測定したしきい値と比較することで判定する。
　なお、Ｃ／Ｎ比の所定のしきい値は、細胞Ｃｅｌの細胞株毎、あるいは培養条件（培養基材、容器の種類、培地の種類等）によって異なる場合がある。この場合には、細胞Ｃｅｌの細胞株毎に、Ｃ／Ｎ比の所定のしきい値を予め定めておき、予め定めた所定のしきい値の中から、判定対象の細胞Ｃｅｌの細胞株に応じたしきい値を選択することによって分化／未分化を判定する。これにより、判定対象の細胞Ｃｅｌの細胞株に応じた所定のしきい値を選択しない場合に比べて、細胞Ｃｅｌの分化／未分化の判定の精度を向上させることができる。ここで、ある細胞株に由来する細胞Ｃｅｌを蛍光染色することにより、この細胞株について、Ｃ／Ｎ比の所定のしきい値を定めることができる。より具体的には、ある細胞株に由来する細胞Ｃｅｌのコロニーに対して、このコロニーに含まれる細胞Ｃｅｌのうち、分化している細胞Ｃｅｌを緑色に、分化していない（未分化の）細胞Ｃｅｌを赤色に蛍光染色する。この蛍光染色された細胞Ｃｅｌの画像を観察して、分化している領域のＣ／Ｎ比と、未分化の領域のＣ／Ｎ比とを求めることにより、ある細胞株についての、Ｃ／Ｎ比のしきい値を求める。この手順を各細胞株について繰り返し適用することにより、細胞株毎にＣ／Ｎ比のしきい値を求めることができる。
　次に、図６、および図７を参照して、幹細胞の密度に基づく、幹細胞の分化／未分化の判定について説明する。
　本例では、幹細胞の密度に基づいて幹細胞の分化／未分化の判定を行うため、複数の幹細胞を対象に判定を行うことになる。したがって、本例はコロニーの分化／未分化の判定を行う場合に好ましい方法である。
　図６は、分化せずに成熟している細胞Ｃｅｌの一例を示す模式図である。また、図７は、分化している細胞Ｃｅｌの一例を示す模式図である。幹細胞には、分化せずに成熟している場合、分化している場合に比べて、コロニーに含まれる細胞Ｃｅｌの密度（特に、核Ｎｕｃの密度）が大きいという特徴がある。ここで、コロニーに含まれる核Ｎｕｃの密度は、隣接する、または近傍の細胞Ｃｅｌの核間距離Ｄｎによって表される。
　まず、図６を参照して、幹細胞が分化せずに成熟している場合の、核間距離Ｄｎについて説明する。同図に示すように、コロニーＣｏｌ１には、細胞Ｃｅｌ１１～細胞Ｃｅｌ１４を含む複数の細胞Ｃｅｌが含まれている。このうち、細胞Ｃｅｌ１１について、核Ｎｕｃ１１の面積が面積Ｓｎ１１であり、細胞質Ｃｙｐ１１の面積が面積Ｓｙ１１である。また、細胞Ｃｅｌ１２について、核Ｎｕｃ１２の面積が面積Ｓｎ１２であり、細胞質Ｃｙｐ１２の面積が面積Ｓｙ１２である。細胞Ｃｅｌ１３について、核Ｎｕｃ１３の面積が面積Ｓｎ１３であり、細胞質Ｃｙｐ１３の面積が面積Ｓｙ１３である。細胞Ｃｅｌ１４について、核Ｎｕｃ１４の面積が面積Ｓｎ１４であり、細胞質Ｃｙｐ１４の面積が面積Ｓｙ１４である。ここで、細胞Ｃｅｌ１１の核Ｎｕｃ１１と、この細胞Ｃｅｌ１１に隣接する細胞Ｃｅｌ１２の核Ｎｕｃ１２との距離は、核間距離Ｄｎ１である。ここで、核間距離Ｄｎ１は、核Ｎｕｃ１１の画像における重心Ｇ１１と、核Ｎｕｃ１２の画像における重心Ｇ１２との間の距離として求められる。
　なお、核Ｎｕｃの重心は、例えば前記したような方法により核Ｎｕｃの領域を判別し、判別された核Ｎｕｃを基に算出する。また重心間の距離は、例えば撮像素子のピクセル数を用いた２点間距離の測定技術を用いて測定することができる。
　次に、図７を参照して、幹細胞が分化している場合の、核間距離Ｄｎについて説明する。同図に示すように、コロニーＣｏｌ２には、細胞Ｃｅｌ２１～細胞Ｃｅｌ２４を含む複数の細胞Ｃｅｌが含まれている。このうち、細胞Ｃｅｌ２１について、核Ｎｕｃ２１の面積が面積Ｓｎ２１であり、細胞質Ｃｙｐ２１の面積が面積Ｓｙ２１である。また、細胞Ｃｅｌ２２について、核Ｎｕｃ２２の面積が面積Ｓｎ２２であり、細胞質Ｃｙｐ２２の面積が面積Ｓｙ２２である。細胞Ｃｅｌ２３について、核Ｎｕｃ２３の面積が面積Ｓｎ２３であり、細胞質Ｃｙｐ２３の面積が面積Ｓｙ２３である。細胞Ｃｅｌ２４について、核Ｎｕｃ２４の面積が面積Ｓｎ２４であり、細胞質Ｃｙｐ２４の面積が面積Ｓｙ２４である。ここで、細胞Ｃｅｌ２１の核Ｎｕｃ２１と、この細胞Ｃｅｌ２１に隣接する細胞Ｃｅｌ２２の核Ｎｕｃ２２との距離は、核間距離Ｄｎ２である。ここで、核間距離Ｄｎ２は、核Ｎｕｃ２１の画像における重心Ｇ２１と、核Ｎｕｃ２２の画像における重心Ｇ２２との間の距離として求められる。
