WO2016072396A1 - 骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子の活性化方法、医薬組成物、複合体の使用、及び骨の再生方法 - Google Patents

骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子の活性化方法、医薬組成物、複合体の使用、及び骨の再生方法 Download PDF

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polyrotaxane
sulfated
bone morphogenetic
factor
molecule
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正彦 寺内
池田　剛
篤志 田村
聰 山口
清 原田
由井　伸彦
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国立大学法人 東京医科歯科大学
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses

Definitions

  • the present invention relates to a bone morphogenetic factor stabilizing / retaining agent, a bone morphogenetic factor activator, a bone morphogenetic factor stabilizing / holding method, a bone morphogenetic factor activating method, a pharmaceutical composition, use of a complex, and a bone regeneration method.
  • the use of bone substitute materials such as polylactic acid and ⁇ -tricalcium phosphate as a substitute for transplanted bone has been studied.
  • the polylactic acid has a problem that it may cause a strong immune reaction or an inflammatory reaction, and since the ⁇ -tricalcium phosphate is an inorganic material, it is stagnated without being absorbed in vivo.
  • the present situation is that the establishment of a wide range of bone regeneration technologies has not been established.
  • Bone morphogenetic protein-2 (hereinafter also referred to as “BMP-2”), which is a growth factor that promotes bone formation, is known to strongly induce bone formation. , Has attracted widespread attention. However, BMP-2 has a problem that it is very unstable because it is rapidly decomposed and deactivated in a living environment. Further, since BMP-2 takes a long period of time such as several months to regenerate a wide range of bones, it is necessary to continuously administer a large amount of BMP-2 in order to maintain the activity. However, it has been reported that when a large amount of BMP-2 is administered, abnormal bones are formed in vivo due to inflammatory action or excessive reaction (for example, see Non-Patent Document 1).
  • heparin which is a sulfated polysaccharide is added to BMP-2, which suppresses inactivation of BMP-2 in the in vivo environment and is excellent in differentiation induction efficiency by BMP-2.
  • a method for maintaining the activity of BMP-2 to form a BMP-2 / heparin electrostatic complex has been proposed (see, for example, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, and Patent Document 1).
  • the above proposal has a problem that it is difficult to apply clinically because heparin has an anticoagulant action.
  • the present invention makes it a subject to solve the said various problems in the past and to achieve the following objectives. That is, the present invention is excellent in safety such as low cytotoxicity and no anticoagulant action, and is excellent in the complex forming action with the bone morphogenetic factor, and can stably hold the bone morphogenetic factor in vivo.
  • Means for solving the above-described problems are as follows. That is, ⁇ 1> containing a sulfated polyrotaxane having a cyclic molecule having a sulfate group and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule, An osteogenesis factor stability-retaining agent characterized by stably retaining an osteogenesis factor. ⁇ 2> containing a sulfated polyrotaxane having a cyclic molecule having a sulfate group and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule, It is an osteogenesis factor activator characterized by activating an osteogenesis factor.
  • a bone morphogenetic agent is allowed to act on a bone morphogenetic agent activator containing at least a cyclic molecule having a sulfate group and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule.
  • An activation method of a bone morphogenetic factor characterized by activating a morphogenetic factor.
  • a pharmaceutical composition containing a bone morphogenetic protein, a cyclic molecule having a sulfate group, and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule, particularly used for bone regeneration.
  • a pharmaceutical composition for ⁇ 6> A complex of a bone-forming factor, a sulfated polyrotaxane having a cyclic molecule having a sulfate group, and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule in the manufacture of a pharmaceutical product for use in bone regeneration. Is use.
  • ⁇ 7> A method for regenerating bone in a subject, Administering a composition containing a bone morphogenetic factor, a cyclic molecule having a sulfate group, and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through a hollow portion of the cyclic molecule to the subject. Is the way to do.
  • the conventional problems can be solved, the object can be achieved, the cytotoxicity is low, the safety is excellent such as no anticoagulation, and the complex formation with the bone morphogenetic factor is achieved.
  • a bone morphogenetic agent that retains bone morphogenetic factor stably in vivo a bone morphogenetic factor stable retention agent, a bone morphogenetic factor stable retention method, a bone morphogenetic agent activator that can activate bone morphogenetic agent, and It is possible to provide a method for activating a bone morphogenetic factor, a pharmaceutical composition capable of regenerating bone, use of a complex, and a method for regenerating bone.
  • FIG. 1 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in heavy water of a polyrotaxane modified with a carboxyethyl group (hereinafter also referred to as “CE-PRX”), which is an intermediate product of Production Example 1.
  • FIG. 2 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of the sulfated polyrotaxane-1 obtained in Production Example 1.
  • FIG. 3 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of the sulfated polyrotaxane-2 obtained in Production Example 2.
  • FIG. 1 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in heavy water of the sulfated polyrotaxane-2 obtained in Production Example 2.
  • FIG. 4 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of the sulfated polyrotaxane-3 obtained in Production Example 3.
  • FIG. 5 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of the sulfated polyrotaxane-4 obtained in Production Example 4.
  • FIG. 6 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of the sulfated polyrotaxane-5 obtained in Production Example 5.
  • FIG. 7 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of the sulfated polyrotaxane-6 obtained in Production Example 6.
  • FIG. 5 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of the sulfated polyrotaxane-3 obtained in Production Example 3.
  • FIG. 5 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy
  • FIG. 8 is a chart of a proton nuclear magnetic resonance spectrum at 500 MHz measured in the heavy water of sulfated polyrotaxane-7 obtained in Production Example 7.
  • FIG. 9 is a diagram showing measurement results of relative ALP activity in Test Example 1.
  • FIG. 10 is a diagram showing the coloring results of wells in which the amount of ALP activity in Test Example 2 was measured.
  • FIG. 11 is a diagram showing measurement results of relative ALP activity in Test Example 3.
  • FIG. 12 is a diagram showing the measurement results of ALP activity in Test Example 4.
  • FIG. 13 is a graph showing the measurement results of the BMP-2 antibody binding rate of Test Example 5.
  • FIG. 14 is a graph showing the measurement results of the amount of ALP activity when BMP-2 inhibitor was added in Test Example 6.
  • FIG. 10 is a diagram showing the coloring results of wells in which the amount of ALP activity in Test Example 2 was measured.
  • FIG. 11 is a diagram showing measurement results of relative ALP activity in Test Example 3.
  • FIG. 12 is a diagram
  • FIG. 15 is a diagram showing the measurement results of cytotoxicity in Test Example 7.
  • FIG. 16 is a diagram showing the measurement results of the anticoagulant action of the sulfated polyrotaxane of Test Example 8.
  • FIG. 17A is a diagram showing the evaluation results of calcification of Test Example 9 with no BMP-2 added.
  • FIG. 17B is a diagram showing an evaluation result of calcification by adding BMP-2 in Test Example 9.
  • FIG. 17C is a diagram showing the evaluation results of calcification by heparin and BMP-2 complex in Test Example 9.
  • FIG. 17D is a diagram showing the evaluation results of calcification by the sulfated polyrotaxane and BMP-2 complex of Test Example 9.
  • FIG. 18 is a diagram showing the measurement results of ALP activity in Test Example 10.
  • FIG. 19A is a view showing an image obtained by X-ray micro CT of the skull of a skull-deficient model mouse to which 10 ng of BMP-2 of Test Example 11 was administered.
  • FIG. 19B is a view showing an image taken by X-ray micro CT of the skull of a skull-deficient model mouse to which 50 ng of BMP-2 of Test Example 11 was administered.
  • FIG. 20A is a diagram showing the results of AST in which the toxicity to liver and kidney in mice administered with the sulfated polyrotaxane of Test Example 12 was examined.
  • FIG. 20B is a diagram showing the results of ALT in which the toxicity to liver and kidney in mice administered with the sulfated polyrotaxane of Test Example 12 was examined.
  • FIG. 20A is a diagram showing the results of AST in which the toxicity to liver and kidney in mice administered with the sulfated polyrotaxane of Test Example 12 was examined.
  • FIG. 20B is a diagram showing the results of
  • FIG. 20C is a diagram showing the results of BUN in which toxicity to the liver and kidney in mice administered with the sulfated polyrotaxane of Test Example 12 was examined.
  • FIG. 20D is a diagram showing CR results of examining toxicity to the liver and kidney in mice administered with the sulfated polyrotaxane of Test Example 12.
  • Bone morphogenetic stabilizer, bone morphogenetic activator, bone morphogenetic factor stable retention method, bone morphogenetic factor activation method, pharmaceutical composition, use of complex, and bone regeneration method Bone morphogenetic stabilizer, bone morphogenetic activator, bone morphogenetic factor stable retention method, bone morphogenetic factor activation method, pharmaceutical composition, use of complex, and bone regeneration method It contains a modified polyrotaxane and an osteogenic factor, and further contains other components as necessary.
  • the present inventors have found the following.
  • the problem is that a positively charged bone-forming factor and a negatively charged heparin form a complex by electrostatic interaction, so that sulfate groups, which have the same chemical structure as heparin, are converted into cyclic molecules. It has been found that the inclusion of a sulfated polyrotaxane that is negatively charged by having a bone-forming factor and the sulfated polyrotaxane can form a complex.
  • the sulfated polyrotaxane has a cyclic molecule having the sulfate group and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule
  • the cyclic molecule having the sulfate group has a high degree of freedom. Mitigates steric hindrance during complex formation with bone morphogenetic factors compared to compounds with fixed sulfate group modification positions such as heparin. It was found that the bone morphogenetic factor can be stably retained in the living body and can be activated.
  • the sulfated polyrotaxane (hereinafter also referred to as “SO 3 -PRX”) is contained in order to improve safety such as low cytotoxicity and absence of anticoagulant activity and complex formation with bone morphogenetic factors. ing.
  • the sulfated polyrotaxane is not particularly limited as long as it has a cyclic molecule having a sulfate group and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule, and can be appropriately selected according to the purpose. You may use individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • the sulfated polyrotaxane refers to a polyrotaxane having a sulfate group modified on a cyclic molecule.
  • the number average molecular weight of the sulfated polyrotaxane is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. It is preferably 2,000 to 500,000, and more preferably 10,000 to 100,000.
  • the number average molecular weight can be calculated from, for example, a chemical composition obtained from a proton nuclear magnetic resonance spectrum.
  • linear molecules are not particularly limited as long as it can penetrate the hollow portion of the cyclic molecule and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the cyclic molecule is detached at both ends of the linear molecule. It has a structure modified with a blocking group that acts like no.
  • linear of “linear molecule” means a straight chain, but may have a branched chain as long as the cyclic molecule can move on the linear molecule.
  • the number average molecular weight of the configuration other than both ends of the linear molecule is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the number average molecular weight of the target sulfated polyrotaxane and the number of cyclic molecules to penetrate. 500 to 1,000,000 is preferable, 500 to 10,000 is more preferable, and 500 to 6,000 is particularly preferable. When the number average molecular weight is less than 500, detachment of the penetrating cyclic molecule is likely to occur, and it is difficult to control the penetrating number of the cyclic molecule. When it exceeds 000, the solubility is lowered, and the control of the number of penetrating cyclic molecules tends to be difficult.
  • the number average molecular weight can be calculated from, for example, a chemical composition obtained from gel permeation chromatography (GPC) measurement or proton nuclear magnetic resonance spectrum.
  • the structure of a well-known polyrotaxane can be selected suitably, for example, the block copolymer of polyethyleneglycol, polypropylene glycol, polyethyleneglycol, and polypropyleneglycol And a random copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol, polymethyl vinyl ether, polyethyleneimine, and the like.
  • numerator a commercial item may be used and what was synthesize
  • the configuration other than both ends of the linear molecule is preferably selected as appropriate according to the combination with the cyclic molecule described later.
  • the cyclic molecule when it is ⁇ -cyclodextrin, it may be polyethylene glycol.
  • the cyclic molecule is ⁇ -cyclodextrin, it is preferable to use polypropylene glycol or a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol.
  • the blocking groups at both ends of the linear molecule are not particularly limited as long as they can cap both ends of the linear molecule to prevent the elimination of the cyclic molecule, and may be appropriately selected according to the purpose.
  • Examples thereof include N-benzoyloxycarbonyl-L-tyrosine; amino acids or derivatives thereof; oligopeptides; fluorescent molecules and the like. Among these, N-benzoyloxycarbonyl-L-tyrosine is preferable.
  • the method for bonding the blocking group to the linear molecule is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • cyclic molecule There is no restriction
  • the cyclodextrin is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, and ⁇ -cyclodextrin. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. Of these, ⁇ -cyclodextrin is preferred.
  • the number of the cyclic molecules penetrating the linear molecule per molecule of the sulfated polyrotaxane is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but an average of 5 to 1,000 An average of 10 to 200 is more preferable, and an average of 20 to 50 is particularly preferable.
  • the cyclic molecule is modified with at least a sulfate group.
  • the sulfated polyrotaxane can be negatively charged and can electrostatically interact with the bone formation factor described later.
  • the sulfate group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include sulfonic acid, ethylsulfonic acid, propylsulfonic acid, butylsulfonic acid, benzenesulfonic acid, sulfamic acid (amidosulfuric acid) and the like. And structural units derived from these salts. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. Among these, a structural unit derived from ethylsulfonic acid is preferable.
  • the sulfate group is not particularly limited as long as the sulfate group can be deprotonated in a physiological pH environment and the sulfated polyrotaxane can be negatively charged. It may be modified through at least one of a linker and other substituents, and may have a repeating structure of at least one of the linker and other substituents. Among these, it is preferably modified through a linker and other substituents, and more preferably modified through a repeating structure of the linker and other substituents.
  • the order of binding to the cyclic molecule is not particularly limited, and even in the order of linker and other substituents, the order of other substituents and linkers is the same. There may be.
  • the number of repetitions of at least one of the linker and the other substituents is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. It is preferably 0 to 20, more preferably 0 to 10, and 0 to 3 Is particularly preferred.
  • the linker is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a carbamate ester bond (—O—CO—NH—), an amide bond (—CO—NH—), an ester bond ( -O-CO-), carbonate bond (-O-CO-O-), ether bond (-O-) and the like.
  • the other substituent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.For example, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a benzyl group, an ethylene glycol group, a triethylene glycol group, Examples include polyethylene glycol groups.
  • the number of sulfate groups modified per molecule of the sulfated polyrotaxane is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 10 to 400 on average, more preferably 20 to 80 on average. preferable.
