RU2686088C2

RU2686088C2 - Способ обработки экстракта из морских водорослей, экстракт, фармацевтическая композиция, биоматериал, способ лечения, применение экстракта и композиции

Info

Publication number: RU2686088C2
Application number: RU2015135635A
Authority: RU
Inventors: Чарльз ДРЭГЭР; Джанет Хелен ФИТТОН; Вики-Энн ГАРДИНЕР; Дэмиен СТРИНГЕР; Самюэль КАРПИНИЕК
Original assignee: Маринова Пти Лтд
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2019-04-24
Also published as: DK2948158T3; KR20150108919A; JP6336487B2; CA2898515A1; EP2948158A4; RU2015135635A; US10149874B2; EP2948158A1; AU2013375786B2; WO2014113836A1; CN105101982A; JP2016505083A; CA2898515C; AU2013375786A1; HK1215164A1; KR102223725B1; US20150359828A1; NZ710602A; EP2948158B1

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу снижения пирогенности экстракта сульфатированных полисахаридов. Способ снижения пирогенности экстракта сульфатированных полисахаридов, включающих в себя сульфатированный полисахприд и пирогенное вещество, при этом способ включает контактирование экстракта с эффективным количеством оксиданта. Биологически активный экстракт. Заявленный способ позволяет эффективно снизить пирогенность экстракта сульфатированных полисахаридов. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 22 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА ЗАЯВКИ

Настоящей заявкой испрашивается приоритет предварительной заявки на патент Соединенных Штатов Америки 61/756,570, поданной 25 января 2013 года, содержание которой тем самым включено в настоящий документ посредством ссылки во всей ее полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам лечения экстрактами, полученными из морских организмов, таких как морские водоросли. В частности, настоящее изобретение относится к изготовлению в основном апирогенных экстрактов, используемых для производства парентеральных фармацевтических композиций, применяемых при лечении и хирургической обработке ран.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Значительное количество работ было посвящено иллюстрации биологической активности различных компонентов морских водорослей, в том числе полисахаридных компонентов, таких как фукоидан и ульван. Фукоидан является сульфатированным полисахаридом, обнаруженным в клеточных стенках многих видов морских бурых водорослей. Исследования в лабораторных условиях показывают, что фукоидан обладает противораковым, антиангиогенным (Maruyama Н., Tamauchi Н., Hashimoto М., Nakano Т. Antitumer activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll of Undaria pinnatifida. In Vivo 2003; 17 (3): 245-249; Haneji K., Matsuda Т., Tomita M. et al. Fucoidan extracted from cladosiphon okamuranus tokida induces apoptosis of human T-cell leukemia virus type 1-infected T-cell lines and primary adult T-cell leukemia cells. Nutr. Cancer 2005; 52 (2): 189-201; Liu J.M., Bignon J., Haroun-Bouhedja F. et al. Inhibitory effect of fucoidan on the adhesion of adenocarcinoma cells to fibronectin. Anticancer Res. 2005; 25 (3B): 2129-2133; Koyanagi S., Tanigawa N.. Nakagawa H., Soeda S., Shimeno H. Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and anitumor activities. Biochem. Pharmacol. 2003; 65 (2): 173-179; Alekseyenko T.V., Zhanayeva S.Y., Venediktova A.A., et al. Anitumor and antimetastatic activity of fucoidan, a sulfated polysaccharide isolated from the Okhotsk Sea Fucus evanescens brown alga. Bull. Exp. Biol. Med. 2007 Jun; 143 (6): 730-2; Nagamin T, Hayakawa K, Kusakabe T, et al. Inhibitory effect of fucoidan on Huh7 hepatoma cells through downregulation of CXCL12. Nutr. Cancer 2009; 61 (3): 340-7), antiviral (Lee J.B., Hayashi K., Hashimoto M., Nakano Т., Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu). Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 2004 Sep; 52 (9): 1091-4; Hayashi K., Nakano Т., Hashimoto M., Kanekiyo K., Hayashi T. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection. Int. Immunopharmacol. 2008 Jan; 8 (1): 109-16.) и иммуномодуляторным эффектом (Raghavendran H.R., Srinivasan P., Rekha S. Immunomodulatory activity of fucoidan against aspirin-induced gastric mucosal damage in rats. Int. Immunopharmacol. 2011 Feb;11 (2): 157-63). Указанные эффекты достигаются путем стимулирования естественных клеток-киллеров и путем регуляции в сторону уменьшения AP-I, участвующего в клеточной пролиферации. Фукоидан также проявляет нейропротекторные (Do Н, Руо S, Sohn EH. Suppression of iNOS expression by fucoidan is mediated by regulation of p38 МАРК, JAK/STAT, AP-1 and IRF-1, and depends on up-regulation of scavenger receptor B1 expression in TNF-alpha- and IFN-gamma-stimulated C6 glioma cells. J. Nutr. Biochem. 2009 Jul 1; Luo D., Zhang Q., Wang H., et al. Fucoidan protects against dopaminergic neuron death in vivo and in vitro. Eur. J. Pharmacol. 2009 Sep 1;617(1-3):33-40.), радиопротекторные (Byon Y.Y., Kim M.H., Yoo E.S., et al. Radioprotective effects of fucoidan on bone marrow cells: improvement of the cell survival and immunoreactivity. J. Vet. Sci. 2008 Dec; 9 (4): 359-65) и противоязвенные (Choi J.I., Raghavendran H.R., Sung N.Y., et al. Effect of fucoidan on aspirin-induced stomach ulceration in rats. Chem Biol Interact. 2010 Jan. 5; 183 (1): 249-54) свойства.

