KR20130009943A - 줄기세포 배양을 위한 제형 및 방법 - Google Patents

줄기세포 배양을 위한 제형 및 방법 Download PDF

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크리스티나 라자라
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Abstract

본 발명은 공액 리놀레산, 에이코사펜타노산, 액티빈 A 및(또는) 스테아르산을 포함하는, 줄기세포의 유도, 유지 및 분화에 적합한 혈청 대체물 제형 및 배양 배지에 관한 것이다.

Description

줄기세포 배양을 위한 제형 및 방법{FORMULATIONS AND METHODS FOR CULTURING STEM CELLS}
인간 배아줄기세포와 같은 줄기세포의 유도, 유지 및 분화에 사용하기 위한 제노-프리 제형(xeno-free formulations)에 관한 것이다.
인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells (hESCs))는 인체의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 만능 세포이다. 인간 ESCs는 배양시 무제한 증식이 가능하므로 약해지거나 손상된 인간 조직을 대체하기 위한 세포 및 조직을 공급할 수 있기 때문에 커다란 치료적 관심을 모아왔다. 미래에는, 인간 ESCs를 증식시켜 특정 세포 타입으로 분화되도록 지시하여, 이를 치료 목적으로 인체에 이식하거나 약물 발견 및 독성학 연구에 있어서 세포 모델로 사용할 수 있을 것이란 기대가 높다.
배아줄기세포는 자연적인 세포 운명에 따르며 자발적으로 분화되는 경향이 있기 때문에 배양시 유지하기가 어렵다. 대부분의 배양 조건에서는 원치않는 분화가 일정 수준으로 발생한다. 줄기세포는 성장 인자, 세포외 매트릭스 분자 및 성분, 환경적 스트레스 요인 및 직접적인 세포-대-세포 상호반응을 포함한, 수많은 내인성 및 외인성 인자의 결과로 분화된다. 장기간의 증식능, 지속적인 배양 후 만능적 발달 능력 및 핵형(karyotypic) 안정성은 줄기세포 배양의 유용성에 있어서 중요한 특징이다.
미분화 단계의 hESCs는 세포의 형태학적 특징을 판단함으로써 모니터할 수 있다. 미분화된 hESCs는 매우 작고 조밀한 세포를 갖는 특징적인 형태를 갖는다. 일부 분화된 세포가 통상적으로 hESCs 콜로니의 가장자리에 나타나는 한편, 최적의 배양법은 최소량의 분화된 세포를 갖는 성장 지지체(growth support)를 제공한다. 전사 인자 Oct4 및 Nanog 뿐만 아니라 세포 표면 마커 TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-3/4와 같이 미분화 단계의 hESCs의 상태를 트래킹하는데 사용되는 여러 종류의 생화학적 마커가 있다. 이들 마커는 hESCs가 어떠한 세포 계통(cell lineage)으로 분화되기 시작할 때 소실된다.
hESCs를 제조하고 배양하는 기본적인 기술이 기재되어 있다. 그러나, hESCs를 배양하기 위하여 현재 사용되는 수많은 공법에는 한계 및 단점이 있다. 배아줄기세포는 전형적으로 동물 혈청 (특히 우태아 혈청) 또는 다른 동물 유래 생성물을 함유하는 배양 배지에서 유도되고 증식되어 그러한 배양중 목적하는 증식이 이루어지도록 하였다. hESC 배양 배지중 동물 유래 생성물의 존재는 몇가지 문제점을 갖는다. 첫째로, 동물 유래 생성물은 수용자(recipient)에서 면역 반응을 일으켜 이식시 거부반응을 일으키는 독성 단백질 또는 면역원을 함유할 수 있다 (Martin et al., Nat Med. 2005 Feb; 11(2):228-32). 둘째로, 동물 생성물을 사용하게 되면 바이러스, 마이코플라즈마 및 프리온과 같은 동물성 병원체에 의한 감염 위험이 증가하며, 이는 세포 치료 및 기타 임상적 용도에 있어 심각한 건강상의 위험을 제기할 수 있다 (Healy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2005 Dec 12;57(13):1981-8). 사실 정부에서는 그러한 병원체를 함유할 수 있는, 동물 유래 생성물을 함유하는 세포 배양 배지의 사용을 규제, 반대하거나 심지어 금지시키는 추세이다. 셋째로, 세포 배양액 중 비제한 성분(undefined components)이 세포 모델 실험, 예를 들어 약물 발견 및 독성학 연구에서의 반복성을 훼손시킨다.
혈청 또는 동물 추출물을 사용하는 것의 단점을 극복하기 위하여, 수많은 무-혈청(serum-free) 배지가 개발되었다. Price 등은 미국 특허 공보 제2002/0076747호에 hESC 배양에 흔히 사용되는 혈청 대체물인 Knockout™ SR 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 개시하였다. 그러나, 이 제형은 동물 유래 생성물, 예로서 소 혈청 알부민을 함유하며, 따라서 이종-유래 (xeno-derived) 성분이 완전히 없는 것은 아니다. 현재 여러 종류의 제노-프리 혈청 대체물(xeno-free serum replacements)과 배지를 입수할 수 있다 (X-Vivo 10, X-Vivo 20, SSS, Lipumin, Serex, Plasmanate, SR3). 이들 혈청 대체물은 흔히 단일 세포 타입의 배지를 지지하도록 특별하게 조제된 것이다. 또한, Thomson 등은 미국 특허 공보 제2006/0084168호에 무-혈청 및 제노-프리 세포 배양 배지를 개시하고 있는데, 이는 배양 중 ESCs의 성장을 지지한다고 주장되고 있다.
불행하게도, Rajala 등은 Hum. Reprod., 2007, 22(5):1231-1238에서, 상기 언급한 모든 제형이 심각한 분화없이 새로운 배지로의 적응상(adaptation phase) 중에 불과 수회의 계대(passage) 동안만 hESCs의 배양을 허용하며, 이후 다음 계대시 급속하게 분화됨을 증명하였다.
국제 특허 공보 WO 2008/148938에는 레티놀을 포함하는 제노-프리 혈청 대체물과 상기 혈청 대체물을 포함하는 ESCs의 유지 및 분화용 배양 배지가 개시되어 있다. 그러나, 만능(pluripotent) 및 다능(multipotent) 줄기세포를 배양하기 위한 제노-프리 제형을 개선할 필요성이 여전히 존재한다.
몇가지의 피더-프리(feeder-free) 배양법이 hESCs용으로 개발되었다. 이들 피더-프리 방법 중 많은 것들이 동물 유래 성분을 이용한다. 또한, 이들 방법은 부적합한 재현성으로 어려움을 겪고 있으며 현재는 안정하고 정상적인 핵형을 갖는 미분화 hESCs의 장기간의 유지용으로는 사용할 수 없다. 효소적으로 계대시키는 피더-프리 배양법은 또한 hESCs에 대해 매우 힘든 것이어서 이들 세포가 더욱 비정상적이 되기 쉬울 수 있다.
hESCs용으로 현재 공지된 배양 배지와 관련한 이들 문제점 때문에, 만능성과 정상적인 세포 핵형을 유지하면서 실질적인 분화없이 장기간 hESCs의 강력한 성장을 재현적으로 지지하며, 기대되는 조절 가이드라인 관리 임상 안전성 및 효과 뿐만 아니라 약물 발견 및 독성학 검증에 사용되는 시험관내 세포 모델에 대해 표준화된 방법과 양립할 수 있는 정성 제노-프리 배양 배지(defined xeno-free culture medium)에 대한 필요성이 크다.
본 발명은 임상-등급(clinical-grade)의 줄기세포의 유도, 유지 및 분화를 위한 수단 및 방법을 제공한다. 더욱 상세하게, 본 발명은 혈청 대체물, 상기 혈청 대체물을 포함하는 최종 배양 배지, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 공액 리놀레산 및 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid(EPA))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방산을 적어도 하나 포함하는 제노-프리 혈청 대체물을 제공하는 것이다. 하나의 양태로, 상기 공액 리놀레산(conjugated linoleic acid (CLA))의 농도는 상기 혈청 대체물로 보충되는 기본 배지인, 최종 배양 배지가 CLA를 약 0.5 ㎎/ℓ 내지 약 5 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이고, 에이코사펜타에노산(EPA)의 농도는 최종 배양 배지가 EPA를 약 1 ㎎/ℓ 내지 약 10 ㎎/ℓ포함하도록 하는 양이다.
하나의 양태로, 상기 혈청 대체물이 액티빈 A(Activin A) 및(또는) 레티놀을 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태로, 액티빈 A의 농도는 최종 배양 배지가 액티빈 A를 약 0.001 ㎎/ℓ 내지 약 0.02 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이고(이거나) 레티놀의 농도는 최종 배양 배지가 레티놀을 약 0.25 ㎎/ℓ 내지 약 1.0 ㎎/ℓ포함하도록 하는 양이다.
또다른 양태로, 상기 혈청 대체물이 스테아르산을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 양태로, 상기 스테아르산의 농도는 최종 배양 배지가 스테아르산을 약 0.5 ㎎/ℓ 내지 약 5 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이다.
