JP2020162536A - 組み換えタンパク質産生増加のための培地用組成物 - Google Patents
組み換えタンパク質産生増加のための培地用組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020162536A JP2020162536A JP2019068192A JP2019068192A JP2020162536A JP 2020162536 A JP2020162536 A JP 2020162536A JP 2019068192 A JP2019068192 A JP 2019068192A JP 2019068192 A JP2019068192 A JP 2019068192A JP 2020162536 A JP2020162536 A JP 2020162536A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- cells
- serum
- fraction
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014616 translation Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 7
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 title description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M [(2r)-3-acetyloxy-2-hydroxypropyl] 2-aminoethyl phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCCN CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M 0.000 claims abstract description 20
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 16
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002036 chloroform fraction Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000963438 Gaussia <copepod> Species 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700037728 Glycine max beta-conglycinin Proteins 0.000 description 1
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- XCQHIHYTTLZESJ-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;propan-2-one Chemical compound OC.CC(C)=O.ClC(Cl)Cl XCQHIHYTTLZESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 101150047862 hil-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000015250 liver sausages Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002032 methanolic fraction Substances 0.000 description 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006012 monoammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Abstract
【課題】無血清培地を用いた場合であっても、遺伝子組み換えタンパク質の産生能力を高めることができる方法及び組成物の提供。【解決手段】ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む遺伝子組換えタンパク質産生促進剤。【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子組み換えタンパク質の産生能力を高めることができる培地用組成物に関するものである。
バイオ医薬品（抗体医薬品）は、特異的、高活性でかつ副作用が少ないなどの従来の低分子医薬にはない効果を有しており、今後高い成長が見込まれている。また、再生医療に必要な細胞の培養（iPS細胞、ES細胞等）、酵素などの有用物質の生産等にも細胞培養が必要である。そのため企業間の開発競争は激化しており、製造や研究開発の一部外注化が進むと予想されている。
バイオ医薬品の多くが、翻訳後修飾が比較的ヒトに近い等の理由により動物細胞を用いて生産されている。この動物細胞で物質生産するには、動物細胞の増殖に必要な血清や血清中から分離したタンパク質成分を添加した培地がよく使われている。しかし、血清は生物材料であるために、マイコプラズマ、ウイルス、ＢＳＥの原因となる異常プリオンが混入している可能性がある。また、血清はロットごとに生物活性が異なり、品質のよいロットを選択するための検査が必要であるところ、この検査にもコストが発生する。そのため、最近、血清を含まない無血清培地に種々の成分を加えて細胞を増殖させる様々な方法が提案されている（特許文献１）。