  • the number of sulfate groups modified per molecule of the cyclic molecule is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.1 to 6 on average, and 0.5 to 3 on average. More preferably, an average of 0.5 to 1 is particularly preferable.
  • Preferred embodiments of the sulfated polyrotaxane include, for example, compounds represented by the following general formula (I), compounds represented by the following general formula (III), and the like.
  • the cyclic molecule is represented by the following general formula (II), the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, and n Represents an integer of 10 to 25,000.
  • Y represents at least one of P and Q
  • P represents an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a benzyl group, an ethylene glycol group, a triethylene glycol group
  • Q represents a carbamate ester bond (—O—CO—NH—), an amide bond (—CO—NH—), an ester bond (—O—CO—), a carbonate bond (—O—).
  • m represents an integer of 0 to 20
  • x represents an integer of 1 to 6
  • M represents a hydrogen atom, a sodium atom, or potassium Indicates an atom.
  • the cyclic molecule is represented by the general formula (II), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n Represents an integer of 10 to 25,000.
  • More preferred embodiments of the sulfated polyrotaxane that is the compound represented by the general formula (I) include, for example, sulfated polyrotaxane represented by the following structural formula (1-A) to the following structural formula (1-E). It is done.
  • the cyclic molecule is represented by the following formula (A), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n represents an integer of 10 to 25,000. In the formula (A), x represents an integer of 1 to 6.
  • the cyclic molecule is represented by the following formula (B), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n represents an integer of 10 to 25,000. In the formula (B), x represents an integer of 1 to 6.
  • the cyclic molecule is represented by the following formula (C), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n represents an integer of 10 to 25,000. In the formula (C), x represents an integer of 1 to 6.
  • the cyclic molecule is represented by the following formula (D), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n represents an integer of 10 to 25,000. In the formula (D), x represents an integer of 1 to 6.
  • the cyclic molecule is represented by the following formula (E), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n represents an integer of 10 to 25,000. In the formula (E), x represents an integer of 1 to 6.
  • sulfated polyrotaxane which is a compound represented by the general formula (III)
  • a sulfated polyrotaxane represented by the following structural formula (1-F) can be mentioned.
  • the cyclic molecule is represented by the following formula (F), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n represents an integer of 10 to 25,000. In the formula (F), x represents an integer of 1 to 6.
  • the linear molecule of the sulfated polyrotaxane represented by the structural formulas (1-A) to (1-F) is polyethylene glycol, and the cyclic molecule is ⁇ -cyclodextrin obtained by chemically modifying ethylsulfonic acid. is there.
  • n represents the number of polyethylene glycol repeating units (n is an integer of 10 to 25,000).
  • n since three repeating units of polyethylene glycol are described in parentheses, “n / 3” is described.
  • ⁇ -cyclodextrin is represented by the formulas (A) to (F), respectively, and the structural formulas (1-A) to (F) In the structural formula (1-F), only one is described.
  • the primary hydroxyl group of ⁇ -cyclodextrin is modified with a structural unit derived from ethyl sulfonic acid via at least one of the linker and the other substituent. Yes.
  • the sulfated polyrotaxane represented by the structural formula (1-A) to the structural formula (1-F) can be preferably produced by methods such as Production Examples 1 to 7 described later.
  • the produced sulfated polyrotaxane has a structure represented by the structural formula (1-A) to the structural formula (1-F) can be confirmed by various analysis methods selected as appropriate. For example, it can be confirmed by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy or infrared spectroscopy. The measurement values obtained by the analysis method may have some errors. However, those skilled in the art will recognize that the sulfated polyrotaxane is represented by the structural formulas (1-A) to (1-F). Having the structure shown can be easily identified.
  • the content of the sulfated polyrotaxane in the bone morphogenetic factor stabilizing / holding agent, bone morphogenetic factor activator, and pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. 0.1 times to 100,000 times, preferably 10 times to 10,000 times, more preferably 1,000 times to 10,000 times, and more preferably 1,000 times to 5,5 times the total amount of forming factor. 000 times is particularly preferable.
  • the bone morphogenetic protein (hereinafter also referred to as BMP) is a substance exhibiting ectopic osteoinductive activity, acting on undifferentiated mesenchymal cells such as subcutaneous tissue and muscle tissue, and It is an active protein that differentiates differentiated mesenchymal cells into chondroblasts, osteoblasts and the like to form cartilage, bone and the like.
  • the bone formation factor is not particularly limited, and if it has a positive charge, it can form a complex with a sulfated polyrotaxane having a negative charge by electrostatic interaction.
  • the isoelectric point of the bone morphogenetic factor is not particularly limited as long as it has a positive charge and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 7.5 to 10.
  • the isoelectric point of BMP-2 is 8.3 to 8.5 (JM Wozney Prog. Growth Factor Res. 1989, 1, 267-280), and it has a positive charge in a physiological environment. Have.
  • the osteogenic factor is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • osteogenic factor-2 BMP-2
  • osteogenic factor-3 BMP-4
  • Bone formation factor-6 BMP-7
  • bone formation factor-8a bone formation factor-8b
  • bone formation factor-9 bone formation factor-10
  • bone formation factor-11 Bone formation factor-15
  • bone formation factor heterodimer consisting of bone formation factor-2 and bone formation factor-6 bone formation factor heterodimer consisting of bone formation factor-2 and bone formation factor-7
  • bone formation factor-4 And an osteogenic factor heterodimer consisting of osteogenic factor-7
  • OIF Oloductive factor
  • osteogenic factor-like protein and the like These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • a bone morphogenetic heterodimer consisting of bone morphogenetic factor-2; bone morphogenetic factor-4; bone morphogenetic factor-7; bone morphogenetic factor-2 and bone morphogenetic factor-6 is preferable.
  • Forming factor-7 is more preferred.
  • the osteogenic factor include J. Biol. Chem. , 264, 13377, 1989, Japanese National Publication No. 2-5000241, Japanese National Publication No. 3-505098, Japanese National Publication No. 4-502336, Japanese National Publication No. 4-505151, Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-84081 JP-A-5-85939, for example.
  • the biological species of the bone morphogenetic factor is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • human, cow, mouse, rat, rabbit, horse, dog, cat, pig, sheep, goat, Examples include monkeys and hamsters. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • a well-known method can be selected suitably, For example, the genetic engineering method using mammalian cells, such as an ovary origin cell of Chinese hamster; be able to.
  • osteogenic factor activator examples include osteoblasts, chondroblasts, cementoblasts, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, periodontal ligament-derived cells, and the like.
  • the content of the bone morphogenetic factor is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the other components are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples thereof include pharmaceutically acceptable carriers.
  • carrier There is no restriction
  • content of the said other component According to the objective, it can select suitably.
  • ⁇ Form> There is no restriction
  • the beads are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include styrene beads, melamine beads, acrylic beads, acrylic-styrene beads, polycarbonate beads, and polyethylene beads.
  • porous body there is no restriction
  • a support such as the sheet, the beads, and the porous body in a container, immersing the support in a solution containing a sulfated polyrotaxane, and adding a bone formation factor to the support, the bone The formation factor can be kept stable for a long time.
  • the form of the bone morphogenetic activator is not particularly limited and can be appropriately selected depending on, for example, a desired method of action as described below. For example, an injection (solution, suspension, application) And solubilizing solid preparations) and inhaled powders.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic, and the like are added to the bone morphogenetic agent activator, and used for subcutaneous and intramuscular use by a conventional method. Injectables for intravenous use can be produced.
  • the pH adjusting agent and the buffering agent include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid, and the like.
  • the isotonic agent include sodium chloride and glucose.
  • the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • ⁇ Action> There are no particular limitations on the method of causing the osteogenic factor activator and the pharmaceutical composition to act. For example, depending on the form of the osteogenic factor activator and the pharmaceutical composition, the patient's condition, etc. Either action or systemic action can be selected. For example, local effects include, for example, reconstruction of bone defects by excision of the tumor, bone augmentation treatment for cleft lip and palate patients, bone augmentation treatment for alveolar bone atrophy before dental implant placement, skull defect Bone augmentation treatment to the part.
  • the target of the bone morphogenetic activator and the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • human, mouse, rat, cow, pig, monkey, dog, Examples include cats.
  • the amount of action of the osteogenic factor activator and the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the action form, the age and weight of the action target, the degree of desired effect, and the like.
  • the bone morphogenetic factor stabilizing / retaining agent for example, since the sulfated polyrotaxane can stably retain the bone morphogenetic factor, it is preferably used for storage of bone morphogenetic factor, column for column chromatography, etc. Can do.
  • the bone morphogenetic agent activator since the sulfated polyrotaxane can activate the bone morphogenetic factor, it can be suitably used for pharmaceutical use, for example.
  • the bone morphogenetic factor can be stably retained by forming a complex of the bone morphogenetic factor and the sulfated polyrotaxane.
  • the conditions for forming the complex of the bone morphogenetic factor and the sulfated polyrotaxane are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the bone morphogenetic factor can be activated by forming a complex of the bone morphogenetic factor and the sulfated polyrotaxane.
  • the conditions for forming the complex of the bone morphogenetic factor and the sulfated polyrotaxane are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a bone since a bone can be regenerated by forming a complex of the bone morphogenetic factor and the sulfated polyrotaxane and embedding it in a bone defect part, it is suitable for, for example, pharmaceutical use. Can be used.
  • the pharmaceutical composition comprises a bone morphogenetic protein, a cyclic molecule having a sulfate group, and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule.
  • a pharmaceutical composition for use in bone regeneration relates to a sulfated polyrotaxane having a bone morphogenetic protein, a cyclic molecule having a sulfate group, and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule in the manufacture of a medicament for use in bone regeneration. Also related to the use of the complex.
  • the present invention also relates to a method for regenerating bone, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the form of the pharmaceutical composition can take various forms as described above, but considering the embedding in the bone defect part, the form of the porous body is preferable.
  • a porous body such as a collagen sponge containing bone morphogenetic protein and sulfated polyrotaxane is also included in the pharmaceutical composition.
  • Such a porous body can be used as an implant for bone regeneration.
  • the ratio of the bone morphogenetic protein to the sulfated polyrotaxane in the porous body is not particularly limited, and is, for example, an arbitrary ratio between 1: 1,000,000 and 1: 1 by mass ratio.
  • the mass ratio is 1: 1,000 or more, 1: 5,000. More preferably, 1: 10,000 or more, for example, 1: 5,000 to 1: 15,000, particularly 1: 10,000.
  • n represents the number of repeating units of polyethylene glycol (in the above compound, since three repeating units of polyethylene glycol are described in parentheses, “n / 3” and Listed).
  • CE group A carboxyethyl group (hereinafter also referred to as “CE group”) was introduced into ⁇ -CD of PRX as described below to obtain a water-soluble polyrotaxane (hereinafter also referred to as “CE-PRX”).
  • 150 mg of the PRX was weighed and dissolved in 10 mL of dehydrated pyridine (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.).
  • 100 mg of succinic anhydride manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • 116 mg of CE-PRX as an intermediate product was obtained by drying under reduced pressure.
  • FIG. 1 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of the obtained CE-PRX measured in heavy water at 500 MHz. From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that CE-PRX has a structure represented by the following structural formula (2). Further, the average number of penetrations of ⁇ -CD per molecule of CE-PRX is 29, the average number of modifications of CE groups per molecule of CE-PRX is 77, the average number of modifications of CE groups per molecule of ⁇ -CD is 2.6, The number average molecular weight of CE-PRX was 36,900.
  • “n” represents the number of polyethylene glycol repeating units (in the structural formula (2), three repeating units of polyethylene glycol are described in parentheses. n / 3 ").
  • ⁇ -cyclodextrin is represented by the following formula (2-A), and only one ⁇ -cyclodextrin is described in the structural formula (2).
  • a structural unit derived from ethyl sulfonic acid (2-aminoethyl sulfonic acid) is introduced into the carboxyethyl group of CE-PRX as follows, and the sulfuric acid group is referred to as an ethyl sulfonic acid group (hereinafter referred to as “SO 3 group”).
  • SO 3 group ethyl sulfonic acid group
  • SO 3 -PRX-1 Water-soluble sulfated polyrotaxane-1
  • reaction Formula 6 2-aminoethylsulfonic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and 2.04 g of DMT-MM were added, and the mixture was stirred and reacted at room temperature for 24 hours as shown in the following reaction formula 6. After the reaction, the solution was added to a dialysis membrane having a molecular weight cut-off of 3,500 (trade name: Spectra Labor 6, manufactured by Spectrum) and dialyzed against ultrapure water for 3 days. The obtained solution was freeze-dried to obtain 152 mg of SO 3 -PRX-1. (Reaction Formula 6)
  • FIG. 2 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of the SO 3 -PRX-1 measured at 500 MHz in heavy water.
  • the average number of penetrations of ⁇ -CD per molecule of SO 3 -PRX is 29, the number of modifications of SO 3 groups per molecule of SO 3 -PRX is 26.1, and modification of SO 3 groups per molecule of ⁇ -CD The number was 0.901, and the number average molecular weight of SO 3 -PRX was 36,900. From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that SO 3 -PRX-1 has a structure represented by the following structural formula (1-A) and has the composition shown in Table 1.
  • n represents the number of polyethylene glycol repeating units (in the structural formula (1-A), three repeating units of polyethylene glycol are described in parentheses). Therefore, it is described as “n / 3”).
  • ⁇ -CD is represented by the following formula (A), and only one is shown in the structural formula (1-A).
  • FIG. 3 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of SO 3 -PRX-2
  • FIG. 4 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of SO 3 -PRX-3. From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that SO 3 -PRX-2 and SO 3 -PRX-3 have the structure represented by the structural formula (1-A) and have the compositions shown in Table 1. It was.
  • linear molecules 20 g of polyethylene glycol, 1.53 g of 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., hereinafter also referred to as “TEMPO”), sodium bromide ( 1.6 g of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was weighed and dissolved in 200 mL of ultrapure water. 40 mL of sodium hypochlorite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the obtained solution. After adjusting the pH of the solution to 11 using an aqueous sodium hydroxide solution, the solution was stirred and reacted at room temperature for 1 hour as shown in the following reaction formula 7.
