JP2013512667A - 幹細胞を培養するための処方物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血清代替処方物、ならびに共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸、アクチビンAおよび/またはステアリン酸を含んでなる、幹細胞の誘導、維持および分化に好適な培養培地に関する。
Description
本発明は、ヒト胚性幹細胞などの幹細胞の誘導、維持および分化において使用するためのゼノフリー(xeno−free)処方物に関する。
ヒト胚性幹細胞(hESC)は、ヒトの体のあらゆる細胞種に分化する可能性がある多能性細胞である。ヒトESCは、培養下で無限増殖が可能であり、そのため欠損ヒト組織または欠陥ヒト組織の置換のために細胞および組織を供給することが可能であることから、治療上極めて興味深いものである。将来、ヒトESCは、治療目的で増殖され、ヒトの体に移植することができる特定の細胞種に分化するように向けられ、または創薬および毒性学の研究において細胞モデルとして使用されると大いに期待されている。
胚性幹細胞は、本来の細胞運命をたどり自発的に分化する傾向があることから、培養下で維持することが難しい。ほとんどの培養条件ではある程度の求められていない分化が起こる。幹細胞は、多くの内因子および外因子(増殖因子、細胞外マトリックス分子および成分、環境的ストレッサーならびに直接的細胞間相互作用を含む)の結果として分化する。長期増殖能、長期培養後の多能性発達可能性および核型安定性は、幹細胞培養物の有用性に関して重要な特徴である。
hESCの未分化段階は、細胞の形態学的特徴を判別することによってモニタリングすることができる。未分化hESCは、特徴的な形態を有し、非常に小さい密集した細胞である。分化した細胞が多少、hESCコロニーの辺縁部に通常現われるが、最適な培養方法により、分化した細胞を最小限の量にする増殖支援を受けられる。転写因子Oct4およびNanogならびに細胞表面マーカーTRA−1−60、TRA−1−81、SSEA−3/4などのhESCの未分化段階の状況を追跡するために使用されるいくつかの生化学的マーカーがある。これらのマーカーは、hESCがいずれかの細胞系統に分化し始めると消失する。
hESCを作出し、培養するための基本技術は記載されている。しかしながら、hESCの培養に現在用いられている手法の多くには限界と欠点がある。胚性幹細胞は、一般には、培養中に所望の増殖を可能にする動物血清(とりわけ、ウシ胎児血清)または他の動物由来製品を含有する培養培地中で誘導され増殖されている。hESC培養培地中に動物由来製品が存在することにはいくつかの問題がある。第一に、動物由来製品は、レシピエントにおいて免疫応答を引き起こし、そのため移植すると拒絶に至らせる毒性タンパク質または免疫原を含む可能性がある(Martin et al., Nat Med. 2005 Feb;11(2):228-32)。第二に、動物製品の使用により、細胞療法や他の臨床的応用において深刻な健康上の危険性を及ぼし得る動物病原体(ウイルス、マイコプラズマおよびプリオンなど)の混入の危険性が高まる(Healy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2005 Dec 12;57(13):1981-8)。実際には、政府機関が、そのような病原体を含む可能性がある動物由来製品を含有する細胞培養培地の使用を規制し、抑制し、禁止さえすることも増えてきている。第三に、細胞培養物中の不確定成分が、例えば、創薬および毒性学の研究における、細胞モデル実験の再現性を損なわせる。
血清または動物抽出物の使用についての欠点を克服するために、複数の血清フリー培地が開発された。Price et al.は、US特許公報第2002/0076747号明細書において、hESC培養によく使用される血清代替物、Knockout(商標)SR培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)を開示している。しかしながら、この処方物は、ウシ血清アルブミンなどの動物由来製品を含有し、それゆえ、異種由来成分を全く含まないわけではない。ゼノフリーの血清代替物および培地は現在いくつかのものが入手可能である(X−Vivo 10、X−Vivo 20、SSS、Lipumin、Serex、Plasmanate、SR3)。これらの血清代替物は、多くの場合、単一細胞型の培養を支援するために特異的に処方されている。さらに、Thomson et al.は、US特許公報第2006/0084168号明細書において、培養下でのESCの増殖を支援するとされる、血清フリーかつゼノフリー細胞培養培地を開示している。
残念ながら、Rajala et al.によりHum. Reprod., 2007, 22(5):1231-1238において、上述の総て処方物がhESCの培養を可能にするのは新しい培地への適応期中の数代の継代の間だけであり、その後の継代では厳密な分化、続いての迅速な分化は起こらないことが示されている。
国際特許公報第WO2008/148938号には、レチノールを含んでなるゼノフリー血清代替物と、ESCの維持および誘導用の該血清代替物を含んでなる培養培地が開示されている。しかしながら、多能性幹細胞および多分化性幹細胞を培養するための改良されたゼノフリー処方物の必要性がまだある。
hESCについてはいくつかのフィーダーフリー培養方法が開発されている。これらのフィーダーフリー方法の多くは動物由来成分を利用する。加えて、これらの方法には再現性が不十分であるという欠点があり、現在のところ、安定した正常核型を示す未分化hESCの長期維持はできない。また、酵素による継代を行うフィーダーフリー培養はhESCについての要求が非常に厳しいためそれらにより異常が起こりやすくなる。
現在知られているhESC用培養培地に関連するこれらの問題から、多能性および正常な細胞核型を維持しながら実質的な分化を起こさずにhESCの強い増殖を再現性よく長期間支援し、かつ、臨床上の安全性および有効性ならびに創薬および毒性学の検証に用いられるin vitro細胞モデルの標準化法に適用される予想規制ガイドラインに適合する、確定したゼノフリー培養培地の必要性が高い。
本発明は、臨床用幹細胞の誘導、維持および分化のための手段および方法を提供する。より具体的には、本発明は、血清代替物、該血清代替物を含んでなる最終培養培地、およびそれらの使用に関する。
本発明の目的は、共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸からなる群から選択される少なくとも1種の脂肪酸を含んでなるゼノフリー血清代替物を提供することである。いくつかの実施形態では、共役リノール酸(CLA)の濃度は、該血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約0.5mg/l〜約5mg/lのCLAを含んでなるものであり、エイコサペンタエン酸(EPA)の濃度は、最終培養培地で約1mg/l〜約10mg/lのEPAを含んでなるものである。