본 발명의 다른 목적은 기본 배지 및 본 발명의 양태에 따르는 혈청 대체물을 포함하는 제노-프리(xeno-free) 세포 배양 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 줄기세포의 유지, 증식 또는 분화를 위한 본 발명의 혈청 대체물 또는 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 줄기세포의 유도 또는 분리를 위한 본 발명의 혈청 대체물 또는 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 새로운 줄기세포주를 시험관 내에서 개시시키는(initiating) 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 a) 목적하는 기원의 분리된 세포를 제공하는 단계, b) 상기 세포를 본 발명의 제노-프리 배양 배지와 접촉시키는 단계, 및 c) 상기 세포를 줄기세포 배양에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함한다. 하나의 양태로, 상기 배양을 피더세포층(feeder cell layer) 상에서 수행할 수 있다. 하나의 양태로, 상기 분리된 세포가 배아, 성체 체세포, 또는 중간엽 세포 기원의 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 a) 상기 줄기세포를 본 발명의 제노-프리 배지와 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 세포를 줄기세포 배양에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함한다. 하나의 양태로, 상기 배양을 피더세포층 상에서 수행할 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 수많은 시험관내 계대에 걸쳐 실질적으로 분화되지 않은 상태로 줄기세포의 유지 및 증식을 지지할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 줄기세포는 실질적으로 분화되지 않으며, 이들의 만능성 또는 다능성을 보유하고 이들의 유전체 안전성(genomic integrity)을 유지한다.
또한, 본 발명의 목적은 줄기세포를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 a) 상기 줄기세포를 성장 인자 또는 분화 세포(예, END2 세포)와 같은 분화제가 보충된 본 발명의 제노-프리 배지와 접촉시키는 단계, 및 b) 상기 세포를 줄기세포의 분화에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 기타 목적, 양태, 세부사항 및 장점은 이후의 도면, 상세한 설명 및 실시예로부터 자명해질 것이다.
하기에서 첨부되는 도면을 참고로 바람직한 양태를 사용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.
도 1a 내지 1d는 5 계대 동안 상이한 삼투압 농도(osmolarity)의 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 hESC 세포주 HS401의 광학 현미경 화상이다: 260 mOsm (도 1a), 290 mOsm (도 1b), 320 mOsm (도 1c) 및 350 mOsm (도 1d). 스케일 바 500 ㎛.
도 2a 내지 2b는 본 발명에 따르는 배양 배지 중에서 지질 및 지질 유도체의 존재하에 배양시킨 hESCs의 형태학 및 분화 단계를 나타낸다. UD, PD 및 DIFF는 각각 미분화, 부분적 분화 및 분화된 hESC 콜로니를 나타낸다. 도 2a) 상이한 지질과 지질 유도체가 보충된 본 발명에 따르는 배양 배지중에서 배양시킨 HS401 세포주. 도 2b) 상이한 지질과 지질 유도체가 보충된 대조용 hES 배지에서 배양시킨 HS401 세포주.
도 3a 내지 3f는 레티놀에 대한 반응으로 줄기세포 마커의 증식 및 발현에서의 증가를 증명한다. 도 3a) 레티놀을 사용하지 않고 5 계대 동안 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 3일째에서의 hESCs (Regea 07/046)의 명시야 현미경(bright-field microscope) 화상. 도 3b) 레티놀 2.0 μM을 함유하는 본 발명에 따르는 배양 배지에서 5 계대 동안 배양시킨 3일째에서의 hESCs (Regea 07/046)의 명시야 현미경 화상. 콜로니의 크기는 레티놀을 사용하지 않고 배양시킨 콜로니와 비교할 때 레티놀이 존재하는 경우에 더 크다. 스케일 바 500 ㎛. 도 3c-3d) 레티놀 2.0 μM을 함유하는 본 발명에 따르는 배양 배지에서 12 계대 동안 배양시킨 hESCs (HS401)의 형광 현미경 화상으로 Nanog와 TRA-1-81의 포지티브 발현을 나타낸다. 삽도(insets)는 DAPI 염색을 나타낸다. 스케일 바 200 ㎛. 도 3e) 레티놀을 사용하지 않는 경우와 레티놀 0.5, 2.0 및 3.5 μM의 존재하에서의 본 발명에 따르는 배양 배지에서 10 계대 동안 배양시킨 hESC 세포주 Regea 07/046의 세포 증식 분석. 도 3f) 레티놀을 사용하지 않는 경우와 레티놀 0.5, 2.0 및 3.5 μM의 존재하에서의 본 발명에 따르는 배양 배지에서 10 계대 동안 배양시킨 hESC 세포주 Regea 07/046에서의 Oct4, GDF3, DNMT3B, TDGF1 및 Nanog 발현의 정량적 RT-PCR 분석.
도 4a 내지 4c는 액티빈 A에 대한 반응으로 줄기세포 마커의 증식 및 발현에서의 증가를 증명한다. 도 4a) 액티빈 A 5 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 부재 및 존재하에 본 발명에 따르는 배양 배지 및 hES 대조용 배지에서 10 계대 동안 배양시킨 hESC 세포주 Regea 07/046의 세포 증식 분석. 도 4b) 액티빈 A 5 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 부재 및 존재하에 본 발명에 따르는 배양 배지 및 hES 대조용 배지에서 10 계대 동안 배양시킨 hESC 세포주 Regea 07/046에서의 Nanog, Oct4, GDF3, DNMT3B, GABRB3 및 GDF3 발현의 정량적 RT-PCR 분석. 도 4c) 액티빈 A 5 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 부재 및 존재하에 본 발명에 따르는 배양 배지 및 hES 대조용 배지에서 10 계대 동안 배양시킨 hESC 세포주 Regea 07/046의 SSEA4 및 TRA-1-60 줄기세포 마커의 FACS 분석.
도 5a 내지 5j는 본 발명에 따르는 배양 배지에서 유도되고 장기간 동안 배양시킨 hESC 세포주의 특성해석(characterization)을 나타낸다. 도 5a) Giemsa 밴드 핵형도는 계대 36에서의 hESC 세포주 Regea 07/046, 계대 25에서의 Regea 08/013, 및 계대 71에서의 Regea 06/040의 정상적인 핵형을 나타낸다. 도 5b) 계대 45에서의 Regea 07/046, 계대 41에서의 Regea 08/013, 및 계대 26에서의 Regea 06/040의 7일째 hESC 세포주의 SSEA-4 및 TRA-1-81의 발현을 나타내는 정량적 FACS 분석. 도 5c) 계대 29에서의 hESC 세포주 Regea 06/040, 계대 53에서의 Regea 07/046 및 계대 41에서의 Regea 08/013의 세포 증식 분석. 도 5d) 계대 52에서의 hESC 세포주 Regea 07/046, 계대 45에서의 Regea 08/013, 및 계대 33에서의 Regea 06/040에서의 Nanog, Oct4, GABRB3, GDF3, DNMT3B 및 TDGF1 발현의 정량적 RT-PCR 분석. 도 5e) 계대 1에서의 본 발명에 따르는 배양 배지중에서 동결 및 후속되는 해동 후 hESC 세포주 07/046(p33)의 미분화 콜로니 형태를 나타내는 명시야 (스케일 바, 500 ㎛) 현미경 화상. 도 5f) 하우스키핑(housekeeping) 대조물로서 AFP 및 SOX-17(내배엽 마커), α-cardiac actin 및 T (Brachyury; 중배엽 마커), SOX-1 및 PAX6 (외배엽 마커), 및 β-actin에 대한 전사물을 나타내는 시험관내-유도된 EBs의 RT-PCR 분석. 레인 1, 50-bp DNA 래더. 계대 42에서의 Regea 07/046, 계대 35에서의 Regea 08/013, 및 계대 101에서의 Regea 06/040. 도 5g) hESC 세포주 Regea 08/013으로부터 분화된 심근세포(cardiomyocytes)를 cardiac troponin T로 포지티브하게 착색시킨다. 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 5h) hESC 세포주 Regea 08/013으로부터 분화된 심근세포를 심실 미오신 중쇄로 포지티브하게 착색시킨다. 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 5i) 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 hESC 세포주 Regea 08/013으로부터 유도된 신경구(neurospheres)의 RT-PCR 분석은 신경 전구체 마커 Musashi, Nestin 및 PAX6; 뉴런 마커 MAP-2, NF68 및 OTX2; 및 성상세포 마커 GFAP의 발현을 나타냈다. 만능 마커 Oct4 및 Nanog의 발현이나, 내배엽-AFP 또는 중배엽 마커 T/Brachyury의 발현은 검출되지 않았다. 도 5j) 플레이팅된 신경구로부터 이동하는 대부분의 세포가 뉴런 마커 MAP-2에 대해 포지티브하게 착색되었으며 거의 모든 세포가 성상세포 마커 GFAP에 대해 포지티브하지 않았다. 스케일 바는 100 ㎛이다.
