CN103432108A

CN103432108A - N-3不饱和脂肪酸在制备促造血干细胞动员剂中的用途

Info

Publication number: CN103432108A
Application number: CN2013103027213A
Authority: CN
Inventors: 夏圣; 李小平; 韩慕天; 程璐; 张苗苗; 邵启祥
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2013-12-11

Abstract

本发明是初步研究了n-3不饱和脂肪酸对骨髓造血功能的影响，发现n-3不饱和脂肪酸可通过调节骨髓造血微环境中造血细胞因子SDF-1α和基质金属蛋白酶12（MMP-12）的表达，促进骨髓造血干细胞的增殖与迁移，提高骨髓外造血干细胞及造血前体的数量，进而发现n-3不饱和脂肪酸对骨髓造血干细胞的动员作用。此发明对于进一步研究n-3不饱和脂肪酸的生物学功能，及将其作为造血干细胞的动员剂使用于造血干细胞移植术有着潜在的应用价值。

Description

N-3不饱和脂肪酸在制备促造血干细胞动员剂中的用途

技术领域

本发明涉及n-3不饱和脂肪酸促进骨髓造血干细胞动员的新用途。

背景技术

外周血造血干细胞移植（Peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT）是因具有采样方便、受者造血功能重建快等特点，被广泛应用于治疗各类恶性血液肿瘤、实体瘤及自身免疫性疾病等的治疗。在进行PBSCT治疗过程中，造血干细胞的动员效果直接影响其疗效。造血干细胞的动员涉及造血干/祖细胞的增殖、迁移出髓、及外周的适应三个阶段。其中，在造血干细胞的增殖阶段需要将干细胞诱导激活，使其活化并发生增殖；出髓阶段是指造血干细胞因与造血龛位中基质细胞的粘附能力下降，干细胞易于迁出骨髓；适应阶段是指迁出的干细胞通过适应髓外新环境，不向骨髓的归巣并避免自身发生凋亡。针对造血干细胞动员的以上特点，近年来，临床上出现了多种造血干细胞动员方法。综合起来，主要有三种：①大剂量化疗。通过大剂量化疗一方面破坏正常造血稳态，使骨髓出现反馈性的造血增生；另一方面可破坏骨髓造血基质微环境，使干细胞更易从其龛位中迁出。②采用促造血的细胞因子，选择性地刺激造血干细胞向某一类血细胞定向分化。目前临床上用的最多的是人粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulatingfactor,G-CSF）。③将化疗与促造血细胞因子联合应用。尽管，对于大部分供者以上方法都可采集到充足的造血干细胞，但此类方法也有其明显的缺点。化疗性药物对于供者骨髓的创伤较大；部分患者对于G-CSF耐受或过敏，并且G-CSF还可引起发热、肾功能不全、潜在的诱导血液细胞肿瘤等不良反应。因而，若能寻找到新的、副作用少的造血干细胞动员剂，对于临床造血干细胞移植的治疗有着非常重要的意义。

N-3不饱和脂肪酸（n-3polyunsaturated fatty acids），又称欧美加3不饱和脂肪酸（Omega-3polyunsaturated fatty acids），是一类第一个不饱和键位于甲基一端的第3个碳原子上的不饱和脂肪酸。其中，常见并且重要的n-3不饱和脂肪酸有α-亚麻酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）。n-3不饱和脂肪酸是人体内的必需脂肪酸之一。人类因体内缺乏相应的酶系统，不能通过自身代谢合成，只能从食物中获得。富含此脂肪酸的食物有深海鱼油、坚果等。此类脂肪酸能竞争n-6不饱和脂肪酸代谢中的酶，并抑制其促炎活性产物的产生。因此，体现出较强的抗炎活性。临床上已将该类脂肪酸作为抗炎剂用于心血管疾病、自身免疫性疾病等慢性炎症的预防与治疗。