　ここで、図６と図７とを比較すると、図６に示すコロニーＣｏｌ１のように幹細胞が分化せずに成熟している場合には、図７に示すコロニーＣｏｌ２のように幹細胞が分化している場合に比べて、Ｃ／Ｎ比が小さい。すなわち、コロニーＣｏｌ１のように、幹細胞が分化せずに成熟している場合、細胞質Ｃｙｐの面積Ｓｙ１１に対して、核Ｎｕｃ１１の面積Ｓｎ１１が、分化している場合に比べて大きい。したがって、分化していない場合の核間距離Ｄｎ１が、分化している場合の核間距離Ｄｎ２に比べて小さくなる。すなわち、ある細胞Ｃｅｌに隣接する（または近傍の）他の細胞Ｃｅｌの核Ｎｕｃどうしの距離を算出することにより、コロニーのある領域について、分化／未分化を判定することができる。
　なお、本願発明の判定を行う際に用いる撮像画像には必ず核Ｎｕｃが存在しなければならない。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞の細胞コロニーは、個々の細胞が培養容器の底に略一面（XY方向）に広がるように増えていく。そして核Ｎｕｃは、細胞Ｃｅｌの中心付近に存在する。核Ｎｕｃを含む画像を取得する方法としては、例えば知られている細胞株毎の核Ｎｕｃの位置（Ｚ方向）情報を予め記憶しておき、記憶されているＺ位置に焦点を合わせて撮像することが可能である。また、１個または複数個の細胞に対し、Ｚ方向に撮像位置をずらした画像を取得し、これらの画像から核ＮｕｃのＺ方向の位置を検出し、検出された位置で画像を取得してもよい。また、核Ｎｕｃの形態的な特徴を自動判別し、判別された核Ｎｕｃに基づき画像を取得してもよい。さらにＺ方向に観察位置をずらしながら位相差観察による画像を取得し、撮像された画像の輝度情報を基に核Ｎｕｃの位置を確定し、これを基に核Ｎｕｃが撮像可能なＺ位置での画像取得をしてもよい。この方法によれば、二次元の画像を基に分化／未分化の判定を行わず、三次元の画像を基に分化／未分化の判定を行うことができる。
［制御装置の構成］
　図１に戻り、制御装置４１の構成について説明する。この制御装置４１は、制御部４２、記憶部４３および入力部４４を有している。
　記憶部４３は、ハードディスクや、フラッシュメモリなどの不揮発性の記憶媒体、およびＤＲＡＭやＳＲＡＭなどの揮発性の記憶媒体などにより構成される。この記憶部４３には、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データ、撮像装置で撮像された全体観察画像のデータ、および顕微鏡画像のデータが記憶されている。この画像データには、培養容器１９内の細胞を位相差顕微鏡によって撮像した位相差画像が含まれている。また、この画像データには、培養容器１９内の細胞について蛍光染色した後に撮像した蛍光画像が含まれている。また、記憶部４３には、分化／未分化領域を判定するためのしきい値が記憶されている。さらに、記憶部４３には、制御部４２によって実行されるプログラムが記憶されている。また、記憶部４３には、制御部４２による種々の演算結果が一時的に記憶される。
　なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、製造メーカ名、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類（細胞株を識別する情報）、（ｅ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｆ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが含まれている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器毎にそれぞれ管理データが生成される。
　なお、本実施例では、観察対象となる細胞株として異なる種類の細胞株を観察する実施例としている。この場合は、細胞株を識別する情報が必要となるが、観察する細胞株が１つである場合や、高精度の分化／未分化判定を必要としない場合など、細胞株を識別する必要が無い場合は、細胞株識別情報は必須ではない。もちろん、観察する細胞株が１つでも細胞株を示す情報を入力してもよい。