バイオ医薬品の多くが、翻訳後修飾が比較的ヒトに近い等の理由により動物細胞を用いて生産されている。この動物細胞で物質生産するには、動物細胞の増殖に必要な血清や血清中から分離したタンパク質成分を添加した培地がよく使われている。しかし、血清は生物材料であるために、マイコプラズマ、ウイルス、ＢＳＥの原因となる異常プリオンが混入している可能性がある。また、血清はロットごとに生物活性が異なり、品質のよいロットを選択するための検査が必要であるところ、この検査にもコストが発生する。そのため、最近、血清を含まない無血清培地に種々の成分を加えて細胞を増殖させる様々な方法が提案されている（特許文献１）。
そこで、細胞増殖自体の誘起または促進に不可欠な成分に加えて、培養速度を高い水準に維持する役割を果たす補完的な成分の添加が検討されてきた。例えば、大豆由来β−コングリシニン（特許文献２）、リン脂質（特許文献３）などが、報告されている。
一方、バイオ医薬品生産等のために開発される無血清培地の最終目的は組み換えタンパク質生産を高い効率で行うことであるので、生産能力を上げることが望まれている。そのため、無血清培地の細胞増殖の改善だけでなく、タンパク質分泌促進因子を開発することも必要である。無血清培地の培地用添加剤として、リン脂質を血清代替として用いることが報告されている（特許文献４）
本発明は、上記のような状況に鑑み、無血清培地を用いた場合であっても、遺伝子組み換えタンパク質の産生能力を高めることができる方法及び組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を無血清培地に添加した培地で動物細胞を培養すると、組み換えタンパク質の生産能力を高めることができることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、
（１）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む遺伝子組換えタンパク質産生促進剤、
（２）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む、（１）のタンパク質産生促進剤、
（３） （１）又は（２）のタンパク質促進剤を含む動物細胞用培地、
を提供するものである。
（１）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む遺伝子組換えタンパク質産生促進剤、
（２）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む、（１）のタンパク質産生促進剤、
（３） （１）又は（２）のタンパク質促進剤を含む動物細胞用培地、
を提供するものである。
本発明によると、細胞増殖を促進し、さらに、組み換えタンパク質の産生も促進することができ、有用物質を効率よく製造することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の培地は、遺伝子組み換えタンパク質を生産するための培地であって、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含むことを特徴とする。
本発明の培地は、遺伝子組み換えタンパク質を生産するための培地であって、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含むことを特徴とする。
本願発明の組成物であるタンパク質産生促進剤は、植物由来及び動物由来のいずれのものを使用してもよい。例えば、ホスファチジルセリンの場合であれば、大豆、魚、獣脳、獣肉、卵、乳製品等さらに酵母などに由来するものを使用することができる。これらの動植物等の組織、酵母などから抽出・単離することで得ることができる。抽出方法は公知の方法を利用でき制限はない。さらに、天然由来のではなく化学合成により、入手したものでも良い。さらに、通常の方法により得られたＰＥやＬＰＥを用いることができるが、さらに精製等によりＰＥ又はＬＰＥを濃縮しても良い。具体的には、リゾホスファチジルエタノールアミンの場合は、例えば、特開２００７−１２６３９８に記載の方法などである。つまり、リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ１ またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収する。
このようにして得られた本願の組成物を動物培養用培地に添加することで動物細胞用培地を得ることができる。添加量は対象となる細胞により異なるが、通常は、ＰＥとＬＥＰの合計量で少なくとも培地濃度が０．０００１重量％以上、好ましくは０．００５重量％以上、さらに好ましくは０．００１重量％以 上の濃度となるように添加する。
本願組成物は、血清培地、低血清培地でも使用できるが、無血清培地の方がより好適に使用できる。培地の組成は、一般的な組成でよく、一般的に市販されている動物細胞用培地も使用することができる。また、宿主細胞に応じで適宜選択することができる。
本発明で用いる動物細胞としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に対して、特にCHO-K1、HEK293等に対して好適である。
本発明で用いる動物細胞としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に対して、特にCHO-K1、HEK293等に対して好適である。
本発明の組成物を培地へ添加する方法は、任意である。通常、前述までの方法で得られた、本発明の組成物を噴霧乾燥、凍結乾燥等して使用する。また、乾燥品を使用しなくても良い。
