KR20070060135A

KR20070060135A - 영장류 배아 줄기 세포의 배양

Info

Publication number: KR20070060135A
Application number: KR1020077009550A
Authority: KR
Inventors: 제임스 에이 톰슨; 마크 레벤스테인
Original assignee: 위셀 리서치 인스티튜트, 인크.
Priority date: 2004-09-28
Filing date: 2005-09-27
Publication date: 2007-06-12
Also published as: AU2005289597B2; CA2582566C; US7439064B2; EP1799811A1; US20090023208A1; JP2008514230A; GB2433943A; AU2005289597A1; KR101437927B1; GB0707395D0; GB2433943B; CN101072868B; US20050244962A1; WO2006036925A1; CA2582566A1; EP1799811B1; CN101072868A

Abstract

본 발명은 본질적으로 포유동물 태아 혈청을 함유하지 않는 환경 하에서, 및 아미노산, 비타민, 염, 무기질, 트랜스페린, 인슐린, 알부민, 및 영양 공급층 배지 이외의 공급원으로부터 제공되는 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 줄기 세포 배양 배지하에서 줄기 세포를 배양하여 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한 영양 공급 세포를 필요로 하지 않거나 또는 영양 공급 세포에 배지를 노출시킬 필요없이 인간 배아 줄기 세포의 배양 및 증식을 지원할 수 있는 조성물을 개시한다.

Description

영장류 배아 줄기 세포의 배양{CULTIVATION OF PRIMATE EMBRYONIC STEM CELLS}

연방정부 지원 연구에 대한 진술서

결정 예정

본 발명은 영장류 배아 줄기 세포 배양물을 배양하는 방법 및 이에 유용한 배양 배지에 관한 것이다.

영장류(예, 원숭이 및 인간)의 다능성 배아 줄기 세포는 착상전 배아로부터 유도되었다. 예, 미국 특허 5,843,780호 및 문헌[J. Thomson et al, 282 Science 1145-1147 (1998)] 참조. 본원에 언급된 상기 문헌 및 기타 모든 문헌의 개시 내용은 본원에 전문이 개시된 것과 같이 참고 인용된다. 상기 세포는 장기간의 배양에도 불구하고 발생 능력을 안정적으로 유지하여 배아의 세 배엽 모두 발달된 유도체를 형성한다.

영장류 (특히 인간) ES 세포주는 인간 발생 생물학, 신약 개발, 약물 테스트 및 이식 의학과 관련된 광범위한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 착상 후의 인간 배아에 대한 최근 지식은 주로 제한된 수의 정적 조직학적 절편을 기초로 한 것이다. 초기 인간 배아의 발생 선택을 조절하는 근원적인 기전은 윤리적인 고려 사항때문 에 본질적으로는 미개척 분야로 남아있다.

마우스는 실험용 포유동물의 발생 생물학의 주된 피험체이고 발생을 조절하는 다수의 기본적 기전이 마우스와 인간 사이에서 보존됨에도 불구하고 마우스와 인간의 초기 발생 사이에는 상당한 차이가 있다. 따라서 영장류/인간 ES 세포는 이의 분화 및 기능에 대한 중요하고도 새로운 식견을 제공한다.

영장류 ES 세포의 분화된 유도체를 이용하여 신규 약물에 대한 유전자 표적을 확인하고, 신규 화합물의 독성 또는 최기성(teratogenicity)을 테스트하고, 이식하여 질병의 세포군을 대체할 수 있다. ES 세포-유도 세포의 이식에 의해 치료될 수 있는 잠재적 병태는 파킨슨병, 심근경색, 소아 당뇨병 및 백혈병을 포함한다. 예, J. Rossant et al. 17 Nature Biotechnology 23-4 (1999) 및 J. Gearhart, 282 Science 1061-2 (1998) 참조.

장기간의 증식 능력, 장기간 배양 후의 발생 능력 및 핵형의 안정성은 영장류 배아 줄기 세포 배양물의 유용성과 관련된 주요 특징이다. (특히 섬유아세포 영양 공급층에서의) 이러한 세포의 배양물에는 전형적으로 동물 혈청(특히 우태혈청)을 보충하여 배양 동안 목적하는 증식을 할 수 있다.

예를 들어, 미국 특허 5,453,357호, 5,670,372호 및 5,690,296호에는 동물 혈청과 함께 염기성 섬유아세포 성장 인자를 병용하는 것을 비롯한 다양한 배양 조건이 설명되었다. 불리하게도, 혈청은 각 뱃치(batch)마다 다양한 성질을 가져서 배양 특성에 영향을 주는 경향이 있다.

WO 98/30679에서는 동물 혈청 대신 혈청 무함유 보충물을 제공하여 배양시 특정 배아 줄기 세포 성장을 지원하는 방안에 관해 논의하였다. 혈청 대체물은 알부민 또는 알부민 대체물, 1종 이상의 아미노산, 1종 이상의 비타민, 1종 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 1종 이상의 항산화제, 1종 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 1종 이상의 콜라겐 전구체 및 1종 이상의 미량 원소를 포함한다. 이러한 대체물은 백혈병 억제 인자, 스틸(steel) 인자 또는 모양체 신경영양성 인자와 함께 추가로 보충될 수 있다고 언급하였다. 불행히도 영장류의 배아 줄기 세포 배양물(특히 섬유아세포 영양 공급층에서 성장한 것)에서는 이러한 배양 배지가 만족스럽지 못한 것으로 판명되었다.

WO 99/20741은, 영양 혈청 배양 배지(예, 우태혈청)에 있어서, 영장류 줄기 세포 배양에서의 다양한 성장 인자, 예컨대 bFGF 사용의 이득에 관해 논의한다. 하지만 영양 혈청이 없는 배양 배지에 대해서는 설명하지 않는다.

미국 특허 5,405,772호에서는 조혈세포 및 골수 기질세포에 대한 성장 배지에 관해 기술한다. 이러한 목적을 위해 혈청 제거 배지에서의 섬유아세포 성장 인자의 사용을 제안하고 있다. 그러나 영장류의 배아 줄기 세포의 성장 조건에 관해서는 기술되지 않고 있다.