　また、異なる種類の細胞株を観察する場合は、細胞の細胞株を識別する細胞株情報を記憶部４３に記憶し、各情報と関連付けされて記憶することが好ましい。また、当該コロニーの面積の特徴量を示す特徴量情報を記憶し、各情報と関連付けされて記憶することが好ましい。
　入力部４４は、キーボードやマウスなどの入力デバイスを備えている。この入力部４４には、ユーザの操作によって細胞株の情報など様々な情報が入力される。
　次に、図２を参照して制御部４２の構成について説明する。制御部４２は、画像読込部４２１と、細胞画像抽出部４２２１と、特徴量算出部４２２２と、未分化領域抽出部４２２３と、記憶制御部４２３とを備えている。
　この制御部４２は、たとえば、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。なお、制御部４２は、プログラムの実行によって、画像読込部４２１と、細胞画像抽出部４２２１と、特徴量算出部４２２２と、未分化領域抽出部４２２３と、記憶制御部４２３としてそれぞれ機能してもよい。
　なお、細胞株の種類が複数の場合は、細胞株の種類を示す情報（細胞株ＩＤ）の入力が必要である。また、細胞株の種類を示す情報の入力は、観察する細胞株の種類を把握しているユーザが入力してもよいし、また観察する細胞の形態、輝度などの細胞を識別し、マッチング技術等により細胞株の種類を自動判断する技術を用いることで、細胞株の種類を示す情報を自動的に作成し入力することも可能である。
　本実施例では、ユーザから入力部４４を介して細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）を入力するケースについて説明する。
　記憶制御部４２３は、制御装置４１の各部が出力する情報の記憶部４３への書き込み、および記憶部４３からの情報の読み込みを制御する。
　画像読込部４２１は、撮像装置３４が撮像した位相差画像の画像データを読み込み、読み込んだ画像データを制御装置４１の各部に供給する。また、画像読込部４２１は、記憶部４３に記憶されている位相差画像の画像データを読み込み、読み込んだ画像データを制御装置４１の各部に供給する。
　細胞画像抽出部４２２１は、撮像装置３４が撮像した例えば位相差画像から、細胞Ｃｅｌの画像を抽出する。具体的には、細胞画像抽出部４２２１は、既知の方法（例えば、輝度や彩度に基づくパターンマッチングなど）によって、位相差画像に含まれる細胞質Ｃｙｐの輪郭を示す画像や、核Ｎｕｃを示す画像を、細胞Ｃｅｌ毎に抽出する。この細胞画像抽出部４２２１が細胞Ｃｅｌの画像を抽出する位相差画像の具体例について、図８を参照して説明する。
　図８は、本実施形態の撮像装置３４が撮像した位相差画像の一例を示す模式図である。この位相差画像ＰＩＣ０１には、コロニーＣｏｌの一部の画像が含まれている。コロニーＣｏｌの位相差画像ＰＩＣ０１には、このコロニーＣｏｌを構成する複数の細胞Ｃｅｌの画像が含まれている。このコロニーＣｏｌのうち、領域Ｆｌｄ１が未分化領域であり、領域Ｆｌｄ２が分化領域である。細胞画像抽出部４２２１は、この位相差画像ＰＩＣ０１の中から、細胞Ｃｅｌの画像を細胞Ｃｅｌ毎に抽出する。
　次に、特徴量算出部４２２２について説明する。この特徴量算出部４２２２は、細胞画像抽出部４２２１が抽出した細胞Ｃｅｌの画像について、その特徴量を算出する。ここで、特徴量とは、細胞Ｃｅｌの画像について、この細胞Ｃｅｌの分化／未分化を判定する場合の特徴量である。この特徴量には、細胞ＣｅｌのＣ／Ｎ比、細胞Ｃｅｌに含まれる核Ｎｕｃの長短比、複数の細胞Ｃｅｌ間の核間距離Ｄｎ（または密度）が含まれる。すなわち、特徴量算出部４２２２は、細胞画像抽出部４２２１が抽出した細胞Ｃｅｌの画像に基づいて、細胞ＣｅｌのＣ／Ｎ比、細胞Ｃｅｌに含まれる核Ｎｕｃの長短比、および複数の細胞Ｃｅｌ間の核間距離Ｄｎを算出する。
　なお、ここでは、特徴量算出部４２２２は、細胞画像抽出部４２２１が抽出した細胞Ｃｅｌの画像に基づいて、複数の特徴量（例えば、Ｃ／Ｎ比、長短比、核間距離Ｄｎ）をまとめて算出する場合について説明したが、これに限らない。特徴量算出部４２２２は、これら複数の特徴量のうち、いずれか１つの特徴量を算出してもよい。また、特徴量算出部４２２２は、これら複数の特徴量のうち、いずれか２つ以上の特徴量について、まとめて算出してもよい。
　次に、未分化領域抽出部４２２３について説明する。未分化領域抽出部４２２３は、特徴量算出部４２２２が算出した特徴量に基づいて、撮像装置３４が撮像した位相差画像に含まれる細胞Ｃｅｌの領域のうち、未分化の領域を抽出する。具体例として、特徴量算出部４２２２が算出した特徴量がＣ／Ｎ比である場合について説明する。
　この場合、未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞Ｃｅｌについて特徴量算出部４２２２が算出したＣ／Ｎ比を取得する。また、未分化領域抽出部４２２３は、記憶部４３に記憶されているＣ／Ｎ比のしきい値を、記憶制御部４２３を介して取得する。また、未分化領域抽出部４２２３は、取得したある細胞ＣｅｌについてのＣ／Ｎ比と、取得したＣ／Ｎ比のしきい値とを比較する。未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞ＣｅｌについてのＣ／Ｎ比が、しきい値よりも小さい場合には、この細胞Ｃｅｌを未分化の細胞と判定する。一方、未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞ＣｅｌについてのＣ／Ｎ比が、しきい値を超える場合には、この細胞Ｃｅｌを分化した細胞と判定する。
　なお、未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞Ｃｅｌについての細胞株の情報を取得している場合には、細胞株毎にそれぞれ予め求められている複数のＣ／Ｎ比のしきい値のうち、この細胞株に対応するしきい値を用いて、未分化の領域を抽出することができる。これにより、未分化領域抽出部４２２３は、細胞株ごとにＣ／Ｎ比のしきい値が異なる場合であっても、未分化の領域を抽出することができる。また、未分化領域抽出部４２２３は、細胞株ごとにＣ／Ｎ比のしきい値を異ならせて未分化の領域を抽出することができるため、未分化の領域の抽出精度を向上させることができる。
　また、他の具体例として、特徴量算出部４２２２が算出した特徴量が核Ｎｕｃの長短比である場合について説明する。この場合、未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞Ｃｅｌについて特徴量算出部４２２２が算出した核Ｎｕｃの長短比を取得する。また、未分化領域抽出部４２２３は、記憶部４３に記憶されている長短比のしきい値を、記憶制御部４２３を介して取得する。また、未分化領域抽出部４２２３は、取得したある細胞Ｃｅｌについての長短比と、取得した長短比のしきい値とを比較する。未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞Ｃｅｌについての長短比が、しきい値よりも小さい場合（例えば、核Ｎｕｃの偏平率が小さい場合）には、この細胞Ｃｅｌを未分化の細胞と判定する。一方、未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞Ｃｅｌについての長短比が、しきい値を超える場合には、この細胞Ｃｅｌを分化した細胞と判定する。
　なお、未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞Ｃｅｌについての細胞株の情報を取得している場合には、細胞株毎にそれぞれ予め求められている複数の長短比のしきい値のうち、この細胞株に対応するしきい値を用いて、未分化の領域を抽出することができる。これにより、未分化領域抽出部４２２３は、細胞株ごとに長短比のしきい値が異なる場合であっても、未分化の領域を抽出することができる。また、未分化領域抽出部４２２３は、細胞株ごとに長短比のしきい値を異ならせて未分化の領域を抽出することができるため、未分化の領域の抽出精度を向上させることができる。