本発明の組成物を動物細胞用培地に添加し、培養することで、組換えタンパク質等の有用物質の発現が促進される。そのため、本願組成物を用いて培養した培地から目的とする有用物質を単離することにより、有用物質を製造することができる。動物細胞から得られる有用物質としては、抗体、酵素、ホルモンなどがある。
以下に実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
（酵母抽出物の製造例）
（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株（ＦＥＲＭＰ−３３４０）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽で、１８L培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行った。ｐＨのコントロールは、アンモニアで行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌して、１８０gの湿潤酵母菌体を得た。
（酵母エキスの抽出）
菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。洗浄後は湿潤菌体を蒸留水に再度懸濁する、又は、凍結乾燥、若しくは熱風乾燥させた乾燥菌体を蒸留水に懸濁する。2N NaOHでpH13に調整後、70℃で20分間攪拌し、酵母エキスを抽出した。酵母エキス抽出後の菌体残渣をドラムドライヤーで乾燥し、乾燥物100gを酵母残渣として使用した。
（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株（ＦＥＲＭＰ−３３４０）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽で、１８L培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行った。ｐＨのコントロールは、アンモニアで行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌して、１８０gの湿潤酵母菌体を得た。
（酵母エキスの抽出）
菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。洗浄後は湿潤菌体を蒸留水に再度懸濁する、又は、凍結乾燥、若しくは熱風乾燥させた乾燥菌体を蒸留水に懸濁する。2N NaOHでpH13に調整後、70℃で20分間攪拌し、酵母エキスを抽出した。酵母エキス抽出後の菌体残渣をドラムドライヤーで乾燥し、乾燥物100gを酵母残渣として使用した。
製造例１
上記酵母残渣100ｇに対して95%エタノールを2倍量となるように加え、60℃、9時間抽出した。5℃に降温して1時間保持した後、ろ紙（ADVANTEC社、NO.5C）で濾過し不溶物を取り除いた。さらに、ろ過液をロータリーエバポレーターにて減圧濃縮乾固し、組成物5.5ｇを得た。
トルラオイル5 gを7.5 mLクロロホルムに溶かして、オープンカラムに供した。樹脂はイアトロビーズ6RS-8060を使用した。展開溶媒をクロロホルムとメタノールにし、クロロホルム100％、80％、60％、40％、20％、0％の順に溶媒を各400 mLずつ流し、クロロホルム80％画分を1.32 g回収した。
次に、クロロホルム80％画分1.3 gを5 mLクロロホルムに溶かして、上記と同じオープンカラムに供した。展開溶媒はクロロホルム、アセトン、メタノールを用いた。展開溶媒の割合の下記の順に流し、計6画分を回収し、画分VIを0.32 g回収した。
クロロホルム アセトン メタノール
画分I 400 mL 0 mL 0 mL
画分II 320 mL 80 mL 0 mL
画分III 200 mL 200 mL 0 mL
画分IV 0 mL 400 mL 0 mL
画分V 0 mL 200 mL 200 mL
画分VI 0 mL 0 mL 400 mL
上記酵母残渣100ｇに対して95%エタノールを2倍量となるように加え、60℃、9時間抽出した。5℃に降温して1時間保持した後、ろ紙（ADVANTEC社、NO.5C）で濾過し不溶物を取り除いた。さらに、ろ過液をロータリーエバポレーターにて減圧濃縮乾固し、組成物5.5ｇを得た。
トルラオイル5 gを7.5 mLクロロホルムに溶かして、オープンカラムに供した。樹脂はイアトロビーズ6RS-8060を使用した。展開溶媒をクロロホルムとメタノールにし、クロロホルム100％、80％、60％、40％、20％、0％の順に溶媒を各400 mLずつ流し、クロロホルム80％画分を1.32 g回収した。
次に、クロロホルム80％画分1.3 gを5 mLクロロホルムに溶かして、上記と同じオープンカラムに供した。展開溶媒はクロロホルム、アセトン、メタノールを用いた。展開溶媒の割合の下記の順に流し、計6画分を回収し、画分VIを0.32 g回収した。
クロロホルム アセトン メタノール
画分I 400 mL 0 mL 0 mL
画分II 320 mL 80 mL 0 mL
画分III 200 mL 200 mL 0 mL
画分IV 0 mL 400 mL 0 mL
画分V 0 mL 200 mL 200 mL
画分VI 0 mL 0 mL 400 mL
得られた各画分をHPLC-ELSD分析した。
カラム：SIL100A3μm 4.6 x 100 mm
カラムオーブン：35℃
流速：1.0 mL/min
移動層：A:メタノール:水＝95：5
B:クロロホルム
分析条件：
カラム：SIL100A3μm 4.6 x 100 mm
カラムオーブン：35℃
流速：1.0 mL/min
移動層：A:メタノール:水＝95：5
B:クロロホルム
分析条件：
結果を図１に示す。
（細胞増殖への影響）
製造例１で得られた各画分を培地に添加し、細胞増殖への影響を確認した。