  • TEMPO 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl
  • reaction Formula 7 After 10 mL of methanol was added to the reaction solution to stop the reaction, hydrochloric acid was added to adjust the pH of the solution to 2. Next, extraction was performed by adding 200 mL of dichloromethane (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.). After two extractions with dichloromethane, the solution was added in portions to diethyl ether for reprecipitation. The obtained precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 18.09 g of PEG-COOH. (Reaction Formula 7)
  • reaction Formula 8 20 g of the ⁇ -CD was weighed out and added to a wide-mouth bottle, and dissolved in 138 mL of ultrapure water. 2 g of the PEG-COOH was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours as shown in the following reaction formula 8. After the reaction, the resulting precipitate was collected by centrifugation. The recovered precipitate was freeze-dried to obtain 14.79 g of pseudo-PRX-COOH. (Reaction Formula 8)
  • reaction formula 9 (hereinafter also referred to as “DIPEA”) was added. As shown in the following reaction formula 9, the reaction was allowed to stir at room temperature for 24 hours. After the reaction, the resulting precipitate was collected by centrifugation. The precipitate was washed in order of methanol and ultrapure water to remove unreacted substances. Further, the precipitate was dissolved in dimethyl sulfoxide and re-precipitated by adding dropwise to ultrapure water. The reprecipitation was repeated 4 times for purification. A small amount of ultrapure water was added to the collected precipitate and freeze-dried to obtain 7.34 g of polyrotaxane (hereinafter also referred to as “PRX”). (Reaction Formula 9)
  • a sulfopropyl group (hereinafter also referred to as “SPE group”) was introduced into ⁇ -CD of the PRX as follows to obtain SO 3 -PRX-5.
  • 250 mg of the PRX was weighed and dissolved in 10 mL of a 1N aqueous sodium hydroxide solution (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.).
  • 2.45 g of 3-bromopropylsulfonic acid sodium salt manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours as shown in the following reaction formula 10.
  • the reaction solution was dropped into diethyl ether and reprecipitated, and the resulting precipitate was collected by filtration.
  • reaction Formula 10 After the reaction, the solution was added to a dialysis membrane having a molecular weight cut-off of 3,500 (trade name: Spectra Labor 6, manufactured by Spectrum) and dialyzed against ultrapure water for 3 days. The resulting solution was lyophilized to obtain 213 mg of SO 3 -PRX-5. (Reaction Formula 10)
  • FIG. 6 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of SO 3 -PRX-5 measured in heavy water at 500 MHz.
  • the average number of penetrations of ⁇ -CD per molecule of SO 3 -PRX-5 is 28.6, and the average number of modifications of SO 3 groups per molecule of SO 3 -PRX-5 is 27.8,
  • the average modification number of SO 3 groups per ⁇ -CD molecule was 0.97, and the number average molecular weight of SO 3 -PRX-5 was 36,900. From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it was confirmed that SO 3 -PRX-5 had a structure represented by the following structural formula (1-F) and had the composition shown in Table 2.
  • n indicates the number of repeating units of polyethylene glycol (in the structural formula (1-F), three repeating units of polyethylene glycol are described in parentheses). Therefore, it is described as “n / 3”).
  • ⁇ -CD is represented by the following formula (F), and only one is represented in the structural formula (1-F).
  • Production Example 6 and Production Example 7 Production of sulfated polyrotaxane-6 and sulfated polyrotaxane-7) Same as Production Example 5 except that polyethylene glycol (manufactured by Sigma-Aldrich, number average molecular weight: 4,500) was changed to polyethylene glycol (manufactured by Polyscience, number average molecular weight: 2,200) in Production Example 5. Thus, SO 3 -PRX-6 was obtained.
  • Production Example 5 was the same as Production Example 5 except that polyethylene glycol (Sigma-Aldrich, number average molecular weight: 4,500) was changed to polyethylene glycol (Sigma-Aldrich, number average molecular weight: 9,800). Similarly, SO 3 -PRX-7 was obtained.
  • FIG. 7 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of SO 3 -PRX-6
  • FIG. 8 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum chart of SO 3 -PRX-7. From the proton nuclear magnetic resonance spectrum, it is confirmed that SO 3 -PRX-6 and SO 3 -PRX-7 have the structure represented by the structural formula (1-F) and have the composition shown in Table 2. It was done.
  • Mouse skull-derived osteoblast-like cells obtained from RIKEN CELL BANK, hereinafter referred to as “MC3T3-E1 cells” were seeded in a 24-well plate at 1.0 ⁇ 10 5 cells / well. 24 hours later, human recombinant BMP-2 100 ng / mL (manufactured by HUMANZYME) and the following sample were added to the 24-well plate at 37 ° C. using phosphate buffered saline (hereinafter also referred to as “PBS”) as a diluted solution. The solution brought into contact with for 2 hours was added dropwise.
  • PBS phosphate buffered saline
  • ALP alkaline phosphatase
  • the protein extraction amount measured the light absorbency of 560 nm with the plate reader using brand name: Micro BCA Protein Kit (made by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), and quantified the total protein.
  • BMP-2 100ng / mL alone was used, and the BMP-2 ALP activity amount (ALP production amount (nmol) / total protein amount ( ⁇ g)) was set to 1. Each ALP activity amount (fold) with respect to the ALP activity amount was calculated. The results are shown in FIG.
  • Test Example 2 Alkaline phosphatase staining test
  • naphthol AS-MX phosphate manufactured by Sigma-Aldrich
  • red violet LB salt manufactured by Sigma-Aldrich
  • Test Example 3 Alkaline Phosphatase Activation Test Using Sulfated Polyrotaxanes with Various Structures
  • the amount of ALP activity was quantified in the same manner as in Test Example 1 except that the sample used in Test Example 1 was changed to the following sample.
  • each ALP activity amount (fold) with respect to the ALP activity amount of BMP-2 when the BLP-2 ALP activity amount (ALP production amount (nmol) / total protein amount ( ⁇ g)) was 1. ) was calculated. The results are shown in FIG.
  • Test Example 4 Alkaline phosphatase activation test when the content of BMP-2 was changed
  • the amount of ALP activity was quantified in the same manner as in Test Example 1 except that the content of BMP-2 was changed as in the following sample. The results are shown in FIG.
  • the sample containing sulfated polyrotaxane has enhanced ALP activity compared to the sample of BMP-2 alone.
  • the ALP activity of BMP-2 50 ng / mL and BMP-2 25 ng / mL + SO 3 -PRX-1 1,000 ⁇ g / mL was equivalent, BMP- in bone regeneration by adding sulfated polyrotaxane It was suggested that the usage-amount of 2 can be reduced.
  • the binding rate between BMP-2 and BMP-2 antibody can be evaluated based on the rate of decrease in absorbance of each sample when the detected absorbance of BMP-2 alone is 100%.
  • Test Example 6 Evaluation of growth factor activity in the presence of BMP-2 inhibitor
  • the amount of ALP activity in the presence of Noggin, a BMP-2 inhibitor was quantified.
  • the ALP activity was evaluated in the same manner as in Test Example 1, and the relative value was calculated when the amount of ALP produced in the Noggin-free group was 100%.
  • the amount of ALP produced decreased in a Noggin concentration-dependent manner by adding Noggin having a BMP-2 inhibitory action to the medium.
  • the complex of SO 3 -PRX and BMP-2 shows that the amount of ALP produced when Noggin is added is higher than that of the complex of heparin and BMP-2. This result shows that SO 3 -PRX can inhibit the interaction between BMP-2 and Noggin.
  • MC3T3-E1 cells obtained from RIKEN CELL BANK were used to evaluate the cytotoxicity of sulfated polyrotaxane as follows.
  • the MC3T3-E1 cells were seeded in a 96-well plate (number of cells: 1 ⁇ 10 4 cells / 90 ⁇ L / well), Eagle's minimum essential medium (Sigma-) containing 10% fetal bovine serum (manufactured by Fetal Bovine Serum, Gibco). And cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • plasma solution antithrombin III solution: buffer was mixed at a volume ratio of 1: 1: 8 to prepare a test solution.
  • the test solution and SO 3 -PRX-1 adjusted to each concentration or heparin adjusted to each concentration were mixed at a volume ratio of 9: 1, and 50 ⁇ L was added to each well of a 96-well plate. 25 ⁇ L of factor Xa solution was added to each well and heated at 37 ° C. for 30 seconds. 50 ⁇ L of the substrate solution was added to each well and allowed to stand at 37 ° C. for 3 minutes.
  • heparin gradually decreased factor Xa activity from a concentration of 0.1 ⁇ g / mL or more, suggesting that it has an anticoagulant action.
  • sulfated polyrotaxane SO 3 -PRX-1
  • SO 3 -PRX-1 did not show an anticoagulant effect because the factor Xa activity did not decrease even at a concentration of 1,000 ⁇ g / mL. That is, it can be said that a sulfated polyrotaxane that does not exhibit an anticoagulant action is superior to heparin in in vivo safety.
  • MC3T3-E1 cells obtained from RIKEN CELL BANK were seeded in 24-well plates at 1.0 ⁇ 10 5 cells / well. After 24 hours, the medium was replaced with a differentiation induction medium supplemented with 10 mM ⁇ -glycerophosphate (Sigma-Aldrich) and 50 ⁇ g / mL ascorbic acid (Sigma-Aldrich). A solution prepared by bringing PBS into contact with the following sample at 37 ° C. for 2 hours was dropped onto the 24-well plate. The medium and the BMP-2 solution were exchanged once every 3 days and cultured for 21 days.
  • Test Example 10 Alkaline phosphatase activation test
  • the amount of ALP activity was quantified in the same manner as in Test Example 1, except that the sample used was changed to the following sample.
  • Each ALP activity amount (ALP production amount (nmol) / total protein amount ( ⁇ g)) was calculated. The results are shown in FIG.
  • mice Five-week-old male ICR mice (purchased from Sankyo Lab Service Co., Ltd.) are mixed with three types of mixed anesthetics (Dmitor (0.75 mg / kg), Midazolam (4 mg / kg), Betolfal (5 mg / kg) in physiological saline. Solution) was administered subcutaneously in an amount of 10 mL / kg. Next, the planned incision on the parietal region of the experimental mouse was shaved. A skin incision of about 1 cm was made in a direction parallel to the sagittal suture on the slightly right side of the sagittal suture equivalent portion as viewed from the back.
  • a hole having the same shape was formed in the left skull as viewed from the back.
  • the sample for embedding was embedded in the defect part.
  • the skin incision was sutured using 4-0 silk thread (trade name: sterilized brate silk, manufactured by Akiyama Seisakusho Co., Ltd.).
  • 10 mL / kg of a medetomidine antagonist (a solution obtained by diluting antisedan (0.75 mg / kg) with physiological saline) was subcutaneously administered to prepare a sample implantation operation.
  • FIG. 19A to FIG. 19B show the results of X-ray micro CT imaging over time after implantation sample implantation.
  • 10 ng of BMP-2 implantation sample (2) in addition to BMP-2, 100 ⁇ g of SO 3 -PRX-5, SO 3 -PRX-6, or SO 3 -PRX-7 was added and transplanted In the embedded sample (4), (5), or embedded sample (6), remarkable bone formation at the defect was confirmed after 14 days.
  • the BMP-2 10 ng + SO 3 -PRX-6 transplantation group (embedding sample (5)) showed the same bone formation as the BMP-2 50 ng transplantation group (embedding sample (7)).
  • the BMP-2 50 ng transplantation group (embedding sample (7)) confirmed bone formation occupying the entire defect after 28 days
  • the BMP-2 50 ng + SO 3 -PRX-5 transplantation group (implantation) In the sample (9)
  • bone formation occupying the entire defect was confirmed after 14 days. From the above, it was suggested that the addition of sulfated polyrotaxane can reduce the concentration of BMP-2 and enable early bone formation.
  • Test Example 12 Blood biochemical examination of mice administered with sulfated polyrotaxane
  • a sample equivalent to the amount of the sample embedded in the transplantation experiment was subcutaneously administered to mice, and the toxicity to the liver and kidney, which are the main metabolic and excretory tissues, was examined.
  • the following samples were subcutaneously administered to 5-week-old male ICR mice (purchased from Sankyo Lab Service Co., Ltd.). After 24 hours, blood was collected from the mice and plasma was prepared.
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • BUN blood urea nitrogen
  • CR creatinine
  • 20A to 20D show the AST, ALT, BUN, and CR concentrations in the blood of mice after 24 hours have elapsed after each sample was administered.
  • concentrations of AST, ALT, BUN, and CR in the group administered with heparin and each sulfated polyrotaxane were not significantly different from those in the saline-administered group, and each sulfated polyrotaxane was not toxic to the liver or kidney. It has been suggested.
  • sulfated polyrotaxane can form a complex with an osteogenic factor and stably retain the osteogenic factor. Moreover, it turned out that sulfated polyrotaxane can form a complex with an osteogenic factor and activate the osteogenic factor.
  • Examples of the aspect of the present invention include the following. ⁇ 1> containing a sulfated polyrotaxane having a cyclic molecule having a sulfate group and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule, An osteogenesis factor stability-retaining agent characterized by stably retaining an osteogenesis factor. ⁇ 2> containing a sulfated polyrotaxane having a cyclic molecule having a sulfate group and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule, It is an osteogenesis factor activator characterized by activating an osteogenesis factor.
  • ⁇ 3> The osteogenic factor activator according to ⁇ 2>, wherein the osteogenic factor is osteogenic factor-2.
  • the cyclic molecule in the sulfated polyrotaxane is ⁇ -cyclodextrin,
  • sulfated polyrotaxane according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 4>, wherein the sulfated polyrotaxane is at least one of a compound represented by the following general formula (I) and a compound represented by the following general formula (III): It is an osteogenic factor activator.
  • the cyclic molecule is represented by the following general formula (II), and the average number of penetrating cyclic molecules per sulfated polyrotaxane molecule is 10 to 1,000, n represents an integer of 10 to 25,000)
  • Y shows at least any one of P and Q, and P is an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a benzyl group, an ethylene glycol group, a triethylene glycol group.
  • ⁇ 7> The above ⁇ 2> to ⁇ 6>, wherein an average number of sulfate groups in the cyclic molecule of the sulfated polyrotaxane is 0.5 to 1 with respect to one molecule of the sulfated polyrotaxane cyclic molecule. It is the described osteogenic factor activator.
  • ⁇ 8> The bone morphogenetic factor activator according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 7>, wherein the content of the sulfated polyrotaxane is 1,000 to 10,000 times the total amount of bone morphogenetic factor. It is.
  • Bone formation by allowing a bone morphogenetic agent to act on a bone morphogenetic factor stable retention agent having at least a sulfated polyrotaxane having a cyclic molecule having a sulfate group and a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule.
  • a method for stably retaining an osteogenesis factor wherein the factor is stably retained by an osteogenesis factor stabilizing / retaining agent.
