CN115010821B - 一种多糖在促进脐带间充质干细胞生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多糖在促进脐带间充质干细胞生长中的应用，属于细胞生物学技术领域。本发明所述提供的多糖为短毛藻多糖，短毛藻多糖由如下制备方法制备得到：将短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；加入20倍量的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的1/4；加入3倍量的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；加入蒸馏水溶解短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖。
Description
本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种促进细胞生长的生物制剂，原申请的申请日为：2021-10-15，原申请的申请号为：CN202111200323.1。
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种多糖在促进脐带间充质干细胞生长中的应用。
背景技术
间充质干细胞是一种具有多向分化潜能和自我复制能力的成体干细胞。由于间充质干细胞具有可移植和低免疫原行的特点，因此其在自身免疫性疾病和各种替代治疗方法拥有着广泛的应用前景。间充质干细胞广泛的存在于脐血，脂肪组织，外周血，牙髓和骨髓等。其中，脐带中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。特定的诱导条件下，脐带间充质干细胞可以被诱导为表皮细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等。因此，脐带间充质干细胞已经被广泛的应用于干细胞治疗中。然而，脐带间充质干细胞在进行体外培养时，增殖速度较为缓慢，因此有效的促进脐带间充质干细胞的体外增殖能力，对于脐带间充质干细胞的临床应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进脐带间充质干细胞生长的生物制剂，从而实现细胞的快速繁殖。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种促进脐带间充质干细胞生长的生物制剂，所述生物制剂为短毛藻多糖，所述短毛藻多糖由如下制备方法制备得到：
（1）将短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；
（2）加入20倍量的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；
（3）将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的1/4；
（4）加入3倍量的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；
（5）加入蒸馏水溶解短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；
（6）将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖；
所述短毛藻多糖的浓度为大于等于10mg/ml。
其次，本发明提供了短毛藻多糖在制备促进脐带间充质干细胞增殖生物制剂中的应用，所述短毛藻多糖由如下制备方法制备得到：
（1）将短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；
（2）加入20倍量的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；
（3）将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的1/4；
（4）加入3倍量的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；
（5）加入蒸馏水溶解短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；
（6）将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖。
优选地，所述应用包括短毛藻多糖促进脐带间充质干细胞促增殖蛋白SCF的蛋白表达。
优选地，所述应用包括短毛藻多糖抑制脐带间充质干细胞抑增殖蛋白p21的蛋白表达。
其次，本发明提供了短毛藻多糖在制备脐带间充质干细胞促增殖蛋白SCF的蛋白表达促进剂中的应用，所述短毛藻多糖由如下制备方法制备得到：
（1）将短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；
（2）加入20倍量的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；
（3）将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的1/4；
（4）加入3倍量的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；
（5）加入蒸馏水溶解短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；
（6）将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖。
最后，本发明提供了短毛藻多糖在制备脐带间充质干细胞抑增殖蛋白p21的蛋白表达抑制剂中的应用，所述短毛藻多糖由如下制备方法制备得到：
（1）将短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；
（2）加入20倍量的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；
（3）将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的1/4；
（4）加入3倍量的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；
（5）加入蒸馏水溶解短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；
（6）将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种短毛藻多糖，本发明所提供的短毛藻多糖可以有效的促进脐带间充质干细胞的增殖，可以有效的促进脐带间充质干细胞促增殖蛋白SCF蛋白的蛋白表达并且可以有效的降低脐带间充质干细胞抑增殖蛋白p21的蛋白表达，因此可将短毛藻多糖用于制备促进脐带间充质干细胞生长的生物制剂。
附图说明
图1 CCK-8实验的检测结果，在图中，*代表P＜0.05,**代表P＜0.01，***代表P＜0.001；
图2 EDU实验的检测结果；
图3 Western Blot实验的检测结果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
（1）将100g短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；
（2）加入2000ml的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；
（3）将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的500ml；
（4）加入1500ml的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；
（5）加入100ml蒸馏水溶解5g短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；
（6）将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖。
实施例2
利用CCK-8实验检测短毛藻多糖对于脐带间充质干细胞增殖的调控