いくつかの実施形態では、血清代替物は、アクチビンAおよび/またはレチノールをさらに含んでなり得る。いくつかの他の実施形態では、アクチビンAの濃度は、最終培養培地で約0.001mg/l〜約0.02mg/lのアクチビンAを含んでなるものであり、かつ/またはレチノールの濃度は、最終培養培地で約0.25mg/l〜約1.0mg/lのレチノールを含んでなるものである。
いくつかのさらに他の実施形態では、血清代替物は、ステアリン酸をさらに含んでなり得る。いくつかのさらなる実施形態では、ステアリン酸の濃度は、最終培養培地で約0.5mg/l〜約5mg/lのステアリン酸を含んでなるものである。
本発明のもう1つの目的は、基本培地および本発明の実施形態による血清代替物を含んでなるゼノフリー細胞培養培地を提供することである。
本発明のさらにもう1つの目的は、幹細胞の維持、増殖または分化のための本血清代替物または細胞培養培地の使用に関する。
さらに、本発明の目的は、幹細胞の誘導または単離のための本血清代替物または細胞培養培地の使用に関する。
本発明のさらなる目的は、新規幹細胞株をin vitroで作出するための方法を提供することである。該方法は、a)望ましい起源の単離された細胞を供給すること、b)本ゼノフリー培養培地と該細胞を接触させること、およびc)幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含んでなる。いくつかの実施形態では、その培養はフィーダー細胞層上で行われ得る。いくつかの実施形態では、該単離された細胞は胚起源、成体体細胞起源または間葉起源のものである。
本発明のさらなる目的は、幹細胞を培養するための方法を提供することである。該方法は、a)本ゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、およびb)幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含んでなる。いくつかの実施形態では、その培養はフィーダー細胞層上で行われ得る。本培養培地は、in vitroでの何代もの継代にわたって実質的に未分化状態での幹細胞の維持および増殖を支援することが可能である。加えて、本発明による培養培地中で培養された幹細胞は、実質的に未分化であり、多能性または多分化能を保有し、ゲノムの完全性を維持する。
さらに、本発明の目的は、幹細胞を分化させるための方法を提供することである。該方法は、a)分化誘導剤(増殖因子など)または分化用細胞(例えば、END2細胞)を添加した本ゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、およびb)幹細胞の分化に好適な条件下で該細胞を培養することを含んでなる。
本発明の他の目的、実施形態、詳細および利点は、次の図面、詳細な説明および実施例から明らかになるであろう。
以下において、添付の図面を参照し好ましい実施形態を用いて本発明をより詳細に記載する。
本発明は、臨床用幹細胞の誘導、維持および分化のための手段および方法に関する。より具体的には、本発明は、ゼノフリー血清代替処方物、および該血清代替物を含んでなる培養培地に関する。さらに、本発明は、幹細胞の誘導、培養、維持および分化のための方法に関する。
よって、本発明は、幹細胞のin vitroでの誘導、維持、増殖または分化に用いる任意の好適な基本培地を補うために使用し得る、確定したゼノフリー血清代替処方物または組成物を提供する。用途に応じて、該血清代替物は、血清フリー基本培地または血清含有基本培地、またはそれらの任意の組合せのいずれかを補うために使用し得る。ゼノフリー基本培地に本ゼノフリー血清代替物が添加されると、最終培養培地もゼノフリーである。
本明細書において、幹細胞という用語は、多能性幹細胞および多分化性幹細胞の両方を包含する。胚性幹細胞(ESC)は、様々な種類の細胞種に分化可能な多能性細胞である。真の胚性幹細胞株(i)は、未分化状態でin vitro無限増殖が可能であり;(ii)長期培養後でも3つの胚性胚葉(内胚葉、中胚葉および外胚葉)系総てに分化可能であり;(iii)長期培養中正常核型を維持する。それゆえ、胚性幹細胞は多能性といわれる。
人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、多能性幹細胞のもう1つの例である。iPS細胞は、分化した細胞から、一般的には成体体細胞(繊維芽細胞など)から発生上の初期化によって生成される。そのような細胞は、例えば、WO2008/151058号およびUS2008/076176号明細書において記載されている。
多分化性幹細胞としては、限定されるものではないが、造血幹細胞および間葉系幹細胞(MSC)が挙げられ、これらは様々な細胞種に分化可能な成体幹細胞である。MSCは、骨髄および脂肪組織を含む異なる供給源から単離され得る。脂肪組織から誘導されたMSCは、脂肪幹細胞(ASC)と呼ばれている。
当技術分野では胚性幹細胞および成体幹細胞の両方の情報が充実している。本発明に従って培養されたhESCを含む幹細胞は、任意の適当な技術(限定されるものではないが、免疫手術が挙げられる)を用いて任意の好適な供給源から得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞を単離し、増殖させるための手法は、米国特許第6,090,622号明細書に記載されている。アカゲザルおよび他の非ヒト霊長類の胚性幹細胞を獲得するための手法は、米国特許第5,843,78号明細書および国際特許公報第WO96/22362号に記載されている。加えて、アカゲザル胚性幹細胞を単離するための方法は、Thomson et al.により記載されている(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848)。割球生検は、ドナー胚に損傷を与えずに胚性幹細胞の単離および増殖を可能にする魅力のある新技術である。幹細胞の他の獲得方法は、当技術分野では容易に入手することができる。
本明細書において提供する手段および方法は、任意の望ましい動物、好ましくは、霊長類(ヒト、有尾サルおよび無尾サルなど)、ならびに非霊長類哺乳類(マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、パンダ、ヤギおよびシマウマなど)を含む哺乳類から誘導された幹細胞に適用できる。
ゼノフリー(xeno−free)という用語は、本明細書において、ヒト幹細胞を培養しようとする場合に、試薬の起源が異種供給源ではない、すなわち、非ヒト動物起源の材料を含まないということを意味する。また、ゼノフリーであるためには、例えば、ネズミ幹細胞の培養は、あらゆるマウス由来材料の不在下で行う必要がある。ヒト幹細胞の培養に好適なゼノフリー供給源には、化学合成もしくは合成製品または細菌、酵母、真菌、植物およびヒト由来の対象試薬の単離物、調製物もしくは精製物が含まれ得る。