製造例１で得られた各画分を培地に添加し、HEK293の増殖への影響を確認した。
HEK２９３を９６Wellプレートに4×10^3 cells/0.1 mL/wellとなるよう調整し24時間CO2インキュベーター培養後、PBS（−）で各Wellを洗浄後、各画分I〜VIを含む無血清培地に置換した。48時間培養後、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所社製）を10μL/well添加し、1時間後、４５０ｎｍで吸光度測定した。測定の結果を図２に示す。
画分I、II、V、VIを0.001％添加したWellの増殖性が無血清培地のコントロールよりも増殖性が改善していた。
製造例１で得られた各画分を培地に添加し、細胞増殖への影響を確認した。
製造例１で得られた各画分を培地に添加し、HEK293の増殖への影響を確認した。
HEK２９３を９６Wellプレートに4×10^3 cells/0.1 mL/wellとなるよう調整し24時間CO2インキュベーター培養後、PBS（−）で各Wellを洗浄後、各画分I〜VIを含む無血清培地に置換した。48時間培養後、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所社製）を10μL/well添加し、1時間後、４５０ｎｍで吸光度測定した。測定の結果を図２に示す。
画分I、II、V、VIを0.001％添加したWellの増殖性が無血清培地のコントロールよりも増殖性が改善していた。
活性のあった各分は、図１の解析結果より、特に活性の強かった画分VIの検出されたピーク面積から、PEが８６．２１％、LPEが１２．５３％含有していることが分かった。
以上から、無血清培地において、PE及びLPEを添加することで、細胞増殖性を改善できることが確認できた。
以上から、無血清培地において、PE及びLPEを添加することで、細胞増殖性を改善できることが確認できた。
画分VIを培地に添加し、Gaussia Luciferase（GLuc）の発現量、Human IL-6（hIL6）の発現量を解析した。使用した培地は、ＲＰＭＩ１６４０（WAKO製 「189-02025」）に、画分VIの組成物を０．０１％添加した無血清培地を用いた。
安定発現株の取得：CHO−K1細胞を1×10^4 cells/mL/24 well plateに播種した。翌日、hIL6遺伝子（500ng/well）をトランスフェクションした。トランスフェクション3日目に、細胞を100mm dishに移して、細胞が80%程度コンフルエントになってから、G418含有培地に切り替え、約1週間培養しながらセレクションを行った。その後、出来上がったコロニーをピックアップして96wellpateで培養し、活性確認を行い、活性があった細胞を更に24well plate、6well plateにスケールアップしてhIL6安定発現株を取得した。
安定発現株の取得：CHO−K1細胞を1×10^4 cells/mL/24 well plateに播種した。翌日、hIL6遺伝子（500ng/well）をトランスフェクションした。トランスフェクション3日目に、細胞を100mm dishに移して、細胞が80%程度コンフルエントになってから、G418含有培地に切り替え、約1週間培養しながらセレクションを行った。その後、出来上がったコロニーをピックアップして96wellpateで培養し、活性確認を行い、活性があった細胞を更に24well plate、6well plateにスケールアップしてhIL6安定発現株を取得した。
（無血清培地のGluc安定発現株に与える影響）
GLuc安定発現株を前述のｈＩＬ６と同様の方法で取得し、5×10^5 cells/2 mL/6 well plateに播種した。翌日、PBS(-)で洗浄し、酵母抽出物含有培地2 mL／well添加し、48時間培養した。 48hr後、培養上清中のGluc活性を測定するとともに、セルカウント法にて細胞数を計測した。
取得した安定株３株（230株、232株、236株）で評価し、３株とも、細胞当たりのGluc活性は、RPMI1640/画分VIがRPMI1640/FBS群やCDM4CHO群よりも高い活性を示した。なお、RPMI1640/FBS群は、ＲＰＭＩ１６４０に、ウシ血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％となるように添加して、CHO−K1細胞を培養する培地として用いた群である。CDM4CHO群は、CHO-K1細胞を培養する培地にCDM4CHO（GE Healthcare社製「HyClone」）のみを用いた群である。
GLuc安定発現株を前述のｈＩＬ６と同様の方法で取得し、5×10^5 cells/2 mL/6 well plateに播種した。翌日、PBS(-)で洗浄し、酵母抽出物含有培地2 mL／well添加し、48時間培養した。 48hr後、培養上清中のGluc活性を測定するとともに、セルカウント法にて細胞数を計測した。
取得した安定株３株（230株、232株、236株）で評価し、３株とも、細胞当たりのGluc活性は、RPMI1640/画分VIがRPMI1640/FBS群やCDM4CHO群よりも高い活性を示した。なお、RPMI1640/FBS群は、ＲＰＭＩ１６４０に、ウシ血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％となるように添加して、CHO−K1細胞を培養する培地として用いた群である。CDM4CHO群は、CHO-K1細胞を培養する培地にCDM4CHO（GE Healthcare社製「HyClone」）のみを用いた群である。
（無血清培地のhIL6安定発現株に与える影響）
