WO2012029863A1 - 成長因子に結合する硫酸化多糖類およびその利用 - Google Patents

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cells
sulfated polysaccharide
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田畑　泰彦
福西　賢晃
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住友ベークライト株式会社
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    • G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides
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    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
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Definitions

  • the present invention relates to a sulfated polysaccharide that is secreted from a cell in the process of cell proliferation and differentiation and binds to a growth factor, a method for evaluating cell proliferation and differentiation targeting the sulfated polysaccharide, the sulfate
  • the present invention relates to a composition for detecting the growth and differentiation of a cell containing a molecule that binds to a sulfated polysaccharide as an active ingredient, and a composition for promoting the growth and differentiation of a cell containing the sulfated polysaccharide as an active ingredient.
  • Stem cells for cell transplantation include embryonic stem cells, mesenchymal stem cells collected from bone marrow and adipose tissue, hematopoietic stem cells, and various tissue stem cells (hepatic stem cells, neural stem cells, etc.).
  • mesenchymal stem cells are relatively easy to obtain and culture. For this reason, in the field of cell transplantation, the research field of living tissue regeneration using mesenchymal stem cells is the most advanced.
  • target tissues for regenerative treatment using intercostal mesenchymal stem cells include bone, cartilage, fat, muscle, tendon, and nerve.
  • bone regeneration a method of transplanting and treating mesenchymal stem cells cultured and proliferated in vitro in a three-dimensional scaffold is used, and there are therapeutic applications (for example, Patent Document 1).
  • the natural healing power of the living body may not be sufficiently effective for large bone defects, etc., but for example, by increasing the natural healing power by administering a substance that promotes cell proliferation and differentiation
  • a substance that promotes cell proliferation and differentiation it is possible to realize regeneration and repair of living tissue without performing stem cell transplantation or gene administration.
  • a substance having such an action is a substance present in the body, it is considered possible to evaluate the state of cell proliferation and differentiation by targeting this substance.
  • This invention is made
  • the objective is to provide the biological body origin substance which can accelerate
  • a further object of the present invention is to provide a method for evaluating the proliferation and differentiation of cells targeting a substance derived from the living body, and a composition for detecting the proliferation and differentiation of cells containing as an active ingredient a molecule that binds to the substance derived from the living body. It is an object of the present invention to provide a composition for promoting the proliferation and differentiation of cells, and an active ingredient containing the substance derived from the living body.
  • the present inventors have found that a part of sulfated polysaccharide secreted from cells binds to a growth factor in the process of cell proliferation and differentiation, and It has been found that the amount of sulfated polysaccharides exhibiting such binding properties from cells is strongly correlated with the degree of cell proliferation and differentiation.
  • the present inventors have clarified the structural characteristics of sulfated polysaccharides secreted from cells.
  • the present inventors have found that by utilizing a sulfated polysaccharide that binds to a growth factor, it is possible to evaluate cell proliferation and differentiation and promote cell proliferation and differentiation. The invention has been completed.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a method for evaluating cell proliferation and differentiation comprising detecting the sulfated polysaccharide according to any one of (1) to (3).
  • a composition for detecting cell proliferation and differentiation comprising as an active ingredient a molecule that binds to the sulfated polysaccharide according to any one of (1) to (3).
  • composition for promoting cell proliferation and differentiation comprising the sulfated polysaccharide according to any one of (1) to (3) as an active ingredient.
  • the sulfated polysaccharide that binds to the growth factor found by the present invention can stabilize or enhance the activity of the growth factor. Therefore, if the sulfated polysaccharide is used, natural healing occurs in the body (In Vivo). It is possible to promote the proliferation and differentiation of cells using force, and to promote the proliferation and differentiation of cells outside the body (In Vitro). In addition, targeting the sulfated polysaccharide binding to the growth factor found by the present invention, evaluation of the degree of cell proliferation and differentiation in the body and evaluation of the degree of cell proliferation and differentiation in vitro. Can be performed.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Results of measurement of the amount of sulfated polysaccharide that can be bound to BMP-2 secreted from osteoprogenitor cells cultured in osteogenesis induction medium (Example) and osteoprogenitor cells cultured in normal medium (Comparative Example) are shown. It is a graph. It is a graph which shows the result of having analyzed the structure of the sulfated polysaccharide secreted from the osteoprogenitor cell cultured in the bone differentiation-inducing medium (Example) and the osteoprogenitor cell cultured in the normal medium (Comparative Example).
  • 6 is a graph showing the results of measuring the amount of alkaline phosphatase (ALP) activity of mesenchymal stem cells cultured in a bone differentiation-inducing medium (Example 3-6) and mesenchymal stem cells cultured in a normal medium (Comparative Example).
  • ALP alkaline phosphatase
  • 6 is a graph showing the results of measuring the amount of calcium deposition of mesenchymal stem cells cultured in a bone differentiation-inducing medium (Example 3-6) and mesenchymal stem cells cultured in a normal medium (Comparative Example).
  • the graph which shows the result of having measured the quantity of the sulfated polysaccharide secreted from the mesenchymal stem cell cultured in the bone differentiation-inducing medium (Example 3-6) and the mesenchymal stem cell cultured in the normal medium (Comparative Example). is there. It is a graph which shows the result of having measured the production amount of sulfated GAG in the cell extract in cartilage differentiation (Example 2). It is a graph which shows the result of having measured the quantity of the sulfated polysaccharide in the culture supernatant in cartilage differentiation (Example 2).
  • Example 6 is a graph showing the results of measuring the amount of sulfated polysaccharide that can bind to BMP-2 in the culture supernatant in cartilage differentiation (Example 2). It is a graph which shows the result of having analyzed the structure of the sulfated polysaccharide secreted from the mesenchymal stem cell cultured in the cartilage differentiation induction medium (Example 2) and the chondrocyte cultured in the normal medium (Comparative Example).
  • the present invention provides a sulfated polysaccharide that is secreted from a cell during the process of cell proliferation and differentiation and binds to a growth factor. Furthermore, the present invention provides a method for evaluating cell proliferation and differentiation, characterized by detecting the sulfated polysaccharide.
  • Examples of the “cell proliferation and differentiation process” in the present invention include proliferation and differentiation processes of bone cells, chondrocytes, muscle cells, adipocytes, hepatocytes, nerve cells, blood cells, etc. Not limited to.
  • the culture system for proliferation and differentiation of these cells it is possible to use a culture system for differentiating from various stem cells into cells of various tissues.
  • stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells collected from bone marrow and adipose tissue, hematopoietic stem cells, and various tissue stem cells (such as liver stem cells and neural stem cells).
  • Examples of organisms from which cells for proliferation and differentiation are derived include, for example, mice, rats, hamsters, humans, monkeys, pigs, cows, horses, sheep, goats, chickens, ducks, ostriches, ducks, dogs, cats. , Rabbits and the like, but are not limited thereto.
  • a method for growing and differentiating cells methods known to those skilled in the art can be used.