本发明的研究发现，在高摄入n-3不饱和脂肪酸的情况下，骨髓中的造血干细胞可被诱导增殖，并迁出骨髓，进入外周血及骨髓外器官中，从而提示n-3不饱和脂肪酸对造血干细胞有明显的动员作用。因该类脂肪酸是人体内的必需脂肪酸，参与正常细胞的细胞膜组成，并可从食物中获得，如能将其用于造血干细胞动员，对受者的副作用较小，是一潜在的有效造血干细胞动员剂，对于造血干细胞移植的治疗有重要临床应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供n-3不饱和脂肪酸的新用途。

n-3不饱和脂肪酸在体内可诱导骨髓造血干细胞的增殖、并促进其向骨髓外迁出，提高造血干细胞在外周血及外周器官中的数量，可以作为造血干细胞的动员剂应用。该脂肪酸主要通过诱导骨髓下调表达SDF-1α，上调表达基质金属蛋白酶12（MMP-12），促进造血干细胞的增殖与迁出。

本发明公开了的n-3不饱和脂肪酸在制备造血干细胞动员剂药物中的应用。所述的造血干细胞动员剂药物包括促骨髓内造血干细胞增殖药物、促骨髓内造血干细胞迁出骨髓药物等。

所述的n-3不饱和脂肪酸是二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid）、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸（Docosahexanoic acid，DHA）。

所述的造血干细胞为：谱系抗原阴性、Sca-1分子阳性和CD117分子阳性。

所述的造血前体细胞为：谱系抗原阴性、Sca-1分子阴性和CD117分子阳性。

本发明的有益效果是：发现了n-3不饱和脂肪酸对造血干细胞的促增殖和迁出骨髓的作用，进而发现了该脂肪酸作为造血干细胞动员剂的用途。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。

图1是不同脂肪酸摄入组小鼠的体重图。

图2是不同脂肪酸摄入组小鼠的脾重图。

图3对不同处理组小鼠脾脏内造血干细胞和造血前体细胞流式分析结果代表图。

图4对不同处理组小鼠脾细胞进行造血干细胞集落培养计数结果（图4上）及不同集落典型显微镜下形态（图4下）图。

图5是不同处理组小鼠脾细胞在被照射受体鼠内的脾集落形成分析试验结果图，图5左为统计分析结果，图画右为不同实验组形成的典型的脾集落照片。

图6是不同处理组小鼠脾组织内细胞因子SCF、SDF-1α/CXCR4和GM-CSF的实时荧光定量PCR分析结果图。

图7是不同处理组小鼠外周血中白细胞计数（图7左）和Lin^-CD117⁺Sca-1⁺造血干细胞的相对比例结果图。

图8是不同处理组骨髓内Lin^-CD117⁺Sca-1-造血前体细胞和Lin^-CD117⁺Sca-1⁺造血干细胞的流式分析结果统计图。

图9是不同处理组骨髓细胞进行造血干细胞集落培养后的不同集落数的结果统计图。

图10是不同处理组骨髓细胞SCF、SDF-1α/CXCR4的实时荧光定量PCR分析结果图。

图11是不同处理组骨髓细胞MMP-9和MMP-12的实时荧光定量PCR分析结果图。

图12是将骨髓细胞与不同浓度n-3不饱和脂肪酸（DHA）共培养后，骨髓细胞表达的MMP-9和MMP-12的实时荧光定量PCR分析结果图。

具体实施方式

实施案例1：高n-3不饱和脂肪酸摄入模型的建立及对造血干细胞的影响

（1）不同脂肪酸摄入模型的建立

取六周龄的C57BL/6雄性小鼠，分成三组，分别给予含13%脂肪的正常饲料（LFD）、59%的高脂饲料（HFD）、59%高n-3不饱和脂肪酸饲料（n-3PUFA）（各组饲料的组份见附表1）。同时各组给予正常饮水。饲喂4周后，分别称取体重（图1）、脾重（图2）、并取外周血等样本按照后续实验内容进行检测分析。结果显示，59%高脂饲喂组，其体重明显高于其它两组；而高n-3不饱和脂肪酸组与正常组无明显差异（图1）。N-3高不饱和脂肪酸组脾重与正常组相比有增加趋势，但无统计学意义（图2）