取得した安定株２株（HE11A1株、HE12A2株）で評価し、２株を5×10^5 cells/2 mL/6 well plateに播種した。翌日、PBS(-)で洗浄し、画分VI含有培地2 mL／well添加し、48時間培養した。 48hr後、培養上清中のhIL6発現量を測定するとともに、セルカウント法にて細胞数を計測した。
HE11A1株、HE12A2株とも、細胞当たりのIL-6産生量はRPMI1640/画分VIが、ほかの2群と比べて明らかに高い値を示した。
取得した安定株２株（HE11A1株、HE12A2株）で評価し、２株を5×10^5 cells/2 mL/6 well plateに播種した。翌日、PBS(-)で洗浄し、画分VI含有培地2 mL／well添加し、48時間培養した。 48hr後、培養上清中のhIL6発現量を測定するとともに、セルカウント法にて細胞数を計測した。
HE11A1株、HE12A2株とも、細胞当たりのIL-6産生量はRPMI1640/画分VIが、ほかの2群と比べて明らかに高い値を示した。
Claims (3)
- ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）又はリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む遺伝子組換えタンパク質産生促進剤
- ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）を含む、請求項１のタンパク質産生促進剤
- 請求項１又は請求項２のタンパク質促進剤を含む動物細胞用培地
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019068192A JP2020162536A (ja) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 組み換えタンパク質産生増加のための培地用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019068192A JP2020162536A (ja) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 組み換えタンパク質産生増加のための培地用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020162536A true JP2020162536A (ja) | 2020-10-08 |
Family
ID=72715102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019068192A Pending JP2020162536A (ja) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 組み換えタンパク質産生増加のための培地用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2020162536A (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09505986A (ja) * | 1993-09-22 | 1997-06-17 | クリエイティブ バイオモレキュールズ，インコーポレイテッド | 脂質を改変した無血清培地 |
| JP2003180342A (ja) * | 2001-12-19 | 2003-07-02 | Sanyo Chem Ind Ltd | 有用物質生産量増加用添加剤 |
| WO2007080919A1 (ja) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Japan Science And Technology Agency | 動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利用 |
| JP2013512667A (ja) * | 2009-12-04 | 2013-04-18 | クリスティーナ、ラジャラ | 幹細胞を培養するための処方物および方法 |
| WO2017195789A1 (ja) * | 2016-05-10 | 2017-11-16 | 興人ライフサイエンス株式会社 | 培地用組成物 |
-
2019
- 2019-03-29 JP JP2019068192A patent/JP2020162536A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09505986A (ja) * | 1993-09-22 | 1997-06-17 | クリエイティブ バイオモレキュールズ，インコーポレイテッド | 脂質を改変した無血清培地 |
| JP2003180342A (ja) * | 2001-12-19 | 2003-07-02 | Sanyo Chem Ind Ltd | 有用物質生産量増加用添加剤 |
| WO2007080919A1 (ja) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Japan Science And Technology Agency | 動物細胞を無血清培養するための培地用添加剤、キット及びこれらの利用 |
| JP2013512667A (ja) * | 2009-12-04 | 2013-04-18 | クリスティーナ、ラジャラ | 幹細胞を培養するための処方物および方法 |
| WO2017195789A1 (ja) * | 2016-05-10 | 2017-11-16 | 興人ライフサイエンス株式会社 | 培地用組成物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 116, JPN6023005573, 1966, pages 489 - 499, ISSN: 0004992048 * |