  • a normal medium such as ⁇ -MEM (alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium) or DMEM (Dulbecco Modified Eagle Minimum Essential) Incubate for 2 to 4 days in a medium supplemented with 10% to 15% fetal bovine serum in a minimum essential medium such as medium).
  • examples of cells that can differentiate into bone cells include, for example, osteoblasts, osteoprogenitor cells, mesenchymal cells (including mesenchymal stem cells), and cell lines thereof (for example, MC3T3-E1, C3H10T1 / 2) can be used.
  • the medium is changed to a differentiation-inducing medium, for example, a medium in which ⁇ -glycerophosphate, ascorbic acid (or ascorbic acid diphosphate, which is a derivative thereof), and dexatazone are added to the normal medium described above. Incubate for days.
  • a differentiation-inducing medium for example, conditions of culturing in a 5% CO 2 gas phase at 37 ° C.
  • the differentiation-inducing medium contains one or more known factors (eg, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-7, bFGF, TGF- ⁇ 1) that induce differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. Can also be added.
  • BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-7, bFGF, TGF- ⁇ 1 that induce differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. Can also be added.
  • Differentiation into rib cells can be detected by, for example, alkaline phosphatase activity. It is also possible to detect calcium deposition using an index. For these detections, commercially available kits such as alkaline phosphatase measurement kit (Lab Assay TMALP, Wako Pure Chemical) and calcium measurement kit (Calcium C-Test Wako, Wako Pure Chemical) can be used.
  • alkaline phosphatase measurement kit Lab Assay TMALP, Wako Pure Chemical
  • calcium measurement kit Calcium C-Test Wako, Wako Pure Chemical
  • cultured human mesenchymal stem cells are detached with trypsin, dispersed in a single cell in a centrifuge tube, and then dispersed in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with reagents (10 ⁇ g / mL / TGF- ⁇ 3, 100 nMndexamethasone, 50 ⁇ g / differentiation induction medium supplemented with mL (ascorbic acid, 100 ⁇ g / mL sodium pyruvate, 40 ⁇ g / mL proline, 6.25 ⁇ g / mL bovine insulin, 6.25 ⁇ g / mL transferrin, 5.33 ⁇ g / mL linoleic acid, 1.25 mg / mL bovine serum albumin) After being dispersed in a cell, a cell pellet is prepared by centrifugation, and cultured as it is for 14 days to differentiate into cartilage. Confirmation of cartilage differentiation can be confirmed by staining various extra
  • a method for proliferating and differentiating skeletal muscle cells for example, the method described in the literature (Eun Ji Gang et al., StemCell 22 (2004) 617-624) can be used.
  • human mesenchymal stem cells are cultured in skeletal muscle by culturing for 6 weeks in a differentiation-inducing medium containing 15% fetal bovine serum-containing DMEM and reagents (5% horse equine serum, 0.1 ⁇ M dexamethasone, 50 ⁇ M hydrocortisone). Differentiate. Differentiation into skeletal muscle can be detected by fluorescent staining of MyoD1 unique to skeletal muscle cells.
  • a method for proliferating and differentiating adipocytes for example, the method described in the literature (KentaroentNagane et al.,. TISSUE ENGINEERING: ERPart A Vol.16 (2010) 21-31) can be used.
  • rat mesenchymal stem cells are added to ⁇ -MEM containing 10% calf serum with reagents (450 ⁇ M ⁇ 3-isobutyl-1-methlxantine, 50 ⁇ g / mL insulin, 60 ⁇ M indomethacin, 1 ⁇ M dexamethasone, 10 ⁇ M trogitazone)
  • Differentiation into adipocytes by culturing in the differentiation induction medium for 6 days. Differentiation into adipocytes can be detected by staining with oil red or measuring the activity of GPDH enzyme.
  • hepatocytes As a method for proliferating and differentiating hepatocytes, for example, the method described in the literature (Agnieszka Banas et al., HEPATOLOGY July (2007) 219-228) can be used. In this method, human mesenchymal stem cells are cultured for 3 weeks in a differentiation-inducing medium in which reagents (300 ng / mL FGF1, 25 ng / mL FGF4, 150 ng / mL HGF) are added to DMEM containing 10% fetal bovine serum.
  • reagents 300 ng / mL FGF1, 25 ng / mL FGF4, 150 ng / mL HGF
  • hepatocytes Furthermore, it is differentiated into hepatocytes by culturing for 2 weeks in a differentiation induction medium supplemented with a reagent (30 ng / mL Oncostatin M, 2 ⁇ 10 ⁇ 5 M dexamethasone). Differentiation into hepatocytes can be detected by measuring the ability of the cells to synthesize albumin and ammonia metabolism.
  • the cells are differentiated into neurons by culturing for 24 hours in a medium supplemented with sterone, 100 ⁇ M putrescine, 30 nM sodium selenite, 20 ng / ml bFGF, 10 mM forskolin). Differentiation into nerve cells can be detected by measuring the expression of a genetic group unique to the nerve cells.
  • sulfated polysaccharide means a polysaccharide having a sulfate group in its molecule.
  • the sulfated polysaccharide in the present invention is not particularly limited as long as it is secreted from the cell in the process of cell proliferation and differentiation and can bind to a growth factor.
  • a sulfation containing the NS and diS2 structures shown in FIG. 6 at a high rate compared to the control value and a diS1 structure shown in FIG. 6 at a low rate compared to the control value. It is a polysaccharide.
  • Control values include, for example, the ratio of NS, diS2, and diS1 structures in sulfated polysaccharides secreted by cells that have not undergone cell proliferation and differentiation (for example, when detecting bone cell proliferation and differentiation)
  • NS, diS2, and diS1 structure ratio values in the sulfated polysaccharide when cells that can differentiate into bone cells are cultured in a normal medium that does not induce differentiation can be used.
  • growth factor means an endogenous protein that promotes proliferation and differentiation of specific cells in the animal body.
  • growth factor to which the sulfated polysaccharide is bound in the present invention include, but are not limited to, BMP-2 and bFGF.
  • the sulfated polysaccharide that binds to the growth factor binds to the growth factor on the carrier by contacting the cell culture supernatant with a carrier (eg, heparin sepharose) to which the growth factor or a fragment thereof is bound, for example. It can be prepared by recovering the sulfated polysaccharide.
  • a carrier eg, heparin sepharose
  • Detection of sulphated polysaccharides can be accomplished, for example, by a 1,9-dimethylmethylene blue (“DMB”) assay.
  • the detection of the sulfated polysaccharide can also be performed by detecting a molecule that specifically binds to the sulfated polysaccharide (for example, an antibody that binds to the sulfated polysaccharide, its binding site peptide, a growth factor that binds to the sulfated polysaccharide). Or its binding site peptide).
  • the antibody is a polyclonal antibody
  • an immunized animal is immunized with an antigen (a sulfated polysaccharide that binds to a growth factor), and the antiserum is used for conventional means (eg, salting out, centrifugation, dialysis, column chromatography). Etc.) can be purified and obtained.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by hybridoma methods (eg, Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975)) or recombinant DNA methods (eg P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY, P. Shepherd). and C.
  • a radioactive substance for example, a fluorescent dye, a chemiluminescent substance, an enzyme, and a coenzyme can be used.
  • a radioactive substance for example, a radioactive substance, a fluorescent dye, a chemiluminescent substance, an enzyme, and a coenzyme can be used.
  • radioisotope fluorescein, rhodamine, dansyl chloride, luciferase, peroxidase, alkaline phosphatase, Examples include lysozyme and biotin / avidin.
  • an antibody as a composition such as a diagnostic agent, it can be obtained in an arbitrary dosage form by employing any appropriate means.
  • the antibody titer of a purified antibody can be measured and prepared by adding an appropriate carrier (described later).
  • Growth factors and their binding site peptides can be obtained by incorporating the DNA encoding them into an appropriate expression vector and introducing it into an appropriate host cell, and recovering the transformant. Then, it is subjected to chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which a sulfated polysaccharide or antibody that binds to a growth factor is immobilized on the column, or a combination of these purification means. Can be purified and prepared. These growth factors and their binding site peptides may be labeled as necessary, as in the case of the above-described antibody.
  • the present invention also provides a composition for detecting cell proliferation and differentiation, which comprises a molecule that binds to such a sulfated polysaccharide as an active ingredient.