　また、他の具体例として、特徴量算出部４２２２が算出した特徴量が細胞Ｃｅｌの密度である場合について説明する。この場合、未分化領域抽出部４２２３は、コロニーＣｏｌのある領域に含まれる複数の細胞Ｃｅｌについて特徴量算出部４２２２が算出した細胞Ｃｅｌの密度を取得する。また、未分化領域抽出部４２２３は、記憶部４３に記憶されている密度のしきい値を、記憶制御部４２３を介して取得する。また、未分化領域抽出部４２２３は、取得したある領域に含まれる複数の細胞Ｃｅｌの密度と、取得した密度のしきい値とを比較する。未分化領域抽出部４２２３は、ある領域に含まれる複数の細胞Ｃｅｌの密度が、しきい値よりも小さい場合には、この細胞Ｃｅｌを未分化の細胞と判定する。一方、未分化領域抽出部４２２３は、ある領域に含まれる複数の細胞Ｃｅｌの密度が、しきい値を超える場合には、この細胞Ｃｅｌを分化した細胞と判定する。
　なお、未分化領域抽出部４２２３は、ある細胞Ｃｅｌについての細胞株の情報を取得している場合には、細胞株毎にそれぞれ予め求められている細胞Ｃｅｌの密度の複数のしきい値のうち、この細胞株に対応するしきい値を用いて、未分化の領域を抽出することができる。これにより、未分化領域抽出部４２２３は、細胞株ごとに細胞Ｃｅｌの密度のしきい値が異なる場合であっても、未分化の領域を抽出することができる。また、未分化領域抽出部４２２３は、細胞株ごとに細胞Ｃｅｌの密度のしきい値を異ならせて未分化の領域を抽出することができるため、未分化の領域の抽出精度を向上させることができる。
　また、分化／未分化の判定結果が明確に把握できるように、判定された細胞Ｃｅｌをモニタに表示する際、分化領域と未分化領域が異なる色で表示されるようにしてもよい。また図８に示すように分化領域と未分化領域の境界に境界線を記してもよい。
　また、判定対象がコロニー全体の場合は、判定対象となっているコロニー全体に含まれる個々の細胞全てに対して上記の判定を行い、コロニー全体での分化／未分化の領域を決定する。
[インキュベータ（観察装置）の動作]
　次に、インキュベータ１１の動作の一例について説明する。このインキュベータ１１は、撮像された位相差画像に基づいて、細胞Ｃｅｌの分化／未分化の判定、すなわち、培養状態の評価を行う。
　図９を参照しつつ、インキュベータ１１の培養状態評価処理の一例を説明する。
　図９は、本実施形態のインキュベータ１１（観察装置）による培養状態評価処理の一例を示すフローチャートである。本実施例では、観察対象となる特定の細胞株の特徴量のしきい値に関するデータを取得し、予め記憶しているものとする。
　インキュベータ１１は、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する。この培養容器１９には、特定の複数種類の細胞株が培養されている。例えば、培養容器１９のうち、培養容器１９Ａには、細胞株Ａが培養されている。また、培養容器１９のうち、培養容器１９Ｂには、細胞株Ｂが培養されている。インキュベータ１１は、観察スケジュールに従って、この培養容器１９Ａ、培養容器１９Ｂを順次、垂直ロボット３８観察ユニット２２に搬送して、培養容器１９の全体の画像（全体観察画像）と、培養容器１９の一部を拡大した顕微鏡画像とを撮像する。また、上述した検量線情報の登録手順によって、この細胞株Ａの検量線情報、細胞株Ｂの検量線情報が記憶部４３に予め記憶されている。このインキュベータ１１のタイムラプス観察の動作について、以下説明する。
　ステップＳ２１０：制御部４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ＹＥＳ側）、制御部４２はステップＳ２２０に処理を移行させる。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ＮＯ側）には、制御部４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。
　ステップＳ２２０：制御部４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたマクロ撮影用カメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。
　本実施例においては、図１、３、４に示す観察装置は観察する細胞を培養する恒温室を備えた装置である。したがって、ステップＳ２２０で撮像する細胞は、観察装置の恒温室で培養されたものとなる。したがって、本ステップは、細胞を培養するステップから開始することも可能である。また本実施例のように、観察装置内に恒温室が備わったものでなくてもよく、細胞を培養するための恒温室が観察装置とは別体となった装置でもよい。
