CN113088487B - 一种间充质干细胞成脂转化抑制剂 - Google Patents
一种间充质干细胞成脂转化抑制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种间充质干细胞成脂转化抑制剂，属于干细胞技术领域。本发明所提供的间充质干细胞成脂转化抑制剂为角叉菜多糖。本发明所提供的抑制剂能够有效的抑制成脂转化相关基因PPARγ和C/EBPα的mRNA表达和蛋白表达，进而抑制骨髓间充质干细胞成脂转化过程中的脂肪滴生成的数目。
Description
本案为分案申请，原申请的发明名称为：角叉菜多糖在抑制间充质干细胞成脂转化中的用途，原申请的申请日为：2020-04-30，原申请的申请号为：CN202010361704.7。
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞成脂转化抑制剂。
背景技术
多糖也被称之为多聚体，是生物有机体中普遍存在的一类生物大分子物质。多糖不仅参与细胞骨架的构成，而且也是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。多糖以游离形式参与生命过程，而且还与蛋白质、肽以及脂质等组成缀合物的形式，在生理机能平衡与稳定的过程中发挥重要的调节作用。
角叉菜是一种低脂肪、高蛋白的大型藻类, 角叉菜不但是生产卡拉胶的重要藻类之一, 在角叉菜藻体内部还富含大量的活性物质, 主要种类为海藻色素、脂肪酸、氨基酸、甾醇、多糖、维生素等, 且一般具有较好的生物活性。目前，关于角叉菜多糖在干细胞的功能目前尚未可知。
骨髓间充质干细胞也被称之为骨髓基质来源干细胞，是一种具有良好的亲塑性及多种分化潜能的成体干细胞。骨髓间充质干细胞主要存在于骨髓中，在体外培养时具有高度的自我更新能力。在特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以定向的培养为成纤维细胞、脂肪细胞、心肌细胞、软骨细胞以及成骨细胞等。骨质疏松是一类全身骨骼代谢疾病，目前的研究发现，成骨细胞和脂肪均来自于骨髓间充质干细胞，骨髓内脂肪细胞的增加和骨质疏松的发病关系密切，骨髓腔内成骨细胞的减少与脂肪细胞的异常增多总是相伴出现。因此，寻找能够有效抑制骨髓间充质干细胞成脂转化的新型药物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种角叉菜多糖用于抑制间充质干细胞成脂转化的新用途。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了角叉菜多糖在抑制间充质干细胞成脂转化中的用途。
优选地，所述角叉菜多糖的提取方法，包括如下步骤：
（1）将干燥的角叉菜洗净，60℃鼓风干燥机烘干，95%乙醇浸泡12h；
（2）60℃鼓风干燥机烘干，粉碎，过50目筛；
（3）转移至超高压生物提取设备中，加入15倍量的水，200MPa压力下，提取3min；
（4）转移至离心机中，3500r/min离心15分钟，去除沉淀，保留上清即得粗多糖提取液；
（5）将粗多糖提取液减压浓缩，并加入至无水乙醇中，醇沉20h；
（6）转移至离心机中，3500r/min离心15分钟，去除上清，保留沉淀；
（7）将沉淀使用无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥即得角叉菜多糖。
此外，本发明提供了角叉菜多糖在制备间充质干细胞成脂转化抑制剂中的用途。
此外，本发明提供了角叉菜多糖在制备成脂转化相关基因C/EBPα和PPARγ抑制剂中的用途。
此外，本发明提供了角叉菜多糖在制备治疗骨质疏松药物中的用途。
除此之外，本发明提供了一种角叉菜多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将干燥的角叉菜洗净，60℃鼓风干燥机烘干，95%乙醇浸泡12h；
（2）60℃鼓风干燥机烘干，粉碎，过50目筛；
（3）转移至超高压生物提取设备中，加入15倍量的水，200MPa压力下，提取3min；
（4）转移至离心机中，3500r/min离心15分钟，去除沉淀，保留上清即得粗多糖提取液；
（5）将粗多糖提取液减压浓缩，并加入至无水乙醇中，醇沉20h；
（6）转移至离心机中，3500r/min离心15分钟，去除上清，保留沉淀；
（7）将沉淀使用无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥即得角叉菜多糖。
本发明的有益效果在于：
本发明首次证明了角叉菜多糖能够通过抑制成脂转化相关基因PPARγ和C/EBPα的mRNA表达和蛋白表达来抑制间充质干细胞的成脂转化，从而有助于进一步利用角叉菜多糖来制备治疗骨质疏松药物。
附图说明
图1 角叉菜多糖对成脂转化相关基因PPARγ mRNA表达的影响
图2 角叉菜多糖对成脂转化相关基因C/EBPα mRNA表达的影响