  • the process of cell proliferation and differentiation proceeds.
  • a control value for example, the value of the secreted amount of the sulfated polysaccharide in a cell in which cell proliferation and differentiation are not progressing (for example, in the case of detecting the proliferation and differentiation of bone cells, it differentiates into bone cells.
  • the value of the secreted amount of the sulfated polysaccharide when the cells are cultured in a normal medium that does not induce differentiation can be used.
  • Control values include, for example, the ratio of NS, diS2, and diS1 structures in sulfated polysaccharides secreted by cells that have not undergone cell proliferation and differentiation (for example, when detecting bone cell proliferation and differentiation)
  • NS, diS2, and diS1 structure ratio values in the sulfated polysaccharide when cells that can differentiate into bone cells are cultured in a normal medium that does not induce differentiation can be used.
  • the composition of the present invention is an experimental reagent for evaluating the degree of cell proliferation and differentiation in experiments using cultured cells, and for evaluating the degree of cell proliferation and differentiation in animal experiments. It becomes. Further, in the human body, for example, for the purpose of diagnosing the precise progress of the treatment with respect to regenerative treatment, it becomes a diagnostic agent for evaluating the degree of cell proliferation and differentiation.
  • the present invention also provides a composition for promoting bone cell proliferation and differentiation, comprising a sulfated polysaccharide that binds to a growth factor as an active ingredient.
  • the composition of the present invention is used for pharmaceutical compositions, foods and drinks (including animal feed), or research and development purposes (for example, experiments in In Vitro and In Vivo, production of artificial tissues and organs such as artificial bones). Can be in the form of a reagent.
  • composition of the present invention stabilizes or enhances the activity of growth factors and promotes cell proliferation and differentiation, resulting in damage to cells, tissues or organs, and abnormal cell proliferation and differentiation. It can be suitably used as a pharmaceutical composition to be administered for the prevention or treatment of diseases or as a food or drink that is taken daily.
  • composition in the present invention can be formulated by a known pharmaceutical method.
  • a known pharmaceutical method for example, capsule, tablet, pill, liquid, powder, granule, fine granule, film coating, pellet, troche, sublingual, chewing agent, buccal, paste, syrup, suspension, To be used orally or parenterally as elixirs, emulsions, coatings, ointments, plasters, cataplasms, transdermal preparations, lotions, inhalants, aerosols, injections, suppositories, etc. Can do.
  • a pharmacologically or pharmaceutically acceptable carrier specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, solvent, base, emulsifier, suspension, surface activity Agent, stabilizer, flavoring agent, fragrance, excipient, vehicle, preservative, binder, diluent, tonicity agent, soothing agent, extender, disintegrant, buffering agent, coating agent, lubricant , Colorants, sweeteners, thickeners, flavoring agents, solubilizers, other additives, and the like.
  • composition of the present invention When used as a pharmaceutical composition, it is used in combination with a known pharmaceutical composition used for the treatment or prevention of diseases caused by cell, tissue, organ damage or abnormal proliferation or differentiation of cells. May be.
  • the food or drink is, for example, a health food, a functional food, a food for specified health use, a dietary supplement, a food for a sick person, a food additive, or an animal feed.
  • the food / beverage products of this invention can be ingested as a composition as described above, and can also be ingested as various food / beverage products.
  • Specific examples of food and drink products include edible oils, dressings, mayonnaise, margarine and other oils; soups, milk drinks, soft drinks, tea drinks, alcoholic drinks, drinks, jelly drinks, functional drinks, etc.
  • Liquid foods Carbohydrate-containing foods such as rice, noodles, breads; Livestock processed foods such as ham and sausages; Fish processed foods such as kamaboko, dried fish, and salted vegetables; Vegetable processed foods such as pickles; Semis such as jelly and yogurt Solid foods; Fermented foods such as miso and fermented beverages; Various confectionery such as Western confectionery, Japanese confectionery, candy, gums, gummi, frozen confectionery, ice confectionery; Retort products such as curry, sauce, Chinese soup; Instant soup Examples include instant foods such as instant miso soup and foods for microwave ovens. Furthermore, health foods and drinks prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules, liquid, paste or jelly are also included.
  • composition of the present invention can be used for animals including humans, but is not particularly limited as animals other than humans, and may be used for various domestic animals, poultry, pets, laboratory animals, and the like. it can. Specific examples include but are not limited to pigs, cows, horses, sheep, goats, chickens, ducks, ostriches, ducks, dogs, cats, rabbits, hamsters, mice, rats, monkeys, and the like.
  • Manufacturing of food and drink in the present invention can be carried out by manufacturing techniques known in the art.
  • the dose or intake is appropriately selected according to the age, weight, symptom, health condition of the subject, type of composition (pharmaceutical, food and drink, etc.), etc.
  • the for example, the dose or intake of the composition of the present invention per dose is generally 0.01 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight.
  • the present invention also provides a method for promoting cell proliferation and differentiation in a subject, characterized by administering or ingesting the composition of the present invention to the subject. Also provided is a method for preventing or treating a disease caused by cell, tissue or organ damage or abnormal cell proliferation and differentiation in a subject, characterized by administering the composition of the present invention to the subject. To do.
  • the product (pharmaceutical product, food and drink, reagent) of the composition of the present invention or instructions thereof may be labeled with an indication that it is used to promote cell growth and differentiation.
  • labeled product or instructions means that the product body, container, packaging, etc. are marked, or instructions, package inserts, promotional materials, or other printed materials that disclose product information. It means that the display is attached to.
  • Indications used to promote cell growth and differentiation can include information about the mechanism by which cell growth and differentiation is promoted by administering or ingesting the composition of the present invention.
  • it should be used for the prevention or treatment of diseases caused by damage to cells, tissues, organs, and abnormal cell proliferation and differentiation. Can include information about.
  • Example 1 Cultivation of mouse-derived osteoprogenitor cells in differentiation-inducing medium
  • Bone differentiation induction was started by adding to the medium so that ascorbic acid (Nacalai Tesque) 50 ⁇ g / mL, ⁇ -glycerophosphate (SIGMA) 10 mM, dexamethasone (Nacalai Tesque) 10 ⁇ 8 M and rhBMP-2 100 ng / mL.
  • the medium was changed once every 3 to 4 days and cultured in a 5% CO 2 incubator for 1 week at 37 ° C., and the cells and culture supernatant were sampled.
  • [Comparative Example 1] Cultivation of mouse-derived osteoprogenitor cells in normal medium Three 10-cm dish (Corning) containing mouse-derived osteoprogenitor cells MC3T3-E1 and 10% fetal bovine serum in ⁇ -MEM Each was seeded at 3.0 ⁇ 10 5 cells and cultured at 37 ° C. for 2 days in a 5% CO 2 incubator. The medium was changed once every 3 to 4 days using the same medium, cultured in a 5% CO 2 incubator for 1 week at 37 ° C., and the cells and culture supernatant were sampled.
  • the value obtained by measuring absorbance at 570 nm with a microplate reader was divided by the number of cells to determine the amount of calcium deposition per cell (FIG. 2).
  • (3) Measurement of the amount of sulfated polysaccharide The amount of sulfated polysaccharide present in the sampled culture supernatant was measured using a 1,9-dimethylmethylene blue (“DMB”) assay.
  • DMB 1,9-dimethylmethylene blue
  • the value obtained by measuring absorbance at 525 nm with a microplate reader was obtained using a solution of chondroitin sulfate A sodium salt dissolved in a medium containing 10% fetal bovine serum in ⁇ -MEM.