  • a bone morphogenetic agent is allowed to act on a bone morphogenetic agent activator containing at least a cyclic molecule having a sulfate group and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule.
  • An activation method of a bone morphogenetic factor characterized by activating a morphogenetic factor.
  • a pharmaceutical composition comprising a bone morphogenetic protein, a cyclic molecule having a sulfate group, and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through a hollow portion of the cyclic molecule.
  • ⁇ 12> a bone morphogenetic protein, a cyclic molecule having a sulfate group, and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule.
  • ⁇ 13> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 11> to ⁇ 12>, wherein the bone morphogenetic protein is at least one of BMP-2 protein and BMP-7 protein.
  • ⁇ 14> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 11> to ⁇ 13>, wherein the bone morphogenetic protein and the sulfated polyrotaxane are infiltrated in a collagen sponge. .
  • ⁇ 15> A complex of a bone morphogenetic protein, a cyclic molecule having a sulfate group, and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through the hollow portion of the cyclic molecule in the manufacture of a medicament for use in bone regeneration Is the use of.
  • ⁇ 16> A method for regenerating bone in a subject, Administering a composition containing a bone morphogenetic protein, a cyclic molecule having a sulfate group, and a sulfated polyrotaxane having a linear molecule penetrating through a hollow portion of the cyclic molecule to the subject. It is a method.
  • the bone morphogenetic factor stable retention agent and the bone morphogenetic factor stability retention method of the present invention since it contains a sulfated polyrotaxane, the bone morphogenetic factor can be stably retained. It can be suitably used for a column such as chromatography. Further, in the bone morphogenetic agent activator and the bone morphogenetic factor activation method of the present invention, since the bone morphogenetic factor can be activated by containing a sulfated polyrotaxane, the drug efficacy is sustained and the amount of action is increased. Reduction of the number of actions is also expected.

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Abstract

　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、骨形成因子を安定に保持する骨形成因子安定保持剤、及び硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、骨形成因子を活性化する骨形成因子活性化剤である。

Description

骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子の活性化方法、医薬組成物、複合体の使用、及び骨の再生方法
　本発明は、骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子の活性化方法、医薬組成物、複合体の使用、及び骨の再生方法に関する。
　従来より、骨再生分野では、移植骨の代替品としてポリ乳酸やβ－リン酸三カルシウム等の骨代替材料の利用が検討されている。しかし、前記ポリ乳酸は、強い免疫反応や炎症反応を惹起する場合があるという問題があり、また、前記β－リン酸三カルシウムは、無機材料であるために生体内吸収されずに停滞するといった問題があり、広範囲の骨再生技術の確立には至っていないのが現状である。
　骨形成を促進する成長因子である骨形成因子－２（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－２、以下、「ＢＭＰ－２」ともいう。）は、強力に骨の形成を誘導することが知られており、近年、広く注目されている。しかし、前記ＢＭＰ－２は、生体環境下において分解及び失活が早く、非常に不安定であるという問題がある。また、前記ＢＭＰ－２は、広範囲の骨を再生させるには数ヶ月といった長期間を要するため、活性を維持するために多量のＢＭＰ－２を継続的に投与する必要がある。しかし、前記ＢＭＰ－２を多量に投与すると生体内で炎症作用や過剰反応により異常な骨が形成されるという問題が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
　そのため、前記問題を解決するために、生体内環境下におけるＢＭＰ－２の不活性化を抑制し、ＢＭＰ－２による分化誘導効率に優れる、ＢＭＰ－２に硫酸化多糖類であるヘパリンを添加し、ＢＭＰ－２／ヘパリン静電複合体を形成させるＢＭＰ－２の活性維持方法が提案されている（例えば、非特許文献２、非特許文献３、及び特許文献１参照）。
　しかしながら、前記提案は、ヘパリンが抗凝固作用を有するため臨床応用することは困難であるという問題がある。
　したがって、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性に優れ、かつ骨形成因子との複合体形成作用に優れる、骨形成因子を生体内で安定に保持することができる骨形成因子安定保持剤及び骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子を活性化することができる骨形成因子活性化剤及び骨形成因子の活性化方法、骨を再生することができる医薬組成物、複合体の使用、並びに骨の再生方法の提供が強く望まれている。
特開２００８－７４７３２号公報
Ｚａｒａ　ＪＮ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ．　Ｐａｒｔ　Ａ，１７（９－１０），１３８９－１３９９（２０１１） Ｔａｋａｄａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２７８（４４），４３２２９－４３２３５（２００３） Ｚｈａｏ　Ｂ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２８１（３２），２３２４６－２３２５３（２００６）
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性に優れ、かつ骨形成因子との複合体形成作用に優れる、骨形成因子を生体内で安定に保持することができる骨形成因子安定保持剤及び骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子を活性化することができる骨形成因子活性化剤及び骨形成因子の活性化方法、骨を再生することができる医薬組成物、複合体の使用、並びに骨の再生方法を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、
　＜１＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
　骨形成因子を安定に保持することを特徴とする骨形成因子安定保持剤である。
　＜２＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
　骨形成因子を活性化することを特徴とする骨形成因子活性化剤である。
　＜３＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも有する骨形成因子安定保持剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を骨形成因子安定保持剤に安定に保持させることを特徴とする骨形成因子の安定保持方法である。
　＜４＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも含有する骨形成因子活性化剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を活性化させることを特徴とする骨形成因子の活性化方法である。
　＜５＞　骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとを含有する、医薬組成物、特に、骨の再生に用いるための医薬組成物である。
　＜６＞　骨の再生に用いるための医薬品の製造における、骨形成因子と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとの複合体の使用である。
　＜７＞　対象における骨の再生方法であって、
　前記対象に骨形成因子と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンと、を含有する組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、方法である。
　本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性に優れ、かつ骨形成因子との複合体形成作用に優れる、骨形成因子を生体内で安定に保持することができる骨形成因子安定保持剤及び骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子を活性化することができる骨形成因子活性化剤及び骨形成因子の活性化方法、骨を再生することができる医薬組成物、複合体の使用、並びに骨の再生方法を提供することができる。
図１は、製造例１の中間生成物であるカルボキシエチル基で修飾されたポリロタキサン（以下、「ＣＥ－ＰＲＸ」ともいう）の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図２は、製造例１で得られた硫酸化ポリロタキサン－１の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図３は、製造例２で得られた硫酸化ポリロタキサン－２の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図４は、製造例３で得られた硫酸化ポリロタキサン－３の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図５は、製造例４で得られた硫酸化ポリロタキサン－４の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図６は、製造例５で得られた硫酸化ポリロタキサン－５の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図７は、製造例６で得られた硫酸化ポリロタキサン－６の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図８は、製造例７で得られた硫酸化ポリロタキサン－７の重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。 図９は、試験例１の相対ＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。 図１０は、試験例２のＡＬＰ活性量を測定したウエルの着色結果を示す図である。 図１１は、試験例３の相対ＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。 図１２は、試験例４のＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。 図１３は、試験例５のＢＭＰ－２抗体結合率の測定結果を示す図である。 図１４は、試験例６のＢＭＰ－２阻害剤添加時のＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。 図１５は、試験例７の細胞毒性の測定結果を示す図である。 図１６は、試験例８の硫酸化ポリロタキサンの抗凝固作用の測定結果を示す図である。 図１７Ａは、試験例９のＢＭＰ－２未添加による石灰化の評価結果を示す図である。 図１７Ｂは、試験例９のＢＭＰ－２添加による石灰化の評価結果を示す図である。 図１７Ｃは、試験例９のヘパリンとＢＭＰ－２複合体による石灰化の評価結果を示す図である。 図１７Ｄは、試験例９の硫酸化ポリロタキサンとＢＭＰ－２複合体による石灰化の評価結果を示す図である。 図１８は、試験例１０のＡＬＰ活性量の測定結果を示す図である。 図１９Ａは、試験例１１のＢＭＰ－２を１０ｎｇ投与した頭蓋骨欠損モデルマウスの頭蓋骨のエックス線マイクロＣＴによる撮影画像を示す図である。 図１９Ｂは、試験例１１のＢＭＰ－２を５０ｎｇ投与した頭蓋骨欠損モデルマウスの頭蓋骨のエックス線マイクロＣＴによる撮影画像を示す図である。 図２０Ａは、試験例１２の硫酸化ポリロタキサンを投与したマウスにおける肝臓及び腎臓に対する毒性を調べたＡＳＴの結果を示す図である。 図２０Ｂは、試験例１２の硫酸化ポリロタキサンを投与したマウスにおける肝臓及び腎臓に対する毒性を調べたＡＬＴの結果を示す図である。 図２０Ｃは、試験例１２の硫酸化ポリロタキサンを投与したマウスにおける肝臓及び腎臓に対する毒性を調べたＢＵＮの結果を示す図である。 図２０Ｄは、試験例１２の硫酸化ポリロタキサンを投与したマウスにおける肝臓及び腎臓に対する毒性を調べたＣＲの結果を示す図である。
（骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子の活性化方法、医薬組成物、複合体の使用、及び骨の再生方法）
　本発明の骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、骨形成因子の安定保持方法、骨形成因子の活性化方法、医薬組成物、複合体の使用、及び骨の再生方法は、硫酸化ポリロタキサン、及び骨形成因子を含有し、必要に応じてさらにその他の成分を含む。
　本発明者らは、以下のことを知見した。
　前記課題は、プラスの電荷を帯びる骨形成因子と、マイナスの電荷を帯びるヘパリンとが静電相互作用により複合体を形成することから、へパリンと同様の化学構造である硫酸基を環状分子に有することによりマイナスの電荷を帯びる硫酸化ポリロタキサンを含有することで、前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成することができることを知見した。
　また、前記硫酸化ポリロタキサンは、前記硫酸基を有する環状分子と、前記環状分子の中空部を貫通する線状分子とを有するため、前記硫酸基を有する環状分子の自由度が高く、前記環状分子が前記線状分子上を移動することができるため、ヘパリンのような硫酸基の修飾位置が固定されている化合物と比較して、骨形成因子との複合体形成時の立体障害を緩和することで強く相互作用し、骨形成因子を生体内で安定に保持することができ、かつ骨形成因子を活性化することができることを知見した。
＜硫酸化ポリロタキサン＞
　前記硫酸化ポリロタキサン（以下、「ＳＯ３－ＰＲＸ」ともいう）は、細胞毒性が少なく、抗凝固作用がないなどの安全性、及び骨形成因子との複合体形成作用を向上させるために含有されている。
　前記硫酸化ポリロタキサンとしては、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。なお、硫酸化ポリロタキサンとは、環状分子に硫酸基が修飾したポリロタキサンをいう。
　前記硫酸化ポリロタキサンの数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２，０００～５００，０００が好ましく、１０，０００～１００，０００がより好ましい。なお、前記数平均分子量は、例えば、プロトン核磁気共鳴スペクトルから得られる化学組成から算出することができる。
－線状分子－
　前記線状分子としては、前記環状分子の中空部を貫通することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、線状分子の両端部に、前記環状分子が脱離しないように作用する封鎖基で修飾された構造を有する。なお、「線状分子」の「線状」とは、直鎖であることを意味するが、線状分子上で前記環状分子が移動することができれば、分岐鎖を有していてもよい。
　前記線状分子の両端部以外の構成の数平均分子量としては、特に制限はなく、目的とする硫酸化ポリロタキサンの数平均分子量や、貫通させる環状分子の数に応じて適宜選択することができるが、５００～１，０００，０００が好ましく、５００～１０，０００がより好ましく、５００～６，０００が特に好ましい。前記数平均分子量が、５００未満であると、貫通している環状分子の脱離が発生しやすく、また、前記環状分子の貫通数を制御することが困難となる傾向にあり、１，０００，０００を超えると、溶解性が低下し、前記環状分子の貫通数の制御が困難となる傾向にある。なお、前記数平均分子量は、例えば、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定やプロトン核磁気共鳴スペクトルから得られる化学組成から算出することができる。
　前記線状分子の両端部以外の構成としては、特に制限はなく、公知のポリロタキサンの構成を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロック共重合体、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのランダム共重合体、ポリメチルビニルエーテル、ポリエチレンイミンなどが挙げられる。
　前記線状分子の両端部以外の構成としては、市販品を用いてもよく、適宜合成したものを用いてもよい。
　前記線状分子の両端部以外の構成は、後述する環状分子との組合せに応じて適宜選択することが好ましく、例えば、前記環状分子がα－シクロデキストリンの場合には、ポリエチレングリコールとすることが好ましく、前記環状分子がβ－シクロデキストリンの場合には、ポリプロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体とすることが好ましい。