图3 角叉菜多糖对于成脂转化相关基因PPARγ和C/EBPα蛋白表达的影响
图4油红O染色检测角叉菜多糖对间充质干细胞成脂转化脂滴形成的影响
图5 吸光度检测油红O染色强度。
具体实施方式
实施例1
（1）将干燥的角叉菜洗净， 60℃鼓风干燥机烘干，95%乙醇浸泡12h；
（2）60℃鼓风干燥机烘干，粉碎，过50目筛；
（3）取1000g干燥后的角叉菜转移至超高压生物提取设备中，加入15倍量的水，200MPa压力下，提取3min；
（4）转移至离心机中， 3500r/min离心15分钟，去除沉淀，保留上清即得粗多糖提取液；
（5）将粗多糖提取液减压浓缩，并加入至无水乙醇中，醇沉20h；
（6）转移至离心机中,3500r/min离心15分钟，去除上清，保留沉淀；
（7）将沉淀使用无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥即得角叉菜多糖。
实施例2
1.成脂转化诱导
（1）将5×104的骨髓间充质干细胞接种于培养板中，加入完全培养基进行培养；
（2）当细胞融合度达到70%时，将培养基更换为成脂诱导培养基+角叉菜多糖（0μg/mL，50μg/mL，100μg/mL, 200μg/mL），成脂诱导14天，每3天进行一次换液，每组设置3个重复；
2.RNA提取
（1）培养14天后，去除培养基，每孔加入500μL Trizol，反复的吹打细胞，直到形成清亮不粘稠的液体；
（2）将混合液转移至1.5ml EP管中，加入100μL氯仿,在振荡器上剧烈震荡充分混匀15s，室温静置5分钟；
（3）4℃，低温高速离心机，12000r/min离心15min，小心将上层透明RNA水相转移至新的无RNA酶EP管中；
（4）加入等体积的异丙醇混匀，冰上放置10min，13000r/min，4℃离心10min，弃去上清，可见管底白色沉淀；
（5）加入400μL 70%酒精温和震荡，12000rpm/min 4℃ 5min，弃去上清液体，管口向下，紧贴滤纸，吸尽管口的液体，室温下干燥5-10min，检测RNA浓度和质量。
3.RNA反转录为cDNA
（1）反转录体系
（2）反转录反应条件
37℃ 15min；85℃ 5s；4℃
4.荧光定量PCR反应
反应体系:
反应条件：
95℃ 10min；95℃ 20s，62℃ 45s，40个循环；72℃ 5min。
3.引物序列
实验结果
实验结果如图1和图2所示，从图1可以看出，50μg/mL角叉菜多糖组的PPARγ的mRNA相对表达量为0.470±0.036, 100μg/mL角叉菜多糖组的PPARγ的mRNA相对表达量为0.373±0.035, 200μg/mL角叉菜多糖组的PPARγ的mRNA相对表达量为0.366±0.050，且差异均具有统计学意义。
从图2可以看出，50μg/mL角叉菜多糖组的C/EBPα的mRNA相对表达量为0.553±0.030, 100μg/mL角叉菜多糖组的C/EBPα的mRNA相对表达量为0.456±0.015, 200μg/mL角叉菜多糖组的C/EBPα的mRNA相对表达量为0.416±0.015，且差异均具有统计学意义。
上述结果说明，角叉菜多糖可以有效的抑制PPARγ和C/EBPα的mRNA表达，且在浓度100μg/mL时已具有优异的抑制效果，因此后续实验采用100μg/mL作为实验组。
实施例3
Western blot检测
1.蛋白提取
（1）成脂诱导过程同实施例2，成脂诱导14天后，将100μL RIPA裂解液加入到培养板中，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞裂解液收集至EP管中；
（2）用细胞超声破碎仪将细胞破碎，4℃，12000r/min，离心15min；
（3）将上清转移至新的EP管中，使用BCA法测量蛋白浓度；
（4）使用5×上样缓冲液调整蛋白浓度为2μg/μL，沸水煮5min，得到蛋白样品。
2.Western blot实验
（1）配置12%分离胶，5%浓缩胶，每孔加入10μL蛋白样品；
（2）电泳条件：浓缩胶为恒压90V，时间约20分钟；分离胶为130V，时间约1h；
（3）电转条件：恒流280mA，0.45nm孔径NC膜；转膜时间1.5h；
（4）用镊子轻轻将膜取出，置于5%脱脂奶粉中，室温封闭1h；
（5）按照蛋白大小裁剪条带，孵育相应的C/EBPα，PPARγ和GAPDH一抗，4℃孵育过夜；
（6）第二天将膜取出，在室温下孵育30min，用TBST洗膜，每次3分钟，重复3次；
（7）孵育二抗，室温，摇床孵育1h；
（8）用TBST洗膜，每次3分钟，重复3次，进行显影曝光。
实验结果
实验结果如图3所示，从图中可以看出，100μg/mL角叉菜多糖组的PPARγ和C/EBPα的蛋白量低于0μg/mL角叉菜多糖组的蛋白量，说明角叉菜多糖能够抑制PPARγ和C/EBPα的蛋白表达。
实施例4
油红O染色检测
（1）将5×104的骨髓间充质干细胞接种于培养板中，加入完全培养基进行培养；