  • the amount of sulfated polysaccharide in 1 mL of the culture supernatant was determined using a calibration curve (FIG. 3).
  • the supernatant was removed, and after washing twice with 200 ⁇ L of 10 mM phosphate buffer, the sampled culture supernatant was added, treated for 30 minutes, and the supernatant was recovered.
  • the amount of sulfated polysaccharide present in the collected supernatant was measured using a 1,9-dimethylmethylene blue (“DMB”) assay. From the value obtained by measuring absorbance at 525 nm with a microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices), sulfuric acid remaining in the supernatant was obtained from a calibration curve obtained using a solution of chondroitin sulfate A sodium salt dissolved in 10 mM phosphate buffer.
  • DMB 1,9-dimethylmethylene blue
  • the amount of sulfated polysaccharide was determined and subtracted from the amount of sulfated polysaccharide in the culture supernatant to determine the amount of sulfated polysaccharide that can bind to bFGF in 1 mL of the culture supernatant (FIG. 4).
  • (5) Measurement of the amount of sulfated polysaccharide that can bind to rhBMP-2 rhBMP-2 was dissolved in 100 ⁇ g / mL of 10 mM phosphate buffer instead of the solution of bFGF in 100 ⁇ g / mL of 10 mM phosphate buffer.
  • the column used was a normal phase chromatography column (TSK-GEL Amide-80, Tosoh Corporation), and 50 mM ammonium formate aqueous solution (pH 4.4) and acetonitrile were used for the mobile phase.
  • TSK-GEL Amide-80 50 mM ammonium formate aqueous solution
  • acetonitrile 50 mM ammonium formate aqueous solution
  • Detection was performed by fluorescence (excitation wavelength: 330 nm, fluorescence wavelength: 420 nm).
  • the area of the medium was subtracted from the area of the culture supernatant for the peak corresponding to the elution time of the peak of the standard disaccharide.
  • Each peak area thus calculated was divided by the sum of the six peak areas and multiplied by 100 to calculate the peak area (%) for comparison.
  • Example 2 Bone marrow fluid collected from rat femur and tibia was seeded in a culture flask and cultured in a 5% carbon dioxide incubator for 2 days at 37 ° C., and then the culture fluid was changed to remove floating cells. Furthermore, bone marrow-derived mesenchymal stem cells MSCs obtained by culturing cells adhered at 37 for 1 to 2 days after culturing and culturing at 37 ° C.
  • DMEM high glucose
  • rhTGF- ⁇ 3 10 ng / mL
  • L-ascorbic acid phosphate (SIGMA) 20 mM
  • Dexamethasone Nacalai Tesque, Inc.
  • L-proline Nacalai Tesque
  • pyruvate sodium salt Nacalai Tesque
  • ITS + premix BD biosciences
  • rhBMP-2 100ng / mL
  • Example 3 Bone marrow fluid collected from rat femur and tibia was seeded in a culture flask, cultured in a 5% CO 2 incubation for 2 days at 37 ° C., and then the medium was changed to remove floating cells.
  • MSCs mesenchymal stem cells obtained by culturing at 37 ° C until they become 70-90% confluent after culturing at 37 ° C for 1-2 days, and then add a medium containing 15% fetal calf serum to ⁇ -MEM.
  • the 6-well plate (Corning) was seeded at 5.0 ⁇ 10 4 cells / well and cultured at 37 ° C. for 2 days in a 5% CO 2 incubation.
  • Bone differentiation induction was started by adding to the medium so that ascorbic acid (Nacalai Tesque) 50 ⁇ g / mL, ⁇ -glycerophosphate (SIGMA) 10 mM, and dexamethasone (Nacalai Tesque) 10 ⁇ 8 M were added.
  • Ascorbic acid Nacalai Tesque
  • SIGMA ⁇ -glycerophosphate
  • dexamethasone Nacalai Tesque
  • Example 4 In inducing bone differentiation, the medium is ascorbic acid (Nacalai Tesque) 50 ⁇ g / mL, ⁇ -glycerophosphate (SIGMA) 10 mM, dexamethasone (Nacalai Tesque) 10 -8 M and rhBMP-2 100 ng / mL
  • SIGMA ⁇ -glycerophosphate
  • dexamethasone Nacalai Tesque
  • rhBMP-2 100 ng / mL
  • Example 5 Human mesenchymal stem cells hMSC (PT-2501, Lonza) 5.0 x 10 4 cells / well in 3 wells of a 6-well plate (SUMILON) containing serum-free medium for mesenchymal stem cells (STK2, Two-cell Co., Ltd.) And cultured at 37 ° C. for 3 days in a 5% CO 2 incubation. Switching to a serum-free medium for mesenchymal stem cell bone differentiation (STK3, Two-cell Co., Ltd.), bone differentiation induction was started. The cells were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubation, and the medium was changed once every 3 to 4 days.
  • SUMILON serum-free medium for mesenchymal stem cells
  • Example 6 Immortalized human mesenchymal stem cell hMSC (huBM01-E6E7-hTERT clone51, obtained from Toguchida Laboratory), DMEM (Low Glucose) containing a medium containing 10% fetal bovine serum (6 well plate) Corning) was seeded at 5.0 ⁇ 10 4 cells / well and cultured at 37 ° C. for 2 days in a 5% CO 2 incubation.
  • DMEM Low Glucose
  • Bone differentiation induction was started by adding to the medium so that ascorbic acid (Nacalai Tesque) 50 ⁇ g / mL, ⁇ -glycerophosphate (SIGMA) 10 mM, and dexamethasone (Nacalai Tesque) 10 ⁇ 8 M were added.
  • Ascorbic acid Nacalai Tesque
  • SIGMA ⁇ -glycerophosphate
  • dexamethasone Nacalai Tesque
  • Example 2 Bone marrow-derived mesenchymal stem cells MSC obtained in the same manner as in Example 2 were suspended in a medium in which 1% fetal bovine serum was added to DMEM (high glucose) to 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL, 0.5 mL each was added to 10 15 mL centrifuge tubes (BD biosciences), and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. The medium was changed once every 3 to 4 days, and the culture supernatant was sampled after 14 days and 21 days, and after 4 days, 7 days, 11 days, 14 days, 18 days and 21 days.
  • DMEM high glucose
  • Example 3 Mesenchymal stem cell MSCs obtained in the same manner as in Example 3 were seeded at 5.0 ⁇ 10 4 cells / well in a 6-well plate (Corning) containing 15% fetal bovine serum in ⁇ -MEM. And cultured at 37 ° C. for 2 days in a 5% CO 2 incubation. Ascorbic acid (Nacalai Tesque) 50 ⁇ g / mL and ⁇ -glycerophosphate (SIGMA) 10 mM were added to the medium, followed by incubation in a 37 ° C., 5% CO 2 incubation.
  • Ascorbic acid Nacalai Tesque
  • SIGMA ⁇ -glycerophosphate
  • Ascorbic acid (Nacalai Tesque) 50 ⁇ g / mL and ⁇ -glycerophosphate (SIGMA) 10 mM were added to the medium, followed by incubation in a 37 ° C., 5% CO 2 incubation.
  • the medium was changed once every 3 to 4 days, and the culture supernatant was sampled after 14 days and 21 days, and after 4 days, 8 days, 11 days, 14 days, 17 days and 21 days.
  • the absorbance obtained at 600 nm was measured with a microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices), and the value obtained was divided by the number of cells to determine the amount of calcium deposition per cell (FIG. 8).
  • (3) Measurement of the amount of sulfated polysaccharide The amount of sulfated polysaccharide present in the sampled culture supernatant was measured using a 1,9-dimethylmethylene blue (“DMB”) assay.
  • DMB 1,9-dimethylmethylene blue
  • the amount of sulfated polysaccharide present in the collected supernatant was measured using a 1,9-dimethylmethylene blue (“DMB”) assay. From the value obtained by measuring the absorbance at 525 nm with a microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices), sulfuric acid remaining in the supernatant by a calibration curve obtained using a solution of chondroitin sulfate A sodium salt dissolved in 10 mM phosphate buffer The amount of sulfated polysaccharide was determined and subtracted from the amount of sulfated polysaccharide in the culture supernatant to determine the amount of sulfated polysaccharide that can bind to rhBMP-2 in 1 mL of the culture supernatant (FIG.
  • DMB 1,9-dimethylmethylene blue
  • the column used was a normal phase chromatography column (TSK-GEL Amide-80, Tosoh Corporation), and 50 mM ammonium formate aqueous solution (pH 4.4) and acetonitrile were used for the mobile phase.
  • the mobile phase was gradient so that 50 mM aqueous ammonium formate solution (pH 4.4) changed from 20% to 41.7% over 80 minutes, and flowed at a flow rate of 0.4 mL / min and a column temperature of 30 ° C., and fluorescence (excitation wavelength: 330 nm, Detection was performed at a fluorescence wavelength of 420 nm.
  • the composition of the present invention containing these sulfated polysaccharides as an active ingredient is used as a reagent for promoting cell growth and differentiation, as well as damage to cells, tissues, organs, cell growth and It can be used as a pharmaceutical for the prevention or treatment of diseases caused by abnormal differentiation, or as a food or drink such as a health food for improving cell proliferation or differentiation.
  • a composition containing a molecule that binds to the sulfated polysaccharide as an active ingredient serves as a diagnostic agent for detecting cell proliferation and differentiation. If these sulfated polysaccharides are detected in a patient who has undergone treatment for regenerative medicine, the effect of the treatment can be evaluated, and the present invention can also be used in the field of regenerative medicine.