血清代替物という用語は、本明細書において、最終細胞培養培地において動物血清の代わりに使用し得る処方物を意味する。従来の血清代替物は、一般には、ビタミン、アルブミン、脂質、アミノ酸、トランスフェリン、酸化防止剤、インスリンおよび微量元素を含んでなる。最終細胞培養培地は、増殖因子、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、L−グルタミンおよび/または抗生物質をさらに含んでなってもよく、それらは基本培地に直接加えられるかまたは血清代替物中にさらに含められる。
驚くべきことに、これまでに、共役リノール酸(CLA)および/またはエイコサペンタエン酸(EPA)が幹細胞の未分化状態での維持において優れた結果をもたらすということが見出された。検証された様々な脂質および脂質誘導体の中で、これらの2種の脂肪酸が未分化形態の維持、未分化コロニー数の増加および幹細胞の多能性または多分化能の保持において優れていた。
従って、本発明による血清代替物は、共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸からなる群から選択される少なくとも1種の脂肪酸を含んでなるゼノフリー処方物である。その血清代替物中のCLAの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約0.5mg/l〜約5mg/l、より具体的には約2.5mg/lのCLAを含んでなるものである。その血清代替物中のEPAの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約1mg/l〜約10mg/l、より具体的には約5mg/lのEPAを含んでなるものである。従って、基本培地に20%(vol/vol)の血清代替物を添加して最終培養培地にする実施形態では、該血清代替物は約2.5mg/l〜約25mg/l、より具体的には約12.5mg/lのCLAおよび/または約5mg/l〜約50mg/l、より具体的には25mg/lのEPAを含んでなる。血清代替物は、基本培地に加えられる形態により種々の割合で提供され得るため、それに応じて各成分の濃度が変化することは当業者には明らかである。
血清代替物への使用に二番目に最適な脂肪酸はステアリン酸である。血清代替物中のステアリン酸の好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約0.5mg/l〜約5mg/l、より具体的には約2.5mg/lのステアリン酸を含んでなるようなものである。従って、基本培地に20%(vol/vol)の血清代替物が添加される実施形態では、該血清代替物は、約2.5mg/l〜約25mg/l、より具体的には約12.5mg/lのステアリン酸を含んでなる。
また、驚くべきことに、アクチビンAが、とりわけCLAおよび/またはEPAと組み合わせると、幹細胞増殖およびNanog、Oct4、GDF3、DNMT3B、GABRB3およびGDF3などの幹細胞マーカーの発現を促進するということも見出された。
従って、本発明による血清代替物は、アクチビンAをさらに含んでなり得る。その血清代替物中のアクチビンAの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約0.001mg/l〜約0.02mg/l、より具体的には約0.005mg/lのアクチビンAを含んでなるものである。よって、基本培地に20%(vol/vol)の血清代替物が添加される実施形態では、該血清代替物は、約0.005mg/l〜約0.1mg/l、より具体的には約0.025mg/lのアクチビンAを含んでなる。
さらに、レチノール、すなわち、ビタミンAが、極めて低い濃度で幹細胞の未分化増殖を支援するということも見出された。レチノールの有効濃度範囲は、WO2008/148938に開示されているものより約10倍低い。レチノールをCLAおよび/またはEPAと組み合わせて使用すると、とりわけ良好な結果が得られ、アクチビンAの存在下でさらに良好な結果が得られる。血清代替物中のレチノールの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約0.25mg/l〜約1.0mg/l、より具体的には約0.57mg/lのレチノールを含んでなるものである。従って、基本培地に20%(vol/vol)の血清代替物が添加される実施形態では、該血清代替物は、約1.25mg/l〜約5.0mg/l、より具体的には約2.85mg/lのレチノールを含んでなる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明による血清代替物は、アクチビンAおよびCLAおよび/またはEPAを含んでなる。他の好ましい実施形態では、その血清代替物は、レチノールおよびCLAおよび/またはEPAを含んでなる。さらに好ましい実施形態では、その血清代替物は、アクチビンA、レチノールおよびCLAおよび/またはEPAを含んでなる。これらの成分の好ましい濃度は上に示している。これらの実施形態によるいずれの血清代替物もステアリン酸をさらに含んでなり得る。
さらなる実施形態では、血清代替物は、上に示した成分に加えて、脂質または脂質誘導体、ビタミン、アルブミンまたはアルブミン代替物、アミノ酸、ビタミン、トランスフェリン、トランスフェリン代替物、酸化防止剤、インスリンまたはインスリン代替物、微量元素および増殖因子からなる群から選択される、少なくとも1種の成分、好ましくはエンドトキシンフリーの成分、を含んでなる。そのような成分は、血清代替処方物中に、幹細胞の多能性と核型の両方を維持しながら実質的に未分化状態での幹細胞の増殖を支援するのに十分な濃度で存在すべきである。
よって、本発明による血清代替物は、少なくとも1種の他の脂質または脂質誘導体をさらに含んでなり得、そのような他の脂質または脂質誘導体としては、限定されるものではないが、リポタンパク質(超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)およびコレステロールなど);リン脂質(ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルエタノールアミンなど);脂肪酸(リノール酸、γ−リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ミリスチン酸およびそれらの誘導体(プロスタグランジンなど)など)が挙げられる。
本発明の様々な実施形態によれば、血清代替物は、上に示した脂質または脂質誘導体の、例えば、少なくとも2種、少なくとも3種または少なくとも4種を含んでなり得る。
血清代替物は、レチノールより他のビタミン(アスコルビン酸、ビオチン、塩化コリン、D−パントテン酸Ca、葉酸、iイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンB12、ビタミンD2など)をさらに含んでよい。一般には、いくつかのビタミンが基本培地に含められ、最終培地に追加のビタミン添加が行われ得る。一般には、本発明による細胞培養培地に、チアミンは約9mg/lの濃度で使用され、一方、アスコルビン酸は約50μg/mlの濃度で使用される。
