CN111454890A - 一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法 - Google Patents

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陈静
钟赟
刘世明
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Abstract

本发明提供一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：S1将获得的脂肪组织转移到无菌的培养皿中，剪碎成乳糜状；S2取所述的乳糜状脂肪组织小块接种至培养容器中，倒置培养，脂肪组织贴紧瓶底；S3向培养容器中加入培养基至覆盖脂肪组织小块，培养至有脂肪细胞爬出；S4待培养容器中游离出足够的脂肪细胞，移去脂肪组织小块，继续培养至细胞融合度为80％以上时，开始传代培养，获得脂肪间充质干细胞。本发明的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，通过组织块培养法，无需胶原酶及其长时间的消化处理，本发明比传统的酶消化法成本更低、操作更简单、细胞纯度更高。

Description

一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一群具有多能性的细胞，可从包括骨髓、脐带、脂肪组织在内的各种组织中分离得到。这些细胞具有巨大的临床和基础研究的吸引力，因为它们具有可塑性，可以在体外分化成所有胚层的细胞，在体内跨越异基因屏障，并抑制炎症。
脂肪源性间充质干细胞(adMSCs)的分离主要依靠胶原酶等酶促消化脂肪组织。然而，这些酶很昂贵，而且一旦消化过度容易对adMSCs的细胞活性产生不利影响。酶消化法从脂肪组织分离得到的间充质干细胞还混有成熟的脂肪细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等，不利于进一步的临床和基础研究。
因此，为了降低成本，减少干扰，寻求一种不依赖消化酶而获得间充质干细胞的方法成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的胶原酶价格昂贵、杂细胞较多等缺陷，提供一种比传统的酶消化法成本更低、操作更简单、细胞纯度更高的小鼠脂肪间充质干细胞分离培养方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)将获得的脂肪组织转移到无菌的培养皿中，剪碎成乳糜状；
(2)取所述的乳糜状脂肪组织小块接种至培养容器中，倒置培养，脂肪组织贴紧瓶底；
(3)向培养容器中加入培养基至覆盖脂肪组织小块，培养至有脂肪细胞爬出；
(4)待培养容器中游离出足够的脂肪细胞，移去脂肪组织小块，继续培养至细胞融合度为80％以上时，开始传代培养，获得脂肪间充质干细胞。
优选地，所述步骤(2)中的乳糜状脂肪组织小块为直径为5mm的圆形小块。
优选地，所述步骤(2)中的培养时间为2～4h。
本发明的实验研究发现，将乳糜状脂肪组织小块切成直径为5mm的圆形小块，培养2～4h，会使脂肪小块贴紧瓶底，不会掉落。由于本发明采用倒置培养，如果脂肪小块的直径过大，倒置培养瓶，会使脂肪组织小块掉落，直径过小不能获得足够量游离的脂肪细胞，倒置培养时间过长，延长培养时间会造成细胞的老化，降低细胞活性。因此，经过本发明的反复大量试验研究，直径为5mm的圆形小块，培养2～4h为最佳方案，能获得足够数量以及活性最强的游离脂肪间充质干细胞。
优选地，所述步骤(2)中的培养容器为25cm2的培养瓶。
优选地，所述步骤(3)中的培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
优选地，所述步骤(3)中加入培养基后，每3天换一次新鲜培养基。
优选地，所述小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法中的培养温度为37℃。
本发明的有益效果：本发明的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，通过组织块培养法，无需胶原酶及其长时间的消化处理，本发明比传统的酶消化法成本更低、操作更简单、细胞纯度更高脂肪间充质干细胞标志物表达量更高。
附图说明
图1是普通倒置相差显微镜(100×)下从脂肪组织块爬出adMSCs的呈长梭形的照片；
图2是普通倒置相差显微镜(100×)下传代后adMSCs呈漩涡状聚集生长的照片；
图3是本发明组织块法获得的adMSCs表面抗原的流式鉴定示意图，结果显示高表达间充质干细胞的表面标志物CD29、CD44、CD90和CD105，低表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45。
图4是胶原酶消化法获得adMSCs表面抗原的流式鉴定示意图，结果显示间充质干细胞的表面标志物表达明显低于本发明组织块法，表明消化法分离的adMSCs含有较多杂细胞，细胞纯度低于组织块法。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