Abstract

本発明により、細胞の増殖および分化を促進しうる生体由来の物質、並びに、当該生体由来の物質を標的とした細胞の増殖および分化の評価方法、当該生体由来の物質に結合する分子を有効成分とする細胞の増殖および分化を検出するための組成物、および当該生体由来の物質を有効成分とする細胞の増殖および分化を促進するための組成物が提供される。本発明では、細胞の増殖および分化の過程において、細胞から分泌される硫酸化多糖類の一部が、成長因子に結合すること、および、このような結合性を示す硫酸化多糖類の細胞からの分泌量が、細胞の増殖および分化の進行と強い相関を示すこと、当該硫酸化多糖類を利用することにより、細胞の増殖および分化の評価や、細胞の増殖および分化の促進を行うことが可能であることを見出した。

Description

成長因子に結合する硫酸化多糖類およびその利用
  本発明は、細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される、成長因子に結合する硫酸化多糖類、並びに、該硫酸化多糖類を標的とした細胞の増殖および分化の評価方法、該硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする細胞の増殖および分化を検出するための組成物、および該硫酸化多糖類を有効成分とする細胞の増殖および分化を促進するための組成物に関する。
　本願は、２０１０年９月２日に日本に出願された特願２０１０－１９６５８３号、及び２０１１年３月２９日に日本に出願された特願２０１１－０７１６６１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
  再生医療において、研究開発され一部実用化されている治療方法として、幹細胞移植が一般的に実施されている。細胞移植のための幹細胞としては、胚性幹細胞、骨髄や脂肪組織などから採取される間葉系幹細胞、造血幹細胞および各種組織幹細胞（肝幹細胞、神経幹細胞など）が用いられているが、これらのうち間葉系幹細胞は入手と培養が比較的容易である。このため、細胞移植においては、間葉系幹細胞を用いた生体組織再生の研究分野が最も進んでいる。
  間葉系幹細胞を用いた再生治療の対象組織は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、腱、神経などが挙げられる。例えば、骨再生では、体外で培養し増殖させた間葉系幹細胞を、三次元スキャホールドに播種、増殖させた後、移植、治療する方法が用いられ、その治療応用例が存在する（例えば、特許文献１）。
  通常、間葉系幹細胞を体外で培養するためには多種類の増殖因子を培養液中に加え続けなければならない。このためのアプローチとして、細胞に増殖因子の遺伝子を導入し、細胞に増殖因子を合成させ、オートクライン的に増殖因子を供給し続ける方法や、転写因子の遺伝子を組み込んだウイルスベクターを用いて、転写因子活性を持続的に発現させることにより、良好な骨・軟骨再生を可能とする方法などが開発されている（例えば、特許文献２）。
  しかしながら、本来、生体は自然治癒力を有しており、実際、単純な骨折などはその自然治癒力を使って治療されている。一方、大きな骨欠損などには生体が本来もつ自然治癒力は十分な効力を発揮できていない場合もあるが、例えば、細胞の増殖や分化を促進する物質を投与して自然治癒力を高めることにより、幹細胞移植や遺伝子投与を行うことなく、生体組織の再生修復を実現することも可能である。また、このような作用を有する物質が体内に存在する物質である場合には、この物質を標的として、細胞の増殖や分化の状況を評価することも可能であると考えられる。
  このような観点から、細胞の増殖や分化を促進し、生体が本来持つ自然治癒力を高めることが可能な、体内に存在する物質の同定が望まれている。
特開2008-29317号公報 国際公開2005/035014号公報
  本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞の増殖および分化を促進しうる生体由来の物質を提供することにある。さらなる本発明の目的は、当該生体由来の物質を標的とした細胞の増殖および分化の評価方法、当該生体由来の物質に結合する分子を有効成分とする細胞の増殖および分化を検出するための組成物、および当該生体由来の物質を有効成分とする細胞の増殖および分化を促進するための組成物を提供することにある。
  本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞の増殖および分化の過程において、細胞から分泌される硫酸化多糖類の一部が成長因子に結合すること、および、このような結合性を示す硫酸化多糖類の細胞からの分泌量が、細胞の増殖および分化の進行の程度と強い相関を示すことを見出した。また、本発明者らは、細胞から分泌される硫酸化多糖類の構造的特徴を明らかにした。さらに、本発明者らは、成長因子に結合する硫酸化多糖類を利用することにより、細胞の増殖や分化の評価や細胞の増殖や分化の促進を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
  本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
  （１）細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される硫酸化多糖類であって、成長因子に結合する硫酸化多糖類。
  （２）細胞の増殖および分化の過程が、骨細胞または軟骨細胞の増殖および分化の過程である、（１）に記載の硫酸化多糖類。
  （３）成長因子がBMP-2およびbFGFからなる群より選択される分子である、（１）または（２）に記載の硫酸化多糖類。
  （４）（１）から（３）のいずれかに記載の硫酸化多糖類を検出することを特徴とする、細胞の増殖および分化の評価方法。
  （５）（１）から（３）のいずれかに記載の硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする、細胞の増殖および分化を検出するための組成物。
  （６）（１）から（３）のいずれかに記載の硫酸化多糖類を有効成分とする、細胞の増殖および分化を促進するための組成物。
  本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類は、成長因子の活性を安定化あるいは増強しうるため、当該硫酸化多糖類を利用すれば、体内（In Vivo）において、自然治癒力を利用した細胞の増殖および分化の促進を行うことや、体外（In Vitro）における、細胞の増殖および分化の促進を行うことが可能となる。また、本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類を標的として、体内における細胞の増殖および分化の進行の程度の評価や、体外における細胞の増殖および分化の進行の程度の評価を行うことが可能となる。
骨分化誘導培地で培養した骨前駆細胞（実施例）および通常培地で培養した骨前駆細胞（比較例）のアルカリホスファターゼ（ALP）活性量を測定した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した骨前駆細胞（実施例）および通常培地で培養した骨前駆細胞（比較例）のカルシウム沈着量を測定した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した骨前駆細胞（実施例）および通常培地で培養した骨前駆細胞（比較例）から分泌された硫酸化多糖類の量を測定した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した骨前駆細胞（実施例）および通常培地で培養した骨前駆細胞（比較例）から分泌された、bFGFに結合できる硫酸化多糖類の量を測定した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した骨前駆細胞（実施例）および通常培地で培養した骨前駆細胞（比較例）から分泌された、BMP-2に結合できる硫酸化多糖類の量を測定した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した骨前駆細胞（実施例）および通常培地で培養した骨前駆細胞（比較例）から分泌された硫酸化多糖類の構造を解析した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した間葉系幹細胞（実施例３－６）および通常培地で培養した間葉系幹細胞（比較例）のアルカリホスファターゼ（ALP）活性量を測定した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した間葉系幹細胞（実施例３－６）および通常培地で培養した間葉系幹細胞（比較例）のカルシウム沈着量を測定した結果を示すグラフである。 骨分化誘導培地で培養した間葉系幹細胞（実施例３－６）および通常培地で培養した間葉系幹細胞（比較例）から分泌された硫酸化多糖類の量を測定した結果を示すグラフである。 軟骨分化（実施例２）における細胞抽出液中の硫酸化GAGの産生量を測定した結果を示すグラフである。 軟骨分化（実施例２）における培養上清中の硫酸化多糖類の量を測定した結果を示すグラフである。 軟骨分化（実施例２）における培養上清中のBMP－２に結合できる硫酸化多糖類の量を測定した結果を示すグラフである。 軟骨分化誘導培地で培養した間葉系幹細胞（実施例２）および通常培地で培養した軟骨細胞（比較例）から分泌された硫酸化多糖類の構造を解析した結果を示すグラフである。
  本発明は、細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される硫酸化多糖類であって、成長因子に結合する硫酸化多糖類を提供する。さらに、本発明は、当該硫酸化多糖類を検出することを特徴とする、細胞の増殖および分化の評価方法を提供する。
  本発明における「細胞の増殖および分化の過程」としては、例えば、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞、血液細胞などの増殖および分化の過程が挙げられるが、これらに制限されない。これら細胞の増殖や分化のための培養系においては、各種幹細胞から各種組織の細胞へ分化させる培養系を用いることが可能である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞、骨髄や脂肪組織などから採取される間葉系幹細胞、造血幹細胞、各種組織幹細胞（肝幹細胞、神経幹細胞など）が挙げられるが、これらに制限されない。また、増殖および分化をさせるための細胞の由来する生物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギなどが挙げられるが、これらに制限されない。
  細胞を増殖および分化させる方法としては、当業者に公知の方法を用いることができる。例えば、骨細胞を増殖および分化させる方法においては、骨細胞に分化しうる細胞を播種後、通常の培地、例えば、α-MEM（alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium）またはDMEM(ダルベッコ変法イーグル最小必須培地)などの最小必須培地に10％～15%のウシ胎児血清を加えた培地で、2～4日間培養する。ここで、骨細胞に分化しうる細胞としては、例えば、骨芽細胞、骨前駆細胞、間葉系細胞（間葉系幹細胞を含む）、およびそれらの細胞株（例えば、MC3T3-E1、C3H10T1/2）を用いることができる。その後、培地を、分化誘導培地、例えば、上記通常の培地に、β-グリセロリン酸、アスコルビン酸（あるいはその誘導体であるアスコルビン酸2リン酸）、およびデキサタゾンを加えた培地に変更し、21～28日間培養する。分化誘導培地での培養においては、例えば、3～4日ごとに培地交換を行いながら、37℃で5%CO2気相下にて培養する条件を適用することができる。分化誘導培地には、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する既知の因子（例えば、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-7、bFGF、TGF-β1など）の１以上をさらに添加することもできる。
  骨細胞への分化は、例えば、アルカリフォスファターゼ活性により検出することができる。また、カルシウムの沈着を指標に検出することもできる。これらの検出には、市販のキット、例えば、アルカリホスファターゼ測定キット（ラボアッセイTMALP、和光純薬）やカルシウム測定キット（カルシウムC-テストワコー、和光純薬）を用いることができる。
  軟骨細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献（ALASTAIR M. MACKAY et al., TISSUE ENGINEERING Vol.4 (1998) 415-428）に記載の方法が利用可能である。この方法においては、培養したヒト間葉系幹細胞をトリプシンで剥離し、遠心管内で、単細胞分散させた後、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に試薬（10μg/mL TGF-β3、100nM デキタメタゾン、50μg/mL アスコルビン酸、100μg/mL ピルビン酸ナトリウム、40μg/mL プロリン、6.25μg/mL ウシインスリン、6.25μg/mL トランスフェリン、5.33μg/mL リノール酸、1.25mg/mL ウシ血清アルブミン）を加えた分化誘導培地に分散した後、遠心操作で細胞ペレットを作成して、そのまま14日間培養して軟骨に分化させる。軟骨への分化の確認は各種細胞外マトリックスを抗体で染色することにより確認することができる。