本発明における使用に好適なアルブミン代替物には、アルブミンの代わりに使用することができ、アルブミンと本質的に同様の効果を有する任意の化合物が含まれる。本発明による血清代替物中および最終培養培地中のアルブミンまたはアルブミン代替物の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一般には、アルブミンまたはアルブミン代替物は、最終培養培地に、約1mg/ml〜約20mg/mlの範囲、好ましくは約5mg/ml〜約15mg/mlの範囲で使用される。一実施形態では、アルブミンは、本発明による細胞培養培地中約10mg/mlで存在する。
フェチュイン、α−フェトプロテインおよびそれらの任意の組合せは血清代替物においてアルブミンの代わりに使用し得る。しかしながら、それらは高価であるため、それらをアルブミンと組み合わせて使用することは実現可能であるかもしれない。1つの好ましい実施形態では、血清代替物は、約0.5mg/mlのフェチュインと約0.25mg/mlのα−フェトプロテインを含んでなる。そのような実施形態では、基本培地に20%血清代替物が添加される。一般的に、典型的な最終細胞培養培地は、約0.01mg/ml〜約1mg/mlのフェチュインおよび/またはα−フェトプロテインを含んでなる。
本発明における使用に好適なアミノ酸としては、限定されるものではないが、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−ヒドロキシプロリン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、およびそれらのD型および誘導体などのアミノ酸が挙げられる。アミノ酸の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。典型的な濃度範囲を表3に示す。本発明による血清代替物は、追加の非必須アミノ酸、例えば、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、グリシン、L−プロリン、L−セリン、およびそれらのD型および誘導体などを含んでよい。そのような追加の非必須アミノ酸は、血清代替物中に含めてよくまたは本発明による最終細胞培養培地に直接加えてもよい。非必須アミノ酸は、市販の混合物(Invitrogenによって提供されているMEM非必須アミノ酸(NEAA)など)として供給され得る。一般には、本発明による最終培地中の該混合物の濃度は約1%である。
L−グルタミンは、安定したジペプチド型のL−グルタミン(例えば、Glutamax(Invitrogen、2mM))として本発明による細胞培養培地に加えることが好ましい。必要に応じて、L−グルタミンは、本発明による血清代替物中に含めてよい。
トランスフェリンは細胞への鉄送達に関与し、体液中の遊離鉄濃度を制御し、鉄によるフリーラジカル毒性を防ぐ。本発明における使用に好適なトランスフェリン代替物には、トランスフェリンの代わりに使用することができ、トランスフェリンと本質的に同様の効果を有する任意の化合物が含まれる。そのような代替物としては、限定されるものではないが、鉄の塩およびキレート(例えば、クエン酸第二鉄キレートまたは硫酸第一鉄)が挙げられる。本発明による血清代替物中および最終培地中のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一般には、本発明による最終培地中のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物の好適な範囲は、約1μg/ml〜約1000μg/ml、好ましくは約5μg/ml〜約100μg/ml、およびより好ましくは約5μg/ml〜約10μg/mlである。一実施形態では、トランスフェリンは、本発明による細胞培養培地中約8μg/mlで存在する。
本発明における使用に好適な酸化防止剤としては、限定されるものではないが、グルタチオンおよびアスコルビン酸が挙げられる。本発明による血清代替物中および最終培地中の酸化防止剤の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一実施形態によれば、本発明による細胞培養培地中、グルタチオンは1.5μg/mlで存在し、アスコルビン酸は50μg/mlで存在する。
本発明における使用に好適なインスリン代替物には、インスリンの代わりに使用することができ、インスリンと本質的に同様の効果を有する任意の化合物が含まれる。本発明による血清代替物中および最終培地中のインスリンまたはインスリン代替物の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一般には、最終培地中のインスリンの好適な範囲は、約1μg/ml〜約1000μg/ml、好ましくは約1μg/ml〜約100μg/ml、より好ましくは約50μg/ml〜約15μg/mlである。一実施形態では、インスリンは約10μg/mlで存在する。
本発明における使用に好適な微量元素としては、限定されるものではないが、Mn2+、Si4+、Mo6+、V5+、Ni2+、Sn2+、Al3+、Ag+、Ba2+、Br−、Cd2+、Co2+、Cr3+、F−、Ge4+、I−、Rb+、Zr4+およびSe4+ならびにそれらの塩が挙げられる。微量元素またはそれらの塩の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で公知の常法を用いて容易に決定することができる。CellGro Mediatech Inc.によって提供されているTrace Elements BおよびTrace Elements Cなどの市販の微量元素組成物もまた使用し得る。必要に応じて、微量元素Cu2+および/またはZn2+は、例えば、CellGro Mediatech Inc.によって提供されている市販のTrace Element A compositionの形で含めてよい。
さらに、本発明者らは、塩化リチウムが胚性幹細胞の分化に有害である可能性があるということを示した。よって、特定の実施形態では、血清代替物は塩化リチウムを含まない。
本発明における使用に好適な増殖因子としては、塩基性FGF(bFGFまたはFGF−2)などの繊維芽細胞増殖因子(FGF)が挙げられる。本発明による最終培地中のFGFの好適な範囲は、約1ng/ml〜約1000ng/ml、好ましくは約2ng/ml〜約100ng/ml、およびより好ましくは約4ng/ml〜約20ng/mlである。一実施形態では、FGFは約8ng/mlで存在する。FGFを使用することが好ましいが、繊維芽細胞増殖因子受容体を活性化するように設計された特定の合成小ペプチド(例えば、組換えDNA変異体または変異株により生産されたもの)などの他の材料を、FGFの代わりに使用してもよい。増殖因子は、本発明による血清代替物中に含めてもよく、または本発明による最終細胞培養培地に別に加えてもよい。
また、本発明による血清代替物または培地の汚染を防止するために、抗生物質も使用することができる。好適な抗生物質またはそれらの組合せ、ならびに好適な濃度は、当業者には明らかである。しかしながら、その培地を臨床的応用のために細胞の培養に使用する場合には、抗生物質の使用を避けるほうがよいであろう。
さらに、β−メルカプトエタノールを、本発明による血清代替物中に含めてよく、または本発明による最終培養培地に別に加えてもよい。一般には、β−メルカプトエタノールの終濃度はその培養培地中約0.1mMである。