В соответствии с данными других исследований фукоидан демонстрирует антикоагулянтную (Colliec S, Fischer A.M., Tapon-Bretaudiere J, et al. Anticoagulant properties of a fucoidan fraction. Thromb. Res. 1991 Oct 15; 64 (2): 143-54; Irhimeh M.R., Fitton J.H., Lowenthal R.M. Pilot clinical study to evaluate the anticoagulant activity of fucoidan. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2009 Aug 18) и антитромботическую (Church F.C., Meade J.В., Treanor R.E., Whinna H.C. Antithrombin activity of fucoidan. The interaction of fucoidan with heparin cofactor II, antithrombin III, and thrombin. J. Biol. Chem. 1989 Feb 25; 264 (6): 3618-23) активность и может создавать аддитивные эффекты при приеме с антикоагулянтами.

Фукоидан также продемонстрировал свою значительную перспективность его применения при предотвращении возникновения послеоперационных спаек. В ходе проведения исследования Cashman et al. (Cashman J.D., Kennah E., Shuto A., Winternitz, Springate CMK, Fucoidan Film Safely Inhibits Surgical Adhesions in a Rat Model, J. Surg. Res. 2011 Dec 171 (2): 495-503) было проведено испытание ряда соединений, и при этом было обнаружено, что фукоидан является самым безопасным и наиболее эффективным соединением. Содержащие фукоидан пленки позволили снизить вероятность образования спаечных рубцов приблизительно на 90% по сравнению с контрольными пленками. В целом у 50%-100% животных не возникали спайки при применении пленок с содержанием фукоидана от 0,33% до 33% в весовом соотношении по сравнению со всеми животными, имеющими спайки при применении контрольных пленок. Не наблюдалось каких-либо неблагоприятных воздействий при применении пленок, содержащих фукоидан при 33% весовом соотношении, что эквивалентно приблизительно 30 мг фукоидана на один кг веса тела.

Также предлагается использовать фукоидан при лечении ран, и, в частности, для заживления ожогов. Ссылка дается на работу Sezer et al. (Sezer A., Hatipoglu F., Cevher E., Ogurtan Z., Bas A.L., and Akbuga J., Chitosan film containing fucoidan as a wound dressing for dermal burn healing: Preparation and in vitro/in vivo evaluation, AAPS Pharm. Sci. Tech. 2007 June; 8 (2): E94-E101). Указанные авторы продемонстрировали на кроличьей модели ожога, что наиболее эффективная регенерированная дермальная папиллярная структура, наиболее эффективная реэпителизация и наиболее быстрое затягивание ран наблюдались в группе животных, проходивших лечение с использованием фукоиданной и хитозанной пленки.

Ульван (являющийся аналогом фукоидана) экстрагируют из зеленых морских водорослей, и он является перспективным для применения в медицинской практике. Например, ульван является исключительно перспективным в качестве подложки при изготовлении биоматериалов, системы доставки лекарственных средств, а также в качестве иммуномодулятора.