　前記線状分子の両端部の封鎖基としては、前記線状分子の両端をキャップして前記環状分子の脱離を防止することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ－ベンゾイルオキシカルボニル－Ｌ－チロシン；アミノ酸又はその誘導体；オリゴペプチド；蛍光分子などが挙げられる。これらの中でも、Ｎ－ベンゾイルオキシカルボニル－Ｌ－チロシンが好ましい。
　前記封鎖基を前記線状分子に結合させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
－環状分子－
　前記環状分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シクロデキストリン、クラウンエーテル、カリックスアレンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、シクロデキストリンが好ましい。
　前記シクロデキストリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、α－シクロデキストリンが好ましい。
　前記硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの前記線状分子に貫通されている前記環状分子の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均５個～１，０００個が好ましく、平均１０個～２００個がより好ましく、平均２０個～５０個が特に好ましい。
　前記環状分子としては、少なくとも硫酸基で修飾されている。前記硫酸基を有することにより、前記硫酸化ポリロタキサンがマイナスの電荷を帯びることができ、後述する骨形成因子と静電相互作用することができる。
　前記硫酸基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スルホン酸、エチルスルホン酸、プロピルスルホン酸、ブチルスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、スルファミン酸（アミド硫酸）等に由来する構造単位、及びこれらの塩に由来する構造単位などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、エチルスルホン酸に由来する構造単位が好ましい。
　前記硫酸基としては、生理的ｐＨ環境で脱プロトン化し、前記硫酸化ポリロタキサンをマイナスの電荷を帯びることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、環状分子に直接修飾されていてもよく、リンカー及び他の置換基の少なくともいずれかを介して修飾されていてもよく、リンカー及び他の置換基の少なくともいずれかの繰り返し構造を有していてもよい。これらの中でも、リンカー及び他の置換基を介して修飾されていることが好ましく、リンカー及び他の置換基の繰り返し構造を介して修飾されていることがより好ましい。なお、リンカー及び他の置換基の両方を有する場合、前記環状分子に結合する順は、特に制限はなく、リンカー、他の置換基の順であっても、他の置換基、リンカーの順であってもよい。
　前記リンカー及び前記他の置換基の少なくともいずれかの繰り返し数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０～２０が好ましく、０～１０がより好ましく、０～３が特に好ましい。
　前記リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）、アミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）、エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－）、カルボネート結合（－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－）、エーテル結合（－Ｏ－）などが挙げられる。
　前記他の置換基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基などが挙げられる。
　前記硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの硫酸基の修飾数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均１０個～４００個が好ましく、平均２０個～８０個がより好ましい。
　前記環状分子１分子あたりの硫酸基の修飾数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、平均０．１個～６個が好ましく、平均０．５個～３個がより好ましく、平均０．５個～１個が特に好ましい。
　前記環状分子を前記線状分子により貫通させる方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
　前記環状分子を硫酸基で修飾する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
　前記硫酸化ポリロタキサンの好ましい態様としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で示される化合物、下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物などが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　但し、前記一般式（Ｉ）中、前記環状分子が、下記一般式（ＩＩ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　但し、前記一般式（ＩＩ）中、Ｙは、Ｐ及びＱの少なくともいずれかを示し、Ｐは、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、又はポリエチレングリコール基を示し、Ｑは、カルバミン酸エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）、アミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）、エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－）、カルボネート結合（－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－）、又はエーテル結合（－Ｏ－）を示し、ｍは、０～２０の整数を示し、ｘは、１～６の整数を示し、Ｍは、水素原子、ナトリウム原子、又はカリウム原子を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　但し、前記一般式（ＩＩＩ）中、前記環状分子が、前記一般式（ＩＩ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
　前記一般式（Ｉ）で示される化合物である硫酸化ポリロタキサンのより好ましい態様としては、例えば、下記構造式（１－Ａ）～下記構造式（１－Ｅ）で示される硫酸化ポリロタキサンなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　但し、前記構造式（１－Ａ）中、前記環状分子が、下記式（Ａ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　但し、前記式（Ａ）中、ｘは、１～６の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　但し、前記構造式（１－Ｂ）中、前記環状分子が、下記式（Ｂ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　但し、前記式（Ｂ）中、ｘは、１～６の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　但し、前記構造式（１－Ｃ）中、前記環状分子が、下記式（Ｃ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　但し、前記式（Ｃ）中、ｘは、１～６の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　但し、前記構造式（１－Ｄ）中、前記環状分子が、下記式（Ｄ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　但し、前記式（Ｄ）中、ｘは、１～６の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　但し、前記構造式（１－Ｅ）中、前記環状分子が、下記式（Ｅ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　但し、前記式（Ｅ）中、ｘは、１～６の整数を示す。
　前記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物である硫酸化ポリロタキサンのより好ましい態様としては、例えば、下記構造式（１－Ｆ）で示される硫酸化ポリロタキサンなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　但し、前記構造式（１－Ｆ）中、前記環状分子が、下記式（Ｆ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　但し、前記式（Ｆ）中、ｘは、１～６の整数を示す。
　前記構造式（１－Ａ）～前記構造式（１－Ｆ）で示される硫酸化ポリロタキサンの線状分子は、ポリエチレングリコールであり、環状分子は、エチルスルホン酸を化学修飾したα－シクロデキストリンである。
　前記構造式（１－Ａ）～前記構造式（１－Ｆ）中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（ｎは、１０～２５，０００の整数）。なお、構造式（１－Ａ）～（１－Ｆ）では、括弧内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している。また、前記構造式（１－Ａ）～前記構造式（１－Ｆ）中、α－シクロデキストリンはそれぞれ前記式（Ａ）～（Ｆ）で示され、前記構造式（１－Ａ）～前記構造式（１－Ｆ）中では１個のみ記載している。
　また、前記式（Ａ）～（Ｆ）では、α－シクロデキストリンの一級ヒドロキシル基が、前記リンカー及び前記他の置換基の少なくともいずれかを介してエチルスルホン酸に由来する構造単位で修飾されている。なお、前記式（Ａ）～（Ｆ）では、前記置換基の修飾がｘ個（ｘ＝１～６）の場合を示している。
　前記構造式（１－Ａ）～前記構造式（１－Ｆ）で示される硫酸化ポリロタキサンは、後述する製造例１～７などの方法で好適に製造することができる。
　製造された硫酸化ポリロタキサンが、前記構造式（１－Ａ）～前記構造式（１－Ｆ）で示される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴分光法や赤外分光法により確認することができる。
　なお、前記分析方法による測定値には、多少の誤差が生じることがあるが、当業者であれば、前記硫酸化ポリロタキサンが前記構造式（１－Ａ）～前記構造式（１－Ｆ）で示される構造を有することは容易に同定することが可能である。
　本発明の骨形成因子安定保持剤、骨形成因子活性化剤、及び医薬組成物における前記硫酸化ポリロタキサンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、骨形成因子全量に対して、０．１倍～１００，０００倍が好ましく、１０倍～１０，０００倍がより好ましく、１，０００倍～１０，０００倍がさらに好ましく、１，０００倍～５，０００倍が特に好ましい。
＜骨形成因子＞
　前記骨形成因子（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、ＢＭＰともいう）は、異所性骨誘導活性を示す物質であり、皮下組織、筋組織内などの未分化間葉系細胞に作用して、前記未分化間葉系細胞を軟骨芽細胞、骨芽細胞などに分化させ、軟骨、骨などを形成させる活性タンパク質である。
　前記骨形成因子としては、特に制限はなく、プラスの電荷を有していれば、マイナスの電荷を有する硫酸化ポリロタキサンと静電相互作用により複合体を形成することができる。
　前記骨形成因子の等電点としては、プラスの電荷を有すれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７．５～１０が好ましい。なお、ＢＭＰ－２の等電点は、８．３～８．５（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｚｎｅｙ　Ｐｒｏｇ．　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ．　１９８９，　１，　２６７－２８０）であり、生理的環境下ではプラスの電荷を有する。
　前記骨形成因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨形成因子－２（ＢＭＰ－２）；骨形成因子－３；骨形成因子－４；骨形成因子－５；骨形成因子－６；骨形成因子－７（ＢＭＰ－７）；骨形成因子－８ａ；骨形成因子－８ｂ；骨形成因子－９；骨形成因子－１０；骨形成因子－１１；骨形成因子－１５；骨形成因子－２及び骨形成因子－６からなる骨形成因子ヘテロダイマー；骨形成因子－２及び骨形成因子－７からなる骨形成因子ヘテロダイマー；骨形成因子－４及び骨形成因子－７からなる骨形成因子ヘテロダイマー；ＯＩＦ（Ｏｓｔｅｒｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒ）；骨形成因子様タンパク質などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、骨形成因子－２；骨形成因子－４；骨形成因子－７；骨形成因子－２及び骨形成因子－６からなる骨形成因子ヘテロダイマーが好ましく、骨形成因子－２、骨形成因子－７がより好ましい。前記骨形成因子としては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２６４，　１３３７７，　１９８９、特表平２－５００２４１号公報、特表平３－５０５０９８号公報、特表平４－５０２３３６号公報、特表平４－５０５１５１号公報、特開平５－８４０８１号公報、特開平５－８５９３９号公報などに詳述されている。
－生物種―
　前記骨形成因子の生物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、ハムスターなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記骨形成因子の精製としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞等の哺乳類細胞；昆虫細胞などを使用した遺伝子工学的手法を用いることができる。
－細胞－
　前記骨形成因子活性化剤が用いられる細胞としては、例えば、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、歯根膜由来細胞などが挙げられる。
　前記骨形成因子の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、形態等に応じて適宜選択することができる。
　前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜形態＞
　前記骨形成因子安定保持剤の形態としては、特に制限はなく、例えば、シート、ビーズ、多孔質体などが挙げられる。
　前記シートとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不織布、フィルム、紙などが挙げられる。
　前記ビーズとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スチレンビーズ、メラミンビーズ、アクリルビーズ、アクリル－スチレンビーズ、ポリカーボネートビーズ、ポリエチレンビーズなどが挙げられる。
　前記多孔質体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スポンジ、ポリエステル多孔質体、ポリカーボネート多孔質体、ポリウレタン多孔質体などが挙げられる。
　前記シート、前記ビーズ、及び前記多孔質体等の支持体を容器に入れて、硫酸化ポリロタキサンを含有する溶液で前記支持体を浸し、前記支持体に骨形成因子を添加することで、前記骨形成因子を長期間安定に保持することができる。
　前記骨形成因子活性化剤の形態としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の作用させる方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、吸入散剤などが挙げられる。
　前記注射剤としては、例えば、前記骨形成因子活性化剤に、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
　前記ｐＨ調整剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
　前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
　前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
　前記医薬組成物の形態としては、特に制限はなく、例えば、シート、多孔質体などが挙げられる。
　前記シートとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不織布、フィルム、紙などが挙げられる。
　前記多孔質体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スポンジ、ポリエステル多孔質体、ポリカーボネート多孔質体、ポリウレタン多孔質体などが挙げられる。
＜作用＞
　前記骨形成因子活性化剤、及び医薬組成物を作用させる方法としては、特に制限はなく、例えば、前記骨形成因子活性化剤、及び医薬組成物の形態、患者の状態等に応じて、局所作用、全身作用のいずれかを選択することができる。例えば、局所作用としては、例えば、腫瘍切除等による骨欠損部の再建治療、唇顎口蓋裂患者への骨増生治療、歯科用インプラント埋入前の歯槽骨萎縮部への骨増生治療、頭蓋骨欠損部への骨増生治療などが挙げられる。
　前記骨形成因子活性化剤、及び医薬組成物の作用対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
　前記骨形成因子活性化剤、及び医薬組成物の作用量としては、特に制限はなく、作用形態や、作用対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
　前記骨形成因子活性化剤、及び医薬組成物の作用時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記骨形成因子活性化剤、及び医薬組成物の作用回数としては、特に制限はなく、作用対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
－用途－
　前記骨形成因子安定保持剤としては、例えば、前記硫酸化ポリロタキサンが骨形成因子を安定に保持することができるため、骨形成因子の保存用、カラムクロマトグラフィー等のカラム用などに好適に用いることができる。
　前記骨形成因子活性化剤としては、前記硫酸化ポリロタキサンが骨形成因子を活性化することができるため、例えば、医薬用などに好適に用いることができる。
　前記骨形成因子の安定保持方法としては、前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させることで、骨形成因子を安定に保持することができる。前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させる条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記骨形成因子の活性化方法としては、前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させることで、骨形成因子を活性化することができる。前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させる条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記医薬組成物としては、前記骨形成因子と前記硫酸化ポリロタキサンとの複合体を形成させ、骨欠損部に埋入させることで、骨を再生することができるため、例えば、医薬用などに好適に用いることができる。