本発明の明らかな実施形態では、本発明による血清代替物として供給する代わりに、上に記載した血清代替物の成分のいずれかを基本培地に直接加えて最終細胞培養培地を供給してよい。
本発明は、幹細胞のin vitro誘導、維持、増殖および分化用の、確定したゼノフリー培養培地をさらに提供する。該培養培地は、基本培地および本明細書に示した血清代替組成物を含んでなる。本発明における使用に好適な基本培地としては、限定されるものではないが、KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(KO−DMEM)、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、Minimal Essential Medium(MEM)、Basal Medium Eagle(BME)、RPMI 1640、F−10、F−12、a Minimal Essential Medium(aMEM)、Glasgow’s Minimal Essential Medium(G−MEM)、Iscove’s Modified Dulbecco’s MediumおよびHyQ ADCF−MAb(HyClone)およびそれらの任意の組合せが挙げられる。1つの好ましい実施形態によれば、基本培地はKO−DMEMである。
「基本培地」という用語は、幹細胞の増殖支援が可能な任意の培地を指し、一般的には、標準的な無機塩、ビタミン、グルコース、緩衝系および必須アミノ酸を供給するものである。基本培地に約1g/L〜約3.7g/Lの重炭酸ナトリウムを添加することが好ましいことがある。好ましくは、基本培地に約2.2g/Lの重炭酸ナトリウムを添加する。
前記血清代替物が添加される基本培地はそれ自体がゼノフリーであり得るし、またはそれに例えば血清をさらに添加し得る。
培養の浸透圧は、幹細胞培養物の成功および生命力に影響を及ぼす。浸透圧は、ミリオスモルで測定され、溶液中の溶解粒子の数の尺度であり、溶液により生じる浸透圧の測定値である。正常ヒト血清の浸透圧は約290ミリオスモルである。他の哺乳類細胞のin vitro培養用の培地では浸透圧が様々であり、330ミリオスモルという高い浸透圧を有する培地もいくつかある。好ましくは、本発明による培地の浸透圧は約280〜約330ミリオスモル(mOsmol)の間である。しかしながら、その培地の浸透圧は、約260ミリオスモルと低い場合もあり、約340ミリオスモルと高い場合もある。本発明による一実施形態では、hESCを約320〜330ミリオスモルの浸透圧で増殖させる。
一実施形態によれば、脂質、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、トランスフェリン、酸化防止剤、インスリンおよび微量元素はその血清代替物中に含められるが、一方、増殖因子、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、L−グルタミンおよび抗生物質は細胞培養培地に直接加えられる。1つの好ましい培養培地の最終組成物を、表2に例示する。
本発明による血清代替物または培養培地は、液体または乾燥形で提供し得る。さらに、それらは、任意の好適な濃縮処方物としても提供し得る。例として、基本培地に10%、15%または20%(vol/vol)の血清代替物を添加して、上に示した成分の終濃度とし得る。必要に応じて、血清代替物または培地の成分を相溶性のある部分処方物に分けてよい。
本発明による血清代替物および培養培地は多くの用途で有用である。また、本発明による血清代替物および培養培地は、ESC、ASCおよびiPS細胞株などの新規幹細胞株の作出、すなわち、誘導または単離にも使用し得る。よって、本発明は、そのような目的に向けた方法を提供する。その方法は、望ましい起源の単離された細胞を供給する工程、本発明の実施形態によるゼノフリー培地と該細胞を接触させる工程、および細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養する工程を含む。一実施形態では、該培地にラミニン(ヒト胎盤ラミニンなど)およびフィブロネクチン(ヒト血漿フィブロネクチンなど)が添加される。好ましくは、ラミニンおよびフィブロネクチンは、約5μg/mlの濃度で使用される。
本発明のこの態様はまた、本発明が新規幹細胞株を作出するための血清代替物または培養培地の使用に関するように設計され得る。よって、本方法の総ての実施形態は、血清代替物または培養培地の該使用に適用される。
血清代替物および最終培養培地は、実質的に未分化状態での幹細胞の維持および増殖の支援、好ましくはin vitroでの何代もの継代にわたっての幹細胞の維持および増殖の支援に好適である。より具体的には、該処方物は、少なくとも約第20継代、好ましくは少なくとも約第30継代、およびより好ましくは少なくとも約第50継代の間の幹細胞の維持および増殖に使用し得る。実施例4に示すように、第80継代をも超える間の実質的に未分化状態での幹細胞の維持に成功している。該幹細胞は多能性または多分化能を保持する。例えば、胚性幹細胞は、内胚葉組織系、中胚葉組織系および外胚葉組織系へと分化する可能性を維持する。さらに、該幹細胞はゲノムの完全性を保持し、それは、例えば、変化していない核型によって、判別される。
治療用途では、本発明による培養培地は、非ヒト動物供給源から精製された、フィーダー細胞、馴化培地、血清または他の培地成分などの成分を含まない。より好ましくは、その培養培地は、組換え法または化学的方法を用いて合成された成分を含んでなる。
よって、本発明は、上記したゼノフリー培養により幹細胞を培養し維持するための方法を提供する。該方法は、本発明による培養培地と幹細胞を接触させること、および幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含む。そのような条件は当業者には明らかである。
本発明のこの態様はまた、本発明が幹細胞株を培養し維持するための血清代替物または培養培地の使用に関するように設計され得る。よって、本方法の総ての実施形態は、血清代替物または培養培地の該使用に適用される。
本培養培地はまた、細胞の増殖および分化の研究にも使用し得、そのような研究には、i)未分化幹細胞の増殖に作用し、ii)幹細胞の分化に作用し、かつiii)組織再生を調節する分子(例えば、薬物候補)を研究し、同定し、かつ/またはスクリーニングすることが含まれる。その培養培地はまた、遺伝子改変された幹細胞またはそれらから得られる分化した細胞における様々な作用物質(治療用タンパク質など)の生産にも使用し得る。