表1：各组饲料的主要脂肪酸组份

（2）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，脾脏中造血干细胞与前体细胞的流式细胞分析

按实施案例1中（1）所述建立不同脂肪酸摄入动物模型，4周后，处死实验小鼠，取脾，用磷酸缓冲液（PBS）洗去血污。将脾放置于200目钢网上，用无菌针栓研磨脾，收获单个脾细胞，用破红液溶去脾脏中的红细胞，用PBS洗三次后，制备单个脾细胞液。取部分脾细胞液，加入到96孔板中，1000rpm/分钟,水平离心2分钟，弃去上清，加入含大鼠血清的PBS20μl封闭，4℃封闭10分钟，加合适稀释度的荧光抗体（含anti-Lineage,anti-CD117,anti-Sca-1）20μl，4℃15分钟。加PBS200μl，室温2分钟后，1000rpm/分钟,水平离心2分钟，弃去上清。PBS洗涤过程重复二次。加PBS200μl，混匀细胞后，收获细胞上流式细胞仪分析。结果显示，与其它两组相比，高n-3不饱和脂肪酸摄入后，脾脏中的Lin^-CD117⁺Sca-1⁺造血干细胞和Lin^-CD117⁺Sca-1^-造血前体细胞明显增加（图3）。

（3）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，脾脏中造血干细胞与前体细胞的集落培养

按实施案例1中（2）所述建立不同脂肪酸摄入动物模型，并制备单个脾细胞液。将脾细胞用计数，并用含2%胎牛血清的IMDM培养基调整至合适浓度。将细胞加至甲基纤维素造血干细胞完全培养基（R&D公司产品）中，用旋涡振荡器振荡，使细胞在甲基纤维素造血干细胞完全培养基中均匀分布，用注射器吸取1.1ml该培养基（含2×10⁵脾细胞）加到35mm培养皿中，37℃，5%CO₂条件下培养8天后，根据集落的形态对GEMM（粒、单、红、巨核细胞）、GM（粒、单）和BFU集落进行计数。结果显示：高n-3不饱和脂肪酸摄入组的GEMM、GM和BFU集落数明显高于其它两组；而高脂组的GM集落数高于正常对照组，但小于高n-3不饱和脂肪酸摄入组（图4）。

（4）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，脾脏细胞的脾集落形成分析试验(Spleen colony forming cellassay,CFU-S)。

按实施案例1中（2）所述建立不同脂肪酸摄入动物模型，并制备单个脾细胞液。将受体C57BL/6鼠用1000cGy的剂量进行照射后，尾静脉分别注射2×10⁵和5×10⁴脾细胞。细胞过继21天后，将受体处死，取脾用Bouin’s固定液(Bouin’s solution)固定后，计数脾上的集落数。结果显示：高n-3不饱和脂肪酸摄入组可形成的脾集落数最多，而高脂组也可产生较正常组多的脾集落数（图5）。

（5）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，脾脏组织内造血相关细胞因子及受体表达量的实时荧光定量PCR分析。

按实施案例1中（1）所述建立不同脂肪酸摄入动物模型，处死实验小鼠后，快速取脾脏组织，置液氮中快速冷冻。用常规Trizol法提取RNA后，42℃，1小时，70℃，15分钟进行逆转录，制备cDNA，利用以下引物对相关基因进行实时荧光定量PCR分析。实时荧光定量PCR反应的体积为20μl，用核糖体的l32基因或GAPDH基因做为内参照。所用引物序列：

SCF（造血干细胞生长因子）：

forward5’-TATGATAACCCTCAACTATGTCGCC-3’（SEQ ID No:1）;reverse5’-TTCTTTTATATTCTTCGGTGCGTTT-3’（SEQ ID No:2）;

CXCR4：

forward5’AGCATGACGGACAAGTACC-3’（SEQ ID No:3）;

reverse5’–GATGATATGGACAGCCTTACAC-3’（SEQ ID No:4）;

SDF-1α:

forward5’-GAGAGCCACATCGCCAGAG-3’(SEQ ID No:5);

reverse5’-TTTCGGGTCAATGCACACTTG-3’(SEQ ID No:6)

GM-CSF:

forward5’-GCCAGGAGATTCCACAACTC-3’(SEQ ID No:7);

reverse5’-GCCTCTACATGCTTCCAAGG-3’(SEQ ID No:8)

GAPDH:

forward5’-GGCATTGCTCTCAATGACAA-3’（SEQ ID No:9）;

reverse5’-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3’（SEQ ID No:10），

L32:

forward5’-GAGCAACAAGAAAACCAAGCA-3’（SEQ ID No:11）;

reverse5’-TGCACACAAGCCATCTACTCA-3’（SEQ ID No:12）;.