Из вышеизложенного видно, что полисахариды, экстрагированные из морских организмов, являются перспективными для использования в различных и клинически важных областях. Существенной проблемой при использовании полезных свойств указанных молекул является наличие в экстрактах указанных молекул пирогенных веществ. В тех случаях, когда при заболевании показано парентеральное применение лекарственного средства, непосредственное нанесение на рану или на операционное поле или имплантирование внутрь организма, использование указанных полисахаридных экстрактов противопоказано ввиду связанных с этим рисков возникновения индуцированной пирогеном гипотермии, токсического шока и даже летального исхода.

Термин "микробный пироген" в противоположность "грамотрицательному бактериальному эндотоксину" стал общим описательным термином для многих различных веществ. Тем не менее, пирогенные вещества могут вырабатываться некоторыми грамположительными бактериями, микобактериями, грибками, а также вирусами, однако пирогены, выработанные грамположительными бактериями, т.е. эндотоксины, имеют большое значение для фармацевтической промышленности и индустрии производства медицинских имплантов.

Из предшествующего уровня техники известен ряд способов для депирогенизации растворов для использования в медицине. Многие способы основаны на разрушении пирогенного вещества. Однако, такие способы нередко приводят в повреждению или разрушению требуемой молекулы в растворе. Это прежде всего относится к случаям, когда требуемая молекула получена естественным путем.

Другие способы депирогенизации предусматривают физическое удаление пирогенного вещества такими методами как хроматография и фильтрование. В то время как такие способы, безусловно, в большей степени приемлемы для обработки растворов, содержащих неустойчивые молекулы, значительные проблемы возникают в области применения способов в промышленном масштабе для производства соединений в промышленных объемах. Зачастую способы разделения в промышленном масштабе не являются экономически целесообразными ввиду стоимости среды и необходимости постоянно заменять или регенерировать среду. В частности, известно, что экстракты морских водорослей содержат остатки и осадок, которые приводят к засорению и забиванию разделительных сред.

Другая проблема с экстрактами морских водорослей заключается в наличии нежелательного окрашивания в бурый цвет, которое зачастую имеет место во время технологического процесса. Предполагается, что такое окрашивание обусловлено щелочной средой, и обычно такое цвет приобретает конечный продукт. В тех случаях, когда экстракт используется для приготовления составов в виде инъецируемых человеку композиций, бесцветный раствор является исключительно предпочтительным в целях обеспечения визуального контроля инъектата до его введения в организм.

Аспектом настоящего изобретения является преодоление или устранение недостатков предшествующего уровня техники путем создания усовершенствованных способов обработки экстрактов из морских водорослей в целях снижения пирогенности и (или) окрашивания. Дополнительным аспектом настоящего изобретения является создание альтернативных способов обработки.

Рассмотрение документов, законов, материалов, устройств, статей и т.п. включено в настоящее описание исключительно в целях создания контекста настоящего изобретения. Не предполагается и не допускается, что все из вышеуказанных документов, законов, материалов, устройств, статей и т.п. являются частью основы известного уровня техники или являлись известным уровнем техники в области, относящейся к настоящему изобретению, т.к. оно существовало до даты приоритета каждого пункта формулы настоящей заявки.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первым аспектом настоящего изобретения является создание способа обработки экстракта из морских водорослей, включающего молекулу-мишень и пирогенное вещество, при этом способ включает следующий(-е) этап(-ы): инактивирование пирогенного вещества и (или) удаление пирогенного вещества, при котором способ приводит к снижению пирогенности экстракта. Способ может включать контактирование экстракта с эффективным количеством одного или нескольких следующих соединений: оксиданта (например, пероксида), поверхностно-активного вещества (например, неионогенного поверхностно-активного вещества), основания (например, гидроксида), активированного угля и цеолита.

Молекула-мишень может представлять собой полисахарид, предпочтительно полисахарид, такой как фукоидан или ульван.

Предпочтительные комбинации в соответствии со способом включают (i) оксидант и основание, (ii) оксидант, основание и поверхностно-активное вещество и (iii) активированный уголь и основание.

Другим аспектом настоящего изобретения является создание в основном апирогенного экстракта из морского организма. В обработанном экстракте содержание пирогенного вещества может составлять менее приблизительно 100 ЕЭ/мг, как определено при проведении LAL-теста, и (или) обработанный экстракт способен пройти «кроличий тест» на пирогенность. Экстракт может быть получен с применением способа в соответствии с описанием, приведенным в настоящей заявке.