최초의 인간 배아 줄기 세포 배양물은 미분화된 상태로 인간 배아 줄기 세포를 증식시킬 수 있는 성질을 보유한 섬유아세포 영양 공급층을 사용하여 배양하였다. 이후에는, 배양 배지를 영양 공급 세포에 노출시켜 직접 영양 공급 세포를 사용하는 것과 동일한 성질을 가지는 조건 배지라 칭하는 것을 제조하면 충분한 것으로 밝혀졌다. 배양물 내의 인간 배아 줄기 세포는 영양 공급 세포 또는 조건 배지 를 이용하지 않고는 미분화 상태를 유지할 수 없다. 영양 공급 세포의 이용 또는 배지의 영양 공급 세포에의 노출은 불필요한 물질로 인해 배양물이 오염될 우려가 있기 때문에 영양 공급 세포 및 조건 배지의 사용을 피하는 것이 바람직하다. 본원에서는 영양 공급 세포에 노출되지 않는 배지를 비조건 배지(unconditioned medium)라 칭한다.

따라서 동물 혈청을 사용할 필요없이 영장류 배아 줄기 세포를 안정적으로 배양하기 위한 기술은 여전히 필요한 것으로 볼 수 있다.

발명의 개요

하나의 측면에 있어서 본 발명은 영장류의 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유동물 태아 혈청을 함유하지 않는 (또한 바람직하게는 본질적으로 어느 동물의 혈청도 함유하지 않는) 배양물 및 섬유아세포 영양 공급층 이외의 공급원에서 제공되는 섬유아세포 성장 인자의 존재하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태로, 줄기 세포 배양을 유지하기 위해 이전에 요구되던 섬유아세포 영양 공급층은 섬유아세포 성장 인자를 충분하게 첨가함으로써 필요없게 된다.

섬유아세포 성장 인자는 포유동물 발생에 가장 중요한 분자이다. 지금까지 20종 이상의 섬유아세포 성장 인자 리간드와 이에 대한 5종의 신호전달 섬유아세포 성장 인자 수용체 (및 이의 스플라이싱 변이체)가 공지되어 있다. 일반적으로 D. Ornitz et al., 25 J. Biol. Chem. 15292-7 (1996); 미국 특허 5,453,357호 참조. 이러한 인자에서의 약간의 변이는 종간에 존재하는 것으로 예상되며, 용어 섬유아세포 성장 인자는 종 제한적인 것은 아니다. 하지만 본 발명자는 바람직하게는 인간 섬유아세포 성장 인자, 더욱 바람직하게는 재조합 유전자로부터 생성된 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자를 사용한다. 본 화합물은 Gibco BRL-Life Technologies 등에서 다량으로 쉽게 구입 가능하다.

본 특허의 목적에 있어서, 개별 성분(예, 우태혈청)이 혈청으로부터 분리되어 외인성으로 공급되더라도 배양물은 여전히 특정 혈청을 본질적으로 함유하지 않을 수 있다는 점을 유념해야 한다. 중요한 점은 혈청이 그 자체로 첨가될 경우 변이적인 문제점이 발생한다는 것이다. 하지만 잘 규명된 1종 이상으로 정제된 혈청 성분(들)을 첨가할 경우에는 문제가 발생하지 않는다.

이러한 방법을 사용하여 배양되는 영장류의 배아 줄기 세포는, (i) 시험관 내에서 미분화 상태로 무한하게 증식을 할 수 있고; (ii) 장기간의 배양 후에도 배아의 세 배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 유도체로 분화할 수 있고; (iii) 장기간의 배양에 걸쳐 (정배수체로) 정상적 핵형을 유지한다라는 점에서 진정한 ES 세포주인 인간 배아 줄기 세포가 바람직하다. 따라서 이러한 세포는 다능성(pluripotent)이 있는 것을 의미한다.

상기 배양법은, 줄기 세포의 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직의 유도체로의 분화를 유지하고, 그리고 줄기 세포의 핵형을 유지하면서 배아 줄기 세포를 1개월 이상 (바람직하게는 6개월 이상; 보다 바람직하게는 12개월 이상) 동안 배양물 내에서 안정하게 증식할 수 있도록 한다.

또다른 측면에 있어서 본 발명은 영장류의 배아 줄기 세포를 배양하는 또다른 방법을 제공한다. 본질적으로 포유동물 태아 혈청을 함유하지 않는 (또한 바람직하게는 본질적으로 어느 동물의 혈청도 함유하지 않는) 배양물 및 섬유아세포 성장 인자 신호전달 수용체를 활성화시킬 수 있는 성장 인자의 존재하에서 줄기 세포를 배양하며, 상기 성장 인자는 섬유아세포 영양 공급층 이외의 공급원으로부터 제공된다. 영양 공급 인자는 바람직하게는 섬유아세포 성장 인자이지만, 이는 또한 섬유아세포 성장 인자 수용체를 활성화하도록 디자인된 기타 물질, 예컨대 일부 작은 합성 펩티드(예, 재조합 DNA 변이체 또는 돌연변이에 의해 생성됨)일 수 있다. 일반적으로 [T. Yamaguchi et al., 152 Dev. Biol. 75-88 (1992)(signaling receptors)] 참조.

또다른 측면에 있어서 본 발명은 영장류의 배아 줄기 세포를 배양하기 위한 배양 시스템을 제공한다. 이 시스템은 섬유아세포 영양 공급층 이외에서 공급되는 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자를 갖는다. 이 배양 시스템은 본질적으로 동물 혈청을 함유하지 않는다.

본 발명의 또다른 측면은 상기 방법을 사용하여 유도되는 세포주 (바람직하게는 클로닝된 세포주)를 제공한다. "유도된"다는 것은 직접적 또는 간접적으로 유도되는 세포주 모두를 포괄하는 가장 광범위한 의미로 사용된다.

뱃치에서 사용하는 동물 혈청의 차이로 인한 결과의 다양성은 피하도록 한다. 또한, 동물 혈청의 사용을 피하고 섬유아세포 성장 인자를 사용하면 클로닝의 효율이 증가될 수 있다는 사실을 밝혀냈다.

따라서 본 발명의 유리한 점은, 다양성은 덜하면서도 더욱 효과적으로 클로닝할 수 있는 영장류의 배아 줄기 세포주의 배양 조건을 제공한다는 것이다. 본 발명의 기타 이점은 명세서 및 청구범위의 연구 후 명백해질 것이다.

발명의 상세한 설명

하기 실험 중 몇몇에 있어서 본원의 발명자 중 하나는 본 발명의 방법 및 배양 시스템을 사용하여 배양 배지에 혈청 첨가 없이 인간 ES 세포주를 배양하였다. 클론 유도된 2종의 인간 ES 세포주는 구성성분으로서 혈청이 없는 배지에서 배양시 클론 유도 후 8개월 이상 동안 증식되고, 배아의 세 배엽 모두 발달된 유도체로 분화할 수 있는 능력을 유지하였다.

하기 제시되는 또다른 실험에 있어서, 혈청 및 영양 공급 세포 모두의 부재에도 인간 섬유아세포 성장 인자(FGF)를 비교적 다량으로 첨가하면 인간 배아 줄기 세포의 배양 및 성장을 촉진한다는 것이 입증되었다. 이로서 동물 세포 또는 동물 세포가 배양되었던 배지에 전혀 노출되지 않은 줄기 세포를 배양할 수 있다. 이러한 줄기 세포 배양 조건 (즉, 영양 공급 세포 및 조건 배지가 없는 배양 조건)은 본원에서 영양 공급 세포 독립적이라고 한다. 영양 공급 세포가 없는 것으로 설명되고 있는 이전의 배양 조건은 영양 공급 세포로 조정한 배지 사용을 기준으로 하여 설명되고 있다. 하지만 조건 배지의 사용은 여전히 배지를 조정하는데 사용해야 하는 영양 공급 세포의 사용에 대한 의존성을 해결하지 못한다. 본원에 설명된 기술은 정상적인 핵형을 가지고 미분화 상태로 남아있는 인간 배아 줄기 세포의 무한하면서 영양 공급 세포 독립적인 배양을 가능하게 한다.

초기 유도, 배양 및 인간 ES 세포주 H9의 특징을 다루는 기술은 문헌[J. Thomson et al., 282 Science 1145-1147 (1998)]에 설명되었다. 하기 설명되는 실험은 상기 및 기타 세포주로 수행되었지만 과정 및 결과는 특정 ES 세포주와는 무관하다.

본원은 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 첨가가 인간 ES 세포의 배양 및 클로닝을 돕는 것에 대해 설명한다. FGF의 첨가는 두가지 별개의 관점에서 중요하다. 첫째, 중간 농도의 FGF 첨가(예, 4 ng/㎖)로 혈청이 결여된 배지에서 미분화된 인간 ES 세포를 배양할 수 있다. 이러한 농도에서는 더 낮은 농도의 FGF와 비교할 때 줄기 세포의 분화 속도가 느리지만 결국에는 세포가 분화할 것이다. 둘째, 더 높은 농도의 FGF 첨가로 배지의 배양 조건이 영양 공급 세포 독립적이 되는데, 이것은 배양시 미분화된 정배수체 인간 ES 세포의 다능성을 무한하게 유지시키기 위해 영양 공급 세포가 전혀 필요하지 않다는 점에서 그러하다.

이러한 첫번째 현상은 인간 ES 세포 내의 FGF 수용체와 상호작용하는 FGF의 작용에 의해 일어난다고 믿어진다. 혈청 사용을 피하기 위해 다수의 공지된 FGF 변이체 중 어떤 것을 배양에 사용하는가는 특별히 중요하지 않다. 본원에는 FGF2로도 알려진 염기성 FGF 또는 bFGF를 일반적으로 사용하지만, 이는 인자들의 FGF 패밀리 구성원 중 bFGF를 쉽게 구입할 수 있기 때문이다. 20종 이상의 상이한 FGF 패밀리 구성원이 동정되어 있으며 이들은 FGF-1 내지 FGF-27이라 칭한다. 본원에서 FGF의 농도는 bFGF의 양으로 주어지지만, 이는 FGF 수용체의 자극량을 정량하려는 의도이고 FGF 패밀리의 기타 구성원에 대해서는 FGF의 농도를 상향 또는 하향으로 조절해야하는 것으로 이해해야 할 것이다. bFGF의 경우, ES 세포 배지 내의 바람직한 FGF 농도는 약 0.1∼약 1000 ng/㎖의 범위이며, 약 4 ng/㎖의 과잉 범위의 농도는 배지 내 혈청이 필요 없도록 하기에 유용하다.

놀랍게도 인간 ES 세포 배지 내 FGF의 두번째 특성에 대해서는 FGF의 변이체 선택이 다소 중요하다는 것을 밝혀내었다. 이와 관련하여 bFGF의 농도를 약 100 ng/㎖로 할 경우 이 농도가 혈청 및 영양 공급 세포를 필요없도록 하여 영양 공급 세포 독립적으로 배양하기에 충분하다는 것을 발견하였다. FGF 패밀리 구성원 FGF2(bFGF), FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18은 ES 세포 배양을 영양 공급 세포 독립적으로 하기 위해 배양물 1 ㎖ 당 100 ng의 농도면 각각 충분하다는 것을 밝혀냈다. 대조적으로 FGF 패밀리 구성원 FGF1(산성 FGF), FGF1β, FGF3, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF10, FGF16, FGF19 및 FGF20은 영양 공급 세포 독립성을 지원하기 위해 100 ng/㎖로는 충분하지 않다는 것을 밝혀냈다. 하지만 본 발명자는 존재하는 데이타는 없지만 이러한 FGF의 형태들을 사용한 결과가 농도의 결과가 아니고 특정 FGF의 더 높은 농도 또한 영양 공급 세포 독립성을 지원하지 못할 것으로 생각한다. FGF9의 경우, 본 발명자의 데이타는 FGF9가 상기 농도(100 ng/㎖)에서 인간 ES 세포 배양을 지원한다고 제안하지만, 이 데이타는 약간 더 불명확하였다.