（1）使用DMEM培养基将短毛藻多糖配置为1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，50mg/ml和100mg/ml的浓度；
（2）将P3代的脐带间充质干细胞接种于96孔板中，每孔4000个/100ul，待细胞贴壁后，对照组不添加短毛藻多糖，实验组分别添加1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，50mg/ml和100mg/ml浓度的短毛藻多糖；
（3）将96孔板置于细胞培养箱中，培养48h后，使用CCK-8检测OD值。
实验所得到的结果如图1所示，其中，对照组的OD值为0.899±0.034；
1mg/ml短毛藻多糖处理后的OD值为0.912±0.028，P值为0.627，差异无统计学意义；
10mg/ml短毛藻多糖处理后的OD值为1.020±0.054，P值为0.030，小于0.05，差异具有统计学意义；
20 mg/ml短毛藻多糖处理后的OD值为1.175±0.047，P值为0.001，小于0.05，差异具有统计学意义；
50 mg/ml短毛藻多糖处理后的OD值为1.329±0.035，P值为0.0001，小于0.05，差异具有统计学意义；
100 mg/ml短毛藻多糖处理后的OD值为1.390±0.030，P值为< 0.0001，小于0.05，差异具有统计学意义；
综合上述结果可以看出，当添加的短毛藻多糖的浓度大于10mg/ml时，可以有效的促进脐带间充质干细胞的细胞增殖能力。
实施例3
利用EDU实验检测短毛藻多糖对脐带间充质干细胞增殖的调控
（1）将P3代的脐带间充质干细胞接种于96孔板中，每孔4000个/100ul，待细胞贴壁后，对照组不添加短毛藻多糖，实验组添加100mg/ml浓度的短毛藻多糖；
（2）处理48h后，加入EDU染料A液，继续孵育6h；
（3）孵育结束后，弃去染液，加入0.3%BSA清洗细胞2次，每次5min；
（4）加入4%甲醛室温固定15min；
（5）固定结束后，加入0.3%BSA清洗2次，加入0.5%TritonX-100室温孵育20min；
（6）去除后，加入0.3%BSA清洗2次，加入适量1 × Click－iT 鸡尾酒反应液，水平摇床室温避光孵育30min；
（7）去除后，加入0.3%BSA清洗2次，加入Hoechst33342避光水平摇床孵育30min；
（8）使用PBS清洗2次后，置于荧光显微镜下进行拍照，阳性细胞比例为增殖细胞数目/总细胞数目×100%。
其中，对照组的阳性细胞比例为31%，而实验组的阳性细胞比例为52%，P值小于0.05，差异具有统计学意义，该结果进一步说明本发明所制备的短毛藻多糖能够有效的促进脐带间充质干细胞的增殖。
实施例4
利用Western Blot实验检测短毛藻多糖对于脐带间充质干细胞增殖相关蛋白的调控
（1）将P3代脐带间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，对照组不添加短毛藻多糖，实验组添加100mg/ml浓度的短毛藻多糖；
（2）将6孔板置于细胞培养箱中，培养72h之后，每孔加入100ul蛋白裂解液裂解细胞，使用细胞刮刀将细胞刮下后，收集至1.5ml的EP管中，置于冰上裂解30min；
（3）裂解结束之后，将EP管置于离心机中离心，离心后取上清，使用BCA法检测蛋白浓度，加入上样缓冲液，沸水煮5min使蛋白充分变性；
（4）配置电泳胶，每孔加入10ul蛋白样品和蛋白Marker，调整电压为90V，恒压至蛋白Marker分开，之后将电泳调整为120V，直至溴酚蓝到达电泳胶的底部；
（5）将胶取出，按照经典的‘三明治’模型安装电转夹，调整为电流250mA，电转1.5h；
（6）电转结束之后，将膜取出置于封闭液中，室温下封闭1h；
（7）孵育SCF，p21和GAPDH一抗，置于4℃孵育过夜后，吸取一抗，使用TBST洗膜3次后，孵育相应的二抗；
（8）孵育1h后，去除二抗，进行显影曝光。
得到的实验结果如图3所示，其中，可以看出实验组的SCF蛋白的蛋白表达量显著高于对照组，而实验组的p21蛋白的表达量则显著低于对照组。上述结果说明短毛藻多糖能够有效的促进脐带间充质干细胞促增殖蛋白SCF的蛋白表达，并且能够有效的抑制脐带间充质干细胞抑增殖蛋白p21的蛋白表达。
Claims (2)
1.短毛藻多糖在制备脐带间充质干细胞促增殖蛋白SCF的蛋白表达促进剂中的应用，其特征在于，所述短毛藻多糖由如下制备方法制备得到：
(1)将短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；
(2)加入20倍量的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；
(3)将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的1/4；
(4)加入3倍量的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；
(5)加入蒸馏水溶解短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；
(6)将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖；
所述蛋白表达促进剂中短毛藻多糖的浓度为大于等于10mg/ml。
2.短毛藻多糖在制备脐带间充质干细胞抑增殖蛋白p21的蛋白表达抑制剂中的应用，其特征在于，所述短毛藻多糖由如下制备方法制备得到：
(1)将短毛藻原料使用清水清洗干净，置于干燥箱中烘干至恒重后，粉碎为短毛藻粉末；
(2)加入20倍量的蒸馏水，90℃下提取3h，8500g离心30min，收集上清，得到短毛藻提取液；
(3)将短毛藻提取液旋转蒸发至原体积的1/4；
(4)加入3倍量的无水乙醇，静置24h后，5000g离心20min，将沉淀冷冻干燥，得到短毛藻粗多糖；
(5)加入蒸馏水溶解短毛藻粗多糖，得到短毛藻粗多糖溶解液；
(6)将短毛粗多糖溶解液经过50kDa的超滤膜，将截留液冷冻干燥后得到短毛藻多糖；
所述蛋白表达抑制剂中短毛藻多糖的浓度为大于等于10mg/ml。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220909 Address after: Room 202, building 15, Max business Hongwan, 17 Guangbo Road, high tech Zone, Chengyang District, Qingdao City, Shandong Province 266109 Applicant after: Qingdao Situo Xinyuan Cell Medicine Co.,Ltd. Address before: 271000 Building 9, Taishan science and Technology Industrial Park, yitianmen street, high tech Zone, Tai'an City, Shandong Province Applicant before: Shandong Yuanyu Biotechnology Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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Effective date of registration: 20230922 Address after: Room 101, 1st Floor, Building 6, No. 58 Jinghai Fifth Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing, 100000 Applicant after: Beijing Hangsheng Jiahe Cell Technology Co.,Ltd. Address before: Room 202, building 15, Max business Hongwan, 17 Guangbo Road, high tech Zone, Chengyang District, Qingdao City, Shandong Province 266109 Applicant before: Qingdao Situo Xinyuan Cell Medicine Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |