JPWO2012029863A1 - 成長因子に結合する硫酸化多糖類およびその利用 - Google Patents
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Abstract
本発明により、細胞の増殖および分化を促進しうる生体由来の物質、並びに、当該生体由来の物質を標的とした細胞の増殖および分化の評価方法、当該生体由来の物質に結合する分子を有効成分とする細胞の増殖および分化を検出するための組成物、および当該生体由来の物質を有効成分とする細胞の増殖および分化を促進するための組成物が提供される。本発明では、細胞の増殖および分化の過程において、細胞から分泌される硫酸化多糖類の一部が、成長因子に結合すること、および、このような結合性を示す硫酸化多糖類の細胞からの分泌量が、細胞の増殖および分化の進行と強い相関を示すこと、当該硫酸化多糖類を利用することにより、細胞の増殖および分化の評価や、細胞の増殖および分化の促進を行うことが可能であることを見出した。
Description
本発明は、細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される、成長因子に結合する硫酸化多糖類、並びに、該硫酸化多糖類を標的とした細胞の増殖および分化の評価方法、該硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする細胞の増殖および分化を検出するための組成物、および該硫酸化多糖類を有効成分とする細胞の増殖および分化を促進するための組成物に関する。
本願は、2010年9月2日に日本に出願された特願2010−196583号、及び2011年3月29日に日本に出願された特願2011−071661号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、2010年9月2日に日本に出願された特願2010−196583号、及び2011年3月29日に日本に出願された特願2011−071661号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
再生医療において、研究開発され一部実用化されている治療方法として、幹細胞移植が一般的に実施されている。細胞移植のための幹細胞としては、胚性幹細胞、骨髄や脂肪組織などから採取される間葉系幹細胞、造血幹細胞および各種組織幹細胞(肝幹細胞、神経幹細胞など)が用いられているが、これらのうち間葉系幹細胞は入手と培養が比較的容易である。このため、細胞移植においては、間葉系幹細胞を用いた生体組織再生の研究分野が最も進んでいる。
間葉系幹細胞を用いた再生治療の対象組織は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、腱、神経などが挙げられる。例えば、骨再生では、体外で培養し増殖させた間葉系幹細胞を、三次元スキャホールドに播種、増殖させた後、移植、治療する方法が用いられ、その治療応用例が存在する(例えば、特許文献1)。
通常、間葉系幹細胞を体外で培養するためには多種類の増殖因子を培養液中に加え続けなければならない。このためのアプローチとして、細胞に増殖因子の遺伝子を導入し、細胞に増殖因子を合成させ、オートクライン的に増殖因子を供給し続ける方法や、転写因子の遺伝子を組み込んだウイルスベクターを用いて、転写因子活性を持続的に発現させることにより、良好な骨・軟骨再生を可能とする方法などが開発されている(例えば、特許文献2)。
しかしながら、本来、生体は自然治癒力を有しており、実際、単純な骨折などはその自然治癒力を使って治療されている。一方、大きな骨欠損などには生体が本来もつ自然治癒力は十分な効力を発揮できていない場合もあるが、例えば、細胞の増殖や分化を促進する物質を投与して自然治癒力を高めることにより、幹細胞移植や遺伝子投与を行うことなく、生体組織の再生修復を実現することも可能である。また、このような作用を有する物質が体内に存在する物質である場合には、この物質を標的として、細胞の増殖や分化の状況を評価することも可能であると考えられる。
しかしながら、本来、生体は自然治癒力を有しており、実際、単純な骨折などはその自然治癒力を使って治療されている。一方、大きな骨欠損などには生体が本来もつ自然治癒力は十分な効力を発揮できていない場合もあるが、例えば、細胞の増殖や分化を促進する物質を投与して自然治癒力を高めることにより、幹細胞移植や遺伝子投与を行うことなく、生体組織の再生修復を実現することも可能である。また、このような作用を有する物質が体内に存在する物質である場合には、この物質を標的として、細胞の増殖や分化の状況を評価することも可能であると考えられる。
このような観点から、細胞の増殖や分化を促進し、生体が本来持つ自然治癒力を高めることが可能な、体内に存在する物質の同定が望まれている。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞の増殖および分化を促進しうる生体由来の物質を提供することにある。さらなる本発明の目的は、当該生体由来の物質を標的とした細胞の増殖および分化の評価方法、当該生体由来の物質に結合する分子を有効成分とする細胞の増殖および分化を検出するための組成物、および当該生体由来の物質を有効成分とする細胞の増殖および分化を促進するための組成物を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞の増殖および分化の過程において、細胞から分泌される硫酸化多糖類の一部が成長因子に結合すること、および、このような結合性を示す硫酸化多糖類の細胞からの分泌量が、細胞の増殖および分化の進行の程度と強い相関を示すことを見出した。また、本発明者らは、細胞から分泌される硫酸化多糖類の構造的特徴を明らかにした。さらに、本発明者らは、成長因子に結合する硫酸化多糖類を利用することにより、細胞の増殖や分化の評価や細胞の増殖や分化の促進を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
(1)細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される硫酸化多糖類であって、成長因子に結合する硫酸化多糖類。
(2)細胞の増殖および分化の過程が、骨細胞または軟骨細胞の増殖および分化の過程である、(1)に記載の硫酸化多糖類。
(3)成長因子がBMP-2およびbFGFからなる群より選択される分子である、(1)または(2)に記載の硫酸化多糖類。
(4)(1)から(3)のいずれかに記載の硫酸化多糖類を検出することを特徴とする、細胞の増殖および分化の評価方法。
(5)(1)から(3)のいずれかに記載の硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする、細胞の増殖および分化を検出するための組成物。
(6)(1)から(3)のいずれかに記載の硫酸化多糖類を有効成分とする、細胞の増殖および分化を促進するための組成物。
本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類は、成長因子の活性を安定化あるいは増強しうるため、当該硫酸化多糖類を利用すれば、体内(In Vivo)において、自然治癒力を利用した細胞の増殖および分化の促進を行うことや、体外(In Vitro)における、細胞の増殖および分化の促進を行うことが可能となる。また、本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類を標的として、体内における細胞の増殖および分化の進行の程度の評価や、体外における細胞の増殖および分化の進行の程度の評価を行うことが可能となる。
本発明は、細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される硫酸化多糖類であって、成長因子に結合する硫酸化多糖類を提供する。さらに、本発明は、当該硫酸化多糖類を検出することを特徴とする、細胞の増殖および分化の評価方法を提供する。
本発明における「細胞の増殖および分化の過程」としては、例えば、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞、血液細胞などの増殖および分化の過程が挙げられるが、これらに制限されない。これら細胞の増殖や分化のための培養系においては、各種幹細胞から各種組織の細胞へ分化させる培養系を用いることが可能である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞、骨髄や脂肪組織などから採取される間葉系幹細胞、造血幹細胞、各種組織幹細胞(肝幹細胞、神経幹細胞など)が挙げられるが、これらに制限されない。また、増殖および分化をさせるための細胞の由来する生物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギなどが挙げられるが、これらに制限されない。