배양시 영양 공급 세포 독립적으로 인간 ES 세포를 지원하기에 충분한 효과적인 FGF 변이체의 정확한 최소량은 지금은 정확히 공지되어있지 않지만 실증적 검증으로 측정될 수 있다. FGF2의 경우, 배지에 단독으로 4 ng/㎖를 첨가시 배양물 내의 인간 ES 세포를 미분화 상태에서 정배수체로 무한하게 유지시키기에는 불충분한 반면 배지에 FGF2를 단독으로 100 ng/㎖ 첨가하는 경우에는 충분하다는 것이 알려져 있다. 4 ng/㎖ 정도의 적은 양을 포함하는 비조건 배지에서 성장한 ES 세포는 어느 정도, 대략 1번의 또는 2번의 계대 동안 미분화된 상태일테지만 이 세포들은 결국 분화를 시작할 것이다. 따라서, ES 세포를 미분화 상태의 정배수체로 무한하게 유지하도록 배양하는 배지의 능력은, 증식, 미분화, 정배수체를 유지시키고 인간 ES 세포의 특정 형태를 유지시키면서 상기 세포를 6번의 계대 이상 동안 배양하는 것으로 입증된다. 본원에 사용되는 바와 같은 FGF의 유지 농도는 6번의 계대 이상 동안 미분화, 정배수체 및 증식 상태에 있는 인간 ES 세포를 유지시키도록 지원하는데 필요한 FGF의 농도이다. FGF2의 경우 최소 유지 농도는 4 ng/㎖∼100 ng/㎖이고 정확한 최소 유지 농도는 하기 프로토콜을 사용하여 측정한 양을 삽입하여 결정할 수 있다. 기타 효과적인 FGF, 예컨대 FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18 각각의 경우에는 각 FGF에 대해 상응하는 최소 유지 농도를 유사 검증으로 측정할 수 있다.

하기 실시예에 설명되는 인간 ES 세포 규정 배지(defined media) 내의 인간 ES 세포는 정배수체로 남아있으면서 조건 배지 없이 그리고 섬유아세포 영양 공급 세포의 완벽한 부재하에서 무한하게 배양될 수 있다. 따라서 ES 세포는 진정으로 영양 공급 세포에 독립적이다. 인간 ES 세포는 특정 형태(뚜렷하지 않은 세포막을 갖는 작고 압축된 형태), 증식 및 전부는 아닐지라도 신체 내 다수의 세포 유형으로 분화하는 능력을 포함하는 인간 ES 세포의 모든 특성을 그대로 유지한다. 인간 ES 세포를 또한 면역저하된 마우스에 주사할 경우 상기 세포는 세 원시 세포층 모두 형성할 수 있는 특징을 그대로 유지할 것이다. 특히, ES 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화되는 능력을 유지한다. ES 세포는 여전히 ES 세포 상태를 제시하는 마커, 예컨대 다능성과 관련된 핵 전사 인자 Oct4의 발현을 나타낸다. 과정 및 결과의 전반에 걸쳐 인간 ES 세포는 정상적인 핵형을 유지한다.

본원에 설명되는 첫번째 실험에서는 조사된(35 회색 γ 조사) 마우스 배아 섬유아세포 위에서 인간 ES 세포를 평판 배양하였다. 본 연구를 위한 배양 배지는 80 % "KnockOut" 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (Gibco BRL, Rockville, MD), 1 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올 및 1 % 비필수 아미노산 스톡(Gibco BRL, Rockville, MD)에 20 % 우태혈청(HyClone, Logan, UT) 또는 본래 마우스 ES 세포에 대해 최적화된 무혈청 대체물인 20 % KnockOut SR(Gibco BRL, Rockville, MD)을 보충한 것으로 구성되었다. KnockOut SR의 성분은 WO 98/30679에서 혈청 대체물로 설명된 것이다.

대안적인 실험에서는 혈청 또는 전술한 혈청 대체물 KnockOut SR을, 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 4 ng/㎖)를 함유하거나 함유하지 않은 배지에 보충하였다. 배양물 내의 bFGF의 바람직한 농도 범위는 .1 ng/㎖∼500 ng/㎖였다.

다양한 배양 조건하에서 클로닝의 효율을 측정하기 위하여 0.05 % 트립신/0.25 % EDTA를 사용하여 7분 동안 H-9 배양물을 단일 세포로 분리하고 원심 분리로 세척하고 유사분열이 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포 위에 평판 배양하였 다(6-웰 평판의 웰 당 10⁵ ES 세포). 클론 ES 세포주의 유도에 대해 단일 세포로부터의 성장을 확인하기 위해 입체현미경 하에서 직접 관찰하여 개별 세포를 선별하고 마이크로피펫을 사용하여 20 % 혈청 대체자 및 4 ng/㎖ bFGF를 함유하는 배지와 마우스 배아 섬유아세포 영양 공급 세포를 함유하는 96 웰 평판의 각 웰에 분주하였다.

콜라게나제 IV형(Gibco BRL, Rockville, MD) 1 mg/㎖를 사용하여 매5∼7일마다 통상적인 계대 배양을 통해 클론을 증폭시켰다. 유도 6 개월 후 H9 세포는 (20개의 염색체 스프레드를 분석하는) 표준 G-밴딩기술에 의해 정상적인 XX 핵형을 제시하였다. 하지만, 유도 7 개월 후 단일 핵형 제조물에서 20개 중 16개의 염색체 스프레드는 정상적인 XX 핵형을 제시하였지만 나머지 20중 4개의 스프레드는 13번 염색체의 단완(short arm) 부분으로 전좌한 것, 역위 20번 염색체를 가지는 것, 4번 염색체 단완으로 전좌한 것 및 다중 단편화된 것을 포함하는 무작위 기형을 나타내었다. 이후, 유도 8, 10 및 12.75 개월 후 H9 세포는 조사된 20개의 염색체 스프레드 모두에서 정상적인 핵형을 제시하였다.