도 6a 내지 6c는 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 인간 유발된 만능 줄기세포 (human induced pluripotent stem cell(iPS 세포))의 특성해석을 나타낸다. 도 6a) hES 배지 및 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 인간 iPS 세포주의 SSEA-4 및 TRA-1-81의 발현을 나타내는 정량적 FACS 분석. hES 배지에서 배양시킨 세포 샘플은 6일령(6 days old) 콜로니로부터 수득하며, 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 iPS 세포주 A로부터의 세포 샘플은 7일령 콜로니로부터, iPS 세포주 B로부터의 샘플은 8일령 콜로니로부터 수득한다. 본 발명에 따르는 배양 배지중, 계대 15에서의 hES 배지, 계대 14에서의 본 발명에 따르는 배양 배지에서 세포주 A 및 계대 16에서의 hES 배지, 계대 7에서의 본 발명에 따르는 배양 배지에서 iPS 세포주 B. 도 6b) 계대 10에서의 hES 배지, 계대 7에서의 본 발명에 따르는 배양 배지에서 iPS 세포주 A와, 계대 11에서의 hES 배지, 계대 8에서의 본 발명에 따르는 배양 배지에서 iPS 세포주 B에서 6일령 콜로니의 Nanog, Oct4, GABRB3, GDF3, DNMT3B 및 TDGF1 발현의 정량적 RT-PCR 분석. 도 6c) 하우스키핑 대조물로서 AFP 및 SOX-17(내배엽 마커), α-cardiac actin 및 T (Brachyury; 중배엽 마커), SOX-1 및 PAX6 (외배엽 마커), 및 β-actin에 대한 전사물을 나타내는 시험관내-유도된 EBs의 RT-PCR 분석. 레인 1, 50-bp DNA 래더. 두 세포주 모두 계대 10에서 수득한다.
도 7a 내지 7e는 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 인간 지방 줄기세포(adipose stem cells(ASCs))의 특성해석을 나타낸다. 도 7a) 인간 혈청 (HS) 함유 배지에서 배양시킨 8일째의 ASCs의 형태학. (스케일 바 500 ㎛). 도 7b) 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 8일째의 ASCs의 형태학. (스케일 바 500 ㎛). 도 7c) HS 배지에서 배양시킨 11일째의 ASCs의 형태학. (스케일 바 500 ㎛). 도 7d) 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 11일째의 ASCs의 형태학. (스케일 바 500 ㎛). 도 7e) WST-1 증식 검정법. ASCs의 증식은 1, 4, 7, 및 11일째 날에 분석한, HS 배지 및 본 발명에 따르는 배양 배지에서 조사하였다. 다이어그램에서의 데이타는 평균±SD로 제시된다. *p<0.05 (4개의 반복 웰에 대해 n=7 공여체).
본 발명은 임상-등급의 줄기세포의 유도, 유지 및 분화를 위한 수단 및 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 제노-프리 혈청 대체물 제형 및 상기 혈청 대체물을 포함하는 배양 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 줄기세포 유도, 배양, 유지 및 분화를 위한 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 줄기세포의 시험관내 유도, 유지, 증식, 또는 분화용으로 사용하기에 적합한 기본 배지를 보충하기 위하여 사용할 수 있는 정성(定性, 또는 defined) 제노-프리 혈청 대체물 제형 또는 조성물을 제공한다. 용도에 따라서, 상기 혈청 대체물을 무-혈청 또는 혈청-함유 기본 배지, 또는 이들의 조합물을 보충하기 위하여 사용할 수 있다. 제노-프리 기본 배지를 본 발명의 제노-프리 혈청 대체물로 보충할 경우, 최종 배양 배지 또한 제노-프리(무-이종, xeno-free)이다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 만능 및 다능 줄기세포 둘 다를 포함한다. 배아 줄기세포(ESCs)는 광범위하게 다양한 상이한 세포 타입으로 분화될 수 있는 만능 세포이다. 진정한 배아 줄기세포주는 (i) 미분화된 상태로 시험관내에서 무제한 증식을 할 수 있고; (ii) 모두 3종의 배아 생식세포 층(내배엽, 중배엽, 및 외배엽)의 유도체로 분화, 심지어 지속적인 배양 후에도 분화될 수 있으며; (iii) 지속적인 배양 내내 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 그러므로, 배아 줄기세포가 만능으로 언급되는 것이다.
유도 만능 줄기세포(iPS cells)는 만능줄기세포의 다른 예이다. iPS 세포는 분화된 세포로부터, 전형적으로는 발달 재프로그래밍에 의해 섬유아세포와 같은 성체 체세포로부터 발생된다. 그러한 세포가 WO 2008/151058 및 US 2008/076176에 기재되어있다.
다능 줄기세포로는, 비제한적으로, 조혈모세포 및 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells (MSCs))가 있으며, 이들은 다양한 세포 타입으로 분화될 수 있는 성체줄기세포이다. MSCs는 골수 및 지방조직을 포함한 상이한 공급원으로부터 분리시킬 수 있다. 지방조직으로부터 유래된 MSCs를 지방줄기세포(ASCs)로 언급한다.
당해 분야에는 배아 및 성체줄기세포 둘 다에 대한 정보가 넘쳐난다. 본 발명에 따라서 배양시킨, hESCs를 포함한 줄기세포는 비제한적으로 면역절제술을 포함한 적합한 기술을 사용하여 적합한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 배아줄기세포를 분리시키고 성장시키기 위한 공법이 미국 특허 제6,090,622호에 기재되어 있다. Rhesus 원숭이 및 기타-비 인간 영장류 배아줄기세포을 수득하기 위한 공법이 미국 특허 제5,843,78호 및 국제 특허 공보 WO 96/22362에 기재되어 있다. 또한, Rhesus 원숭이 배아줄기세포를 분리시키는 방법이 Thomson et al., (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848)에 기재되어 있다. 난할구 생검(biopsy)은 매력적인 새로운 기술로 이는 공여체 배아를 손상시키지 않고 배아줄기세포의 분리 및 증식을 가능하게 한다. 줄기세포를 수득하는 다른 방법을 당해 분야에서 용이하게 입수할 수 있다.
본 명세서에 제공되는 수단 및 방법은 어떠한 목적하는 동물, 바람직하게는 인간, 원숭이, 및 유인원과 같은 영장류를 포함한 포유동물, 뿐만 아니라 마우스, 래트, 말, 양, 팬더, 염소 및 얼룰말과 같은 비-영장류 포유동물로부터 유래된 줄기세포에 적용시킬 수 있다.
"제노-프리(xeno-free)"란 용어는 본 명세서에서 반응물질(reagent)의 기원이 외부 공급원으로부터가 아닌 것, 즉, 인간 줄기세포를 배양시키고자 할 경우 비-인간 동물 기원의 물질을 함유하지 않음을 의미한다. 마찬가지로, 예를 들어, 뮤린 줄기세포 배양은 제노-프리이기 위해서는 어떠한 마우스 유래 물질의 부재하에서 수행되어야 한다. 인간 줄기세포를 배양하기에 적합한 제노-프리 공급원은 세균, 효모, 진균, 식물 및 인간으로부터의 당해 반응물질의 화학적 합성법 또는 합성 제제 또는 분리, 제조 또는 정제를 포함할 수 있다.
용어 "혈청 대체물(serum replacement)"은 본 명세서에서 최종 세포 배양 배지에서 동물 혈청을 대체하는데 사용될 수 있는 제형을 의미한다. 통상의 혈청 대체물은 전형적으로 비타민, 알부민, 지질, 아미노산, 트랜스페린, 항산화제, 인슐린 및 미량 원소를 포함한다. 최종 세포 배양 배지는 또한 기본 배지에 직접 첨가되거나 혈청 대체물에 추가로 포함되는 성장 인자, 비-필수 아미노산, β-머캅토에탄올, L-글루타민 및(또는) 항생제를 포함할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러, 공액 리놀레산 (CLA) 및(또는) 에이코사펜타에노산(EPA)가 미분화 상태의 줄기세포를 유지하는데 있어서 탁월한 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 시험된 다양한 지질 및 지질 유도체 중에서, 이들 2종의 지방산이 미분화 형태를 유지하고, 미분화 콜로니의 수를 증가시키며, 줄기세포의 만능성 또는 다능성을 보유하는데 있어서 탁월하였다.
따라서, 본 발명에 따르는 혈청 대체물은 공액 리놀레산 및 에이코사펜타에노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방산을 적어도 하나 포함하는 제노-프리 제형이다. 상기 혈청 대체물 중 CLA의 바람직한 농도 범위는 최종 배양 배지가 CLA를 약 0.5 ㎎/ℓ 내지 약 5 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 CLA를 약 2.5 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이다. 상기 혈청 대체물 중 EPA의 바람직한 농도 범위는 최종 배양 배지가 EPA를 약 1 ㎎/ℓ 내지 약 10 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 EPA를 약 5 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이다. 따라서, 기본 배지가 20% (vol/vol) 혈청 대체물로 보충되어 최종 배양 배지에 도달하도록 하는 양태에서, 상기 혈청 대체물은 CLA를 약 2.5 ㎎/ℓ 내지 약 25 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 약 12.5 ㎎/ℓ 포함하고(하거나) EPA를 약 5 ㎎/ℓ 내지 약 50 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 25 ㎎/ℓ 포함한다. 혈청 대체물을 상이한 퍼센트를 갖는 기본 배지에 첨가하는 형태로 제공할 수 있으며, 따라서, 이에 의해 개별 성분의 농도가 변화된다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 자명하다.