その血清代替物および最終培養培地はさらに望ましい系統への幹細胞の分化、とりわけ治療目的での幹細胞の分化にも使用し得る。これは、適当かつ十分な濃度の分化誘導剤を本培養培地に加えることによって達成され得る。分化誘導剤の限定されない例としては、Noggin(乏突起神経膠細胞(oligodentrocytes)に分化させるために使用され得る);ソニックヘッジホッグ(sonig hedgehog)およびレチノイン酸(運動ニューロンに分化させるために使用され得る);bFGF(網膜細胞系統に分化させるために使用され得る);およびBMP2(心筋細胞に分化させるために使用され得る);アクチビンAおよびIGF2(インスリン産生細胞に分化させるために使用され得る);ならびにアクチビンA、BMP2およびBMP4(肝細胞に分化させるために使用され得る)が挙げられる。さらに、分化誘導剤は、心筋細胞に分化させるために使用され得る、END2などの分化用細胞であってよい。他の分化誘導剤は当技術分野で周知である。本発明のこの態様はまた、本発明が望ましい系統へ幹細胞を分化させるための方法に関するように設計され得る。その方法は、分化誘導剤を添加した本発明による培養培地と幹細胞を接触させること、および幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含む。現在の分化プロトコールは、細胞の特性および分化に未知の影響を及ぼす可能性がある様々な不確定製品および培養培地を利用する。本処方物、分化方法および使用はこれらの不利点を共有しない。
本発明による処方物、方法および使用は、所望により、フィーダー細胞層上での幹細胞株の培養および/または作出に使用し得る。好適なフィーダー細胞としては、限定されるものではないが、ヒト包皮繊維芽細胞、例えば、CRL−2429(ATCC, Mananas, USA)などの繊維芽細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明による処方物、方法および使用は、幹細胞のフィーダー細胞フリー培養に用いられる。
実施例1.hESCに対する培養培地浸透圧の影響
ゼノフリー処方物の性能を高めるために、本発明者らは本発明による培養培地の浸透圧を最適化した。浸透圧は5M NaClを用いて調整した。本発明者らは、第5継代についてのヒト胚性幹細胞(hESC)の培養において種々の異なる容量オスモル濃度を検証し、各継代後にそれらの細胞の形態を調べた。浸透圧320mOsmで最良の性能が得られた(図1C)。浸透圧260mOsm(図1A)では小さい不ぞろいのコロニーが形成され、浸透圧290mOsm(図1B)ではそれらのコロニーの形態が改善されたがコロニーサイズは小さかった。浸透圧350mOsmではコロニーの増殖が明らかに抑制された(図1D)。
ゼノフリー処方物の性能を高めるために、本発明者らは本発明による培養培地の浸透圧を最適化した。浸透圧は5M NaClを用いて調整した。本発明者らは、第5継代についてのヒト胚性幹細胞(hESC)の培養において種々の異なる容量オスモル濃度を検証し、各継代後にそれらの細胞の形態を調べた。浸透圧320mOsmで最良の性能が得られた(図1C)。浸透圧260mOsm(図1A)では小さい不ぞろいのコロニーが形成され、浸透圧290mOsm(図1B)ではそれらのコロニーの形態が改善されたがコロニーサイズは小さかった。浸透圧350mOsmではコロニーの増殖が明らかに抑制された(図1D)。
実施例2.特定の脂質および脂質誘導体はhESCの未分化増殖を増強する
様々な脂質および脂質誘導体を、本発明による培養培地(RegES)においておよびKO−SR(Knockout serum replacement、Invitrogen)を含有する従来のhES培養培地において試験した。各継代の前に未分化コロニーの一般形態ならびにサイズおよび厚さを視覚に基づき評価した(表3)。それらの結果によれば、共役リノール酸、エイコサペンタエン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、リノール酸−オレイン酸−アラキドン酸混合物、および、とりわけレチノールでは、hES培地および本発明による培養培地の両方において未分化コロニーの形態が改善した(表3)。加えて、ステアリン酸、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、プロスタグランジンF2およびDL−イソプロテレノールは、hES培養培地で不良な形態および/または過剰な分化をもたらしたが、一方、本発明による培養培地ではこれらの添加物は満足な形態をもたらした。
様々な脂質および脂質誘導体を、本発明による培養培地(RegES)においておよびKO−SR(Knockout serum replacement、Invitrogen)を含有する従来のhES培養培地において試験した。各継代の前に未分化コロニーの一般形態ならびにサイズおよび厚さを視覚に基づき評価した(表3)。それらの結果によれば、共役リノール酸、エイコサペンタエン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、リノール酸−オレイン酸−アラキドン酸混合物、および、とりわけレチノールでは、hES培地および本発明による培養培地の両方において未分化コロニーの形態が改善した(表3)。加えて、ステアリン酸、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、プロスタグランジンF2およびDL−イソプロテレノールは、hES培養培地で不良な形態および/または過剰な分化をもたらしたが、一方、本発明による培養培地ではこれらの添加物は満足な形態をもたらした。
さらに、hESCコロニーは3つのカテゴリー;未分化、一部分化および分化、に分類された。各継代の前に各コロニータイプの数を計算した。後に、コロニー総量に対する各コロニータイプの割合値を計算した(図2)。本発明による培養培地では、共役リノール酸、エイコサペンタエン酸、ステアリン酸、レチノール、リノール酸−オレイン酸−アラキドン酸混合物、DL−イソプロテレノール、パルミトオレイン酸およびリノール酸の存在下で、対照hESまたはヒト血清アルブミンの代わりにAlbumax(Invitrogen)を含有するAlbumax−RegES培地中で培養したコロニーと比べて未分化コロニーの数が増加し、分化コロニーの数が減少した。hES培養培地では、コレステロール、アラキドン酸、共役リノール酸、レチノールおよびホスファチジルコリンの存在下で、対照hES培地中で培養したコロニーと比べて未分化コロニーの数が増加し、分化コロニーの数が減少した。
レチノールおよび共役リノール酸が、両方の培養培地においてコロニーの形態および未分化コロニーの数を全体的に改善することが見出された。レチノールおよび共役リノール酸の他、エイコサペンタエン酸も本発明による培養培地において未分化コロニーの数を増加させることにより優れた性能をもたらした。よって、共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸が、ゼノフリー血清代替物中に含めるのに最も好ましい脂肪酸である。本発明による培養培地ではステアリン酸を用いて三番目に良好な性能が観察された。
実施例3.レチノールは増殖および幹細胞マーカーの発現を増加させる