结果显示：与造血相关的造血干细胞生长因子SCF和SDF-1α/CXCR4在高脂组及高n-3不饱和脂肪酸组均增加。同时，高n-3不饱和脂肪酸组高水平表达与髓系分化有关的GM-CSF（图6）。

（6）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，外周血中造血干细胞分析。

按实施案例1中所述建立不同脂肪酸摄入模型，小鼠眼眶采血，EDTA抗凝，取部分外周血细胞用白细胞计数液破红细胞后，用血细胞计数板进行白细胞计数。余下细胞用购自eBioscience的外周血破红剂溶红细胞，加PBS，1000rpm/分钟，离心10分钟，弃上清。用PBS再重复洗涤一次后，加入大鼠血清4℃封闭10分钟后，加不同荧光素标记的anti-Lineage,anti-CD117,anti-Sca-1标记细胞样本，4℃，15分钟后，用PBS洗去未结合荧光素标记抗体，流式分析Lin^-CD117⁺Sca-1⁺的比例。结果显示：高n-3不饱和脂肪酸摄入组外周血白细胞总数及造血干细胞比例均高于其他两组（图7）。

（7）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，骨髓内造血干细胞和前体细胞的分析。

按实施案例1中所述建立不同脂肪酸摄入模型，处死小鼠。取股、胫骨，用无菌注射器吸取冷PBS冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲出后，1000rpm/分钟，离心10分钟，弃上清，用PBS重悬细胞，按实施案件1中所述进行流式细胞标记与分析和造血干细胞集落培养。结果显示：尽管不同脂肪酸摄入组间骨髓内前体细胞的数量无明显差异，但高n-3不饱和脂肪酸摄入组的Lin^-CD117⁺Sca-1⁺造血干细胞明显高于其他两组（图8）。但其GEMM、GM、BFU的集落数与其它两组无显差异（图9）。

（8）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，骨髓内造血相关细胞因子及受体表达量的实时荧光定量PCR分析。按实施案例1中（6）所述建立不同脂肪酸摄入动物模型，并收获骨髓细胞，将该细胞按实施案例1中（5）所述提取RNA，并进行cDNA合成与实时荧光定量PCR分析。所用引物同实施案例1（5）。结果显示：高n-3不饱和脂肪酸摄入组骨髓内SDF-1α的表达明显低于其它两组低（图10）。

（9）高n-3不饱和脂肪酸摄入后，骨髓内基质金属蛋白酶表达量的实时荧光定量PCR分析。按实施案例1中（7）所述建立不同脂肪酸摄入动物模型，并收获骨髓细胞，提取RNA，用以下引物进行基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-12(MMP-12)的检测与分析，以GAPDH为内参。引物序列如下：

murine MMP-9:

forward5’-AAATGGTGCCCCATGTCACTTT-3’（SEQ ID No:13）;

reverse5’-GCTCCGTGTAGAGTCTCTCACTAGG-3’（SEQ ID No:14）;

murine MMP-12:

forward5’-TTACAGGATCTATAATTACACTCCGGAC-3’（SEQ ID No:15）;

reverse5’-GCAAAAAGTATCATAATGTCAGCCT-3’（SEQ ID No:16）。

结果显示：高n-3不饱和脂肪酸摄入组骨髓细胞不但表达了与高脂组相似的高水平MMP-9；还高表达更高水平的MMP-12（图11）。

实施案例2、高n-3不饱和脂肪酸体外共培养对骨髓细胞MMP-12表达的影响（图12）

取正常6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠，按实施案例1中的所述冲洗、制备骨髓细胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640校细胞浓度至2×10⁶/ml。加入不同终浓度DHA（0、25uM、50uM、250uM），共培养24h后，收集骨髓细胞，离心，弃上清。用Trizol法提取RNA，按实施案例1中所述进行cDNA逆转录，并用实施案例1（9）中所用引物及方法进行基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-12(MMP-12)的实时荧光定量PCR分析。结果显示：DHA对于骨髓细胞MMP-9的表达无明显影响，但随着DHA浓度的增加，骨髓细胞的MMP-12的表达明显增加（图12）。

Claims

1. n-3不饱和脂肪酸在制备造血干细胞动员剂药物上的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的造血干细胞动员剂药物包括促骨髓内造血干细胞增殖药物、促骨髓内造血干细胞迁出骨髓药物。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于n-3不饱和脂肪酸是：二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于造血干细胞为谱系抗原阴性、Sca-1抗原阳性和CD117抗原阳性。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于造血前体细胞是：谱系抗原阴性、Sca-1分子阴性和CD117分子阳性。