細胞を増殖および分化させる方法としては、当業者に公知の方法を用いることができる。例えば、骨細胞を増殖および分化させる方法においては、骨細胞に分化しうる細胞を播種後、通常の培地、例えば、α-MEM(alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium)またはDMEM(ダルベッコ変法イーグル最小必須培地)などの最小必須培地に10%〜15%のウシ胎児血清を加えた培地で、2〜4日間培養する。ここで、骨細胞に分化しうる細胞としては、例えば、骨芽細胞、骨前駆細胞、間葉系細胞(間葉系幹細胞を含む)、およびそれらの細胞株(例えば、MC3T3-E1、C3H10T1/2)を用いることができる。その後、培地を、分化誘導培地、例えば、上記通常の培地に、β-グリセロリン酸、アスコルビン酸(あるいはその誘導体であるアスコルビン酸2リン酸)、およびデキサタゾンを加えた培地に変更し、21〜28日間培養する。分化誘導培地での培養においては、例えば、3〜4日ごとに培地交換を行いながら、37℃で5%CO2気相下にて培養する条件を適用することができる。分化誘導培地には、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する既知の因子(例えば、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-7、bFGF、TGF-β1など)の1以上をさらに添加することもできる。
骨細胞への分化は、例えば、アルカリフォスファターゼ活性により検出することができる。また、カルシウムの沈着を指標に検出することもできる。これらの検出には、市販のキット、例えば、アルカリホスファターゼ測定キット(ラボアッセイTMALP、和光純薬)やカルシウム測定キット(カルシウムC-テストワコー、和光純薬)を用いることができる。
軟骨細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献(ALASTAIR M. MACKAY et al., TISSUE ENGINEERING Vol.4 (1998) 415-428)に記載の方法が利用可能である。この方法においては、培養したヒト間葉系幹細胞をトリプシンで剥離し、遠心管内で、単細胞分散させた後、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に試薬(10μg/mL TGF-β3、100nM デキタメタゾン、50μg/mL アスコルビン酸、100μg/mL ピルビン酸ナトリウム、40μg/mL プロリン、6.25μg/mL ウシインスリン、6.25μg/mL トランスフェリン、5.33μg/mL リノール酸、1.25mg/mL ウシ血清アルブミン)を加えた分化誘導培地に分散した後、遠心操作で細胞ペレットを作成して、そのまま14日間培養して軟骨に分化させる。軟骨への分化の確認は各種細胞外マトリックスを抗体で染色することにより確認することができる。
心筋細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献(Keiichi Fukuda, Artificial Organs Vol.25 (2001) 187-193)に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、20%ウシ胎児血清含有のイスコフ改変DMEMに3μM 5-azacytidineを加えた分化誘導培地で24時間以上培養して心筋に分化させる。心筋への分化は、顕微鏡下で細胞の自発鼓動を観察することで確認することできる。
骨格筋細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献(Eun Ji Gang et al., StemCell 22 (2004) 617-624)に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、15%ウシ胎児血清含有DMEMに試薬(5% ウマ血清、0.1μM デキタメタゾン、50μM ヒドロコルチゾン)を加えた分化誘導培地で6週間培養することで骨格筋に分化させる。骨格筋への分化は、骨格筋細胞特有のMyoD1を蛍光染色することによって検出することができる。
脂肪細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献(Kentaro Nagane et al., TISSUE ENGINEERING: Part A Vol.16 (2010) 21-31)に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ラット間葉系幹細胞を、10%仔ウシ血清含有のα-MEMに試薬(450μM 3-isobutyl-1-methlxantine、50μg/mL インスリン、60μM インドメタシン、1μM デキタメタゾン、10μM trogitazone)を加えた分化誘導培地で6日間培養することで脂肪細胞へ分化させる。脂肪細胞への分化は、オイルレッドによる染色や、GPDH酵素の活性の測定により、検出することができる。
肝細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献(Agnieszka Banas et al., HEPATOLOGY July (2007) 219-228)に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、10%ウシ胎児血清含有DMEMに、試薬(300ng/mL FGF1、25ng/mL FGF4、150ng/mL HGF)を加えた分化誘導培地で3週間培地した後、さらに、分化誘導培地に試薬(30ng/mL オンコスタチンM、2x10-5M デキタメタゾン)を添加したもので2週間培養することで、肝実質細胞へ分化させる。肝実質細胞への分化は、細胞のアルブミン合成能やアンモニア代謝の測定により検出することができる。
神経細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献(Ju Ah Jeong et al., NEUROREPORT Vol.15 (2004) 1731-1734)に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、20%ウシ胎児血清含有DMEMに試薬(25mM 塩化カリウム、2% ジメチルスルホキシド(DMSO)、100μM Butylate hyderoxyamisole、5μg/mL インスリン、100μg/mL トランスフェリン、20mM プロジェステロン、100μM putrescine、30nM sodium selenite、20ng/ml bFGF、10mM forskolin)を加えた培地で24時間培養することにより、神経細胞へ分化させる。神経細胞への分化は、神経細胞に特有の遺伝群の発現を測定することで検出することができる。
また、本発明において「硫酸化多糖類」とは、その分子中に硫酸基をもつ多糖類を意味する。本発明における硫酸化多糖類は、細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌され、かつ、成長因子に結合しうるものである限り特に制限はない。好ましくは、対照値と比較して高い割合で、図6に示されるNSとdiS2の構造を含み、かつ、対照値と比較して低い割合で、図6に示されるdiS1の構造を含む硫酸化多糖類である。対照値としては、例えば、細胞の増殖および分化が進行していない細胞が分泌する硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値(例えば、骨細胞の増殖および分化を検出する場合には、骨細胞に分化しうる細胞を、分化誘導しない通常の培地で培養を行った場合の当該硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値)を用いることができる。
また、本発明において「成長因子」とは、動物体内において、特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性のタンパク質を意味する。本発明における硫酸化多糖類が結合する「成長因子」としては、例えば、BMP-2やbFGFが挙げられるが、これらに制限されない。
成長因子に結合する硫酸化多糖類は、例えば、成長因子あるいはそれらの断片を結合させた担体(例えば、ヘパリンセファロース)に、細胞の培養上清を接触させ、当該担体上の成長因子に結合する硫酸化多糖類を回収することにより調製することができる。
硫酸化多糖類の検出は、例えば、1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイより実施することができる。硫酸化多糖類の検出は、また、当該硫酸化多糖類に特異的に結合する分子(例えば、当該硫酸化多糖類に結合する抗体やその結合部位ペプチド、当該硫酸化多糖類に結合する成長因子やその結合部位ペプチド)を用いても行うことができる。
抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原(成長因子に結合する硫酸化多糖類)で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段(例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど)によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler & Milstein, Nature, 256:495(1975))や組換えDNA法(例えば、P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY、P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS、Vandamme A. M. et al., Eur. J. Biochem. 192:767-775 (1990))によって作製することができる。これらの抗体は、必要に応じて、標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン/アビジンなどが挙げられる。抗体を診断剤などの組成物として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当な担体(後述)を加えて調製することができる。
成長因子やその結合部位ペプチドは、これらをコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、形質転換体の抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは成長因子に結合する硫酸化多糖類や抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、これらの精製手段を複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。これら成長因子やその結合部位ペプチドは、上記の抗体の場合と同様に、必要に応じて、標識されていてもよい。
本発明は、このような硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする、細胞の増殖および分化を検出するための組成物をも提供する。
本発明の組成物を用いて硫酸化多糖類を検出した結果、対照値と比較して高い量の当該硫酸化多糖類が検出された場合には、細胞の増殖および分化の過程が進行していると評価することができる。対照値としては、例えば、細胞の増殖および分化が進行していない細胞における当該硫酸化多糖類の分泌量の値(例えば、骨細胞の増殖および分化を検出する場合には、骨細胞に分化しうる細胞を、分化誘導しない通常の培地で培養を行った場合の当該硫酸化多糖類の分泌量の値)を用いることができる。また、分泌される硫酸化多糖類において、対照値と比較して高い割合で、図6に示されるNSとdiS2の構造が検出された場合や、対照値と比較して低い割合で、図6に示されるdiS1の構造が検出された場合には、細胞の増殖および分化の過程が進行していると評価することができる。対照値としては、例えば、細胞の増殖および分化が進行していない細胞が分泌する硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値(例えば、骨細胞の増殖および分化を検出する場合には、骨細胞に分化しうる細胞を、分化誘導しない通常の培地で培養を行った場合の当該硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値)を用いることができる。このように本発明の組成物は、培養細胞を用いた実験において、細胞の増殖や分化の程度を評価したり、および動物実験において、細胞の増殖や分化の程度を評価するための実験用試薬となる。また、ヒトの人体において、例えば、再生治療に対して治療の正確な進行程度を診断する目的で、細胞の増殖や分化の程度を評価するための診断薬となる。
本発明は、また、成長因子に結合する硫酸化多糖類を有効成分とする、骨細胞の増殖および分化を促進するための組成物を提供する。本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品(動物用飼料を含む)、あるいは研究開発目的(例えば、In VitroやIn Vivoの実験、人工骨などの人工の組織や臓器の製造)に用いられる試薬の形態であり得る。
本発明の組成物は、成長因子の活性を安定化あるいは増強して、細胞の増殖および分化を促進する作用を有するため、細胞、組織または臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防や治療のために投与される医薬組成物として、あるいは、日常的に摂取される飲食品として好適に用いることができる。
本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。
本発明の組成物の製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖や分化の異常に起因する疾患の治療や予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品;スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品;飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品;ハム、ソーセージ等の畜産加工食品;かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品;漬物等の野菜加工食品;ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品;みそ、発酵飲料等の発酵食品;洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類;カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品;インスタントスープ,インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。
本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、細胞の増殖や分化の促進のために有効な1種もしくは2種以上の成分を添加してもよい。また、細胞の増殖や分化の促進以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類(医薬品、飲食品など)などに応じて、適宜選択される。例えば、1回当たりの本発明の組成物の投与量または摂取量は、一般に、0.01mg/kg体重〜100mg/kg体重である。本発明は、このように、本発明の組成物を対象に投与もしくは摂取させることを特徴とする、対象における細胞の増殖および分化を促進する方法をも提供するものである。また、本発明の組成物を対象に投与することを特徴とする、対象における、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防または治療の方法をも提供するものである。
本発明の組成物の製品(医薬品、飲食品、試薬)またはその説明書は、細胞の増殖および分化を促進するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。細胞の増殖および分化を促進するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物を投与もしくは摂取することにより細胞の増殖および分化が促進される機序についての情報を含むことができる。また、細胞の増殖および分化を促進するために用いられる旨の表示においては、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防または治療のために用いられること、に関する情報を含むことができる。
以下、実施例および比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例1] マウス由来骨前駆細胞の分化誘導培地での培養
マウス由来骨前駆細胞MC3T3-E1を、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた10cmディッシュ(Corning)3枚にそれぞれ3.0×105cellsとなるよう播種し、5%CO2インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク)10-8MおよびrhBMP-2 100ng/mLとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。3〜4日に一度培地交換を行い、5%CO2インキュベータ内で1週間、37℃で培養し、細胞および培養上清をサンプリングした。
[比較例1] マウス由来骨前駆細胞の通常の培地での培養
マウス由来骨前駆細胞MC3T3-E1を、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた10cmディッシュ(Corning)3枚にそれぞれに3.0×105cellsとなるよう播種し、5%CO2インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。同様の培地を用いて3〜4日に一度培地交換を行い、5%CO2インキュベータ内で1週間、37℃で培養し、細胞および培養上清をサンプリングした。
[評価方法]
(1)アルカリホスファターゼ(ALP)活性量の測定(骨細胞分化指標)
サンプリングした細胞を溶液(3M 塩化ナトリウム(和光純薬)、0.3M クエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/L ドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、アルカリホスファターゼ測定キット(ラボアッセイTMALP、和光純薬)を用いてALP活性量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で405nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのALP活性量を求めた(図1)。
(2)カルシウム沈着量の測定(骨細胞分化指標)
サンプリングした細胞を溶液(3M 塩化ナトリウム(和光純薬)、0.3M クエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/L ドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、等量の1M HCL水溶液(ナカライテスク)を加えて4℃で4時間以上静置した後、カルシウム測定キット(カルシウムC-テストワコー、和光純薬)を用いてカルシウム沈着量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で570nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのカルシウム沈着量を求めた(図2)。
(3)硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中の硫酸化多糖類量を求めた(図3)。
(4)bFGFに結合できる硫酸化多糖類量の測定
Heparin Sepharose(GEヘルスケア)をよく分散させてから5μLとり、50μLの10mM リン酸バッファーで2回洗浄後、10mM リン酸バッファーおよび100μg/mLの10mM リン酸バッファーにbFGFを溶解させた溶液をそれぞれ100μL加え10分間処理した。上澄みを除去し、10mM リン酸バッファー200μLで2回洗浄後、サンプリングした培養上清を加え、30分処理し、上澄みを回収した。回収した上澄み中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、10mM リン酸バッファーにコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により上澄みに残った硫酸化多糖類量を求め、培養上清中の硫酸化多糖類量から差し引いて培養上清1mL中のbFGFに結合できる硫酸化多糖類量を求めた(図4)。
(5)rhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量の測定
100μg/mLの10mM リン酸バッファーにbFGFを溶解させた溶液の代わりに100μg/mLの10mM リン酸バッファーにrhBMP-2を溶解させた溶液を用いたほかはbFGFに結合できる硫酸化多糖類量の測定と同様に実施した(図5)。
(6)硫酸化多糖類の構造確認
実施例1記載の培養上清100μL及びα-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地100μL、または比較例1記載の培養上清250μL及びα-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地250μLに、それぞれMilliQを加えて全量500μLとした。この溶液を、限外濾過膜Amicon Ultra(登録商標)10K 0.5mL(ミリポア)を用いて25℃、14000Gで30分間遠心分離に供した。回収した溶液に、再度MilliQ480μLを加えて25℃、14000Gで40分間遠心分離に供した。その後、回収した溶液25μLから10μLをとり、消化用バッファー[10mM 酢酸ナトリウム三水和物(ナカライテスク株式会社)、10mM 酢酸カルシウム一水和物(ナカライテスク株式会社)、pH=7.0]6μLと、0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLと、0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリチナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLとを加え、全量が30μLとなるよう、さらにMilliQを加えて、37℃で1時間インキュベートした。この溶液20μLと不飽和ヘパラン/へパリン-二糖キット(生化学工業株式会社)にある6種類の二糖の100μM混合水溶液20μLを糖鎖精製キットBlotGlyco(登録商標)(住友ベークライト株式会社)を用いて精製し糖鎖を回収した。回収した糖鎖水溶液5μLを、高速液体クロマトグラフ(LaChrom Elite、株式会社日立ハイテクノロジーズ)にて解析した。カラムは、順相クロマトグラフィーカラム(TSK-GEL Amide-80、東ソー株式会社)を用い、移動相には50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH4.4)とアセトニトリルを使用した。移動相においては、50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH4.4)が20%から41.7%に80分かけて変化するように勾配をつけ、糖鎖水溶液を流速0.4mL/分、カラム温度30℃で流し、蛍光(励起波長330nm、蛍光波長420nm)にて検出した。得られたHPLCチャートから、標準二糖のピークの溶出時間と一致するピークについて培養上清の面積から培地の面積を差し引いた。こうして算出した各ピーク面積を6つのピーク面積総和で割り100をかけてピーク面積(%)を算出して比較した。
[実施例1] マウス由来骨前駆細胞の分化誘導培地での培養
マウス由来骨前駆細胞MC3T3-E1を、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた10cmディッシュ(Corning)3枚にそれぞれ3.0×105cellsとなるよう播種し、5%CO2インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク)10-8MおよびrhBMP-2 100ng/mLとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。3〜4日に一度培地交換を行い、5%CO2インキュベータ内で1週間、37℃で培養し、細胞および培養上清をサンプリングした。
[比較例1] マウス由来骨前駆細胞の通常の培地での培養
マウス由来骨前駆細胞MC3T3-E1を、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた10cmディッシュ(Corning)3枚にそれぞれに3.0×105cellsとなるよう播種し、5%CO2インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。同様の培地を用いて3〜4日に一度培地交換を行い、5%CO2インキュベータ内で1週間、37℃で培養し、細胞および培養上清をサンプリングした。
[評価方法]
(1)アルカリホスファターゼ(ALP)活性量の測定(骨細胞分化指標)
サンプリングした細胞を溶液(3M 塩化ナトリウム(和光純薬)、0.3M クエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/L ドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、アルカリホスファターゼ測定キット(ラボアッセイTMALP、和光純薬)を用いてALP活性量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で405nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのALP活性量を求めた(図1)。
(2)カルシウム沈着量の測定(骨細胞分化指標)
サンプリングした細胞を溶液(3M 塩化ナトリウム(和光純薬)、0.3M クエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/L ドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、等量の1M HCL水溶液(ナカライテスク)を加えて4℃で4時間以上静置した後、カルシウム測定キット(カルシウムC-テストワコー、和光純薬)を用いてカルシウム沈着量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で570nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのカルシウム沈着量を求めた(図2)。
(3)硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中の硫酸化多糖類量を求めた(図3)。
(4)bFGFに結合できる硫酸化多糖類量の測定
Heparin Sepharose(GEヘルスケア)をよく分散させてから5μLとり、50μLの10mM リン酸バッファーで2回洗浄後、10mM リン酸バッファーおよび100μg/mLの10mM リン酸バッファーにbFGFを溶解させた溶液をそれぞれ100μL加え10分間処理した。上澄みを除去し、10mM リン酸バッファー200μLで2回洗浄後、サンプリングした培養上清を加え、30分処理し、上澄みを回収した。回収した上澄み中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、10mM リン酸バッファーにコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により上澄みに残った硫酸化多糖類量を求め、培養上清中の硫酸化多糖類量から差し引いて培養上清1mL中のbFGFに結合できる硫酸化多糖類量を求めた(図4)。
(5)rhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量の測定
100μg/mLの10mM リン酸バッファーにbFGFを溶解させた溶液の代わりに100μg/mLの10mM リン酸バッファーにrhBMP-2を溶解させた溶液を用いたほかはbFGFに結合できる硫酸化多糖類量の測定と同様に実施した(図5)。
(6)硫酸化多糖類の構造確認
実施例1記載の培養上清100μL及びα-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地100μL、または比較例1記載の培養上清250μL及びα-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地250μLに、それぞれMilliQを加えて全量500μLとした。この溶液を、限外濾過膜Amicon Ultra(登録商標)10K 0.5mL(ミリポア)を用いて25℃、14000Gで30分間遠心分離に供した。回収した溶液に、再度MilliQ480μLを加えて25℃、14000Gで40分間遠心分離に供した。その後、回収した溶液25μLから10μLをとり、消化用バッファー[10mM 酢酸ナトリウム三水和物(ナカライテスク株式会社)、10mM 酢酸カルシウム一水和物(ナカライテスク株式会社)、pH=7.0]6μLと、0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLと、0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリチナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLとを加え、全量が30μLとなるよう、さらにMilliQを加えて、37℃で1時間インキュベートした。この溶液20μLと不飽和ヘパラン/へパリン-二糖キット(生化学工業株式会社)にある6種類の二糖の100μM混合水溶液20μLを糖鎖精製キットBlotGlyco(登録商標)(住友ベークライト株式会社)を用いて精製し糖鎖を回収した。回収した糖鎖水溶液5μLを、高速液体クロマトグラフ(LaChrom Elite、株式会社日立ハイテクノロジーズ)にて解析した。カラムは、順相クロマトグラフィーカラム(TSK-GEL Amide-80、東ソー株式会社)を用い、移動相には50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH4.4)とアセトニトリルを使用した。移動相においては、50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH4.4)が20%から41.7%に80分かけて変化するように勾配をつけ、糖鎖水溶液を流速0.4mL/分、カラム温度30℃で流し、蛍光(励起波長330nm、蛍光波長420nm)にて検出した。得られたHPLCチャートから、標準二糖のピークの溶出時間と一致するピークについて培養上清の面積から培地の面積を差し引いた。こうして算出した各ピーク面積を6つのピーク面積総和で割り100をかけてピーク面積(%)を算出して比較した。
その結果、diS1は通常培地の方が、NSとdiS2は分化誘導培地の方に多く生成していた(図6)。
[実施例2]
ラット大腿骨および脛骨より採取した骨髄液を培養フラスコに播種し5%炭酸ガスインキュベーター内で2日間、37℃で培養後、培養液を交換して浮遊細胞を除去した。さらに1〜2日間、37で接着している細胞を培養後継代し、70〜90%コンフルエントになるまで37℃で培養して得た骨髄由来の間葉系幹細胞MSCを、DMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地に2.0×106cells/mLとなるよう懸濁させ、rhTGF-β3 10ng/mL、L-アスコルビン酸ホスフェート(SIGMA)20mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)100nM、 L-プロリン(ナカライテスク株式会社)40μg/mL、ピルビン酸ナトリウム塩(ナカライテスク株式会社)2mM、ITS+premix(BD biosciences)1vol%及びrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加し、15mL遠沈管(BD biosciences)10本に0.5mLずつ加えて軟骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベータ内で培養し、3〜4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、7日後、11日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[実施例3]
ラット大腿骨及び脛骨より採取した骨髄液を培養フラスコに播種し5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養後、培地交換して浮遊細胞を除去した。さらに1〜2日間、37℃で培養後継代し70〜90%コンフルエントになるまで37℃で培養して得た間葉系幹細胞MSCを、α-MEMに15%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)10-8Mとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3〜4日に一度培地交換を行い、10日後及び21日後に細胞を、3日後、7日後、10日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[実施例4]
骨分化を誘導するにあたり、培地にアスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)10-8M及びrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加した以外は実施例3と同様に行った。
[実施例5]
ヒト間葉系幹細胞hMSC(PT-2501、Lonza)を、間葉系幹細胞用無血清培地(STK2、株式会社ツーセル)を入れた6ウェルプレート(SUMILON)の3ウェルに5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で3日間、37℃で培養した。間葉系幹細胞骨分化用無血清培地(STK3、株式会社ツーセル)に切り替え、骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3〜4日に一度培地交換を行い、4日後、7日後、14日後及び21日後に細胞及び培養上清をサンプリングした。
[実施例6]
不死化されたヒト間葉系幹細胞hMSC(huBM01-E6E7-hTERT clone51、戸口田研究室よりもらったもの)を、DMEM(Low Glucose)に10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)10-8Mとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3~4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、8日後、11日後、14日後、17日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[比較例2]
実施例2と同様にして得られた骨髄由来の間葉系幹細胞MSCを、DMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地に2.0×106cells/mLとなるよう懸濁させ、15mL遠沈管(BD biosciences)10本に0.5mLずつ加えて、37℃、5%CO2インキュベータ内で培養した。3〜4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、7日後、11日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[比較例3]
実施例3と同様にして得た間葉系幹細胞MSCを、α-MEMに15%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mMとなるように培地に添加して引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養した。3〜4日に一度培地交換を行い、10日後及び21日後に細胞を、3日後、7日後、10日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[比較例4]
培地にrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加した以外は比較例3と同様に行った。
[比較例5]
ヒト間葉系幹細胞hMSC(PT-2501、Lonza)を、間葉系幹細胞用無血清培地(STK2、株式会社ツーセル)を入れた6ウェルプレート(SUMILON)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で3日間、37℃で培養した。同様の培地を用いて引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3~4日に一度培地交換を行い、4日後、7日後、14日後及び21日後に細胞及び培養上清をサンプリングした。
[比較例6]
不死化されたヒト間葉系幹細胞hMSC(huBM01-E6E7-hTERT clone51、戸口田研究室よりもらったもの)を、DMEM(Low Glucose)に10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mMとなるように培地に添加して引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養した。3~4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、8日後、11日後、14日後、17日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[評価方法]
(1)アルカリホスファターゼ(ALP)活性量の測定
サンプリングした細胞を溶液(3M塩化ナトリウム(和光純薬工業株式会社)、0.3Mクエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、アルカリホスファターゼ測定キット(ラボアッセイTMALP、和光純薬工業株式会社)を用いてALP活性量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で405nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのALP活性量を求めた(図7)。
(2)カルシウム沈着量の測定
サンプリングした細胞を溶液(3M塩化ナトリウム(和光純薬工業株式会社)、0.3Mクエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、等量の1MHCL水溶液(ナカライテスク)を加えて4℃で4時間以上静置した後、カルシウム測定キット(カルシウムE-HAテストワコー、和光純薬工業株式会社)を用いてカルシウム沈着量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で600nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのカルシウム沈着量を求めた(図8)。
(3)硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中の存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、各実施例及び比較例の培養に用いた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中に1日当たり分泌される硫酸化多糖類量を求めた(図9)。
(4)硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)産生量の測定
サンプリングした細胞を溶液(300μg/mLパパイン(和光純薬工業株式会社)、2mM DTT(ナカライテスク株式会社)、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク株式会社))に60℃、3時間処理して溶解させ、1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で測定し得られた525nmの吸光度から、細胞を溶解させた際に用いた上記溶液にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により算出した値を細胞数で割り、細胞あたりの硫酸化多糖類量を求めた(図10)。
(5)硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、DMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中に1日当たり分泌される硫酸化多糖類量を求めた(図11)。
(6)rhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量の測定
Heparin Sepharose(GEヘルスケア)をよく分散させてから5μLとり、50μLの10mMリン酸バッファーで2回洗浄後、10mMリン酸バッファー及び100μg/mL の10mMリン酸バッファーにrhBMP-2を溶解させた溶液をそれぞれ100μL加え10分間処理した。上澄みを除去し、10mMリン酸バッファー200μLで2回洗浄後、サンプリングした培養上清(実施例2の14日後及び21日後、比較例2の14日後)を加え、30分処理し、上澄みを回収した。回収した上澄み中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、10mMリン酸バッファーにコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により上澄みに残った硫酸化多糖類量を求め、培養上清中の硫酸化多糖類量から差し引いて培養上清1mL中のrhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量を求めた(図12)。
(7)硫酸化多糖類の構造確認
実施例2記載の培養上清(18日後)100μL及びDMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地100μLにそれぞれMilliQを加えて全量500μLとした溶液、または比較例2記載の培養上清(18日後)500μL及びDMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地500μLを限外濾過膜Amicon Ultra(登録商標) 10K 0.5mL(ミリポア)を用いて25℃、14000Gで30分間遠心分離をかけた。再度MilliQ 480μLを加えて25℃、14000Gで40分間遠心分離をかけた後、回収した溶液25μLから10μLをとり、消化用バッファー(10mM酢酸ナトリウム三水和物(ナカライテスク株式会社)、10mM酢酸カルシウム一水和物(ナカライテスク株式会社)、pH = 7.0)6μLと0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLと0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリチナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLを加え、全量が30μLとなるようMilliQを加えて、37℃で1時間インキュベートした。この溶液20μLと不飽和ヘパラン/へパリン-二糖キット(生化学工業株式会社)にある6種類の二糖の100μM混合水溶液20μLを糖鎖精製キットBlotGlyco(登録商標)(住友ベークライト株式会社)を用いて精製し糖鎖を回収した。回収した糖鎖水溶液5μLを、高速液体クロマトグラフ(LaChrom Elite、株式会社日立ハイテクノロジーズ)にて解析した。カラムは、順相クロマトグラフィーカラム(TSK-GEL Amide-80、東ソー株式会社)を用い、移動相には50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH 4.4)とアセトニトリルを使用した。移動相は、50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH 4.4)が20%から41.7%に80分かけて変化するように勾配をつけ、流速0.4 mL/min、カラム温度30℃で流し、蛍光(励起波長330nm、蛍光波長420nm)にて検出した。得られたHPLCチャートから、標準二糖のピークの溶出時間と一致するピークについて培養上清の面積から培地の面積を差し引き、各ピーク面積を6つのピーク面積総和で割り100をかけてピーク面積(%)を算出して比較した(図13)。
[実施例2]
ラット大腿骨および脛骨より採取した骨髄液を培養フラスコに播種し5%炭酸ガスインキュベーター内で2日間、37℃で培養後、培養液を交換して浮遊細胞を除去した。さらに1〜2日間、37で接着している細胞を培養後継代し、70〜90%コンフルエントになるまで37℃で培養して得た骨髄由来の間葉系幹細胞MSCを、DMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地に2.0×106cells/mLとなるよう懸濁させ、rhTGF-β3 10ng/mL、L-アスコルビン酸ホスフェート(SIGMA)20mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)100nM、 L-プロリン(ナカライテスク株式会社)40μg/mL、ピルビン酸ナトリウム塩(ナカライテスク株式会社)2mM、ITS+premix(BD biosciences)1vol%及びrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加し、15mL遠沈管(BD biosciences)10本に0.5mLずつ加えて軟骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベータ内で培養し、3〜4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、7日後、11日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[実施例3]
ラット大腿骨及び脛骨より採取した骨髄液を培養フラスコに播種し5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養後、培地交換して浮遊細胞を除去した。さらに1〜2日間、37℃で培養後継代し70〜90%コンフルエントになるまで37℃で培養して得た間葉系幹細胞MSCを、α-MEMに15%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)10-8Mとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3〜4日に一度培地交換を行い、10日後及び21日後に細胞を、3日後、7日後、10日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[実施例4]
骨分化を誘導するにあたり、培地にアスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)10-8M及びrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加した以外は実施例3と同様に行った。
[実施例5]
ヒト間葉系幹細胞hMSC(PT-2501、Lonza)を、間葉系幹細胞用無血清培地(STK2、株式会社ツーセル)を入れた6ウェルプレート(SUMILON)の3ウェルに5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で3日間、37℃で培養した。間葉系幹細胞骨分化用無血清培地(STK3、株式会社ツーセル)に切り替え、骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3〜4日に一度培地交換を行い、4日後、7日後、14日後及び21日後に細胞及び培養上清をサンプリングした。
[実施例6]
不死化されたヒト間葉系幹細胞hMSC(huBM01-E6E7-hTERT clone51、戸口田研究室よりもらったもの)を、DMEM(Low Glucose)に10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mM、デキサメタゾン(ナカライテスク株式会社)10-8Mとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3~4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、8日後、11日後、14日後、17日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[比較例2]
実施例2と同様にして得られた骨髄由来の間葉系幹細胞MSCを、DMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地に2.0×106cells/mLとなるよう懸濁させ、15mL遠沈管(BD biosciences)10本に0.5mLずつ加えて、37℃、5%CO2インキュベータ内で培養した。3〜4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、7日後、11日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[比較例3]
実施例3と同様にして得た間葉系幹細胞MSCを、α-MEMに15%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mMとなるように培地に添加して引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養した。3〜4日に一度培地交換を行い、10日後及び21日後に細胞を、3日後、7日後、10日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[比較例4]
培地にrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加した以外は比較例3と同様に行った。
[比較例5]
ヒト間葉系幹細胞hMSC(PT-2501、Lonza)を、間葉系幹細胞用無血清培地(STK2、株式会社ツーセル)を入れた6ウェルプレート(SUMILON)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で3日間、37℃で培養した。同様の培地を用いて引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3~4日に一度培地交換を行い、4日後、7日後、14日後及び21日後に細胞及び培養上清をサンプリングした。
[比較例6]
不死化されたヒト間葉系幹細胞hMSC(huBM01-E6E7-hTERT clone51、戸口田研究室よりもらったもの)を、DMEM(Low Glucose)に10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート(Corning)に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)50μg/mL、β-グリセロホスフェート(SIGMA)10mMとなるように培地に添加して引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養した。3~4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、8日後、11日後、14日後、17日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
[評価方法]
(1)アルカリホスファターゼ(ALP)活性量の測定
サンプリングした細胞を溶液(3M塩化ナトリウム(和光純薬工業株式会社)、0.3Mクエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、アルカリホスファターゼ測定キット(ラボアッセイTMALP、和光純薬工業株式会社)を用いてALP活性量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で405nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのALP活性量を求めた(図7)。