본 발명자는 이전에 설명된 동물 혈청을 포함하는 배양 조건에서 인간 ES 세포의 클로닝 효율이 (bFGF의 존재 또는 부재에 관계없이) 불량하다는 것을 관찰하였다. 본 발명자는 또한 동물 혈청의 부재시에는 클로닝의 효율이 증가하고 bFGF가 첨가되면 더 증가하는 것을 관찰하였다. 이제, FGF의 첨가는 일반적으로 인간 ES 세포의 배양을 촉진하고 특히 인간 ES 배양물의 클로닝이 용이하도록 돕는다는 것 을 확립하였다.

하기 제시된 데이타는 10⁵개씩 각기 평판 배양한 ES 세포의 결과인 콜로니의 총수 ± 평균의 표준 오차(콜로니 클로닝 효율 백분율)이다. 태아 혈청 20 %를 포함하고 bFGF의 부재시 240 ± 28의 결과가 나왔다. 혈청 20 %와 bFGF(4 ng/㎖) 첨가시 결과는 대략 동일한 260 ± 12이다. 혈청 부재시(20 % 혈청 대체자 존재) bFGF 역시 없을 때의 결과는 633 ± 43이고 이때 bFGF를 첨가하면 826 ± 61이었다. 따라서, 혈청은 클로닝 효율에 불리하게 영향을 미치며, 혈청이 없으면서 bFGF가 존재할 경우에는 클로닝 효율의 상승적 이득이 부가되었다.

혈청의 존재하에서 인간 ES 세포의 장기간 배양에는 외인성으로 공급되는 bFGF를 첨가할 필요가 없고 (상기 진술한 바와 같이) bFGF를 혈청 함유 배지에 첨가시 인간 ES 세포의 클로닝 효율은 유의적으로 증가하지 않는다. 하지만 무혈청 배지에서의 bFGF는 인간 ES 세포의 초기 클로닝 효율을 증가시킨다.

또한 동물 혈청의 부재하에서 외인성 bFGF를 공급하는 것은 영장류의 배아 줄기 세포의 연속되는 미분화 증식에 매우 중요하다는 것을 밝혀냈다. 외인성 bFGF가 결여된 무혈청 배지에서의 인간 ES 세포는 2주의 배양으로 균일하게 분화되었다. (bFGF의 부재하에서) 기타 요인, 예컨대 LIF의 첨가는 분화를 막지 못했다.

이해하게 된 결과들은 특히 클론주에 적용할 수 있다. 이러한 점에서, 직접 현미경 관찰하에서 96 웰 평판의 웰로 세포 각각을 분주하여 증폭을 위한 클론을 선별하였다. 96 웰 평판의 웰에서 평판 배양된 192 H-9 세포 중 2개의 클론은 성공 적으로 증폭하였다(H-9.1 및 H-9.2). 이 후, 이러한 클론 모두 혈청 대체자 및 bFGF로 보충된 배지에서 연속적으로 배양되었다.

H9.1 및 H9.2 두 세포 모두 클로닝 후 8개월 이상의 연속되는 배양 후에도 정상적인 XX 핵형을 유지하였다. 상기 H-9.1 및 H-9.2 클론은 무혈청 배지에서 장기간의 배양 후에도 세 배아 배엽 모두의 유도체를 형성할 수 있는 잠재력을 유지하였다. 6개월의 배양 후, H9.1 및 H9.2 클론이 정상적인 핵형을 보유하는 것을 확인하고 SCID-베이지 마우스에 주사하였다.

H9.1 및 H9.2 세포 둘다 장 상피(내배엽) 배아 신장, 횡문근, 평활근, 뼈, 연골(중배엽) 및 신경 조직(외배엽)을 포함하는 세 배아 배엽 모두의 유도체를 포함하는 기형종을 형성하였다. 높은 계대의 H9.1 및 H9.2 세포의 기형종에서 관찰되는 분화의 범위는 낮은 계대의 부모 H9 세포에 의해 형성되는 기형종에서 관찰되는 것과 유사하였다.

동물 혈청은 성장에 지원적인 반면 인간 ES 세포 배양에는 이롭고도 불리한 화합물을 포함할 수 있는 복합 혼합물이라는 점을 상기 설명을 통해 알 것이다. 또한 상이한 혈청 뱃치는 인간 ES 세포의 활발한 미분화 증식을 지원하는 이들의 능력에 따라 광범위하게 다르다. 확실히 규명된 성분으로 혈청을 대체하면 이러한 혈청 뱃치 변화와 관련된 결과의 다양성을 감소시키고 더욱 신중하게 규명된 분화 연구를 할 수 있다.

또한 혈청을 포함하는 배지의 클로닝 효율이 낮다는 것은, 통상적으로 사용되는 혈청 중에 줄기 세포 생존, 특히 세포들을 단일 세포로 분산시킬 경우의 생존 에 불리한 화합물의 존재를 시사한다. 따라서 상기 화합물의 사용을 피하는 것이 상당히 바람직하다.

영양 공급 세포 독립적 배양

이 후 추가 연구에서는 혈청 및 영양 공급 세포의 부재하에서 더 높은 농도의 FGF로 ES 세포주를 배양하였다. 3가지 상이한 배지 배합물을 이러한 연구에 사용하였으며, 이 배지 배합물을 본원에서는 UM1OO, BM+ 및 DHEM으로 칭한다. 명칭 UM100은 bFGF 100 ng/㎖가 첨가된 비조건 배지를 가리킨다. 이 UM1OO 배지는 Gibco Knockout Serum Replacer 제품을 포함하지만 어떠한 종류의 섬유아세포 영양 공급 세포의 사용도 포함하거나 요구하지 않는다. BM+ 배지는 기본 배지(DMEM/F12)에 하기 설명되는 첨가제를 더한 것이며 상기 배지 또한 영양 공급 세포 없이 세포를 배양할 수 있지만 이러한 배지는 혈청 대체자 제품을 포함하지 않는다. 마지막으로 명칭 DHEM은 정해진 인간 배아 줄기 세포 배지를 가리킨다. 또한 하기에 설명되는 이 배지는 소 알부민을 포함하는 BM+ 배지와는 반대로 전적으로 무기 구성성분 및 인간 단백질만으로 구성되어 있으면서 인간 ES 세포의 배양, 클로닝 및 무한 증식에 충분하다.