본 발명의 혈청 대체물에 사용하기에 다음으로 좋은 지방산은 스테아르산이다. 상기 혈청 대체물 중 스테아르산의 바람직한 농도 범위는 최종 배양 배지가 스테아르산을 약 0.5 ㎎/ℓ 내지 약 5 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 스테아르산을 약 2.5 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이다. 따라서, 기본 배지가 20% (vol/vol) 혈청 대체물로 보충되어 최종 배양 배지에 도달하도록 하는 양태에서, 상기 혈청 대체물은 스테아르산을 약 2.5 ㎎/ℓ 내지 약 25 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 약 12.5 ㎎/ℓ 포함한다.
놀랍게도, 액티빈 A가, 특히 CLA 및(또는) EPA와 함께 줄기세포 증식 및 줄기세포 마커, 예로서 Nanog, Oct4, GDF3, DNMT3B, GABRB3 및 GDF3의 발현을 증진시키는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명에 따르는 혈청 대체물은 추가로 액티빈 A(Activin A)를 포함할 수 있다. 상기 혈청 대체물 중 액티빈 A의 바람직한 농도 범위는 최종 배양 배지가 액티빈 A를 약 0.001 ㎎/ℓ 내지 약 0.02 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 약 0.005 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이다. 그러므로, 기본 배지가 20% (vol/vol) 혈청 대체물로 보충되어 최종 배양 배지에 도달하도록 하는 양태에서, 상기 혈청 대체물은 액티빈 A를 약 0.005 ㎎/ℓ 내지 약 0.1 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 약 0.025 ㎎/ℓ 포함한다.
또한, 레티놀, 즉, 비타민 A가 매우 낮은 농도에서 줄기세포의 미분화 성장을 지지하는 것으로 밝혀졌다. 레티놀의 유효한 농도 범위는 WO 2008/148938에 개시된 것 보다 약 10배 더 낮다. 레티놀을 CLA 및(또는) EPA와 함께 사용할 때 특히 양호한 결과가 수득되며, 액티빈 A의 존재하에서 훨씬 더 좋은 결과가 수득된다. 상기 혈청 대체물 중 레티놀의 바람직한 농도 범위는 최종 배양 배지가 레티놀을 약 0.25 ㎎/ℓ 내지 약 1.0 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 레티놀을 약 0.57 ㎎/ℓ 포함하도록 하는 양이다. 따라서, 기본 배지가 20% (vol/vol) 혈청 대체물로 보충되어 최종 배양 배지에 도달하도록 하는 양태에서, 상기 혈청 대체물은 레티놀을 약 1.25 ㎎/ℓ 내지 약 5.0 ㎎/ℓ, 더욱 특정하게는 약 2.85 ㎎/ℓ 포함한다.
줄기세포에 대한 각 성분들의 효과
줄기세포 형태에 대한 효과 줄기세포 증식에 대한 효과 줄기세포 자가-재생에 대한 효과
레티놀을 포함하는 혈청 대체물 +++ +++ ++
액티빈 A를 포함하는 혈청 대체물 + +++ +++
CLA를 포함하는 혈청 대체물 ++ + ++
EPA를 포함하는 혈청 대체물 ++ + +++
레티놀, 액티빈 A를 포함하는 혈청 대체물 +++ ++++ ++++
레티놀, 액티빈 A, CLA 및(또는) EPA를 포함하는 혈청 대체물 +++++ ++++ +++++
바람직한 양태 중 하나로, 본 발명에 따르는 혈청 대체물이 액티빈 A와 CLA 및(또는) EPA를 포함한다. 다른 바람직한 양태로, 본 발명의 혈청 대체물이 레티놀과 CLA 및(또는) EPA를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태로, 본 발명의 혈청 대체물이 액티빈 A, 레티놀과, CLA 및(또는) EPA를 포함한다. 이들 성분들의 바람직한 농도는 상기 제시되어 있다. 이들 양태에 따르는 각각 및 모든 혈청 대체물은 추가로 스테아르산을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로, 본 발명의 혈청 대체물은 상기 제시된 성분 외에, 지질 또는 지질 유도체, 비타민, 알부민 또는 알부민 대체물, 아미노산, 비타민, 트랜스페린, 트랜스페린 대체물, 항산화제, 인슐린 또는 인슐린 대체물, 미량 원소, 및 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분, 바람직하게는 내독소가 없는 성분을 적어도 1종을 포함한다. 그러한 성분은 줄기세포의 만능성과 핵형을 둘다 유지하면서, 실질적으로 미분화 상태로 줄기세포가 증식되는 것을 지지하기에 충분한 농도로 본 발명의 혈청 대체물에 존재하게 된다.
따라서, 본 발명에 따르는 혈청 대체물은 비제한적으로, 리포단백질, 예로서 초저밀도 리포단백질(VLDL), 저밀도 리포단백질(LDL), 고밀도 리포단백질(HDL) 및 콜레스테롤; 인지질, 예로서 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 및 포스파티딜에탄올아민; 지방산, 예로서 리놀레산, 감마-리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 올레산, 도코사헥사에노산, 팔미트산, 팔미톨레산, 미리스트산 및 이들의 유도체, 예로서 프로스타글란딘을 포함한, 다른 지질 또는 지질 유도체 중 적어도 1종을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 양태에 따라서, 본 발명의 혈청 대체물은 예를 들어, 적어도 2종, 적어도 3종 또는 적어도 4종의 상기 제시된 지질 또는 지질 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 혈청 대체물은 레티놀을 제외한 다른 비타민, 예로서 아스코르브산, 바이오틴, 콜린 클로라이드, D-Ca 판토테네이트, 엽산(Folic acid), 이노시톨, 나이아신아미드, 피리독살, 피리돈신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12, 비타민 D2를 추가로 함유할 수 있다. 전형적으로 수종의 비타민이 기본 배지에 포함되며 추가의 비타민 보조제가 최종 배지에 첨가될 수 있다. 전형적으로, 티아민은 약 9 ㎎/ℓ의 농도로 사용되는 반면, 아스코르브산은 본 발명에 따르는 세포 배양 배지에 약 50 ㎍/㎖의 농도로 사용된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 알부민 대체물로는 알부민 대신 사용될 수 있으며 알부민과 필수적으로 유사한 효과를 갖는 화합물을 포함한다. 본 발명에 따르는 혈청 대체물 및 최종 배양 배지중 알부민 또는 알부민 대체물의 적합한 농도는 당해 분야에 숙지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 알부민 또는 알부민 대체물은 최종 배지에 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 15 ㎎/㎖의 농도로 사용된다. 하나의 양태로, 알부민이 본 발명에 따르는 세포 배양 배지에 약 10 ㎎/㎖으로 존재한다.
페투인(fetuin), α-페토단백질, 및 이들의 조합물을 사용하여 혈청 대체물에서 알부민을 대체할 수 있다. 그러나, 이들의 높은 단가로 인하여, 이들을 알부민과 함께 사용하는 것이 실현가능할 수 있다. 하나의 바람직한 양태로, 혈청 대체물이 페투인 약 0.5 ㎎/㎖과 α-페토단백질 약 0.25 ㎎/㎖을 포함한다. 그러한 양태에서는, 기본 배지를 20% 혈청 대체물로 보충하여야 한다. 일반적으로, 전형적인 최종 세포 배양 배지는 페투인 및(또는) α-페토단백질을 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖ 포함한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 아미노산으로는 비제한적으로, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라민, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 및 이들의 D-형태 및 유도체와 같은 아미노산이 있다. 아미노산의 적합한 농도는 당해 분야에 숙지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적인 농도 범위가 표 3에 제시되어 있다. 본 발명에 따르는 혈청 대체물은 추가의 비-필수 아미노산, 예로서 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, 글리신, L-프롤린, L-세린, 및 이들의 D-형태 및 유도체를 함유할 수 있다. 그러한 추가적인 비-필수 아미노산은 본 발명에 따르는 혈청 대체물에 포함되거나 최종 세포 배양 배지에 직접 첨가될 수 있다. 비-필수 아미노산은 상업적으로 입수가능한 혼합물로서, 예로서 Invitrogen에 의해 제공되는 MEM 비-필수 아미노산(NEAA)으로 제공될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따르는 최종 배지 중 상기 혼합물의 농도는 약 1%이다.
L-글루타민이 본 발명에 따르는 세포 배양 배지에 안정화된, 디펩타이드 형태의 L-글루타민으로서, 예로서 Glutamax (Invitrogen, 2 mM)로서 바람직하게 첨가된다. 요구될 때, L-글루타민이 본 발명에 따르는 혈청 대체물에 포함될 수 있다.