　ステップＳ２３０：特徴量算出部４２２２は、記憶部４３に記憶されている管理データから細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）を取得する。
　ステップＳ２４０：画像読込部４２１は、ステップＳ２２０において撮像された画像を取得する。画像の取得は、位相差観察により取得する場合や蛍光観察により取得する場合などがある。蛍光観察で画像取得する場合は、観察前に蛍光試薬を観察標本に添加する添加装置を備えることが好ましい。この画像には、コロニーの画像が含まれていてもよく、細胞単体やコロニーの一部材領域の画像でもよい。
　ステップＳ２５０：細胞画像抽出部４２２１は、ステップＳ２４０において取得された画像から、この画像に含まれる細胞Ｃｅｌの画像を抽出する。
　ステップＳ２６０：特徴量算出部４２２２は、ステップＳ２５０で抽出された細胞Ｃｅｌの画像に基づいて、この細胞Ｃｅｌの画像の特徴量を算出する。
　ステップＳ２７０：未分化領域抽出部４２２３は、ステップＳ２６０で算出された特徴量と、記憶部４３に予め記憶されているしきい値とに基づいて、ステップＳ２４０で取得された画像の中から、未分化の領域を抽出する。制御部４２は、抽出した結果の画像をモニタに表示してもよい。
　ステップＳ２８０：制御部４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送する。その後、制御部４２は、観察シーケンスを終了してステップＳ２１０に処理を戻す。
　この他、ステップＳ２７０における分化／未分化の判定の結果、未分化の状態にあるか否かが把握できた後、良好な状態にあると判定された細胞を観察装置から取り出し、例えば、創薬研究や再生医療に用いる細胞として提供することができる。また、ステップＳ２７０における判定の結果、細胞が分化した状態にあると判定された細胞を除去することができる。
　図示されていないが、分化／未分化が判定された画像情報を用い、分化した細胞を採取する装置を備えることも可能である。例えば、取得した画像を用い未分化の細胞の位置情報を検出し、検出された位置に採取装置（例えば、ピペット）を移動させ吸引することで採取することが可能である。そして、採取された未分化細部は更に培養装置に搬送し成熟させることも可能である。
　このようにして細胞株毎にステップＳ２１０～ステップＳ２８０を繰り返すことにより、各観察スケジュールにおける培養状態の評価結果が、記憶部４３に記憶される。更に、選別された良好な細胞のみを研究機関等に提供することができる。
　以上説明したように、本実施形態のインキュベータ１１（観察装置）は、位相差画像に基づいて細胞の分化／未分化を判定する特徴量算出部４２２２と、未分化領域抽出部４２２３とを備えている。これにより、インキュベータ１１は、非侵襲的な方法により細胞の分化／未分化を判定することができる。また、インキュベータ１１は、画像の複数の特徴量に基づいて、細胞の分化／未分化を判定することができるため、分化／未分化領域の判定の精度を向上させることができる。また、成熟度判定や良否判定に際し非侵襲の観察（例えば位相差観察）で得られる画像を用いることから判定された細胞はその後の工程である創薬研究や再生医療に障害なく、継続して使用することが可能となる。
　なお、制御装置４１は、同じ培養容器１９の複数ポイント（例えば５点観察または培養容器１９の全体）を同じ観察時間帯で撮像した複数の顕微鏡画像を、タイムラプス観察の１回分の画像として扱うようにしてもよい。
　また、本発明の実施形態におけるインキュベータ１１（観察装置）の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。
　なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。
　さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよい。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。