| OMICS A JOURNAL OF INTEGRATIVE BIOLOGY, vol. 14, no. 6, JPN6023005571, 2010, pages 665 - 677, ISSN: 0004992047 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6938154B2 (ja) | 未分化細胞が除去された分化誘導細胞集団、その利用及びその製造方法 | |
| Lavrov et al. | Sponge cell reaggregation: mechanisms and dynamics of the process | |
| Recha-Sancho et al. | Chondroitin sulfate-and decorin-based self-Assembling scaffolds for cartilage tissue engineering | |
| Cao et al. | A novel function of BMHP1 and cBMHP1 peptides to induce the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells | |
| KR20150014436A (ko) | 진핵 세포용 배양 배지 | |
| CN113088487B (zh) | 一种间充质干细胞成脂转化抑制剂 | |
| Alevra Sarika et al. | Human liver-derived extracellular matrix for the culture of distinct human primary liver cells | |
| JP2020162536A (ja) | 組み換えタンパク質産生増加のための培地用組成物 | |
| Josic et al. | Application of proteomics in biotechnology–microbial proteomics | |
| Miksiunas et al. | Cardiomyogenic differentiation potential of human dilated myocardium-derived mesenchymal stem/stromal cells: the impact of HDAC inhibitor SAHA and biomimetic matrices | |
| CN110241128B (zh) | 一种含有cbd的融合基因、细胞系、液态ecm与应用 | |
| JP4452829B2 (ja) | 細胞性粘菌を利用した医薬候補物質のスクリーニング法 | |
| CN116217663A (zh) | 一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽kftpap、制备方法及应用 | |
| JP6997079B2 (ja) | 培地用組成物 | |
| CA3038021A1 (en) | Compound or salt thereof, anti-inflammatory agent, anti-cancer agent against lung cancer, method of producing compound or salts thereof, method of treating inflammatory diseases and method of treating lung cancer | |
| KR102161947B1 (ko) | 측분비인자를 포함하는 세포 배양용 조성물 | |
| KR102161946B1 (ko) | 측분비인자 및 이의 제조방법 | |
| CN103865861A (zh) | 基于LuxS缺陷的变异链球菌AMC代谢恢复株 | |
| JP2018080166A (ja) | 骨代謝調整剤 | |
| KR20120063766A (ko) | 미세조류 나비쿨라 인세르타의 가수분해물 및 이를 포함하는 항산화 조성물 | |
| CN101381741B (zh) | 一种能够对真核细胞进行基因输运的多肽类载体及衍生物 | |
| JP6300641B2 (ja) | 皮膚バリア機能改善効果を有する放線菌培養物 | |
| JP2015529463A (ja) | 細胞選択的なプロテオーム標識 | |
| JP5667365B2 (ja) | サッカロマイセス・セレビシエ変異株、及び該変異株を用いた含硫化合物高含有酵母の製造方法。 | |
| EP4166658A1 (en) | Diatom-based genetic engineering system methodology for the eco-sustainable production of ovothiols |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220228 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20220228 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230131 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230217 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230808 |