트랜스페린은 철을 세포로 전달하고, 생물학적 유액중 유리 철 농도를 조정하며 철-매개된 자유 라디칼 독성을 방지하는데 연루되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 트랜스페린 대체물은 트랜스페린 대신 사용될 수 있으며 트랜스페린과 필수적으로 유사한 효과를 갖는 화합물을 포함한다. 그러한 대체물로는, 비제한적으로, 철염 및 킬레이트 (예, 구연산철 킬레이트 또는 황산제일철)가 있다. 본 발명에 따르는 혈청 대체물 및 최종 배지 중 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물의 적합한 농도는 당해 분야에 숙지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물은 본 발명에 따르는 최종 배지에 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 하나의 양태로, 트랜스페린이 본 발명에 따르는 세포 배양 배지에 약 8 ㎍/㎖으로 존재한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 항산화제로는 비제한적으로, 글루타티온 및 아스코르브산이 있다. 본 발명에 따르는 혈청 대체물 및 최종 배지 중 항산화제의 적합한 농도는 당해 분야에 숙지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 하나의 양태에 따라서, 글루타티온이 본 발명에 따르는 세포 배양 배지에 1.5 ㎍/㎖ 존재하고 아스코르브산이 50 ㎍/㎖로 존재한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 인슐린 대체물은 인슐린 대신 사용될 수 있으며 인슐린과 필수적으로 유사한 효과를 갖는 화합물을 포함한다. 본 발명에 따르는 혈청 대체물 및 최종 배지 중 인슐린 또는 인슐린 대체물의 적합한 농도는 당해 분야에 숙지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 인슐린 또는 인슐린 대체물은 본 발명에 따르는 최종 배지에 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 15 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 하나의 양태로, 인슐린이 본 발명에 따르는 세포 배양 배지에 약 10 ㎍/㎖으로 존재한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 미량 원소로는 비제한적으로, Mn2+, Si4+, Mo6+, V5+, Ni2+, Sn2+, Al3+, Ag+, Ba2+, Br-, Cd2+, Co2+, Cr3+, F-, Ge4+, I-, Rb+, Zr4+ 및 Se4+와 이들의 염이 있다. 미량 원소 또는 이들의 염의 적합한 농도는 당해 분야에 숙지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 미량 원소 조성물, 예로서 CellGro Mediatech Inc.에 의해 공급되는 Trace Elements B 및 C가 또한 사용될 수 있다. 요구될 때, 미량 원소 Cu2+ 및(또는) Zn2+가 예를 들어, CellGro Mediatech Inc.에 의해 공급되는 상업적으로 입수가능한 Trace Elements A 조성물의 형태로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 염화리튬(lithium chloride)이 배아줄기세포에 대해 유해하여 이들의 분화를 일으킬 수 있음을 밝혀냈다. 따라서, 특정 양태로, 본 발명의 혈청 대체물에 염화리튬이 없다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 성장 인자로는 기본적인 FGF (bFGF 또는 FGF-2)와 같은 섬유아세포 성장인자(FGFs)가 있다. 본 발명에 따르는 최종 배지중 FGF의 적합한 범위는 약 1 ng/㎖ 내지 약 1000 ng/㎖, 바람직하게는 약 2 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 더욱 바람직하게는 약 4 ng/㎖ 내지 약 20 ng/㎖이다. 하나의 양태로, FGF가 약 8 ng/㎖로 존재한다. FGF가 바람직하게 사용되는 한편, 기타 물질, 예로서 섬유아세포 성장 인자 수용체를 활성화시키도록 디자인된 특정의 합성 소 펩타이드 (예, 재조합 DNA 변이체 또는 돌연변이체에 의해 생산된 것)를 FGF 대신 사용될 수 있다. 성장 인자는 본 발명에 따르는 혈청 대체물 중에 포함될 수 있거나 이들은 본 발명에 따르는 최종 세포 배양 배지에 별도로 첨가될 수 있다.
본 발명에 따르는 혈청 대체물 또는 배지의 오염을 방지하기 위하여 항생제가 또한 사용될 수 있다. 적합한 항생제 또는 이들의 조합물, 뿐만 아니라 적합한 농도는 당해 분야의 숙련가에게 자명하다. 그러나, 배지를 임상적 용도로 세포의 배양에 사용하고자 할 경우, 항생제의 사용을 피하는 것을 원할 수 있다.
또한, β-머캅토에탄올이 본 발명에 따르는 혈청 대체물에 포함될 수 있거나 본 발명에 따르는 최종 배양 배지에 따로 첨가될 수 있다. 전형적으로, β-머캅토에탄올의 최종 농도는 배양 배지중에서 약 0.1 mM이다.
본 발명의 확실한 양태로, 상기한 혈청 대체물의 성분 중 어느 하나를 기본 배지에 직접 가하여 본 발명에 따르는 혈청 대체물로 제공되는 대신 최종 세포 배양 배지를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 줄기세포의 시험관내 유도, 유지, 증식 및 분화를 위한 정성(defined) 제노-프리 배양 배지를 제공한다. 상기 배양 배지는 기본 배지와 본 명세서에 기재된 혈청 대체물 조성물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 기본 배지로는 비제한적으로, KnockOut Dulbecco's Modified Eagle's Medium (KO-DMEM), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, a Minimal Essential Medium (aMEM), Glasgow's Minimal Essential Medium (G-MEM), Iscove's Modified Dulbecco's Medium and HyQ ADCF-MAb (HyClone) 및 이들의 조합물이 있다. 바람직한 양태 중 하나에 따르면, 기본 배지가 KO-DMEM이다.
용어 "기본 배지"는 줄기세포의 성장을 지지할 수 있으며, 일반적으로 표준 무기염, 비타민, 글루코오스, 완충 시스템 및 필수 아미노산을 공급하는 배지를 언급한다. 바람직하게는, 기본 배지를 중탄산나트륨 약 1 g/ℓ 내지 약 3.7 g/ℓ로 보충할 수 있다. 바람직하게는, 기본 배지를 중탄산나트륨 약 2.2 g/ℓ으로 보충한다.
본 발명의 혈청 대체물로 보충할 기본 배지는 자체가 제노-프리일 수 있거나 예를 들어, 혈청으로 추가 보충될 수 있다.
배지의 삼투압 농도(osmolarity)는 줄기세포 배양의 성공과 활력(vitality)에 영향을 준다. 밀리-오스몰로 측정된 삼투압 농도(오스몰 농도)는 용액 중 용해된 입자의 수의 척도로, 이는 용액이 생성하는 삼투압의 측정치이다. 정상인 혈청의 삼투압 농도는 약 290 밀리-오스몰이다. 다른 포유동물 세포의 시험관내 배양용 배지의 삼투압 농도는 가변적이지만, 일부 배지의 삼투압 농도는 최대 330 밀리-오스몰이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 배지의 삼투압 농도는 약 280 내지 약 330 mOsmol이다. 그러나, 상기 배지의 삼투압 농도는 낮아야 약 260 mOsmol이고 높아야 약 340 mOsmol이다. 본 발명에 따르는 하나의 양태로, hESCs는 약 320 내지 330 밀리-오스몰의 삼투압 농도에서 성장시킨다.
하나의 양태에 따라서, 지질, 알부민, 아미노산, 비타민, 트랜스페린, 항산화제, 인슐린, 및 미량 원소가 본 발명의 혈청 대체물에 포함되는 한편, 성장 인자, 비-필수 아미노산, β-머캅토에탄올, L-글루타민 및 항생제는 세포 배양 배지에 직접 첨가된다. 바람직한 배양 배지의 최종 조성이 표 2에 예시된다.