－医薬組成物－
　前記医薬組成物は、骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとを含有することを特徴とする医薬組成物であり、より詳細には、骨の再生に用いるための医薬組成物である。言い換えれば、本発明は、骨の再生に用いるための医薬品の製造における、骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとの複合体の使用にも関する。また、本発明は、対象に前記医薬組成物を投与する工程を含む、骨を再生するための方法にも関する。
　前記医薬組成物の形態としては、上記のように様々な形態をとりうるが、骨欠損部に埋入させることを考慮すると、多孔質体の形態とすることが好ましい。例えば、骨形成因子タンパク質と硫酸化ポリロタキサンとを含むコラーゲンスポンジなどの多孔質体も、前記医薬組成物に含まれる。このような多孔質体は、骨再生用のインプラントとして利用することができる。前記多孔質体中における、骨形成因子タンパク質と硫酸化ポリロタキサンとの比率は、特に制限はなく、例えば、質量比で１：１，０００，０００～１：１の間の任意の比率であることができ、環状分子１分子あたりの硫酸基の平均修飾数が約１（例えば０．９～１．１）の硫酸化ポリロタキサンの場合、質量比として１：１，０００以上、１：５，０００以上、もしくは１：１０，０００以上、例えば１：５，０００～１：１５，０００、特に１：１０，０００が好ましい。
　以下に製造例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例、及び試験例に何ら限定されるものではない。なお、下記反応式の化合物中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（前記化合物では、カッコ内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。
（製造例１：硫酸化ポリロタキサン－１の製造）
　線状分子として、ポリエチレングリコール（シグマ－アルドリッチ社製、数平均分子量：４，５００、以下、「ＰＥＧ」ともいう）を２０ｇ、１，１’－カルボニルイミダゾール（シグマ－アルドリッチ社製）を９．９４ｇ量り取り、ナス型フラスコへ加えた。テトラヒドロフラン（関東化学株式会社製）を２００ｍＬ加え溶解し、下記反応式１に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、ジエチルエーテルに反応溶液を滴下し、再沈殿させ、得られた沈殿物を濾過により回収した。前記再沈殿の操作を２回繰り返した後に、前記沈殿物を減圧乾燥することで、両端にカルボニルイミダゾールに由来する構造単位を有するＰＥＧ（以下、「ＰＥＧ－ＣＩ」ともいう）を１４．３ｇ得た。
（反応式１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　前記ＰＥＧ－ＣＩ　１３．３ｇをナス型フラスコへ加え、テトラヒドロフラン（関東化学株式会社製）を５０ｍＬ加え溶解した。エチレンジアミン（和光純薬工業株式会社）を１２．５ｍＬ滴下し、下記反応式２に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、ジエチルエーテルに反応溶液を滴下し、再沈殿させ、得られた沈殿物を濾過により回収した。前記再沈殿の操作を２回繰り返した後に、前記沈殿物を減圧乾燥することで両端に一級アミノ基を有するＰＥＧ（以下、「ＰＥＧ－ＮＨ２」ともいう）を１２．８ｇ得た。
（反応式２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　前記ＰＥＧ－ＮＨ２と、α－シクロデキストリン（商品名：デキシパールα－１００、塩水港精糖株式会社製、以下、「α－ＣＤ」ともいう）を用い、以下のようにして、擬ポリロタキサンを調製した。なお、下記α－ＣＤは、前記ＣＥ基の修飾数がｘ（ｘ＝１～６）の場合を示している。
　前記α－ＣＤを４．９２ｇ量り取り広口瓶に加え、超純水１７．２ｍＬに溶解した。前記ＰＥＧ－ＮＨ２を１．０５ｇ量り取り加え、下記反応式３に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。回収した沈殿物を凍結乾燥することで擬ポリロタキサン（以下、「擬ＰＲＸ」ともいう）を得た。
（反応式３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　前記擬ポリロタキサンの両端部を、以下のようにしてＮ－ベンゾイルオキシカルボニル－Ｌ－チロシン（シグマ－アルドリッチ社製）に由来する構造単位でキャッピングすることにより、複数のα－ＣＤを貫通させた線状分子の両端部に封鎖基を有するポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」ともいう）を得た。
　Ｎ－ベンゾイルオキシカルボニル－Ｌ－チロシンを３．２ｇ、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（和光純薬工業株式会社製）（以下、「ＤＭＴ－ＭＭ」ともいう）を２．７９ｇ量り取りスクリュー管に加え、メタノール１４０ｍＬに溶解した溶液を得た。前記擬ポリロタキサンに対して、前記溶液を加え、下記反応式４に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。メタノール、超純水の順で前記沈殿物を洗浄し、未反応物を除去した。さらに、前記沈殿物をジメチルスルホキシド（関東化学株式会社製）に溶解し、超純水に滴下することで再沈殿させた。前記再沈殿を３回繰り返すことで精製した。回収した沈殿物に少量の超純水を加え、凍結乾燥することでポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」ともいう）を３．６２ｇ得た。
（反応式４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　前記ＰＲＸのα－ＣＤにカルボキシエチル基（以下、「ＣＥ基」ともいう）を以下のようにして導入し、水溶性のポリロタキサン（以下、「ＣＥ－ＰＲＸ」ともいう）を得た。
　前記ＰＲＸを１５０ｍｇ量り取り、脱水ピリジン（関東化学株式会社製）１０ｍＬに溶解した。無水コハク酸（東京化成工業株式会社製）を１００ｍｇ加え、下記反応式５に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。反応後、ジエチルエーテルに反応液を滴下し、再沈殿させ、得られた沈殿物を濾過により回収した。再沈殿の操作を２回繰り返した後に、減圧乾燥することで中間生成物であるＣＥ－ＰＲＸを１１６ｍｇ得た。
（反応式５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　得られたＣＥ－ＰＲＸについて、重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図１に示す。プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＣＥ－ＰＲＸが下記構造式（２）で示される構造を有することが確認された。また、ＣＥ－ＰＲＸ１分子あたりのα－ＣＤの平均貫通数は２９、ＣＥ－ＰＲＸ１分子あたりのＣＥ基の修飾数は平均７７、α－ＣＤ１分子あたりのＣＥ基の修飾数は平均２．６、ＣＥ－ＰＲＸの数平均分子量は３６，９００であった。なお、下記構造式（２）中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（前記構造式（２）では、カッコ内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。また、前記構造式（２）中、α－シクロデキストリンは下記式（２－Ａ）で示され、前記構造式（２）中では１個のみ記載している。前記式（２－Ａ）では、前記ＣＥ基の修飾数がｘ（ｘ＝１～６）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　前記ＣＥ－ＰＲＸのカルボキシエチル基に以下のようにしてエチルスルホン酸（２－アミノエチルスルホン酸）に由来する構造単位を導入し、硫酸基をエチルスルホン酸基（以下、「ＳＯ３基」ともいう）として有する水溶性の硫酸化ポリロタキサン－１（以下、「ＳＯ３－ＰＲＸ－１」ともいう）を合成した。
　前記ＣＥ－ＰＲＸを１１６ｍｇ量り取り、超純水を１５ｍＬ加え、水酸化ナトリウム水溶液を添加し、溶液のｐＨを７に調整した。２－アミノエチルスルホン酸（東京化成工業株式会社製）を１４８ｍｇ、ＤＭＴ－ＭＭを２．０４ｇ加え、下記反応式６に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、溶液を分画分子量３，５００の透析膜（商品名：スペクトラボア６、スペクトラム社製）に加え、超純水に対し３日間透析を行った。得られた溶液を凍結乾燥することでＳＯ３－ＰＲＸ－１を１５２ｍｇ得た。
（反応式６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　前記ＳＯ３－ＰＲＸ－１について、重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図２に示す。なお、ＳＯ３－ＰＲＸ１分子あたりのα－ＣＤの平均貫通数は２９であり、ＳＯ３－ＰＲＸ１分子あたりのＳＯ３基の修飾数は２６．１、α－ＣＤ１分子あたりのＳＯ３基の修飾数は０．９０１、ＳＯ３－ＰＲＸの数平均分子量は３６，９００であった。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３－ＰＲＸ－１が下記構造式（１－Ａ）で示される構造を有し、表１に示す組成であることが確認された。なお、下記構造式（１－Ａ）中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（前記構造式（１－Ａ）では、カッコ内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。また、前記構造式（１－Ａ）中、α－ＣＤは下記式（Ａ）で示され、前記構造式（１－Ａ）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ａ）では、前記ＳＯ３基の修飾がｘ（ｘ＝１～６）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（製造例２、及び製造例３：硫酸化ポリロタキサン－２、及び硫酸化ポリロタキサン－３の製造）
　製造例１と同様にして、無水コハク酸、２－アミノエチルスルホン酸の添加量を変化させることでＳＯ３－ＰＲＸ１分子あたりのＳＯ３基の修飾数の異なる硫酸化ポリロタキサン－２（以下、「ＳＯ３－ＰＲＸ－２」ともいう）、及び硫酸化ポリロタキサン－３（以下、「ＳＯ３－ＰＲＸ－３」ともいう）を合成した。得られたＳＯ３－ＰＲＸ－２、及びＳＯ３－ＰＲＸ－３について、前記プロトン核磁気共鳴スペクトルを用いて、重水中で５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定した。ＳＯ３－ＰＲＸ－２のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図３、及びＳＯ３－ＰＲＸ－３のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図４に示す。前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３－ＰＲＸ－２、及びＳＯ３－ＰＲＸ－３が前記構造式（１－Ａ）で示される構造を有し、表１に示す組成であることが確認された。
（製造例４：硫酸化ポリロタキサン－４の製造）
　硫酸化ポリロタキサン－４（以下、「ＳＯ３－ＰＲＸ－４」ともいう）について、ＰＥＧを数平均分子量９，８００のポリエチレングリコール（シグマ－アルドリッチ社製）を軸ポリマーの原料として使用した以外は、製造例１と同様にして、ＳＯ３－ＰＲＸ－４を得た。
　得られたＳＯ３－ＰＲＸ－４について、前記プロトン核磁気共鳴装置を用いて、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルを重水中で測定した。ＳＯ３－ＰＲＸ－４のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図５に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３－ＰＲＸ－４が前記構造式（１－Ａ）で示される構造を有し、表１に示す組成であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
（製造例５：硫酸化ポリロタキサン－５の製造）
　硫酸化ポリロタキサン－５（以下、「ＳＯ３－ＰＲＸ－５」ともいう）について、数平均分子量４，５００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、シグマ－アルドリッチ社製）を軸ポリマーの原料として下記に従い合成した。
　線状分子として、ポリエチレングリコールを２０ｇ、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（東京化成工業株式会社製、以下、「ＴＥＭＰＯ」ともいう）を１．５３ｇ、臭化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を１．６ｇ量り取り、超純水２００ｍＬに溶解した。得られた溶液に次亜塩素酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を４０ｍＬ加えた。水酸化ナトリウム水溶液を用いて溶液のｐＨを１１に調製後、下記反応式７に示すように、溶液を１時間、室温で撹拌し反応させた。前記反応溶液に、メタノールを１０ｍＬ加え反応を停止した後に、塩酸を加え溶液のｐＨを２に調製した。次に、ジクロロメタン（関東化学社製）を２００ｍＬ加え、抽出を行った。ジクロロメタンによる抽出を２回行った後に、溶液をジエチルエーテルに少量ずつ加え再沈殿を行った。得られた沈殿物をろ過により回収し、減圧乾燥することでＰＥＧ－ＣＯＯＨを１８．０９ｇ得た。
（反応式７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　前記α－ＣＤを２０ｇ量り取り広口瓶に加え、超純水１３８ｍＬに溶解した。前記ＰＥＧ－ＣＯＯＨを２ｇ量り取り加え、下記反応式８に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。回収した沈殿物を凍結乾燥することで擬ＰＲＸ－ＣＯＯＨを１４．７９ｇ得た。
（反応式８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　前記擬ＰＲＸ－ＣＯＯＨと１－アダマンチルアミン（和光純薬工業株式会社製）を２．６６ｇ、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（和光純薬工業株式会社製）（以下、「ＢＯＰ」ともいう）を４．８６ｇを広口瓶に量り取り、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」ともいう）を１１８ｍＬ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（和光純薬工業株式会社製）（以下、「ＤＩＰＥＡ」ともいう）を３ｍＬ加えた。下記反応式９に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。前記反応後、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。メタノール、超純水の順で前記沈殿物を洗浄し、未反応物を除去した。さらに、前記沈殿物をジメチルスルホキシドに溶解し、超純水に滴下することで再沈殿させた。前記再沈殿を４回繰り返すことで精製した。回収した沈殿物に少量の超純水を加え、凍結乾燥することでポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」ともいう）を７．３４ｇ得た。
（反応式９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　前記ＰＲＸのα－ＣＤにスルホプロピル基（以下、「ＳＰＥ基」ともいう）を以下のようにして導入し、ＳＯ３－ＰＲＸ―５を得た。
　前記ＰＲＸを２５０ｍｇ量り取り、１規定の水酸化ナトリウム水溶液（関東化学株式会社製）１０ｍＬに溶解した。３―ブロモプロピルスルホン酸ナトリウム塩（東京化成工業株式会社製）を２．４５ｇ加え、下記反応式１０に示すように、室温で２４時間撹拌し反応させた。反応後、ジエチルエーテルに反応液を滴下し、再沈殿させ、得られた沈殿物を濾過により回収した。前記反応後、溶液を分画分子量３，５００の透析膜（商品名：スペクトラボア６、スペクトラム社製）に加え、超純水に対し３日間透析を行った。得られた溶液を凍結乾燥することでＳＯ３－ＰＲＸ－５を２１３ｍｇ得た。
（反応式１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　前記ＳＯ３－ＰＲＸ－５について、重水中で測定した、５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを図６に示す。なお、ＳＯ３－ＰＲＸ－５の１分子あたりのα－ＣＤの平均貫通数は２８．６であり、ＳＯ３－ＰＲＸ－５の１分子あたりのＳＯ３基の平均修飾数は２７．８、α－ＣＤ１分子あたりのＳＯ３基の平均修飾数は０．９７、ＳＯ３－ＰＲＸ－５の数平均分子量は３６，９００であった。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３－ＰＲＸ－５が下記構造式（１－Ｆ）で表される構造を有し、表２に示す組成であることが確認された。なお、下記構造式（１－Ｆ）中、「ｎ」はポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す（前記構造式（１－Ｆ）では、カッコ内にポリエチレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｎ／３」と記載している）。また、前記構造式（１－Ｆ）中、α－ＣＤは下記式（Ｆ）で表され、前記構造式（１－Ｆ）中では１個のみ記載している。また、前記式（Ｆ）では、前記ＳＯ３基の修飾がｘ（ｘ＝１～６）の場合を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
（製造例６、及び製造例７：硫酸化ポリロタキサン－６、及び硫酸化ポリロタキサン－７の製造）
　製造例５において、ポリエチレングリコール（シグマ－アルドリッチ社製、数平均分子量：４，５００）をポリエチレングリコール（ポリサイエンス社製、数平均分子量：２，２００）に変更した以外は、製造例５と同様にして、ＳＯ３－ＰＲＸ－６を得た。
　製造例５において、ポリエチレングリコール（シグマ－アルドリッチ社製、数平均分子量：４，５００）をポリエチレングリコール（シグマ－アルドリッチ社製、数平均分子量：９，８００）に変更した以外は、製造例５と同様にして、ＳＯ３－ＰＲＸ－７を得た。
　得られたＳＯ３－ＰＲＸ－６、及びＳＯ３－ＰＲＸ－７について、前記プロトン核磁気共鳴装置を用いて、重水中で５００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定した。ＳＯ３－ＰＲＸ－６のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図７、ＳＯ３－ＰＲＸ－７のプロトン核磁気共鳴スペクトルチャートを図８に示す。
　前記プロトン核磁気共鳴スペクトルから、ＳＯ３－ＰＲＸ－６、及びＳＯ３－ＰＲＸ－７が前記構造式（１－Ｆ）で表される構造を有し、表２に示す組成であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
（試験例１：アルカリフォスファターゼ活性化試験）