  心筋細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献（Keiichi Fukuda, Artificial Organs Vol.25 (2001) 187-193）に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、20％ウシ胎児血清含有のイスコフ改変DMEMに3μM 5-azacytidineを加えた分化誘導培地で24時間以上培養して心筋に分化させる。心筋への分化は、顕微鏡下で細胞の自発鼓動を観察することで確認することできる。
  骨格筋細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献（Eun Ji Gang et al., StemCell 22 (2004) 617-624）に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、15％ウシ胎児血清含有DMEMに試薬（5％ ウマ血清、0.1μM デキタメタゾン、50μM ヒドロコルチゾン）を加えた分化誘導培地で6週間培養することで骨格筋に分化させる。骨格筋への分化は、骨格筋細胞特有のMyoD1を蛍光染色することによって検出することができる。
  脂肪細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献（Kentaro Nagane et al., TISSUE ENGINEERING: Part A Vol.16 (2010) 21-31）に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ラット間葉系幹細胞を、10％仔ウシ血清含有のα-MEMに試薬（450μM 3-isobutyl-1-methlxantine、50μg/mL インスリン、60μM インドメタシン、1μM デキタメタゾン、10μM trogitazone）を加えた分化誘導培地で6日間培養することで脂肪細胞へ分化させる。脂肪細胞への分化は、オイルレッドによる染色や、GPDH酵素の活性の測定により、検出することができる。
  肝細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献（Agnieszka Banas et al., HEPATOLOGY July (2007) 219-228）に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、10％ウシ胎児血清含有DMEMに、試薬（300ng/mL FGF1、25ng/mL FGF4、150ng/mL HGF）を加えた分化誘導培地で3週間培地した後、さらに、分化誘導培地に試薬（30ng/mL オンコスタチンM、2x10-5M デキタメタゾン）を添加したもので2週間培養することで、肝実質細胞へ分化させる。肝実質細胞への分化は、細胞のアルブミン合成能やアンモニア代謝の測定により検出することができる。
  神経細胞を増殖および分化させる方法としては、例えば、文献（Ju Ah Jeong et al., NEUROREPORT Vol.15 (2004) 1731-1734）に記載の方法が利用可能である。この方法においては、ヒト間葉系幹細胞を、20％ウシ胎児血清含有DMEMに試薬（25mM 塩化カリウム、2% ジメチルスルホキシド（DMSO）、100μM Butylate hyderoxyamisole、5μg/mL インスリン、100μg/mL トランスフェリン、20ｍM プロジェステロン、100μM putrescine、30nM sodium selenite、20ng/ml bFGF、10mM forskolin）を加えた培地で24時間培養することにより、神経細胞へ分化させる。神経細胞への分化は、神経細胞に特有の遺伝群の発現を測定することで検出することができる。
  また、本発明において「硫酸化多糖類」とは、その分子中に硫酸基をもつ多糖類を意味する。本発明における硫酸化多糖類は、細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌され、かつ、成長因子に結合しうるものである限り特に制限はない。好ましくは、対照値と比較して高い割合で、図６に示されるNSとdiS2の構造を含み、かつ、対照値と比較して低い割合で、図６に示されるdiS1の構造を含む硫酸化多糖類である。対照値としては、例えば、細胞の増殖および分化が進行していない細胞が分泌する硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値（例えば、骨細胞の増殖および分化を検出する場合には、骨細胞に分化しうる細胞を、分化誘導しない通常の培地で培養を行った場合の当該硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値）を用いることができる。
  また、本発明において「成長因子」とは、動物体内において、特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性のタンパク質を意味する。本発明における硫酸化多糖類が結合する「成長因子」としては、例えば、BMP-2やbFGFが挙げられるが、これらに制限されない。
  成長因子に結合する硫酸化多糖類は、例えば、成長因子あるいはそれらの断片を結合させた担体（例えば、ヘパリンセファロース）に、細胞の培養上清を接触させ、当該担体上の成長因子に結合する硫酸化多糖類を回収することにより調製することができる。
  硫酸化多糖類の検出は、例えば、1,9-ジメチルメチレンブルー（「DMB」）アッセイより実施することができる。硫酸化多糖類の検出は、また、当該硫酸化多糖類に特異的に結合する分子（例えば、当該硫酸化多糖類に結合する抗体やその結合部位ペプチド、当該硫酸化多糖類に結合する成長因子やその結合部位ペプチド）を用いても行うことができる。
  抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（成長因子に結合する硫酸化多糖類）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler  &  Milstein,  Nature,  256：495(1975)）や組換えDNA法（例えば、P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY、P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS、Vandamme A. M. et al., Eur. J. Biochem. 192:767-775 (1990)）によって作製することができる。これらの抗体は、必要に応じて、標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン／アビジンなどが挙げられる。抗体を診断剤などの組成物として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当な担体（後述）を加えて調製することができる。
  成長因子やその結合部位ペプチドは、これらをコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、形質転換体の抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは成長因子に結合する硫酸化多糖類や抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、これらの精製手段を複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。これら成長因子やその結合部位ペプチドは、上記の抗体の場合と同様に、必要に応じて、標識されていてもよい。
  本発明は、このような硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする、細胞の増殖および分化を検出するための組成物をも提供する。
  本発明の組成物を用いて硫酸化多糖類を検出した結果、対照値と比較して高い量の当該硫酸化多糖類が検出された場合には、細胞の増殖および分化の過程が進行していると評価することができる。対照値としては、例えば、細胞の増殖および分化が進行していない細胞における当該硫酸化多糖類の分泌量の値（例えば、骨細胞の増殖および分化を検出する場合には、骨細胞に分化しうる細胞を、分化誘導しない通常の培地で培養を行った場合の当該硫酸化多糖類の分泌量の値）を用いることができる。また、分泌される硫酸化多糖類において、対照値と比較して高い割合で、図６に示されるNSとdiS2の構造が検出された場合や、対照値と比較して低い割合で、図６に示されるdiS1の構造が検出された場合には、細胞の増殖および分化の過程が進行していると評価することができる。対照値としては、例えば、細胞の増殖および分化が進行していない細胞が分泌する硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値（例えば、骨細胞の増殖および分化を検出する場合には、骨細胞に分化しうる細胞を、分化誘導しない通常の培地で培養を行った場合の当該硫酸化多糖類におけるNS、diS2、diS1の構造の割合の値）を用いることができる。このように本発明の組成物は、培養細胞を用いた実験において、細胞の増殖や分化の程度を評価したり、および動物実験において、細胞の増殖や分化の程度を評価するための実験用試薬となる。また、ヒトの人体において、例えば、再生治療に対して治療の正確な進行程度を診断する目的で、細胞の増殖や分化の程度を評価するための診断薬となる。
  本発明は、また、成長因子に結合する硫酸化多糖類を有効成分とする、骨細胞の増殖および分化を促進するための組成物を提供する。本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究開発目的（例えば、In VitroやIn Vivoの実験、人工骨などの人工の組織や臓器の製造）に用いられる試薬の形態であり得る。
  本発明の組成物は、成長因子の活性を安定化あるいは増強して、細胞の増殖および分化を促進する作用を有するため、細胞、組織または臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防や治療のために投与される医薬組成物として、あるいは、日常的に摂取される飲食品として好適に用いることができる。
  本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。
  本発明の組成物の製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
  本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖や分化の異常に起因する疾患の治療や予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。
  本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品；みそ、発酵飲料等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ，インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。
  本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、細胞の増殖や分化の促進のために有効な１種もしくは２種以上の成分を添加してもよい。また、細胞の増殖や分化の促進以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
  本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の組成物の投与量または摂取量は、一般に、0.01mg/kg体重～100mg/kg体重である。本発明は、このように、本発明の組成物を対象に投与もしくは摂取させることを特徴とする、対象における細胞の増殖および分化を促進する方法をも提供するものである。また、本発明の組成物を対象に投与することを特徴とする、対象における、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防または治療の方法をも提供するものである。
  本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、細胞の増殖および分化を促進するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。細胞の増殖および分化を促進するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物を投与もしくは摂取することにより細胞の増殖および分化が促進される機序についての情報を含むことができる。また、細胞の増殖および分化を促進するために用いられる旨の表示においては、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防または治療のために用いられること、に関する情報を含むことができる。
  以下、実施例および比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
 