본 발명에 따르는 바람직한 배양 배지의 최종 조성
성분 바람직한 배양 배지 중 농도 (mg/l) 전형적인 농도 범위 (mg/ml)
제형 1 제형 2 제형 3 제형 4
지방산*
공액 리놀레산 2.5 2.5 2.5 2.5 0-1000
및(또는)
에이코사펜타에노산 5 5 5 5 0-1000
아미노산*
글리신 53 53 53 53 0-200
L-히스티딘 183 183 183 183 0-250
L-이소류신 615 615 615 615 0-700
L-메티오닌 44 44 44 44 0-200
L-페닐알라닌 336 336 336 336 0-400
L-프롤린 600 600 600 600 0-1000
L-히드록시프롤린 15 15 15 15 0-100
L-세린 162 162 162 162 0-250
L-트레오닌 425 425 425 425 0-500
L-트립토판 82 82 82 82 0-100
L-티로신 84 84 84 84 0-100
L-발린 454 454 454 454 0-500
비타민*
티아민 9 9 9 9 0-20
레티놀 0.57 0.57 0-100
항산화제*
글루타티온 1.5 1.5 1.5 1.5 0-20
아스코르브산 50 50 50 50 0-200
단백질
인간 혈청 알부민* 10000 10000 10000 10000 0-50000
인슐린* 10 10 10 10 0-200
트랜스페린* 8 8 8 8 0-200
FGF 0.008 0.008 0.008 0.008 0.004-0.5
액티빈 A 0.005 0.005 0-0.5
미량 원소*
MnSO4·H2O 0.17 0.17 0.17 0.17 0-10
Na2SiO3·9H2O 140 140 140 140 0-200
몰리브드산 암모늄염 1.24
 1.24
 1.24
 1.24
 0-10
NH4VO3 0.65 0.65 0.65 0.65 0-10
NiSO4·6H2O 0.13 0.13 0.13 0.13 0-10
SnCl2 (무수) 0.12 0.12 0.12 0.12 0-10
AlCl3·6H2O 1.20 1.20 1.20 1.20 0-10
AgNO3 0.17 0.17 0.17 0.17 0-10
Ba(C2H3O2)2 2.55 2.55 2.55 2.55 0-10
KBr 0.12 0.12 0.12 0.12 0-10
CdCl2 2.28 2.28 2.28 2.28 0-10
CoCl2·6H2O 2.38 2.38 2.38 2.38 0-10
CrCl3 (무수) 0.32 0.32 0.32 0.32 0-10
NaF 4.20 4.20 4.20 4.20 0-10
GeO2 0.53 0.53 0.53 0.53 0-10
KI 0.17 0.17 0.17 0.17 0-10
RbCl 1.21 1.21 1.21 1.21 0-10
ZrOCl2·8H2O 3.22 3.22 3.22 3.22 0-10
셀레늄 0.00001 0.00001 0.00001 0.00001 0.00000-0.1
기타 성분
NEAA 1% 1% 1% 1% 0-10%
L-글루타민 2 mM 2 mM 2 mM 2 mM 1-2 mM
β-머캅토에탄올 0.1 mM 0.1 mM 0.1 mM 0.1 mM 0-1 mM
항생제 50 U/ml 50 U/ml 50 U/ml 50 U/ml 0-100 U/ml
기본 배지
상기 표 2에서 별표로 표시된 성분은 본 발명에 따르는 혈청 대체물의 형태로 제공된다.
본 발명에 따르는 혈청 대체물 또는 배양 배지는 액체 또는 건조 형태로 제공될 수 있다. 또한, 이들은 적합한 농축 제형으로 제공될 수 있다. 예로서, 기본 배지를 10%, 15% 또는 20% (vol/vol) 혈청 대체물로 보충하여 상기 제시된 바와 같은 성분의 최종 농도가 되도록 할 수 있다. 필요할 경우, 본 발명의 혈청 대체물 또는 배지의 성분을 화합성 서브제형(subformulations)으로 나눌 수 있다.
본 발명에 따르는 혈청 대체물 및 배양 배지는 다양한 용도로 유용하다. 본 발명에 따르는 혈청 대체물 및 배양 배지는 새로운 줄기세포주, 예로서 ESCs, ASCs 및 iPS 세포주의 개시, 즉, 유도 또는 분리용으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 그러한 목적을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 목적하는 기원의 분리된 세포를 제공하는 단계, 상기 세포를 본 발명의 양태에 따르는 제노-프리 배지와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포를 세포 배양에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함한다. 하나의 양태로, 상기 배지를 라미닌, 예로서 인간 태반 라미닌, 및 피브로넥틴, 예로서 인간 혈장 피브로넥틴으로 보충한다. 바람직하게는, 라미닌과 피브로넥틴을 약 5 ㎍/㎖의 농도로 사용한다.
본 발명의 상기 태양은 또한 본 발명이 새로운 줄기세포주를 개시하기 위한 혈청 대체물 또는 배양 배지의 용도에 관한 것이도록 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명 방법의 모든 양태는 혈청 대체물 또는 배양 배지의 상기 용도에 적용된다.
본 발명의 혈청 대체물 및 최종 배양 배지는 실질적으로 미분화된 상태로, 바람직하게는 수많은 시험관내 계대에 걸쳐서 줄기세포를 유지 및 증식시키는 것을 지지하는데 적합하다. 더욱 상세하게, 상기 제형은 적어도 약 20, 바람직하게는 적어도 약 30, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50 계대 동안 줄기세포를 유지 및 증식시키는데 사용될 수 있다. 실시예 4에서 증명되는 바와 같이, 줄기세포가 심지어 80 계대에 걸쳐서 실질적으로 미분화 상태로 성공적으로 유지되었다. 상기 줄기세포는 이들의 만능성, 또는 다능성을 보유한다. 예를 들어, 배야줄기세포는 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직의 유도체로 분화될 수 있는 이들의 능력을 유지한다. 또한, 상기 줄기세포는 예를 들어, 이들의 변화되지 않은 핵형에 의해 판정되는 바와 같이, 이들의 유전체 안정성(genomic integrity)을 보유한다.
치료적 용도의 경우, 본 발명에 따르는 배양 배지는 비-인간 동물 공급원으로부터 정제된, 피더 세포, 조정배지(conditioned medium), 혈청 또는 기타 배지 성분과 같은 성분을 포함하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 재조합 또는 화학적 방법을 사용하여 합성한 성분을 포함한다.
따라서, 본 발명은 상기한 바와 같은 제노-프리 배양에서 줄기세포를 배양하고 유지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 줄기세포를 본 발명에 따르는 배양 배지와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포를 줄기세포 배양에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함한다. 그러한 조건은 당해 분야의 숙련가에게 자명하다.
본 발명의 상기 태양은 또한 본 발명이 줄기세포주를 배양하고 유지하기 위한 혈청 대체물 또는 배양 배지의 용도에 관한 것이 되도록 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 모든 양태는 본 발명이 혈청 대체물 또는 배양 배지의 상기 용도에 적용된다.
본 발명의 배양 배지는 또한 i) 미분화 줄기세포의 증식에 영향을 주고, ii) 줄기세포의 분화에 영향을 주며, iii) 조직 재생을 조절하는, 약물 후보물질과 같은 분자를 연구, 확인 및(또는) 선별(screening)하는 것을 포함하는, 세포 증식 및 분화를 연구하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 또한 유전자 변형된 줄기세포 또는 그들로부터 수득한 분화된 세포에 있어서, 치료적 단백질과 같은 다양한 약제를 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 혈청 대체물 및 최종 배양 배지는 또한 목적하는 계통으로, 특히 치료적 목적으로 줄기세포를 분화시키는데 사용될 수 있다. 이는 적절하고 충분한 농도의 분화제를 본 발명의 배양 배지에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 분화제의 비-제한 예로서, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 분화시키는데 사용될 수 있는 Noggin; 운동 뉴런을 분화시키는데 사용될 수 있는 sonig hedgehog과 레티노산; 망막 세포 계통을 분화시키는데 사용될 수 있는 bFGF; 및 심근세포를 분화시키는데 사용될 수 있는 BMP2; 인슐린-생산 세포를 분화시키는데 사용될 수 있는 액티빈 A 와 IGF2; 및 간세포를 분화시키는데 사용될 수 있는 액티빈 A, BMP2 및 BMP4가 있다. 또한, 상기 분화제가 END2와 같은 분화 세포일 수 있으며, 이는 심근세포를 분화시키는데 사용될 수 있다. 기타 분화제가 당해 분야에 숙지되어 있다. 본 발명의 이러한 태양은 또한 본 발명이 목적하는 계통으로 줄기세포를 분화시키는 방법에 관한 것이 되도록 제형화될 수 있다. 이 방법은 줄기세포를 분화제가 보충된 본 발명에 따르는 배양 배지와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포를 줄기세포 배양에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함한다. 현재 사용되는 분화 프로토콜은 다양한 비제한(undefined) 생성물과 세포 특징과 분화에 미지의 영향을 줄 수 있는 배양 배지를 이용한다. 본 발명의 제형, 분화 방법 및 용도는 이러한 단점을 갖지 않는다.
본 발명에 따르는 제형, 방법, 및 용도는 임의로 피더 세포층에서 줄기세포를 배양하고(하거나) 개시시키는데 사용될 수 있다. 적합한 피더 세포로는 비제한적으로, 섬유아세포, 예로서 인간 포피(foreskin) 섬유아세포, 예를 들면, CRL-2429 (ATCC, Mananas, USA)가 있다.
일부 양태에서, 본 발명에 따르는 제형, 방법, 및 용도가 줄기세포의 무-피더 (feeder cell-free) 세포 배양에 사용된다.
실시예 1. hESCs 에 대한 배양 배지 삼투압 농도( osmolarity )의 효과
제노-프리 제형의 성능을 개선하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명에 따르는 삼투압 농도를 최적화하였다. 삼투압 농도는 5M NaCl로 조절하였다. 본 발명자들은 5 계대 동안 인간 배아줄기세포 (hESCs)의 배양에서 여러가지 상이한 삼투몰 농도를 시험하였고 세포의 형태는 매 계대 후 조사하였다. 최고로 높은 성능은 320 mOsm의 삼투압 농도에서 수득되었다 (도 1c). 260 mOsm의 삼투압 농도의 경우 (도 1a), 작고 불균일한 콜로니가 형성되었고, 콜로니의 형태가 290 mOsm의 삼투압 농도에서 개선되었지만 (도 1b) 콜로니의 크기가 작았다. 350 mOsm의 삼투압 농도는 콜로니의 성장을 명백하게 제한하였다 (도 1d).