UM100/BM+/DHEM에서의 인간 ES 세포주 H1 및 H9의 배양

UM1OO 배지는 다음과 같이 제조하였다: 비조건 배지(UM)는 80 % (v/v) DMEM/F12(Gibco/Invitrogen) 및 20 % (v/v) Knockout-Serum Replacer(Gibco/Invitrogen)에 1 mM 글루타민(Gibco/Invitrogen), 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Sigma-St. Louis, MO) 및 1 % 비필수 아미노산 스톡(Gibco/Invitrogen) 을 보충한 것으로 이루어졌다. 배지를 완성하기 위해 bFGF 100 ng/㎖를 첨가하고 배지를 0.22 μM 나일론 여과지(Nalgene)에 여과시켰다.

BM+ 배지는 다음과 같이 제조하였다: 16.5 mg/㎖ BSA (Sigma), 196 μg/㎖ 인슐린 (Sigma), 108 μg/㎖ 트랜스페린 (Sigma), 100 ng/㎖ bFGF, 1 mM 글루타민 (Gibco/Invitrogen), 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Sigma) 및 1 % 비필수 아미노산 스톡 (Gibco/Invitrogen)을 DMEM/F12 (Gibco/Invitrogen)에 배합하고 삼투압을 5 M NaCl을 사용하여 340 mOsm으로 조절하였다. 이 배지를 0.22 μM 나일론 여과지(Nalgene)에 여과시켰다.

DHEM 배지를 다음과 같이 제조하였다: 16.5 mg/㎖ HSA (Sigma), 196 μg/㎖ 인슐린 (Sigma), 108 μg/㎖ 트랜스페린 (Sigma), 100 ng/㎖ bFGF, 1 mM 글루타민 (Gibco/Invitrogen), 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Sigma), 1 % 비필수 아미노산 스톡 (Gibco/Invitrogen), 비타민 지원물 (Sigma), 미량 무기질 (Cell-gro®) 및 0.014 mg/L∼0.07 mg/L 셀레늄 (Sigma)을 DMEM/F12 (Gibco/Invitrogen)에 배합하고 5 M NaCl을 이용하여 340 mOsm로 삼투압을 조절하였다. 배지 내의 비타민 지원물은 티아민(6.6 g/L), 환원형 글루타티온(2 mg/L) 및 아스코르브산 PO₄를 포함할 수 있다. 또한, 배지 내에 사용된 미량 무기질은 Trace Elements B (Cell- gro®, Cat #: MT 99-175-C1과 C (Cell-gro®, Cat #: MT 99-176-C1)을 배합한 것이고; 각각은 1,000 X 용액으로 판매된다. Trace Elements B 및 C가 각각 Cleveland's Trace Element I 및 II와 동일한 조성물을 포함하는 것은 잘 알려져 있다. (예, Cleveland, W.L., Wood, I. Erlanger, B.F., J Imm. Methods 56: 221-234, 1983 참조) 0.22 μM 나일론 여과지(Nalgene)에 상기 배지를 여과시켰다. 마지막으로 무균의 정해진 지질 (Gibco/Invitrogen)을 첨가하여 배지를 완성하였다.

사전에 MEF(마우스 배아 섬유아세포) 영양 공급 세포 위에서 성장 중인 H1 또는 H9 인간 배아 줄기 세포에 디스파제(dispase, 1 mg/㎖)를 처리하여 기계적으로 계대 배양하고 Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA) 상에서 평판 배양하였다. 세포 계대 배양에 적당한 것으로 세포 밀도가 측정될 때까지 적절한 배지로 매일 교환하였다. 상기 설명한 바와 같이 디스파제를 처리하여 세포를 계대 배양한 후 Matrigel (Becton Dickinson) 상에서 유지하였다.

성장 속도

다양한 배지 내의 인간 ES 세포의 성장 속도를 측정하기 위해, 6-웰 조직 배양 디쉬(Nalgene)에서 3중으로 밀도가 약 5 x 10⁵ 세포/웰이 되도록 세포를 평판 배양하였다. 3, 5 및 7일째 날에 3중 웰 각각에 트립신/EDTA (Gibco/Invitrogen)를 처리한 후, 개별화하여 세포수를 계수하였다. 7일째 되는 날 추가 웰을 트립신으로 처리하고, 계수한 후, 약 2 x 10⁵ 세포/웰 세포 밀도로 신규 평판에 재접종하였다. ES 세포 표면 마커 Oct4, SSEA4 및 Tral-60을 사용하여 FACS 분석법으로 트립신 처리된 7일째 배양물을 분석하였다. 3번의 연속되는 계대로부터 성장 속도를 수집하였다. 성장 속도 실험은 UM1OO-배양된 인간 ES 세포가 CM-배양된 인간 ES 세포만큼 활발하게 성장한다는 것을 제시하고 있다.

부착 역학

다양한 배지 내의 인간 ES 세포의 부착률을 측정하기 위해 6-웰 조직 배양 디쉬(Nalgene)에 2 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 세포를 평판 배양하였다. 30분∼48시간 범위의 시점에서 부착되지 않은 세포를 세척하여 버리고 부착된 세포를 트립신/EDTA (Gibco/Invitrogen)으로 떼어내어 계수하였다. 이들 실험은 UM1OO 성장 속도 데이타가 UM1OO 및 CM에서의 성장 속도가 동등한 것과 반대로 성장은 더 느리고 세포 부착은 더 뛰어난 조합에 기인하는 것인지를 조사하기 위해 수행하였다. 본 발명자는 부착 백분률이 시험된 모든 시점에서 배지 모두에 대해 동등하다는 것을 발견하였다. 따라서 이들은 동일한 속도로 성장한다.

인간 ES 세포의 FACS 분석

37℃에서 10분 동안 트립신/EDTA (Gibco/Invitrogen) + 2 % 계혈청 (ICN Biomedicals, Inc., Aurora, OH)을 사용하여 6-웰 조직 배양 평판(Nalgene)으로부터 인간 ES 세포를 떼어내었다. 이 세포들을 동일한 부피의 FACS 완충제(PBS + 2 % FBS + 0.1 % 아자이드나트륨)로 희석시키고 80 μM 세포 스트레이너(Nalgene)를 통해 여과하였다. 1000 RPM에서 5분 동안 펠렛을 수집하고 0.5% 파라포름알데하이드 1 ㎖중에서 재현탁시켰다. 인간 ES 세포를 37℃에서 10분 동안 고정시키고 상기 설명한 바와 같이 펠렛을 수집하였다. 인간 ES 세포를 FACS 완충액 2 ㎖중에 재현탁시키고 헤마사이토메터(hemacytometer)를 사용하여 총 세포수를 계수하였다. 상기 설명한 바와 같이 세포들을 펠렛화시킨 후 얼음 상의 90 % 메탄올 중에서 30분 동 안 투과시켰다. 상기 설명한 바와 같이 인간 ES 세포를 펠렛화시킨 후 FACS 튜브(Becton Dickinson)내에서 FACS 완충액 + 0.1 % 트리톤 X-100 (Sigma) 1 ㎖로 1 x 10⁵ 세포를 희석시켰다. hESC를 상기 설명한 바와 같이 펠렛화시키고 FACS 완충액 + 0.1 % 트리톤 X-100 (Sigma) 중에 희석된 1차 항체 50 ㎕에 재현탁하였다. 적절한 대조군 항체의 샘플을 병렬로 공급하였다. hESC를 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 상층액을 따라 버리고 세포를 2차 항체(Molecular Probes/Invitrogen) 50 ㎕ 중에서 30분 동안 암실에서 실온으로 항온처리하였다. CellQuest Software (Becton Dickinson)를 이용한 Facscalibur (Becton Dickinson) 세포 분류기에서 FACS 분석을 수행하였다. FACS 분석을 수행하는 이러한 방법으로 세포 표면 마커를 검출하여 ES 세포를 보유하고 있는지를 제시할 수 있다. 관찰된 결과는 UM100에서 배양된 인간 ES 세포가 집단으로서 Oct-4에 대해 90 % 양성이라는 것이다. 이는 CM-배양된 ES 세포와 유사하며 세포들이 ES 세포군임을 확인한다. SSEA4 및 Tral-60의 분석을 위해, 파라포름알데하이드 또는 메탄올 중에서 세포를 처리하지 않은 것을 제외하고는, Oct-4에 대한 상기 과정을 수행하였다. 세포 염색 후 세포를 FACS 완충액 (트리톤 무함유)에서 재현탁시키고 다시 트리톤이 없는 FACS 완충액 중의 적당한 항체로 상기 설명한 바와 같이 분석하였다. 미분화된 ES 세포 배양물은 또한 이러한 2종의 세포 표면 마커에 대해서도 평균 약 90 % 양성이었다. 이는 상기 논의한 FACS 분석으로 입증되었다

결과

인간 ES 세포주 H1 세포들은 지금까지 인간 ES 세포의 형태 및 특징을 유지하면서 UM100 배지 내에서 33 계대 (164 세포수 배가) 이상 동안 배양되었다. H1 세포는 인간 ES 세포의 형태 및 특징을 유지하면서 6 계대 (70 일) 이상 동안 BM+ 배지 내에서 배양되었다. H9 세포는 5 계대 (67 일) 이상 동안 DHEM 배지 내에서 배양되었다. H9 및 H7 인간 ES 세포는 또한 각각 22 계대 및 21 계대 동안 미분화 상태로 UM100 배지 내에서 배양되었다. BM+ 및 UM100에서 배양된 세포의 후속 검증으로 정상적인 핵형을 확인하였다.

FGF 형태 연구

테스트 배지로 교환하기 전 3번의 계대 배양 동안 조건 배지 내에서 표준 조건으로 인간 ES 세포주 H1을 배양하였다. 테스트 조건을 위해 세포들을 24시간 동안(0 일) 조건 배지 상에서 배양한 후 다음날 (1일) 테스트 배지로 교환하였다. 이 후 세포들을 각 테스트 배지 내에서 배양하였다. 병렬로 테스트 배지로 교환하기 전 조건 배지 중의 Matrigel 상에서 5번의 계대 배양 동안 인간 ES 세포주 H9을 또한 배양하였다.

다음과 같은 절차를 사용하여 세포를 계대 배양하였다. 세포 배양물을 6 웰 조직 배양 평판 내에서 (약 7일을 소요하여) 적당한 밀도로 배양하고, 배양물을 37℃에서 5∼7분 동안 1 ㎖ 디파제 (1 mg/㎖) (Gibco/Invitrogen)로 처리하였다. 디파제를 제거한 후 적절한 배양 배지 2 ㎖로 대체하였다. 5 ㎖ 피펫을 사용하여 세포들을 조직 배양 평판에서 물리적으로 제거한 후 피펫팅으로 분산시켰다. 임상 원심분리기를 이용하여 5분간 1000 rpm으로 세포들을 펠렛화시켰다. 적당한 부피의 배지에 상기 펠렛을 재현탁시킨 후 목적하는 희석도에서 재평판 배양하였다.

첨가되는 FGF를 선별한 것 이외에는 배지 배합물은 일정하였다. 기본 배지는 UM100이었고 FGF는 목적하는 테스트 조건에 따라 다양하였다. 하기 FGF 변이체를 테스트하고 각각을 100 ng/㎖로 배지에 첨가하였다: FGF1 (산성 FGF), FGF1β(산성 FGF의 이소폼), FGF2 (염기성 FGF), FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF1O, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20. 모든 FGF들은 구입 가능하거나 재조합 숙주에서 생성되었다.