　マウス頭蓋骨由来骨芽細胞様細胞（独立行政法人理化学研究所　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫより入手）、以下、「ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞」ともいう）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ウエルプレートに播種した。２４時間後、前記２４ウエルプレートに、リン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」ともいう）を希釈溶液として、ヒトリコンビナントＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ（ＨＵＭＡＮＺＹＭＥ社製）と以下の試料とを３７℃で２時間接触させた溶液を滴下した。７２時間培養後に各ウエルをＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝溶液（和光純薬工業株式会社製）を０．２ｍＬ加えてタンパク質を抽出した。骨形成初期マーカーであるアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」ともいう）の産生量を商品名：Ｌａｂ　Ａｓｓａｙ　ＡＬＰ（和光純薬工業株式会社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダ（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣプレートリーダ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、定量した。また、タンパク質抽出量は商品名：Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて５６０ｎｍの吸光度をプレートリーダで測定し、総タンパク質を定量した。また、コントロール群として、ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ単体を使用し、前記ＢＭＰ－２のＡＬＰ活性量（ＡＬＰ産生量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（μｇ））を１とした場合のＢＭＰ－２のＡＬＰ活性量に対する各ＡＬＰ活性量（倍）を算出した。結果を図９に示す。
＜試料＞
　（１）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ
　（２）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　（４）ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（５）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　図９に示すように、ＢＭＰ－２にＳＯ３－ＰＲＸ－１を複合化させることによって、ＢＭＰ－２単体よりもＡＬＰ活性が多く、成長因子活性が亢進されたことが示唆された。また、ヘパリン単体、ＳＯ３－ＰＲＸ－１単体ではＡＬＰ活性の向上は確認されなかったことより、ＢＭＰ－２と、ヘパリン又は硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成によりＡＬＰ活性を向上できることが示唆された。
（試験例２：アルカリフォスファターゼ染色試験）
　前記試験例１で使用した試料について、前記試験例１と同様の操作により、各試料を７２時間培養後、培養液を除去し、ＰＢＳでウエルを２回洗浄した。次に、４％中性緩衝ホルムアルデヒド液を滴下し、１０分間静置した後、ＰＢＳでウエルを２回洗浄した。次に、ナフトールＡＳ－ＭＸリン酸塩（シグマ－アルドリッチ社製）が０．１ｍｇ／ｍＬ、及びレッドバイオレットＬＢ塩（シグマ－アルドリッチ社製）が０．６ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した０．２Ｍトリス塩酸緩衝溶液を各ウエルに０．５ｍＬずつ滴下し、１５分間静置した。次に、ＰＢＳでウエルを２回洗浄し、基質の着色を目視で観察した。結果を図１０に示す。なお、前記試料を含有しない未処理群として、ＰＢＳにおける基質の着色を図１０の左に示す。
　図１０に示すように、ＢＭＰ－２とＳＯ３－ＰＲＸ－１を複合化させた試料のウエルにおいては、ＢＭＰ－２のウエルよりも溶液の着色が強く、ＢＭＰ－２単体よりもＡＬＰの活性が亢進されていることが分かる。また、ヘパリン単体、ＳＯ３－ＰＲＸ－１単体では未処理群と着色の程度が同等であり、ＢＭＰ－２と硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成によりＡＬＰ活性を向上できることが示唆された。
（試験例３：様々な構造の硫酸化ポリロタキサンを使用した場合のアルカリフォスファターゼ活性化試験）
　ＳＯ３－ＰＲＸの化学構造がＢＭＰ－２による骨分誘導に与える影響を調べるため以下の試験を行った。前記試験例１で使用した試料を以下の試料に変更した以外は、試験例１と同様にＡＬＰ活性量を定量した。前記試験例１と同様に前記ＢＭＰ－２のＡＬＰ活性量（ＡＬＰ産生量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（μｇ））を１とした場合のＢＭＰ－２のＡＬＰ活性量に対する各ＡＬＰ活性量（倍）を算出した。結果を図１１に示す。
＜試料＞
　（１）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ
　（２）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１０μｇ／ｍＬ
　（４）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１００μｇ／ｍＬ
　（５）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　（６）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－２　１０μｇ／ｍＬ
　（７）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－２　１００μｇ／ｍＬ
　（８）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－２　１，０００μｇ／ｍＬ
　（９）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－３　１００μｇ／ｍＬ
　（１０）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－３　１，０００μｇ／ｍＬ
　（１１）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－４　１０μｇ／ｍＬ
　図１１に示すように、ＳＯ３－ＰＲＸ－１、ＳＯ３－ＰＲＸ－２、及びＳＯ３－ＰＲＸ－３添加群では硫酸化ポリロタキサンの添加量を増加することで、ヘパリンより有意に高い活性を示すことが示唆された。また、ＳＯ３－ＰＲＸ－１、ＳＯ３－ＰＲＸ－２、及びＳＯ３－ＰＲＸ－３は、硫酸化ポリロタキサンの添加量が少なくても、ヘパリンと同等以上の活性を有しているため、抗凝固作用を有するヘパリンに代えて使用することができることが示唆された。ＳＯ３－ＰＲＸ－１、ＳＯ３－ＰＲＸ－２、及びＳＯ３－ＰＲＸ－３添加群の比較より、硫酸化ポリロタキサン１分子中に修飾された硫酸基数はＡＬＰ活性の向上に大きく影響せず、いずれの硫酸基修飾数においてもＡＬＰ活性が亢進されることが示唆された。また、軸ポリマーの分子量が異なるＳＯ３－ＰＲＸ－４の添加にＡＬＰ活性の向上が確認された。
（試験例４：ＢＭＰ－２の含有量を変更した場合のアルカリフォスファターゼ活性化試験）
　ＢＭＰ－２の含有量を以下の試料のように変更したこと以外は、試験例１と同様にＡＬＰ活性量を定量した。結果を図１２に示す。
＜試料＞
　（１）ＢＭＰ－２　２５ｎｇ／ｍＬ
　（２）ＢＭＰ－２　２５ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　５０ｎｇ／ｍＬ
　（４）ＢＭＰ－２　５０ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　（５）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ
　（６）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　図１２に示すように、硫酸化ポリロタキサンを含有する試料では、ＢＭＰ－２単体の試料と比較して、ＡＬＰ活性が亢進されることが示唆された。また、ＢＭＰ－２　５０ｎｇ／ｍＬと、ＢＭＰ－２　２５ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬとのＡＬＰ活性は同等であったことより、硫酸化ポリロタキサン添加により骨再生におけるＢＭＰ－２の使用量を低下できることが示唆された。
（試験例５：ＢＭＰ－２と硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成の評価）
　ＢＭＰ－２と硫酸化ポリロタキサンが静電相互作用による複合体を形成した場合、ＢＭＰ－２と硫酸化ポリロタキサンで覆われると考えられる。そこで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（商品名：ＥＬＩＳＡ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｋｉｔ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を用いて、以下のようにしてＢＭＰ－２と硫酸化ポリロタキサンとの複合体形成を抗体との結合量変化より評価した。
　ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートの各ウエルに、Ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ溶液を１μｇ／ｍＬずつ滴下し、室温にて一晩静置した。翌日、前記溶液を除去し、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）でプレートを４回洗浄したのち、Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ（１％　ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を３００μＬずつ滴下、室温にて１時間静置した。１時間後、前記溶液を吸引し、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で４回洗浄した。次に、各ウエルに、以下の試料を添加し、室温で２時間静置した後、前記溶液を除去して、ＰＢＳでプレートを４回洗浄した。その後、ＢＭＰ－２標識のＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ溶液を各ウエルに滴下し、室温で１時間、静置した。前記溶液を除去し、洗浄用Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）でプレートを４回洗浄し、基質溶媒を添加することで発色させ、４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダ（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣプレートリーダ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）で測定した。結果を図１３に示す。ＢＭＰ－２単体での検出吸光度を１００％とした場合の、各試料の吸光度の減少率により、ＢＭＰ－２とＢＭＰ－２抗体と結合率を評価することができる。すなわち、ＢＭＰ－２が複合体を形成することにより抗体認識部位が覆われるため、ＢＭＰ－２への抗体結合量が減少すると推測されることから、前記検出蛍光強度の減少率が大きいほど、ＢＭＰ－２表面の被覆率が高く、複合体の形成を推測できる。
＜試薬＞
　（１）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ
　（２）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　図１３に示すように、ＢＭＰ－２とヘパリンとの複合体では、検出吸光度の減少が約１０％であった。一方、ＢＭＰ－２とＳＯ３－ＰＲＸとの複合体では、検出蛍光強度の減少が約５０％であった。以上の結果から、ＳＯ３－ＰＲＸは、ヘパリンよりもＢＭＰ－２表面の被覆率が高いため抗体との結合量が減少したと考えられる。よってＳＯ３－ＰＲＸは、ヘパリンよりもＢＭＰ－２と強く相互作用し複合体を形成するが示唆された。
（試験例６：ＢＭＰ－２阻害剤共存下での成長因子活性の評価）
　前記試験例１と同様にＢＭＰ－２阻害剤であるＮｏｇｇｉｎ共存下でのＡＬＰ活性量を定量した。前記試験例１と同様にＡＬＰ活性を評価し、Ｎｏｇｇｉｎ無添加群のＡＬＰ産生量を１００％としたときの相対値で算出した。
＜試薬＞
　（１）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ
　（２）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　Ｎｏｇｇｉｎ　５０ｎｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　Ｎｏｇｇｉｎ　１００ｎｇ／ｍＬ
　（４）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（５）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　Ｎｏｇｇｉｎ　５０ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ　
　（６）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　Ｎｏｇｇｉｎ　１００ｎｇ／ｍＬ＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ　
　（７）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　（８）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　Ｎｏｇｇｉｎ　５０ｎｇ／ｍＬ＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ　
　（９）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　Ｎｏｇｇｉｎ　１００ｎｇ／ｍＬ＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ　
　図１４に示すように、ＢＭＰ－２阻害作用を有するＮｏｇｇｉｎを培地中に添加することでＡＬＰ産生量はＮｏｇｇｉｎ濃度依存的に減少した。一方、ＳＯ３－ＰＲＸとＢＭＰ－２との複合体では、ヘパリンとＢＭＰ－２との複合体よりも、Ｎｏｇｇｉｎ添加時のＡＬＰ産生量が高いことが分かる。本結果は、ＳＯ３－ＰＲＸが、ＢＭＰ－２とＮｏｇｇｉｎとの相互作用を阻害することができることを示している。
（試験例７：硫酸化ポリロタキサンの細胞毒性の評価）
　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（独立行政法人理化学研究所　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫより入手）を用い、以下のようにして硫酸化ポリロタキサンの細胞毒性を評価した。
　前記ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を９６ウエルプレートに播種し（細胞数：１×１０４個／９０μＬ／ウエル）、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ社製）を含むイーグル最小必須培地（シグマ－アルドリッチ社製）中で、２４時間、３７℃で培養した。培地を９０μＬのイーグル最小必須培地に交換後、下記試料を１，０００μｇ／ｍＬの濃度で各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、商品名：Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（株式会社同仁堂製）を１０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で１時間静置した。その後、プレートリーダ（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣプレートリーダ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、試料の代わりにリン酸緩衝溶液を添加した細胞の吸光度を細胞生存率１００％として、以下のようにして細胞生存率（％）を算出した。結果を図１５に示す。
＜試料＞
　（１）ヘパリン
　（２）ＳＯ３－ＰＲＸ－１（製造例１で作製）
　（３）ＳＯ３－ＰＲＸ－２（製造例２で作製）
＜細胞生存率の算出方法＞
　細胞生存率（％）＝〔｛（試料を添加し、培養した細胞の吸光度）－（培養液のみの吸光度）｝／{（リン酸緩衝溶液を添加し、培養した細胞の吸光度）－（培養液のみの吸光度）}〕×１００
　図１５中、「□」は「ヘパリン」の結果を示し、「△」は「ＳＯ３－ＰＲＸ－１」の結果を示し、「×」は「ＳＯ３－ＰＲＸ－２」の結果を示す。
　図１２に示すように、ＳＯ３－ＰＲＸ－１、及びＳＯ３－ＰＲＸ－２は１６８時間の培養後も細胞生存率の低下を示さないのに対し、ヘパリンは細胞生存率の低下を示すことが明らかとなった。
　この結果から、硫酸化ポリロタキサンは、細胞毒性の点から、ヘパリンよりも安全であることが示唆された。
（試験例８：硫酸化ポリロタキサンの抗凝固作用の評価）
　ヘパリンはアンチトロンビンＩＩＩと複合体を形成し、Ｘａ因子の活性を阻害することで抗凝固作用を示す。そこで、抗凝固活性測定キット（商品名：テストチームヘパリンＳ、積水メディカル株式会社製）を用いて、以下のようにしてＸａ因子の活性を測定し、硫酸化ポリロタキサンの抗凝固作用を評価した。
　前記抗凝固活性測定キット付属のマニュアルに従い、血漿溶液：アンチトロンビンＩＩＩ溶液：緩衝液を１：１：８の体積比となるように混合し、検査溶液を調製した。検査溶液と各濃度に調製したＳＯ３－ＰＲＸ－１、又は各濃度に調製したヘパリンを９：１の体積比で混合し、９６ウエルプレートの各ウエルに５０μＬずつ加えた。各ウエルにＸａ因子溶液を２５μＬずつ加え、３７℃にて３０秒間加温した。各ウエルに基質液を５０μＬずつ加え、３７℃にて３分間静置した。その後に、４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダ（商品名：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣプレートリーダ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）で測定した。結果を図１６に示す。
＜試料＞
　（１）ヘパリン　０．００１μｇ／ｍＬ
　（２）ヘパリン　０．０１μｇ／ｍＬ
　（３）ヘパリン　０．１μｇ／ｍＬ
　（４）ヘパリン　１μｇ／ｍＬ
　（５）ヘパリン　１０μｇ／ｍＬ
　（６）ヘパリン　１００μｇ／ｍＬ
　（７）ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（８）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　０．００１μｇ／ｍＬ
　（９）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　０．０１μｇ／ｍＬ
　（１０）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　０．１μｇ／ｍＬ
　（１１）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１μｇ／ｍＬ
　（１２）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１０μｇ／ｍＬ
　（１３）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１００μｇ／ｍＬ
　（１４）ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　図１６に示すように、ヘパリンでは０．１μｇ／ｍＬ以上の濃度から徐々にＸａ因子活性が低下し、抗凝固作用を有することが示唆された。一方、硫酸化ポリロタキサン（ＳＯ３－ＰＲＸ－１）は１，０００μｇ／ｍＬの濃度でもＸａ因子活性の低下が起こらず、抗凝固作用を示さないことが示唆された。すなわち、抗凝固作用を示さない硫酸化ポリロタキサンはヘパリンよりも生体内での安全性に優れると言える。