실시예 2. 특정 지질과 지질 유도체는 hESCs의 미분화 성장을 향상시킨다.
다양한 지질 및 지질 유도체를 본 발명에 따르는 배양 배지 (RegES) 및 KO-SR (Knockout 혈청 대체물, Invitrogen)을 함유하는 통상의 hES 배양 배지에서 시험하였다. 미분화 콜로니의 일반적인 형태, 뿐만 아니라 크기 및 두께는 시지각 (visual perceptions)을 기본으로하여 각 계대 전에 평가하였다 (표 3). 상기 결과에 따르면, 공액 리놀레산, 에이코사펜타에노산, 팔미톨레산, 리놀레산, 리놀레산-올레산-아라키돈산 혼합물 및 특히 레티놀이 hES 배지 및 본 발명에 따르는 배양 배지 둘다에서 미분화 콜로니의 형태를 개선시켰다 (표 3). 또한, 스테아르산, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 프로스타글란딘 F2 및 DL-이소프로테레놀은 hES 배양 배지에서 불량한 형태 및(또는) 과도한 분화를 일으키는 반면, 본 발명에 따르는 배양 배지에서 이들 보조물질들은 만족스러운 형태를 발생시켰다.
또한, hESC 콜로니를 세개의 카테고리; 미분화, 부분적 분화 및 분화로 분류하였다. 각 콜로니 타입의 수는 각 계대 전에 계산하였다. 이후, 콜로니의 총수 중 각 콜로니 타입에 대한 퍼센트 값을 계산하였다 (도 2). 대조용 hES 또는 인간 혈청 알부민 대신 Albumax (Invitrogen)를 함유하는 Albumax-RegES 배지에서 배양된 콜로니와 비교할 때 본 발명에 따르는 배양 배지에서는 공액 리놀레산, 에이코사펜타에노산, 스테아르산, 레티놀, 리놀레산-올레산-아라키돈산 혼합물, DL-이소프로테레놀, 팔리톨레산 및 리놀레산의 존재하에서 미분화된 콜로니의 수가 증가하였고 분화된 콜로니의 수는 감소하였다. 대조용 hES 배지에서 배양시킨 콜로니와 비교할 때 hES 배양 배지에서는 콜레스테롤, 아라키돈산, 공액 리놀레산, 레티놀 및 포스파티딜콜린의 존재하에서 미분화된 콜로니의 수가 증가하였고 분화된 콜로니의 수는 감소하였다.
레티놀과 공액 리놀레산은 전체적으로 두 배양 배지에서 모두 콜로니 형태 및 미분화된 콜로니의 수를 개선시킨 것으로 밝혀졌다. 레티놀 및 공액 리놀레산 외에, 에이코사펜타에노산이 본 발명에 따르는 배양 배지에서 미분화된 콜로니의 수를 증가시킴으로써 탁월한 성능을 발휘하였다. 따라서, 공액 리놀레산과 에이코사펜타에노산이 제노-프리 혈청 대체물에 첨가될 수 있는 가장 바람직한 지방산이다. 세번째로 높은 성능은 본 발명에 따르는 배양 배지에서 스테아르산의 경우에 관찰되었다.
평가된 지질 및 지질 유도체
그룹 통상명칭/약어 농도 형태*
hES/RegES
포화 FAs 미리스트산 2.5 ㎍/ml +/-
스테아르산 2.5 ㎍/ml +/++
불포화 FAs 팔미톨레산, PA 2.5 ㎍/ml ++/++
올레산, OA 2.5 ㎍/ml +++/-
리놀레산, LA 2.5 ㎍/ml ++/++
공액 리놀레산, CLA 5 ㎍/ml +++/++
감마-리놀레산, GLA 2.5 ㎍/ml ++/-
알파-리놀레산, ALA 5 ㎍/ml -/-
아라키돈산, AA 2.5 ㎍/ml +++/-
에이코사펜타에노산, EPA 5 ㎍/ml ++/++
도코사헥사에노산, DHA 5 ㎍/ml -/-
리놀레산-올레산-아라키돈산 혼합물 2.5 ㎕/ml ++/++
인지질 포스파티딜콜린, PC 2.5 ㎍/ml ++/-
리소포스파티딜콜린, LPC 5 ㎍/ml -/++
포스파티딜에탄올아민 PE 5 ㎍/ml -/++
스핑고지질 스핑고신-1-포스페이트, S1P 10 μM -/-
에이코사노이드 프로스타글란딘 E2, PGE2 50 ng/ml +/-
프로스타글란딘 F2, PGF2 50 ng/ml -/++
스테롤 콜레스테롤 2 ㎍/ml ++/-
비타민 A 레티놀 2.5 ㎍/ml +++/+++
카테콜아민 DL-이소프로테레놀 0.1 mg/ml +/++
*미분화된 콜로니의 일반적인 형태, 크기 및 두께를 평가하였다. - 콜로니의 과도한 분화, 불량한 형태. + 불량한 형태, 콜로니에서의 불균일한 단부, 얇고(거나) 작은 콜로니. ++ 만족스러운 형태, 콜로니에 일부 불균일한 단부가 존재할 수 있으며, 콜로니는 중간 두께와 크기를 갖는다. +++ 좋은 형태, 균일하고, 두꺼우며 커다란 콜로니.
실시예 3. 레티놀은 줄기세포 마커의 증식과 발현을 증가시킨다.
레티놀을 선택하여 미분화된 hESCs의 유지에 대해 추가로 평가하였다. 초기 연구는 0.1 내지 0.5 μM 농도의 레티놀은 효과가 없으며 미분화된 콜로니의 형태 또는 수에서의 개선이 없는 것으로 나타났다. 그러나, 추가적인 평가는 2.0 μM 이상의 농도의 레티놀은 hESCs의 증식을 개선시킬 뿐만 아니라 hESC 특이적 마커의 발현을 유발시키는 것으로 나타났다 (도 3). 2.0 μM의 레티놀의 존재하에서, 콜로니의 성장이 더 빨리 개시되어 3일째에 이미 콜로니의 크기가 더 컸다 (도 3a 내지 3b). 증식 검정법으로 2.0 μM 또는 3.5 μM의 레티놀의 존재하에서 배양시킨 hESCs는 레티놀 없이 또는 0.5 μM 레티놀의 존재하에서 배양시킨 hESCs와 비교할 때 거의 2배의 증식 속도를 갖는 것으로 증명되었다 (도 3e). 레티놀의 존재하에서 배양시킨 hESCs의 면역세포화학적 염색은 줄기세포 마커 Nanog 및 TRA-1-81의 발현을 나타냈다 (도 3c 내지 3d). 또한, 레티놀은 만능성 지지 유전자, 특히 Nanog의 발현을 증가시켰는데, 이의 상대적 발현 수준은 2.0 μM 또는 3.5 μM의 레티놀의 존재하에서 20배가 넘었다 (도 3f).
실시예 4. 액티빈 A는 본 발명의 배양 배지의 성능을 추가로 향상시킨다.
증식 검정법으로 본 발명에 따르는 배양 배지 중 5 또는 10 ng/㎖ 액티빈 A의 존재하에서 배양시킨 hESCs는 액티빈 A 없이 배양시킨 hESCs와 비교할 때 거의 2배의 증식 속도를 가지며 상기 증식 속도는 대조용 hES 배지에서 배양시킨 hESCs에 필적하는 것으로 증명되었다 (도 4a). 형광-활성화된 세포 분류법 (FACS) 및 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR) 분석으로 액티빈 A가 전사 및 해독 수준에서 모두 만능성 지지 마커의 발현을 증가시키는 것으로 증명되었다 (도 4b 내지 4c).
실시예 5. 본 발명의 배양 배지에서 hESCs 의 유도, 장기간의 배양 및 특성해석.
본 발명에 따르는 배양 배지를 사용하여, 새로운 hESC 세포주 (07/046 및 08/013)를 줄기세포 연구용으로 기부된 잉여의 불량 품질 인간 배아로부터 성공적으로 유도시켰다. 이들 세포주는 정상적으로 핵형화되었으며 정상적인 2배체 핵형을 나타낸다 (도 5a). 형광-활성화된 세포 분류법 (FACS) 및 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR) 분석으로 이들 세포주들이 hES 배지를 사용하여 유도시키고 배양시킨 hESC 세포주 Regea 06/040에 필적하는 수준으로 줄기세포 마커를 발현시킴이 증명되었다 (도 5b, 5d). 세포 증식 분석은 Regea 07/046 및 Regea08/013 세포주의 세포 증식 속도는 Regea 06/040의 세포 증식 속도에 필적하는 것으로 나타났다 (도 5c). 본 발명에 따르는 배양 배지는 또한 hESCs의 동결 및 해동에 사용될 수 있다 (도 5e).