각각의 계대 배양 후에 인간 ES 세포 배양을 지원하는 특정 FGF 형태의 능력을 감정하였다. 인간 ES 세포 배양을 지원하는 것으로 감정되었던 조건으로 영양 공급 세포와 독립적으로 배양시 미분화된 상태로 적절하게 증식하는 배양물을 지원하고, 효과적인 계대 배양을 할 수 있고, 인간 ES 세포 표지자 Oct4, SSEA4 및 Tral-60의 발현을 계속할 수 있다. 배양시 인간 ES 세포를 지원하지 못하는 것으로 감정되었던 조건은 세포의 유의적인 분화가 형태학적으로 명확히 관찰되고 이 세포가 콜로니 계대 배양시 증식할 수 없는 배양물을 초래하였다. 인간 ES 세포를 지원하는 FGF 변이체들은 FGF2, FGF4, FGF17 및 FGF18이었다. 미분화 상태에서 인간 ES 세포의 유지를 지원하지 못하는 FGF 변이체는 FGF1, FGF1B, FGF3, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF1O, FGF16, FGF19 및 FGF20이었다. FGF9가 첨가된 배지에 대한 결과는 초기에는 한계가 있었다. 절차를 반복함에 따라 100 ng/㎖로 보충된 FGF9 또한 배양시 미분화된 인간 ES 세포를 지원하는 것으로 보인다.

현시점에서 FGF4, FGF17 및 FGF20으로 보충된 배지는 8계대 배양 동안 H1 세 포의 미분화된 인간 ES 세포 배양을 지원하였다. 인간 ES 세포주 H9 및 H14 상에서 FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18을 함유하는 유사한 복제물은 각각 3 및 2 계대로 증폭하였다.

본 발명은 바람직한 구체예와 관련하여 상기에서 설명하였다. 이러한 개념의 기타 형태는 또한 청구 범위의 범위 내에 있는 것으로 의도한다. 예를 들어, 상기 실험에는 재조합으로 생성된 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자를 사용하지만 자연적으로 분리된 섬유아세포 성장 인자 또한 적당할 것이다. 이러한 기술은 원숭이 및 기타 영장류의 세포 배양에 적용하는 것 또한 적당한 것으로 판명된다.

따라서 본 청구범위는 본 발명의 범위를 완전히 감정하기 위한 것으로 기대할 수 있다.

본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법 및 이에 사용하는 배양 배지를 제공한다.

Claims

인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법으로서,

본질적으로 포유동물 태아 혈청을 함유하지 않는 배양물 내에서, 및 아미노산, 비타민, 염, 무기물, 트랜스페린 또는 트렌스페린 대체물, 인슐린 또는 인슐린 대체물, 알부민, 및 영양 공급층 이외의 공급원으로부터 제공되며 유지 농도 이상의 높은 농도로 존재하는 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 줄기 세포 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배지가 영양 공급 세포를 필요로 하지 않거나 또는 영양 공급 세포에 배지의 노출을 필요로 하지 않으면서, 6번 이상의 계대 동안 인간 미분화 증식 정배수체 배아 줄기 세포의 배양 및 증식을 지원할 수 있는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양물은 본질적으로 어떠한 동물의 혈청도 함유하지 않는 방법.
제1항에 있어서, FGF는 FGF2, FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, FGF는 배지 내에 100 ng/㎖ 농도로 존재하는 FGF2인 방법.
혈청 및 영양 공급 세포를 함유하지 않는 규정 배지(defined media) 내에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법으로서,

알부민, 아미노산, 비타민, 무기물, 1종 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 1종 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 포함하고, 본질적으로 포유동물 태아 혈청을 함유하지 않으며, 섬유아세포 성장 인자의 신호전달 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 약 100 ng/㎖ 이상으로 포함하는 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 성장 인자는 영양 공급층 이외의 공급원으로부터 제공되며, 상기 배지는 영양 공급 세포 또는 조건 배지 없이 미분화 상태로 줄기 세포의 증식을 지원하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양 단계는 줄기 세포가 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직의 유도체로 분화하기 위한 잠재력을 유지하고 줄기 세포의 핵형을 유지하면서 1개월 이상 동안 배양물 내에서 증식하는 배아 줄기 세포를 포함하는 방법.
제5항에 있어서, FGF는 FGF2, FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
인간 배아 줄기 세포; 및

알부민, 아미노산, 비타민, 무기질, 1종 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 1종 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 포함하는 줄기 세포 배지를 포함 하는 인간 배아 줄기 세포의 배양물로서, 배양 배지는 본질적으로 포유동물 태아 혈청을 함유하지 않고 섬유아세포 성장 인자 신호 전달 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 유지 농도 이상으로 포함하고, 혈청의 부재 및 영양 공급 세포의 부재 및 또한 영양 공급 세포에 노출시킨 배지의 부재하에서 무한하게 줄기 세포를 배양할 수 있으며,

줄기 세포를 정상적인 핵형을 가지면서 미분화된 상태로 무한하게 유지시킬 수 있는 배양물.
제8항에 있어서, 섬유아세포 성장 인자는 배지 내에 약 100 ng/㎖ 이상의 농도로 존재하는 FGF2인 배양물.
줄기 세포 배양 배지 내에 인간 배아 줄기 세포를 포함하는 영양 공급 세포 독립적인 인간 배아 줄기 세포의 배양물로서,

상기 줄기 세포 배양 배지는 알부민, 아미노산, 비타민, 무기질, 1종 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 1종 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 포함하고, 이 배양 배지는 본질적으로 포유동물 태아 혈청을 함유하지 않고, FGF2, FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 섬유아세포 성장 인자를 유지 농도 이상으로 포함하며,

세포를 미분화 상태에서 정배수체로 유지시키는 동안 영양 공급 세포에 독립적인 배양물.
제10항에 있어서, 섬유아세포 성장 인자는 약 100 ng/㎖ 이상의 농도로 존재하는 배양물.