（2）当细胞融合度达到70%时，将培养基更换为成脂诱导培养基+角叉菜多糖（0μg/mL和100μg/mL），成脂诱导14天，每3天进行一次换液，每组设置3个重复；
（3）培养结束后，弃掉培养基，用PBS轻轻的清洗细胞3次，每次3分钟，加入10%甲醛固定40分钟；
（4）弃掉甲醛，加入500μL油红O染色液，染色30分钟；
（5）将油红O去除，用PBS轻轻的清洗细胞3次，每次3分钟，倒置显微镜下观察并进行拍照。
实验结果
从图4可以看出，相较于0μg/mL角叉菜多糖，100μg/mL油红O染色的细胞数目和脂肪滴的数目显著的减少，说明通过角叉菜多糖可以显著抑制骨髓间充质干细胞的成脂转化。
实施例5
吸光度检测
（1）成脂诱导过程同实施例2，成脂诱导14天后，弃掉培养基，用PBS轻轻的清洗细胞3次，每次3分钟，加入10%甲醛固定40分钟；
（2）弃掉甲醛，加入500μL油红O染色液，染色30分钟；
（3）弃掉油红O染色液，用PBS轻轻的清洗细胞3次，每次3分钟；
（4）加入500μL异丙醇萃取细胞内结合的油红O染色液，20分钟；
（5）将萃取液加入到96孔板中，510nm处检测吸光值，每组设置3个重复。
实验结果
从图5可以看出，100μg/mL角叉菜多糖组所萃取的油红O染色液吸光度为0.763±0.045，而0μg/mL角叉菜多糖所萃取的油红O染色液的吸光度为0.243±0.035，差异具有统计学意义。
综上所述，角叉菜多糖能够有效的抑制骨髓间充质干细胞的成脂转化。
序列表
<110> 青岛思拓新源细胞医学有限公司
<120> 角叉菜多糖在抑制间充质干细胞成脂转化中的用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (1)
1.一种间充质干细胞成脂转化抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为角叉菜多糖，所述角叉菜多糖的提取方法包括如下步骤：
（1）将干燥的角叉菜洗净，60℃鼓风干燥机烘干，95%乙醇浸泡12h；
（2）60℃鼓风干燥机烘干，粉碎，过50目筛；
（3）转移至超高压生物提取设备中，加入15倍量的水，200MPa压力下提取3min；
（4）转移至离心机中，3500r/min离心15分钟，去除沉淀，保留上清即得粗多糖提取液；
（5）将粗多糖提取液减压浓缩，并加入至无水乙醇中，醇沉20h；
（6）转移至离心机中，3500r/min离心15分钟，去除上清，保留沉淀；
（7）将沉淀使用无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥即得角叉菜多糖。
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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Effective date of registration: 20221116 Address after: 264203 12th floor, office building of Weihai Zhengsheng Biotechnology Co., Ltd., north of Huanghe street and east of Guangtai airport, Zhangcun Town, Huancui District, Weihai City, Shandong Province Applicant after: Weihai Jiansheng Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Room 202, building 15, Max business Hongwan, 17 Guangbo Road, high tech Zone, Chengyang District, Qingdao City, Shandong Province 266109 Applicant before: Qingdao Situo Xinyuan Cell Medicine Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: An inhibitor of mesenchymal stem cell lipogenic transformation Effective date of registration: 20230425 Granted publication date: 20221206 Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Weihai Branch Pledgor: Weihai Jiansheng Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2023980039089 |