1、抽取小鼠腹股沟处脂肪组织，放入含100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素的PBS中清洗，去除表面的血液和毛发，眼科镊剔除表面可见血管，继续用PBS冲洗2次。
2、将脂肪组织转移到无菌的培养皿中，眼科剪尽量剪碎成乳糜状。
3、用眼科镊或者吸管转移脂肪组织到25cm2的培养瓶内，接种成5mm左右大小的圆形小块，将培养瓶底面翻转倒置，放入37℃培养箱内静置2h，使脂肪小块贴紧瓶底。
4、缓慢地向培养瓶内加入适量的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，覆盖脂肪小块，动作要轻柔，避免使黏附在瓶底的组织块飘起。
5、放入37℃培养箱内培养，每3天换一次培养基，观察组织块是否有细胞爬出。
6、一旦培养皿中游出足够的细胞，移去脂肪组织小块，继续置于37℃培养箱内培养，待脂肪间充质干细胞生长融合至80％以上时传代培养。
实施例2
将实施例1获得的脂肪间充质干细胞进行细胞表面抗原的流式鉴定，结果如图1所示，显示高表达间充质干细胞的表面标志物CD29、CD44、CD90和CD105，低表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45，表面标志物的表达情况如表1所示，表明本发明的制备方法获得脂肪间充质干细胞符合标准。
表1：实施例1获得的脂肪间充质干细胞的表面标志物表达情况
Name Events ％Total ％Grandparent ％Parent
1-1:CD45 76 0.70 0.74 0.75
1-1:CD90 10,140 93.38 98.42 99.67
1-2:CD44 10,166 93.95 98.82 99.84
1-2:CD34 29 0.27 0.28 0.28
1-3:CD105 8,383 75.27 78.55 79.40
1-3:CD29 10,550 94.73 98.86 99.92
实施例3
将实施例1制备的脂肪间充质干细胞与胶原酶消化法获得的脂肪间充质干细胞进行对比。
胶原酶消化法的步骤为：将脂肪组织剪碎；置于离心管中并加入2倍体积的0.1％I型胶原酶，37℃恒温摇床150r/min消化60min；加入等体积含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化；70um细胞滤网过滤除去组织碎片，1500r/min离心5min；细胞沉淀用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬，接种到培养皿中培养。
结果如图2所示，显示间充质干细胞的表面标志物表达明显低于组织块法，表面标志物的表达情况如表2所示，表明消化法分离的adMSCs含有较多杂细胞，细胞纯度低于组织块法。
表2：胶原酶消化法获得的脂肪间充质干细胞表面标志物表达情况
Name Events ％Total ％Grandparent ％Parent
1-2:CD44 4,362 43.62 76.66 77.84
1-2:CD34 80 0.80 1.41 1.43
1-3:CD29 5,260 52.60 98.37 99.91
1-3:CD45 114 1.14 2.13 2.17
1-4:CD105 2,125 21.25 39.16 39.73
实施例4
本实施例与实施例1的唯一区别在于，本实施例的培养时间为3h。
实施例5
本实施例与实施例1的唯一区别在于，本实施例的培养时间为4h。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将获得的脂肪组织转移到无菌的培养皿中，剪碎成乳糜状；
(2)取所述的乳糜状脂肪组织小块接种至培养容器中，倒置培养，脂肪组织贴紧瓶底；
(3)向培养容器中加入培养基至覆盖脂肪组织小块，培养至有脂肪细胞爬出；
(4)待培养容器中游离出足够的脂肪细胞，移去脂肪组织小块，继续培养至细胞融合度为80％以上时，开始传代培养，获得脂肪间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的乳糜状脂肪组织小块为直径为5mm的圆形小块。
3.如权利要求1所述的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的培养时间为2～4h。
4.如权利要求1所述的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的培养容器为25cm2的培养瓶。
5.如权利要求1所述的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
6.如权利要求1所述的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入培养基后，每3天换一次新鲜培养基。
7.如权利要求1所述的小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法中的培养温度为37℃。
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