　以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
　１１…観察装置、４１…制御装置、４２１…画像読込部、４２２…判定部、４２２１…細胞画像抽出部、４２２２…Ｃ／Ｎ比算出部、４２２３…未分化領域抽出部、４２３…記憶制御部、４２３…記憶部

Claims (12)

  1. 　撮像された細胞画像中の、細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定部
    　を備えることを特徴とする判定装置。
  2. 　前記判定部は、
    　予め定められた細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に関する情報と取得された前記画像から得られる情報に基づき判定する
    　ことを特徴とする請求項１に記載の判定装置。
  3. 　前記撮像された細胞画像は、
    　蛍光観察で取得した画像または位相差観察で取得した画像である
    　ことを特徴とする請求項１または２に記載の判定装置。
  4. 　前記判定部は、
    　前記細胞核細胞質比が示す前記細胞の核の密度に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する
    　ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の判定装置。
  5. 　前記判定部は、
    　さらに、前記細胞画像の細胞核の形態情報が示す前記細胞の直径に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する
    　ことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の判定装置。
  6. 　前記判定部は、
    　前記細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、前記コロニーにおける未分化領域を判定する
    　ことを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の判定装置。
  7. 　前記判定部は、
    　前記細胞が未分化か否かを細胞株毎に予め定められた細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に関する情報に基づいて判定する
    　ことを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の判定装置。
  8. 　培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像部と、
    　請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の判定装置と
    　を備える観察システム。
  9. 　培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像手順と、
    　前記撮像手順によって撮像された前記細胞画像が示す、前記細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定手順と、
    　を有する観察方法。
  10. 　コンピュータに、
    　培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像手順と、
    　撮像された細胞画像中の、細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定手順と、
    　を実行させるためのプログラム。
  11. 　培養中の細胞を撮像して前記細胞の細胞画像を生成する撮像手順と、
    　撮像された細胞画像中の、細胞の核の形態情報または細胞核細胞質比に基づいて、前記細胞が未分化か否かを判定する判定手順と、
    　を有することを特徴とする細胞の製造方法。
  12. 　請求項１１に記載の細胞の製造方法により製造された細胞。
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