レチノールを選択し、未分化hESCの維持についてさらに評価した。初期研究では、レチノールは0.1〜0.5μMの濃度では効果がなく、形態や未分化コロニーの数の改善が見られないことが示された。しかしながら、さらなる評価では、レチノールが2.0μM以上の濃度でhESCの増殖を改善するだけでなく、hESC特異的マーカーの発現も誘導することが示された(図3)。2.0μMのレチノールの存在下では、コロニーの増殖はより早く始まり、すでに3日目にはコロニーのサイズはより大きかった(図3A〜図3B)。増殖アッセイでは、2.0μMまたは3.5μMのレチノールの存在下で培養したhESCが、レチノールなしでまたは0.5μMのレチノールの存在下で培養したhESCと比べてほぼ2倍の増殖速度であることが示された(図3E)。レチノールの存在下で培養したhESCの免疫細胞化学的染色では、幹細胞マーカーNanogおよびTRA−1−81の発現が示された(図3C〜図3D)。さらに、レチノールは多能性の裏付けとなる遺伝子、とりわけNanog、の発現を増加させ、2.0μMおよび3.5μMのレチノールの存在下で相対的発現レベルは20倍を超えた(図3F)。
レチノールを選択し、未分化hESCの維持についてさらに評価した。初期研究では、レチノールは0.1〜0.5μMの濃度では効果がなく、形態や未分化コロニーの数の改善が見られないことが示された。しかしながら、さらなる評価では、レチノールが2.0μM以上の濃度でhESCの増殖を改善するだけでなく、hESC特異的マーカーの発現も誘導することが示された(図3)。2.0μMのレチノールの存在下では、コロニーの増殖はより早く始まり、すでに3日目にはコロニーのサイズはより大きかった(図3A〜図3B)。増殖アッセイでは、2.0μMまたは3.5μMのレチノールの存在下で培養したhESCが、レチノールなしでまたは0.5μMのレチノールの存在下で培養したhESCと比べてほぼ2倍の増殖速度であることが示された(図3E)。レチノールの存在下で培養したhESCの免疫細胞化学的染色では、幹細胞マーカーNanogおよびTRA−1−81の発現が示された(図3C〜図3D)。さらに、レチノールは多能性の裏付けとなる遺伝子、とりわけNanog、の発現を増加させ、2.0μMおよび3.5μMのレチノールの存在下で相対的発現レベルは20倍を超えた(図3F)。
実施例4.アクチビンAは本発明の培養培地の性能をさらに増強する
増殖アッセイでは、本発明による培養培地中5ng/mlまたは10ng/mlのアクチビンAの存在下で培養したhESCが、アクチビンAなしで培養したhESCと比べてほぼ2倍の増殖速度であり、その増殖速度が対照hES培地中で培養したhESCと同程度であることが示された(図4A)。蛍光活性化細胞選別(FACS)および定量逆転写PCR(qRT−PCR)解析では、アクチビンAが多能性の裏付けとなるマーカーの発現を転写レベルと翻訳レベルの両方において増加させることが示された(図4B〜図4C)。
増殖アッセイでは、本発明による培養培地中5ng/mlまたは10ng/mlのアクチビンAの存在下で培養したhESCが、アクチビンAなしで培養したhESCと比べてほぼ2倍の増殖速度であり、その増殖速度が対照hES培地中で培養したhESCと同程度であることが示された(図4A)。蛍光活性化細胞選別(FACS)および定量逆転写PCR(qRT−PCR)解析では、アクチビンAが多能性の裏付けとなるマーカーの発現を転写レベルと翻訳レベルの両方において増加させることが示された(図4B〜図4C)。
実施例5.本発明の培養培地におけるhESCの誘導、長期培養および特性評価
新規hESC株(07/046および08/013)は、本発明による培養培地を用いることにより、幹細胞研究のために提供された余剰の質の悪いヒト胚からの誘導に成功している。ヒトESC株を、第80継代を超える間連続培養している。これらの細胞株は定期的に核型決定し、正常な2倍体核型を示す(図5A)。蛍光活性化細胞選別(FACS)および定量逆転写PCR(qRT−PCR)解析では、これらの細胞株が幹細胞マーカーを、hES培地を用いて誘導し、培養したhESC株Regea 06/040と同程度のレベルで発現することが示された(図5B、図5D)。細胞増殖解析では、Regea 07/046およびRegea08/013細胞株の細胞増殖速度がRegea 06/040と同程度であることが示された(図5C)。本発明による培養培地はまた、hESCの凍結および融解にも使用することができる(図5E)。
新規hESC株(07/046および08/013)は、本発明による培養培地を用いることにより、幹細胞研究のために提供された余剰の質の悪いヒト胚からの誘導に成功している。ヒトESC株を、第80継代を超える間連続培養している。これらの細胞株は定期的に核型決定し、正常な2倍体核型を示す(図5A)。蛍光活性化細胞選別(FACS)および定量逆転写PCR(qRT−PCR)解析では、これらの細胞株が幹細胞マーカーを、hES培地を用いて誘導し、培養したhESC株Regea 06/040と同程度のレベルで発現することが示された(図5B、図5D)。細胞増殖解析では、Regea 07/046およびRegea08/013細胞株の細胞増殖速度がRegea 06/040と同程度であることが示された(図5C)。本発明による培養培地はまた、hESCの凍結および融解にも使用することができる(図5E)。
新規細胞株がin vitroでそれらの多能性を維持することを確認するために、本発明者らは胚様体(EB)アッセイを行った。細胞株Regea 07/046および08/013のEB由来細胞は3つの異なる胚系統、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉のマーカーを発現した(図5F)。また、本発明者らは、ゼノフリー条件で誘導し長期間誘導し、培養したhESCが心筋細胞系統および神経細胞系統に分化することができるかどうかを検証した。心臓分化の開始後12〜16日後に自発収縮を繰り返す領域が観察された。解離した、自発収縮を繰り返す細胞は、横紋のあるパターンを形成し、心臓トロポニンTマーカーおよび心室ミオシン重鎖マーカーについて陽性染色を示した(図5G〜図5H)。神経細胞を作製するために、本発明による培養培地中およびhES培地中で培養したhESCコロニーを、小クラスターに切開し、最大20週間浮遊培養した。分化した細胞はRT−PCRにおいて神経前駆体マーカー、ニューロンマーカーおよび星状細胞マーカーを発現した(図5I)。免疫細胞化学的染色では、細胞のニューロンおよび神経膠の運命が確認された(図5J)。これらの結果は、本発明によるゼノフリー培養培地で誘導し、培養したhESC株はそれらの多能性を維持し、さらに、これらの細胞株から心筋細胞および神経細胞を生成することができることを示した。
実施例6.本発明による培養培地におけるiPS細胞の培養および特性評価
ヒト多能性細胞用に開発した本発明による培養培地の性能をさらに示すために、本発明者らは2種のヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)株をヒトフィーダー細胞上でこれらの条件にて培養した。細胞の形態および幹細胞マーカー発現は、hES培地中で培養した細胞と比べて類似している(図6A〜図6B)。加えて、EBの解析では、本発明による培養培地中で培養したiPS細胞が3つの胚葉総てに分化する能力を維持することが示された(図6C)。
ヒト多能性細胞用に開発した本発明による培養培地の性能をさらに示すために、本発明者らは2種のヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)株をヒトフィーダー細胞上でこれらの条件にて培養した。細胞の形態および幹細胞マーカー発現は、hES培地中で培養した細胞と比べて類似している(図6A〜図6B)。加えて、EBの解析では、本発明による培養培地中で培養したiPS細胞が3つの胚葉総てに分化する能力を維持することが示された(図6C)。
実施例7.本発明による培養培地におけるASCの培養および特性評価
脂肪組織サンプルから単離されたASCを用いて、間葉系幹細胞の培養についての本発明による培養培地の性能を評価した。本発明による培養培地中およびヒト血清含有培地(HS培地)中で増殖させたASCの増殖速度を決定するために、WST−1増殖解析をいくつかの時点(1、4、7および11日目)で行った。両方の条件において7種のASC株を解析に用いた。同時に、光学顕微鏡検査により細胞形態を観察して、増殖アッセイの結果を確認した(図7A〜図7D)。増殖解析では、すでに4日目に、本発明による培養培地での培養物がHS培地と比べてより速いASC増殖速度を示すことが示された(図7E)。その後、7日目および11日目にASCは本発明による培養培地において、HS培地と比べてより速い速度で増殖し続けた。4日目(p=0.035)、7日目(p=0.022)および11日目(p=0.018)において本発明による培養培地とHS培地との間で増殖速度に有意差が認められた(図7E)。
脂肪組織サンプルから単離されたASCを用いて、間葉系幹細胞の培養についての本発明による培養培地の性能を評価した。本発明による培養培地中およびヒト血清含有培地(HS培地)中で増殖させたASCの増殖速度を決定するために、WST−1増殖解析をいくつかの時点(1、4、7および11日目)で行った。両方の条件において7種のASC株を解析に用いた。同時に、光学顕微鏡検査により細胞形態を観察して、増殖アッセイの結果を確認した(図7A〜図7D)。増殖解析では、すでに4日目に、本発明による培養培地での培養物がHS培地と比べてより速いASC増殖速度を示すことが示された(図7E)。その後、7日目および11日目にASCは本発明による培養培地において、HS培地と比べてより速い速度で増殖し続けた。4日目(p=0.035)、7日目(p=0.022)および11日目(p=0.018)において本発明による培養培地とHS培地との間で増殖速度に有意差が認められた(図7E)。
本発明による培養培地中およびHS培地中で展開させたASCの表面マーカー発現特性を比較するために、フローサイトメトリーによる特性評価を行った(表4)。各培養条件につき4つの細胞株を解析した。両方の培養条件でASCの特徴的な表面マーカー発現プロフィールが維持されたが、統計分析では、HS培地中で培養したASCと本発明による培養培地中で培養したASCとのシアロムチン様接着分子CD34(p=0.043)、白血球共通抗原CD45(p=0.017)、接着分子CD105(p=0.020)およびMHCクラスIアイソタイプHLA−ABC(p=0.021)についての発現に有意差が認められた。
技術の進歩とともに、本発明の概念を様々な方法で実行することができることは、当業者には明らかであろう。本発明およびその実施形態は、上記した実施例に限定されず、特許請求の範囲の範囲内で変更することができる。
引用した総ての参考文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
Claims (16)
- 共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸からなる群から選択される少なくとも1種の脂肪酸を含んでなる、ゼノフリー血清代替物。
- アクチビンAをさらに含んでなる、請求項1に記載の血清代替物。
- レチノールをさらに含んでなる、請求項1または2に記載の血清代替物。
- ステアリン酸をさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の血清代替物。
- 共役リノール酸(CLA)の濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約0.5mg/l〜約5mg/lのCLAを含んでなるものであり、エイコサペンタエン酸(EPA)の濃度が、該最終培養培地で約1mg/l〜約10mg/lのEPAを含んでなるものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の血清代替物。
- アクチビンAの濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約0.001mg/l〜約0.02mg/lのアクチビンAを含んでなるものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の血清代替物。
- レチノールの濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約0.25mg/l〜約1.0mg/lのレチノールを含んでなるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の血清代替物。
- ステアリン酸の濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約0.5mg/l〜約5mg/lのステアリン酸を含んでなるものである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の血清代替物。
- 基本培地と、請求項1〜8のいずれか一項に記載の血清代替物とを含んでなる、ゼノフリー細胞培養培地。
- 幹細胞の維持、増殖または分化のための、請求項9に記載の細胞培養培地の使用。
- 幹細胞の誘導または単離のための、請求項9に記載の細胞培養培地の使用。
- 新規幹細胞株をin vitroで作出するための方法であって、
a)望ましい起源の単離された細胞を供給すること、
b)請求項9に記載のゼノフリー培地と該細胞を接触させること、および
c)幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養すること
を含んでなる、方法。 - 前記単離された細胞が胚起源、成体体細胞起源または間葉起源のものである、請求項12に記載の方法。
- 幹細胞を培養するための方法であって、
a)請求項9に記載のゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、および
b)幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養すること
を含んでなる、方法。 - 前記培養がフィーダー細胞層上で行われる、請求項12または請求項14に記載の方法。
- 幹細胞を分化させるための方法であって、
a)分化誘導剤を添加した請求項9に記載のゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、および
b)幹細胞の分化に好適な条件下で該細胞を培養すること
を含んでなる、方法。
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