（試験例９：硫酸化ポリロタキサンとＢＭＰ－２複合体による石灰化の評価）
　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（独立行政法人理化学研究所　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫより入手）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ウエルプレートに播種した。２４時間後、１０ｍＭのβ－グリセロフォスフェート（シグマ－アルドリッチ社製）と５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（シグマ－アルドリッチ社製）を添加した分化誘導培地に培地交換した。前記２４ウエルプレートに、ＰＢＳを希釈溶液として、以下の試料を３７℃で２時間接触させた溶液を滴下した。３日に一回培地とＢＭＰ－２溶液を交換し、２１日間培養した。
　培養後、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞にエタノール溶液を加え２０分間、室温で静置することで細胞を固定し、１質量％アリザリンレッド溶液を加え、５分間、室温で静置した。ＰＢＳで３回洗浄した後に、顕微鏡（ＢＸ４１、オリンパス株式会社製）で観察を行った。なお、ＢＭＰ－２は、ヒトリコンビナントＢＭＰ－２（ＨＵＭＡＮＺＹＭＥ社製）を使用し
た。結果を図１７Ａ～図１７Ｄに示す。
＜試料＞
　（１）ＰＢＳ（ＢＭＰ－２未添加）
　（２）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（４）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－１　１，０００μｇ／ｍＬ
　図１７Ａ～図１７Ｄに示すように、（１）ＰＢＳ（ＢＭＰ－２未添加群）ではアリザリンレッドで染色される石灰化物が認められず、骨分化効率が低いことが示唆された。（２）ＢＭＰ－２添加群では点状にアリザリンレッドで染色される石灰化物が観察された。（３）ＢＭＰ－２＋ヘパリン添加群では、ＢＭＰ－２添加群と比較して大きな石灰化物が観察された。これに対して、ＢＭＰ－２＋ＳＯ３－ＰＲＸ－１添加群ではウエル全面にアリザリンレッドで染色される石灰化物が観察され、骨分化効率が非常に高いことが分かる。よって、ＳＯ３－ＰＲＸ－１はＢＭＰ－２による骨分化誘導を強力に亢進することが示唆された。
（試験例１０：アルカリフォスファターゼ活性化試験）
　試験例１において、使用した試料を以下の試料に変更した以外は、試験例１と同様にして、ＡＬＰ活性量を定量した。各ＡＬＰ活性量（ＡＬＰ産生量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（μｇ））を算出した。結果を図１８に示す。
＜試料＞
　（１）ＰＢＳ（ＢＭＰ－２未添加）
　（２）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１，０００μｇ／ｍＬ
　（４）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－５　１，０００μｇ／ｍＬ
　（５）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－６　１，０００μｇ／ｍＬ
　（６）ＢＭＰ－２　１００ｎｇ／ｍＬ　＋　ＳＯ３－ＰＲＸ－７　１，０００μｇ／ｍＬ
　図１８に示すように、ＢＭＰ－２にＳＯ３－ＰＲＸ－５、ＳＯ３－ＰＲＸ－６、及びＳＯ３－ＰＲＸ－７を添加した場合、いずれも有意にＡＬＰの産生量の増加が認められたことから、ＢＭＰ―２による骨分化誘導効率を亢進することが示唆された。
（試験例１１：頭蓋骨欠損モデルマウスの骨増生能の評価）
＜埋入用試料の調製＞
　直径３．５ｍｍの生検トレパン（商品名：ＢＩＯＰＳＹ　ＰＵＮＣＨ、カイインダストリー株式会社製）を用いて、商品名：コラーゲンスポンジ　３５ｍｍディッシュ用（高研株式会社製）をくり抜いたものを移植用スポンジとした。下記の試料を超純水１５μＬに溶解し、移植用コラーゲンスポンジに浸潤させ、埋入用試料とした。
＜埋入用試料＞
　（１）超純水
　（２）ＢＭＰ－２　１０　ｎｇ／ｍＬ
　（３）ＢＭＰ－２　１０　ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　１００　μｇ／ｍＬ
　（４）ＢＭＰ－２　１０　ｎｇ／ｍＬ　＋ＳＯ３－ＰＲＸ－５　１００　μｇ／ｍＬ
　（５）ＢＭＰ－２　１０　ｎｇ／ｍＬ　＋ＳＯ３－ＰＲＸ－６　１００　μｇ／ｍＬ
　（６）ＢＭＰ－２　１０　ｎｇ／ｍＬ　＋ＳＯ３－ＰＲＸ－７　１００　μｇ／ｍＬ
　（７）ＢＭＰ－２　５０　ｎｇ／ｍＬ
　（８）ＢＭＰ－２　５０　ｎｇ／ｍＬ　＋　ヘパリン　５００　μｇ／ｍＬ
　（９）ＢＭＰ－２　５０　ｎｇ／ｍＬ　＋ＳＯ３－ＰＲＸ－６　５００　μｇ／ｍＬ
　５週齢の雄性ＩＣＲマウス（三協ラボサービス株式会社より購入）に三種混合麻酔薬（ドミトール（０．７５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（４ｍｇ／ｋｇ）、ベトルファール（５ｍｇ／ｋｇ）を生理食塩水内で混和した溶液）を１０ｍＬ／ｋｇ量を皮下投与した。次に、実験用マウスの頭頂部切開予定部を剃毛した。背部からみて矢状縫合相当部のやや右側を矢状縫合に平行方向に１ｃｍ程度の皮膚切開を加えた。背部からみて左側頭蓋骨に直径３．５ｍｍの生検トレパン（商品名：ＢＩＯＰＳＹ　ＰＵＮＣＨ、カイインダストリー株式会社製）を用いて同形の穴を空けた。欠損部に前記埋入用試料を埋入した。皮膚切開部を４－０絹糸（商品名：滅菌済みブレートシルク、秋山製作所株式会社製）を用いて縫合した。メデトミジン拮抗薬（アンチセダン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）を生理食塩水で希釈した溶液）１０ｍＬ／ｋｇを皮下投与し、試料埋入手術とした。
　術後７日間、１４日間、２１日間、及び２８日間経過したマウスを３．０質量％イソフルランによる吸入麻酔下で、エックス線マイクロＣＴ（装置名：Ｒ＿ｍＣＴ　ＦＸ、リガク株式会社製）を用いて、撮影条件を設定：ＦＯＶ　２０、撮影時間：１７秒間、管電圧：９０ｋＶ、管電流：１６０μＡとして撮影した。撮影した画像は３Ｄ　ｖｉｅｗｅｒを用いて画像解析を行った。
　図１９Ａ～図１９Ｂに埋入用試料移植後、経時的にエックス線マイクロＣＴを撮影した結果を示す。ＢＭＰ－２　１０ｎｇの埋入用試料（２）と比較して、ＢＭＰ－２に加え、ＳＯ３－ＰＲＸ－５、ＳＯ３－ＰＲＸ－６、又はＳＯ３－ＰＲＸ－７を１００μｇ添加して移植した埋入用試料（４）、（５）、又は埋入用試料（６）では、１４日間後より欠損部での顕著な骨形成が確認された。特に、ＢＭＰ－２　１０ｎｇ＋ＳＯ３－ＰＲＸ－６移植群（埋入用試料（５））では、ＢＭＰ－２　５０ｎｇ移植群（埋入用試料（７））と同等の骨形成を示した。また、ＢＭＰ－２　５０ｎｇ移植群（埋入用試料（７））では２８日間後に欠損部全体を占める骨形成が確認されたのに対して、ＢＭＰ－２　５０ｎｇ＋ＳＯ３－ＰＲＸ－５移植群（埋入用試料（９））では、１４日間後より欠損部全体を占める骨形成が確認された。以上より、硫酸化ポリロタキサンの添加によりＢＭＰ－２の低濃度化、及び早期の骨形成が可能であることが示唆された。
（試験例１２：硫酸化ポリロタキサンを投与したマウスの血液生化学検査）
　硫酸化ポリロタキサンの安全性評価として、移植実験で埋入した試料量と同等の試料をマウスに皮下投与し、主要な代謝、排泄組織である肝臓及び腎臓に対する毒性を調べた。５週齢の雄性ＩＣＲマウス（三協ラボサービス株式会社より購入）に下記の試料を皮下投与した。２４時間経過後、マウスより血液を採取し血漿を調製した。肝毒性の指標であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、腎毒性の指標である血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲ）の濃度を測定した。
＜試料＞
　（１）生理食塩水
　（２）ヘパリン　３３．３　ｍｇ／ｋｇ
　（３）ＳＯ３－ＰＲＸ－５　３３．３　ｍｇ／ｋｇ
　（４）ＳＯ３－ＰＲＸ－６　３３．３　ｍｇ／ｋｇ
　（５）ＳＯ３－ＰＲＸ－７　３３．３　ｍｇ／ｋｇ
　図２０Ａ～図２０Ｄに各試料を投与し、２４時間経過した後のマウスの血液中のＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＵＮ、ＣＲ濃度を示す。ヘパリン、各硫酸化ポリロタキサンを投与した群のＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＵＮ、及びＣＲの濃度は生理食塩水投与群と有意な差は認められず、各硫酸化ポリロタキサンは、肝臓、及び腎臓に対する毒性がないことが示唆された。
　以上の結果から、硫酸化ポリロタキサンは、骨形成因子と複合体を形成して、骨形成因子を安定に保持することができることが分かった。
　また、硫酸化ポリロタキサンは、骨形成因子と複合体を形成して、骨形成因子を活性化することができることが分かった。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
　骨形成因子を安定に保持することを特徴とする骨形成因子安定保持剤である。
　＜２＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
　骨形成因子を活性化することを特徴とする骨形成因子活性化剤である。
　＜３＞　骨形成因子が、骨形成因子－２である前記＜２＞に記載の骨形成因子活性化剤である。
　＜４＞　硫酸化ポリロタキサン中の環状分子が、α－シクロデキストリンであり、
　硫酸化ポリロタキサン中の線状分子が、ポリエチレングリコールである前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
　＜５＞　硫酸化ポリロタキサンが、下記一般式（Ｉ）で示される化合物、及び下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の少なくともいずれかである前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 （但し、前記一般式（Ｉ）中、前記環状分子が、下記一般式（ＩＩ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 （但し、前記一般式（ＩＩ）中、Ｙは、Ｐ及びＱの少なくともいずれかを示し、Ｐは、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、又はポリエチレングリコール基を示し、Ｑは、カルバミン酸エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）、アミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）、エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－）、カルボネート結合（－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－）、又はエーテル結合（－Ｏ－）を示し、ｍは、０～２０の整数を示し、ｘは、１～６の整数を示し、Ｍは、水素原子、ナトリウム原子、又はカリウム原子を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 （但し、前記一般式（ＩＩＩ）中、前記環状分子が、前記一般式（ＩＩ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。）
　＜６＞　硫酸化ポリロタキサン中の線状分子の数平均分子量が、５００～６，０００である前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
　＜７＞　硫酸化ポリロタキサンの環状分子中の硫酸基の平均修飾数が、硫酸化ポリロタキサンの環状分子１分子に対して、０．５～１である前記＜２＞から＜６＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
　＜８＞　硫酸化ポリロタキサンの含有量が、骨形成因子全量に対して、１，０００倍～１０，０００倍である前記＜２＞から＜７＞のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤である。
　＜９＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも有する骨形成因子安定保持剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を骨形成因子安定保持剤に安定に保持させることを特徴とする骨形成因子の安定保持方法である。
　＜１０＞　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも含有する骨形成因子活性化剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を活性化させることを特徴とする骨形成因子の活性化方法である。
　＜１１＞　骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとを含有する、医薬組成物である。
　＜１２＞　骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとを含有する、
　骨の再生に用いるための医薬組成物である。
　＜１３＞　前記骨形成因子タンパク質が、ＢＭＰ－２タンパク質、及びＢＭＰ－７タンパク質の少なくともいずれかである前記＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
　＜１４＞　前記骨形成因子タンパク質と、前記硫酸化ポリロタキサンとが、コラーゲンスポンジ中に浸潤していることを特徴とする、前記＜１１＞から＜１３＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
　＜１５＞　骨の再生に用いるための医薬品の製造における、骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとの複合体の使用である。
　＜１６＞　対象における骨の再生方法であって、
　前記対象に骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンと、を含有する組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、方法である。
　本発明の骨形成因子安定保持剤、及び骨形成因子の安定保持方法では、硫酸化ポリロタキサンを含有することにより、骨形成因子を安定に保持することができるため、骨形成因子の保存用、カラムクロマトグラフィー等のカラム用などに好適に利用することができる。
　また、本発明の骨形成因子活性化剤、及び骨形成因子の活性化方法では、硫酸化ポリロタキサンを含有することにより、骨形成因子を活性化することができるため、薬効の持続性、作用量や作用回数の低減も期待される。

Claims (16)

  1. 　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
    　骨形成因子を安定に保持することを特徴とする骨形成因子安定保持剤。
  2. 　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを含有し、
    　骨形成因子を活性化することを特徴とする骨形成因子活性化剤。
  3. 　前記骨形成因子が、骨形成因子－２である請求項２に記載の骨形成因子活性化剤。
  4. 　前記硫酸化ポリロタキサン中の前記環状分子が、α－シクロデキストリンであり、
    　前記硫酸化ポリロタキサン中の前記線状分子が、ポリエチレングリコールである請求項２から３のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
  5. 　前記硫酸化ポリロタキサンが、下記一般式（Ｉ）で示される化合物、及び下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の少なくともいずれかである請求項２から４のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （但し、前記一般式（Ｉ）中、前記環状分子が、下記一般式（ＩＩ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （但し、前記一般式（ＩＩ）中、Ｙは、Ｐ及びＱの少なくともいずれかを示し、Ｐは、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ベンジル基、エチレングリコール基、トリエチレングリコール基、又はポリエチレングリコール基を示し、Ｑは、カルバミン酸エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－）、アミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）、エステル結合（－Ｏ－ＣＯ－）、カルボネート結合（－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－）、又はエーテル結合（－Ｏ－）を示し、ｍは、０～２０の整数を示し、ｘは、１～６の整数を示し、Ｍは、水素原子、ナトリウム原子、又はカリウム原子を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （但し、前記一般式（ＩＩＩ）中、前記環状分子が、前記一般式（ＩＩ）で表され、硫酸化ポリロタキサン１分子あたりの環状分子の平均貫通数が１０個～１，０００個であり、ｎは、１０～２５，０００の整数を示す）
  6. 　前記硫酸化ポリロタキサン中の前記線状分子の数平均分子量が、５００～６，０００である請求項２から５のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
  7. 　前記硫酸化ポリロタキサンの前記環状分子中の硫酸基の平均修飾数が、前記硫酸化ポリロタキサンの環状分子１分子に対して、０．５～１である請求項２から６のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
  8. 　前記硫酸化ポリロタキサンの含有量が、前記骨形成因子全量に対して、１，０００倍～１０，０００倍である請求項２から７のいずれかに記載の骨形成因子活性化剤。
  9. 　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも有する骨形成因子安定保持剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を骨形成因子安定保持剤に安定に保持させることを特徴とする骨形成因子の安定保持方法。
  10. 　硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンを少なくとも含有する骨形成因子活性化剤に、骨形成因子を作用させることにより、骨形成因子を活性化させることを特徴とする骨形成因子の活性化方法。
  11. 　骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとを含有する、医薬組成物。
  12. 　骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとを含有する、
    　骨の再生に用いるための医薬組成物。
  13. 　前記骨形成因子タンパク質が、ＢＭＰ－２タンパク質、及びＢＭＰ－７タンパク質の少なくともいずれかである請求項１１から１２のいずれかに記載の医薬組成物。
  14. 　前記骨形成因子タンパク質と、前記硫酸化ポリロタキサンとが、コラーゲンスポンジ中に浸潤していることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれかに記載の医薬組成物。
  15. 　骨の再生に用いるための医薬品の製造における、骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンとの複合体の使用。
  16. 　対象における骨の再生方法であって、
    　前記対象に骨形成因子タンパク質と、硫酸基を有する環状分子、及び前記環状分子の中空部を貫通する線状分子を有する硫酸化ポリロタキサンと、を含有する組成物を投与する工程を含むことを特徴とする、方法。
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