[実施例１]  マウス由来骨前駆細胞の分化誘導培地での培養
  マウス由来骨前駆細胞MC3T3-E1を、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた10cmディッシュ（Corning）3枚にそれぞれ3.0×105cellsとなるよう播種し、5%CO2インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸（ナカライテスク）50μg/mL、β-グリセロホスフェート（SIGMA）10mM、デキサメタゾン（ナカライテスク）10-8MおよびrhBMP-2 100ng/mLとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。3～4日に一度培地交換を行い、5%CO2インキュベータ内で１週間、37℃で培養し、細胞および培養上清をサンプリングした。
 
[比較例１]  マウス由来骨前駆細胞の通常の培地での培養
  マウス由来骨前駆細胞MC3T3-E1を、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた10cmディッシュ（Corning）3枚にそれぞれに3.0×105cellsとなるよう播種し、5%CO2インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。同様の培地を用いて3～4日に一度培地交換を行い、5%CO2インキュベータ内で１週間、37℃で培養し、細胞および培養上清をサンプリングした。
 
[評価方法]
（１）アルカリホスファターゼ（ALP）活性量の測定（骨細胞分化指標）
  サンプリングした細胞を溶液（3M 塩化ナトリウム（和光純薬）、0.3M クエン酸三ナトリウム（ナカライテスク）、200mg/L ドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク））に溶解させ、アルカリホスファターゼ測定キット（ラボアッセイTMALP、和光純薬）を用いてALP活性量を測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で405nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのALP活性量を求めた（図１）。
 
（２）カルシウム沈着量の測定（骨細胞分化指標）
  サンプリングした細胞を溶液（3M 塩化ナトリウム（和光純薬）、0.3M クエン酸三ナトリウム（ナカライテスク）、200mg/L ドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク））に溶解させ、等量の1M HCL水溶液（ナカライテスク）を加えて4℃で4時間以上静置した後、カルシウム測定キット（カルシウムC-テストワコー、和光純薬）を用いてカルシウム沈着量を測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で570nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのカルシウム沈着量を求めた（図２）。
 
（３）硫酸化多糖類量の測定
  サンプリングした培養上清中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー（「DMB」）アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で525nmの吸光度を測定し得られた値から、α-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中の硫酸化多糖類量を求めた（図３）。
 
（４）bFGFに結合できる硫酸化多糖類量の測定
  Heparin Sepharose（GEヘルスケア）をよく分散させてから5μLとり、50μLの10mM リン酸バッファーで2回洗浄後、10mM リン酸バッファーおよび100μg/mLの10mM リン酸バッファーにbFGFを溶解させた溶液をそれぞれ100μL加え10分間処理した。上澄みを除去し、10mM リン酸バッファー200μLで2回洗浄後、サンプリングした培養上清を加え、30分処理し、上澄みを回収した。回収した上澄み中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー（「DMB」）アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で525nmの吸光度を測定し得られた値から、10mM リン酸バッファーにコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により上澄みに残った硫酸化多糖類量を求め、培養上清中の硫酸化多糖類量から差し引いて培養上清1mL中のbFGFに結合できる硫酸化多糖類量を求めた（図４）。
 
（５）rhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量の測定
  100μg/mLの10mM リン酸バッファーにbFGFを溶解させた溶液の代わりに100μg/mLの10mM リン酸バッファーにrhBMP-2を溶解させた溶液を用いたほかはbFGFに結合できる硫酸化多糖類量の測定と同様に実施した（図５）。
 
（６）硫酸化多糖類の構造確認
  実施例１記載の培養上清100μL及びα-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地100μL、または比較例１記載の培養上清250μL及びα-MEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地250μLに、それぞれMilliQを加えて全量500μLとした。この溶液を、限外濾過膜Amicon Ultra（登録商標）10K 0.5mL（ミリポア）を用いて25℃、14000Gで30分間遠心分離に供した。回収した溶液に、再度MilliQ480μLを加えて25℃、14000Gで40分間遠心分離に供した。その後、回収した溶液25μLから10μLをとり、消化用バッファー[10mM 酢酸ナトリウム三水和物（ナカライテスク株式会社）、10mM 酢酸カルシウム一水和物（ナカライテスク株式会社）、pH=7.0]6μLと、0.5U/mLになるよう0.1%BSA（Equitech-bio inc）水溶液にヘパリナーゼ（生化学工業株式会社）を溶解させた溶液5μLと、0.5U/mLになるよう0.1%BSA（Equitech-bio inc）水溶液にヘパリチナーゼ（生化学工業株式会社）を溶解させた溶液5μLとを加え、全量が30μLとなるよう、さらにMilliQを加えて、37℃で1時間インキュベートした。この溶液20μLと不飽和ヘパラン／へパリン-二糖キット（生化学工業株式会社）にある6種類の二糖の100μM混合水溶液20μLを糖鎖精製キットBlotGlyco（登録商標）（住友ベークライト株式会社）を用いて精製し糖鎖を回収した。回収した糖鎖水溶液5μLを、高速液体クロマトグラフ（LaChrom Elite、株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて解析した。カラムは、順相クロマトグラフィーカラム（TSK-GEL Amide-80、東ソー株式会社）を用い、移動相には50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH4.4）とアセトニトリルを使用した。移動相においては、50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH4.4）が20%から41.7%に80分かけて変化するように勾配をつけ、糖鎖水溶液を流速0.4mL/分、カラム温度30℃で流し、蛍光（励起波長330nm、蛍光波長420nm）にて検出した。得られたHPLCチャートから、標準二糖のピークの溶出時間と一致するピークについて培養上清の面積から培地の面積を差し引いた。こうして算出した各ピーク面積を6つのピーク面積総和で割り100をかけてピーク面積（％）を算出して比較した。
  その結果、diS１は通常培地の方が、NSとdiS2は分化誘導培地の方に多く生成していた（図６）。
 
［実施例２］
ラット大腿骨および脛骨より採取した骨髄液を培養フラスコに播種し５％炭酸ガスインキュベーター内で２日間、３７℃で培養後、培養液を交換して浮遊細胞を除去した。さらに１～２日間、３７で接着している細胞を培養後継代し、７０～９０％コンフルエントになるまで３７℃で培養して得た骨髄由来の間葉系幹細胞MSCを、DMEM（high glucose）に1%ウシ胎児血清を加えた培地に2.0×106cells/mLとなるよう懸濁させ、rhTGF-β3 10ng/mL、L-アスコルビン酸ホスフェート（SIGMA）20mM、デキサメタゾン（ナカライテスク株式会社）100nM、 L-プロリン（ナカライテスク株式会社）40μg/mL、ピルビン酸ナトリウム塩（ナカライテスク株式会社）2mM、ITS+premix（BD biosciences）1vol%及びrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加し、15mL遠沈管（BD biosciences）10本に0.5mLずつ加えて軟骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベータ内で培養し、３～４日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、7日後、11日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
 
［実施例３］
ラット大腿骨及び脛骨より採取した骨髄液を培養フラスコに播種し5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養後、培地交換して浮遊細胞を除去した。さらに1～2日間、37℃で培養後継代し70～90%コンフルエントになるまで37℃で培養して得た間葉系幹細胞MSCを、α-MEMに15%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート（Corning）に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸（ナカライテスク株式会社）50μg/mL、β-グリセロホスフェート（SIGMA）10mM、デキサメタゾン（ナカライテスク株式会社）10-8Mとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3～4日に一度培地交換を行い、10日後及び21日後に細胞を、3日後、7日後、10日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
 
［実施例４］
骨分化を誘導するにあたり、培地にアスコルビン酸（ナカライテスク株式会社）50μg/mL、β-グリセロホスフェート（SIGMA）10mM、デキサメタゾン（ナカライテスク株式会社）10-8M及びrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加した以外は実施例３と同様に行った。
 
［実施例５］
ヒト間葉系幹細胞hMSC（PT-2501、Lonza）を、間葉系幹細胞用無血清培地（STK2、株式会社ツーセル）を入れた6ウェルプレート（SUMILON）の3ウェルに5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で3日間、37℃で培養した。間葉系幹細胞骨分化用無血清培地（STK3、株式会社ツーセル）に切り替え、骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3～4日に一度培地交換を行い、4日後、7日後、14日後及び21日後に細胞及び培養上清をサンプリングした。
 
［実施例６］
不死化されたヒト間葉系幹細胞hMSC（huBM01-E6E7-hTERT clone51、戸口田研究室よりもらったもの）を、DMEM（Low Glucose）に10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート（Corning）に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸（ナカライテスク株式会社）50μg/mL、β-グリセロホスフェート（SIGMA）10mM、デキサメタゾン（ナカライテスク株式会社）10-8Mとなるように培地に添加し骨分化誘導を開始した。37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3~4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、8日後、11日後、14日後、17日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
 
［比較例２］
実施例２と同様にして得られた骨髄由来の間葉系幹細胞MSCを、DMEM（high glucose）に1%ウシ胎児血清を加えた培地に2.0×106cells/mLとなるよう懸濁させ、15mL遠沈管（BD biosciences）10本に0.5mLずつ加えて、37℃、5%CO2インキュベータ内で培養した。３～４日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、7日後、11日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
 
［比較例３］
実施例３と同様にして得た間葉系幹細胞MSCを、α-MEMに15%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート（Corning）に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸（ナカライテスク株式会社）50μg/mL、β-グリセロホスフェート（SIGMA）10mMとなるように培地に添加して引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養した。3～4日に一度培地交換を行い、10日後及び21日後に細胞を、3日後、7日後、10日後、14日後、18日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
 