(2)カルシウム沈着量の測定
サンプリングした細胞を溶液(3M塩化ナトリウム(和光純薬工業株式会社)、0.3Mクエン酸三ナトリウム(ナカライテスク)、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク))に溶解させ、等量の1MHCL水溶液(ナカライテスク)を加えて4℃で4時間以上静置した後、カルシウム測定キット(カルシウムE-HAテストワコー、和光純薬工業株式会社)を用いてカルシウム沈着量を測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で600nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのカルシウム沈着量を求めた(図8)。
(3)硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中の存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、各実施例及び比較例の培養に用いた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中に1日当たり分泌される硫酸化多糖類量を求めた(図9)。
(4)硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)産生量の測定
サンプリングした細胞を溶液(300μg/mLパパイン(和光純薬工業株式会社)、2mM DTT(ナカライテスク株式会社)、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム(ナカライテスク株式会社))に60℃、3時間処理して溶解させ、1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で測定し得られた525nmの吸光度から、細胞を溶解させた際に用いた上記溶液にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により算出した値を細胞数で割り、細胞あたりの硫酸化多糖類量を求めた(図10)。
(5)硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、DMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中に1日当たり分泌される硫酸化多糖類量を求めた(図11)。
(6)rhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量の測定
Heparin Sepharose(GEヘルスケア)をよく分散させてから5μLとり、50μLの10mMリン酸バッファーで2回洗浄後、10mMリン酸バッファー及び100μg/mL の10mMリン酸バッファーにrhBMP-2を溶解させた溶液をそれぞれ100μL加え10分間処理した。上澄みを除去し、10mMリン酸バッファー200μLで2回洗浄後、サンプリングした培養上清(実施例2の14日後及び21日後、比較例2の14日後)を加え、30分処理し、上澄みを回収した。回収した上澄み中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー(「DMB」)アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー(VERSAmax、Molecular Devices)で525nmの吸光度を測定し得られた値から、10mMリン酸バッファーにコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により上澄みに残った硫酸化多糖類量を求め、培養上清中の硫酸化多糖類量から差し引いて培養上清1mL中のrhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量を求めた(図12)。
(7)硫酸化多糖類の構造確認
実施例2記載の培養上清(18日後)100μL及びDMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地100μLにそれぞれMilliQを加えて全量500μLとした溶液、または比較例2記載の培養上清(18日後)500μL及びDMEM(high glucose)に1%ウシ胎児血清を加えた培地500μLを限外濾過膜Amicon Ultra(登録商標) 10K 0.5mL(ミリポア)を用いて25℃、14000Gで30分間遠心分離をかけた。再度MilliQ 480μLを加えて25℃、14000Gで40分間遠心分離をかけた後、回収した溶液25μLから10μLをとり、消化用バッファー(10mM酢酸ナトリウム三水和物(ナカライテスク株式会社)、10mM酢酸カルシウム一水和物(ナカライテスク株式会社)、pH = 7.0)6μLと0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLと0.5U/mLになるよう0.1%BSA(Equitech-bio inc)水溶液にヘパリチナーゼ(生化学工業株式会社)を溶解させた溶液5μLを加え、全量が30μLとなるようMilliQを加えて、37℃で1時間インキュベートした。この溶液20μLと不飽和ヘパラン/へパリン-二糖キット(生化学工業株式会社)にある6種類の二糖の100μM混合水溶液20μLを糖鎖精製キットBlotGlyco(登録商標)(住友ベークライト株式会社)を用いて精製し糖鎖を回収した。回収した糖鎖水溶液5μLを、高速液体クロマトグラフ(LaChrom Elite、株式会社日立ハイテクノロジーズ)にて解析した。カラムは、順相クロマトグラフィーカラム(TSK-GEL Amide-80、東ソー株式会社)を用い、移動相には50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH 4.4)とアセトニトリルを使用した。移動相は、50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH 4.4)が20%から41.7%に80分かけて変化するように勾配をつけ、流速0.4 mL/min、カラム温度30℃で流し、蛍光(励起波長330nm、蛍光波長420nm)にて検出した。得られたHPLCチャートから、標準二糖のピークの溶出時間と一致するピークについて培養上清の面積から培地の面積を差し引き、各ピーク面積を6つのピーク面積総和で割り100をかけてピーク面積(%)を算出して比較した(図13)。
本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類を利用すれば、体内および体外において、骨細胞の分化の促進を行うことが可能である。従って、これら硫酸化多糖類を有効成分とする本発明の組成物は、細胞の増殖および分化の促進を行うための試薬としての利用の他、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防または治療のための医薬品や、細胞の増殖や分化における改善を図るための健康食品などの飲食品として、利用することができる。
また、本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類を標的として、体内や体外における細胞の増殖および分化の進行の程度の評価を行うことが可能である。当該硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする組成物は、細胞の増殖や分化を検出するための診断薬となる。再生医療のための治療を行った患者において、これら硫酸化多糖類を検出すれば、その治療の効果を評価することができるため、本発明は再生医療の分野においても利用することができる。
Claims (6)
- 細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される硫酸化多糖類であって、成長因子に結合する硫酸化多糖類。
- 細胞の増殖および分化の過程が、骨細胞または軟骨細胞の増殖および分化の過程である、請求項1に記載の硫酸化多糖類。
- 成長因子がBMP-2およびbFGFからなる群より選択される分子である、請求項1または2に記載の硫酸化多糖類。
- 請求項1から3のいずれかに記載の硫酸化多糖類を検出することを特徴とする、細胞の増殖および分化の評価方法。
- 請求項1から3のいずれかに記載の硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする、細胞の増殖および分化を検出するための組成物。
- 請求項1から3のいずれかに記載の硫酸化多糖類を有効成分とする、細胞の増殖および分化を促進するための組成物。
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