새로운 세포주가 이들의 시험관내 만능성을 유지하는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 배아유사세포덩어리 (embryoid body; EB) 검정법을 수행하였다. 세포주 Regea 07/046 및 08/013으로부터 EB-유도된 세포는 3종의 상이한 배아 계통; 내배엽, 외배엽, 및 중배엽으로부터 마커를 발현시켰다 (도 5f). 본 발명자들은 또한 장기간의 제노-프리 조건하에서 유도되어 배양시킨 hESCs가 심근세포 및 신경 세포 계통으로 분화될 수 있는지 시험하였다. 심장 분화 개시 후 12 내지 16일 경과 후 자발적 박동 영역이 관찰되었다. 분리된, 자발적 박동 세포는 선모양의 패턴을 가졌으며 심장 트로포닌 T 및 심실 미오신 중쇄 마커에 의해 포지티브하게 염색되었다 (도 5g 내지 5h). 뉴런 세포를 발생시키기 위하여, hESC 콜로니를 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시키고 hES 배지를 작은 클러스터로 절개하여 20주까지 현탁 배양시켰다. 분화된 세포는 RT-PCR에서 신경 전구체 마커, 뉴런 마커 및 성상세포 마커를 발현시켰다 (도 5i). 면역세포화학 염색법으로 상기 세포의 뉴런 및 신경교 운명이 증명되었다 (도 5j). 이들 결과는 본 발명에 따르는 제노-프리 배양 배지에서 유도되어 배양시킨 hESC 세포주는 이들의 만능성을 유지하며 또한 심근세포 및 뉴런 세포가 이들 세포주로부터 발생될 수 있음을 나타냈다.
실시예 6. 본 발명에 따르는 배양 배지에서의 iPS 세포 배양 및 특성해석
인간 만능 세포용으로 개발된 본 발명에 따르는 배양 배지의 성능을 추가로 증명하기 위하여, 본 발명자들은 2종의 인간 유도 만능 줄기세포(iPS 세포)주를 이들 조건하의 인간 피더 세포상에서 배양시켰다. 상기 세포의 형태 및 줄기세포 마커 발현은 hES 배지에서 배양시킨 세포와 비교하여 유사하다 (도 6a 내지 6b). 또한, EBs 분석으로 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 iPS 세포가 3종 배아층 모두로 분화될 수 있는 능력을 유지함이 증명되었다 (도 6c).
실시예 7. 본 발명에 따르는 배양 배지에서의 ASCs 배양 및 특성해석.
지방 조직 샘플로부터 분리된 ASCs를 사용하여 중간엽 줄기세포의 배양에 대한 본 발명에 따르는 배양 배지의 성능을 평가하였다. 본 발명에 따르는 배양 배지와 인간 혈청 함유 배지 (HS 배지)에서 성장시킨 ASCs의 증식 속도를 측정하기 위하여 WST-1 증식 분석을 몇개의 시점 (1,4,7 및 11일)에서 수행하였다. 상기 두 조건에서 분석을 위하여 7개의 ASC 세포주를 사용하였다. 동시에, 세포 형태는 광학 현미경 조사법으로 관찰하여 증식 검정 결과를 확인하였다 (도 7a 내지 7d). 상기 증식 분석은 본 발명에 따르는 배양 배지를 사용한 배양이 4일에 이미 HS 배지와 비교하여 ASCs의 증식 속도가 더 높게 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 7e). 이어서, ASCs는 7일 및 11일째 HS 배지와 비교하여 본 발명에 따르는 배양 배지에서 더 높은 속도로 계속 증식하였다. 이런 증식 속도에서의 확실한 차이는 본 발명에 따르는 배양 배지와 HS 배지 간에 4일째 (p=0.035), 7일째 (p=0.022) 및 11일째 (p=0.018)에 관찰되었다 (도 7e).
유세포분석기 특성해석을 수행하여 본 발명에 따르는 배양 배지와 HS 배지에 확장되어 있는 ASCs의 표면 마커 발현 특징을 비교하였다 (표 4). 매 배양 조건에 대해 4개의 세포주를 분석하였다. 두 배양 조건 모두 ASCs의 특징적인 표면 마커 발현 프로필을 유지한 반면, 통계적 분석으로 HS 배지 및 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 ASCs의 시알로뮤신-유사 접착 분자 CD34 (p=0.043), 백혈구 공통 항원 CD45 (p=0.017), 접착 분자 CD105 (p=0.020)과 MHC 클래스 I 동형 HLA-ABC (p=0.021)의 발현에서의 확실한 차이가 밝혀졌다.
HS 배지 및 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 ASCs의 표면 마커 발현 특징
표면 단백질 항원 HS 배지
(n=4) 		RegES 배지
(n=4)
CD34 * 시알로뮤신-유사 접착 분자 3,5 ±1,7 1,2 ±0,7
CD45 * 백혈구 공통 항원 0,4 ±0,0 2,4 ±1,2
CD90 Thy-1, T-세포 표면 당단백질 93,1 ±11,2 99,8 ±0,1
CD105 * SH-2, 엔도글린 52,0 ±8,3 75,7 ±6,6
HLA-ABC * 주조직적합성 클래스 I 항원 0,6 ±0,4 10,0 ±11,4
HLA-DR 주조직적합성 클래스 II 항원 0,8 ±0,6 0,4 ±0,1
HS 배지에서 배양시킨 세포주 5/08, 19/08, 24/08 및 25/08은 계대 2 내지 3이었고 본 발명에 따르는 배양 배지에서 배양시킨 세포주 9/08, 11/08, 25/08 및 31/08은 계대 3 내지 4였다. 데이타는 괄호안에 표시된 공여체/샘플의 수로부터 평균 ± 표준 편차로 제시된다. *p<0.05.
기술이 진보함에 따라, 본 발명의 개념이 다양한 방식으로 시행될 수 있음이 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 본 발명 및 이의 양태는 상기한 실시예로 제한되지 않으며 특허 청구 범위의 범주내에서 변화될 수 있다.
인용된 모든 참고 문헌은 본 명세서에서 참고로 포함된다.

Claims (16)

  1. 공액 리놀레산 및 에이코사펜타에노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 지방산을 포함하는 제노-프리(xeno-free) 혈청 대체물.
  2. 제1항에 있어서, 액티빈 A(Activin A)를 추가로 포함하는 혈청 대체물.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 레티놀을 추가로 포함하는 혈청 대체물.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 스테아르산을 추가로 포함하는 혈청 대체물.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공액 리놀레산(CLA)의 농도는, 상기 혈청 대체물로 보충될 기본 배지인, 최종 배양 배지가 약 0.5 ㎎/ℓ 내지 약 5 ㎎/ℓ 의 CLA를 포함하도록 하는 것이고, 상기 에이코사펜타에노산(EPA)의 농도는 상기 최종 배양 배지가 약 1 ㎎/ℓ 내지 약 10 ㎎/ℓ 의 EPA를 포함하도록 하는 것인 혈청 대체물.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 A의 농도는, 상기 혈청 대체물로 보충될 기본 배지인, 최종 배양 배지가 약 0.001 ㎎/ℓ 내지 약 0.02 ㎎/ℓ의 액티빈 A를 포함하도록 하는 것인 혈청 대체물.
  7. 제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티놀의 농도는, 상기 혈청 대체물로 보충될 기본 배지인, 최종 배양 배지가 약 0.25 ㎎/ℓ 내지 약 1.0 ㎎/ℓ의 레티놀을 포함하도록 하는 것인 혈청 대체물.
  8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테아르산의 농도는, 상기 혈청 대체물로 보충될 기본 배지인, 최종 배양 배지가 약 0.5 ㎎/ℓ 내지 약 5 ㎎/ℓ 의 스테아르산을 포함하도록 하는 것인 혈청 대체물.
  9. 기본 배지와 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 따르는 혈청 대체물을 포함하는 제노-프리 세포 배양 배지.
  10. 줄기세포의 유지, 증식 또는 분화를 위한 제9항에 따르는 세포 배양 배지의 용도.
  11. 줄기세포의 유도 또는 분리를 위한 제9항에 따르는 세포 배양 배지의 용도.
  12. a) 목적하는 기원의 분리된 세포를 제공하는 단계,
    b) 상기 세포를 제9항에 따르는 제노-프리 배지와 접촉시키는 단계, 및
    c) 상기 세포를 줄기세포 배양에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함하는, 시험관내에서 새로운 줄기세포를 개시시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 분리된 세포가 배아, 성체 체세포, 또는 중간엽 세포 기원의 것인 방법.
  14. a) 상기 줄기세포를 제9항에 따르는 제노-프리 배지와 접촉시키는 단계, 및
    b) 상기 세포를 줄기세포 배양에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 배양 방법.
  15. 제12항 또는 14항에 있어서, 상기 배양을 피더 세포층(feeder cell layer) 상에서 수행하는 방법.
  16. a) 상기 줄기세포를 분화제(differentiating agent)가 보충된 제9항에 따르는 제노-프리 배지와 접촉시키는 단계, 및
    b) 상기 세포를 줄기세포의 분화에 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 분화 방법.
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