［比較例４］
培地にrhBMP-2 100ng/mLとなるよう添加した以外は比較例３と同様に行った。
 
［比較例５］
ヒト間葉系幹細胞hMSC（PT-2501、Lonza）を、間葉系幹細胞用無血清培地（STK2、株式会社ツーセル）を入れた6ウェルプレート（SUMILON）に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で3日間、37℃で培養した。同様の培地を用いて引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養し、3~4日に一度培地交換を行い、4日後、7日後、14日後及び21日後に細胞及び培養上清をサンプリングした。
 
［比較例６］
不死化されたヒト間葉系幹細胞hMSC（huBM01-E6E7-hTERT clone51、戸口田研究室よりもらったもの）を、DMEM（Low Glucose）に10%ウシ胎児血清を加えた培地を入れた6ウェルプレート（Corning）に5.0×104cells/wellとなるよう播種し、5%CO2インキュベート内で2日間、37℃で培養した。アスコルビン酸（ナカライテスク株式会社）50μg/mL、β-グリセロホスフェート（SIGMA）10mMとなるように培地に添加して引き続き37℃、5%CO2インキュベート内で培養した。3~4日に一度培地交換を行い、14日後及び21日後に細胞を、4日後、8日後、11日後、14日後、17日後及び21日後に培養上清をサンプリングした。
 
［評価方法］
（１）アルカリホスファターゼ（ALP）活性量の測定
サンプリングした細胞を溶液（3M塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、0.3Mクエン酸三ナトリウム（ナカライテスク）、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク））に溶解させ、アルカリホスファターゼ測定キット（ラボアッセイTMALP、和光純薬工業株式会社）を用いてALP活性量を測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で405nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのALP活性量を求めた（図７）。
 
（２）カルシウム沈着量の測定
サンプリングした細胞を溶液（3M塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、0.3Mクエン酸三ナトリウム（ナカライテスク）、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク））に溶解させ、等量の1MHCL水溶液（ナカライテスク）を加えて4℃で4時間以上静置した後、カルシウム測定キット（カルシウムE-HAテストワコー、和光純薬工業株式会社）を用いてカルシウム沈着量を測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で600nmの吸光度を測定し得られた値を細胞数で割り、細胞あたりのカルシウム沈着量を求めた（図８）。
 
（３）硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中の存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー（「DMB」）アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で525nmの吸光度を測定し得られた値から、各実施例及び比較例の培養に用いた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中に1日当たり分泌される硫酸化多糖類量を求めた（図９）。
 
（４）硫酸化グリコサミノグリカン（GAG）産生量の測定
サンプリングした細胞を溶液（300μg/mLパパイン（和光純薬工業株式会社）、2mM DTT（ナカライテスク株式会社）、200mg/Lドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク株式会社））に60℃、3時間処理して溶解させ、1,9-ジメチルメチレンブルー（「DMB」）アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で測定し得られた525nmの吸光度から、細胞を溶解させた際に用いた上記溶液にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により算出した値を細胞数で割り、細胞あたりの硫酸化多糖類量を求めた（図１０）。
 
（５）硫酸化多糖類量の測定
サンプリングした培養上清中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー（「DMB」）アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で525nmの吸光度を測定し得られた値から、DMEM（high glucose）に1%ウシ胎児血清を加えた培地にコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により培養上清1mL中に1日当たり分泌される硫酸化多糖類量を求めた（図１１）。
 
（６）rhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量の測定
Heparin Sepharose（GEヘルスケア）をよく分散させてから5μLとり、50μLの10mMリン酸バッファーで2回洗浄後、10mMリン酸バッファー及び100μg/mL の10mMリン酸バッファーにrhBMP-2を溶解させた溶液をそれぞれ100μL加え10分間処理した。上澄みを除去し、10mMリン酸バッファー200μLで2回洗浄後、サンプリングした培養上清（実施例２の14日後及び21日後、比較例２の14日後）を加え、30分処理し、上澄みを回収した。回収した上澄み中に存在する硫酸化多糖類量を1,9-ジメチルメチレンブルー（「DMB」）アッセイを用いて測定した。マイクロプレートリーダー（VERSAmax、Molecular Devices）で525nmの吸光度を測定し得られた値から、10mMリン酸バッファーにコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩を溶解させた溶液を用いて得た検量線により上澄みに残った硫酸化多糖類量を求め、培養上清中の硫酸化多糖類量から差し引いて培養上清1mL中のrhBMP-2に結合できる硫酸化多糖類量を求めた（図１２）。
 
（７）硫酸化多糖類の構造確認
実施例２記載の培養上清（18日後）100μL及びDMEM（high glucose）に1%ウシ胎児血清を加えた培地100μLにそれぞれMilliQを加えて全量500μLとした溶液、または比較例２記載の培養上清（18日後）500μL及びDMEM（high glucose）に1%ウシ胎児血清を加えた培地500μLを限外濾過膜Amicon Ultra（登録商標） 10K 0.5mL（ミリポア）を用いて25℃、14000Gで30分間遠心分離をかけた。再度MilliQ 480μLを加えて25℃、14000Gで40分間遠心分離をかけた後、回収した溶液25μLから10μLをとり、消化用バッファー（10mM酢酸ナトリウム三水和物（ナカライテスク株式会社）、10mM酢酸カルシウム一水和物（ナカライテスク株式会社）、pH = 7.0）6μLと0.5U/mLになるよう0.1%BSA（Equitech-bio inc）水溶液にヘパリナーゼ（生化学工業株式会社）を溶解させた溶液5μLと0.5U/mLになるよう0.1%BSA（Equitech-bio inc）水溶液にヘパリチナーゼ（生化学工業株式会社）を溶解させた溶液5μLを加え、全量が30μLとなるようMilliQを加えて、37℃で1時間インキュベートした。この溶液20μLと不飽和ヘパラン／へパリン-二糖キット（生化学工業株式会社）にある6種類の二糖の100μM混合水溶液20μLを糖鎖精製キットBlotGlyco（登録商標）（住友ベークライト株式会社）を用いて精製し糖鎖を回収した。回収した糖鎖水溶液5μLを、高速液体クロマトグラフ（LaChrom Elite、株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて解析した。カラムは、順相クロマトグラフィーカラム（TSK-GEL Amide-80、東ソー株式会社）を用い、移動相には50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH 4.4）とアセトニトリルを使用した。移動相は、50mM ギ酸アンモニウム水溶液(pH 4.4）が20%から41.7%に80分かけて変化するように勾配をつけ、流速0.4 mL/min、カラム温度30℃で流し、蛍光（励起波長330nm、蛍光波長420nm）にて検出した。得られたHPLCチャートから、標準二糖のピークの溶出時間と一致するピークについて培養上清の面積から培地の面積を差し引き、各ピーク面積を6つのピーク面積総和で割り100をかけてピーク面積（%）を算出して比較した（図１３）。
  本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類を利用すれば、体内および体外において、骨細胞の分化の促進を行うことが可能である。従って、これら硫酸化多糖類を有効成分とする本発明の組成物は、細胞の増殖および分化の促進を行うための試薬としての利用の他、細胞、組織、臓器の損傷や、細胞の増殖および分化の異常に起因する疾患の予防または治療のための医薬品や、細胞の増殖や分化における改善を図るための健康食品などの飲食品として、利用することができる。
  また、本発明により見出された成長因子に結合する硫酸化多糖類を標的として、体内や体外における細胞の増殖および分化の進行の程度の評価を行うことが可能である。当該硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする組成物は、細胞の増殖や分化を検出するための診断薬となる。再生医療のための治療を行った患者において、これら硫酸化多糖類を検出すれば、その治療の効果を評価することができるため、本発明は再生医療の分野においても利用することができる。

Claims (6)

  1.   細胞の増殖および分化の過程において細胞から分泌される硫酸化多糖類であって、成長因子に結合する硫酸化多糖類。
  2.   細胞の増殖および分化の過程が、骨細胞または軟骨細胞の増殖および分化の過程である、請求項１に記載の硫酸化多糖類。
  3.   成長因子がBMP-2およびbFGFからなる群より選択される分子である、請求項１または２に記載の硫酸化多糖類。
  4.   請求項１から３のいずれかに記載の硫酸化多糖類を検出することを特徴とする、細胞の増殖および分化の評価方法。
  5.   請求項１から３のいずれかに記載の硫酸化多糖類に結合する分子を有効成分とする、細胞の増殖および分化を検出するための組成物。
  6.   請求項１から３のいずれかに記載の硫酸化多糖類を有効成分とする、細胞の増殖および分化を促進するための組成物。
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