Также предусматривается создание фармацевтической композиции, включающей в основном апирогенный экстракт из морского организма в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке, в комбинации с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является создание способа для лечения и предотвращения заболевания, включающего введение фармацевтической композиции или имплантацию биоматериала в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке, млекопитающему, нуждающемуся в такой фармацевтической композиции или имплантации.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения предусматривается использование фармацевтической композиции или биоматериала в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке, в области медицины. Также предусматривается использование в основном апирогенного экстракта из морского организма в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке, или фармацевтической композиции в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке при производстве лекарственных препаратов для лечения или предотвращения заболевания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

После рассмотрения описания изобретения специалисту в данной области техники должно быть очевидно, каким образом настоящее изобретение реализуется в различных альтернативных вариантах осуществления изобретения и альтернативных областях применения. Тем не менее, хотя различные варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны ниже, очевидно, что эти варианты осуществления изобретения представлены исключительно для примера и не являются ограничительными. Таким образом, настоящее описание различных альтернативных вариантов осуществления изобретения не должно истолковываться как ограничивающее объем или сущность настоящего изобретения. Более того, указание преимуществ изобретения или другие аспекты относятся к конкретным иллюстративным вариантам, а не обязательно ко всем вариантам, охваченным формулой изобретения.

По всему описанию и в формуле настоящей заявки термин "включать" и варианты термина, например, "включающий" и "включает" не направлен на исключение других дополнений, компонентов, целых чисел или этапов.

Ссылка по всему описанию изобретения на "один пример осуществления настоящего изобретения" или "пример осуществления настоящего изобретения" означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описание которых приведено в связи с примером настоящего изобретения, включены в, по меньшей мере, один пример осуществления настоящего изобретения. Таким образом, появление фраз "в одном примере осуществления настоящего изобретения" или "в примере осуществления настоящего изобретения" в различных местах описания настоящего изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же примеру осуществления настоящего изобретения, но могут к нему относиться.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предусматривается создание способа обработки экстракта из морских водорослей, включающего молекулу-мишень и пирогенное вещество, при этом способ включает следующий(-е) этап(-ы):

инактивацию пирогенного вещества и (или) удаление пирогенного вещества, при котором способ приводит к снижению пирогенности экстракта.

Заявитель обнаружил, что экстракты из морских водорослей и морских животных могут быть эффективно депирогенизированы, придавая им безопасные свойства для использования человеком. Важно отметить тот факт, что удаление и инактивация приводят к несущественному отрицательному действию на активные молекулы-мишени, присутствующие в экстракте. Более того, было продемонстрировано, что извлечение молекул-мишеней является коммерчески приемлемым.

В одном примере осуществления настоящего изобретения молекула-мишень является полисахаридом и предпочтительно сульфатированным полисахаридом. Полисахаридом в одном примере осуществления настоящего изобретения являются фукоидан или ульван.

Как видно из предыдущего раздела «Предпосылки к созданию изобретения», указанное открытие является существенным прогрессом в данной области техники, обеспечивая проведение более глубоких исследований медицинского применения in vivo активных молекул в морских организмах, таких как, фукоидан и ульван, а также потенциальное повседневное использование указанных активных молекул в фармацевтических композициях или при производстве медицинских имплантов.

В одном примере осуществления способа настоящего изобретения этап инактивирования пирогенного вещества включает обеспечение контакта экстракта с эффективным количеством одного или нескольких следующих соединений: оксиданта, поверхностно-активного вещества, основания, активированного угля и цеолита.

Не ограничиваясь теорией, в соответствии с которой способ включает использование оксиданта, предлагается, чтобы оксидант действовал для инактивирования пирогенного вещества. Тем не менее, было отмечено, что количество оксиданта, которое являлось эффективным при снижении пирогенности, не вызывало существенных разрушительных изменений у полисахаридной молекулы экстракта. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения молекула фукоидана или молекула ульвана в основном сохраняет биологическую активность. В соответствии со значением, используемом в настоящем контексте, термин "биологическая активность" относится к любой способности молекулы-мишени вызывать структурное и (или) функциональное изменение биологической молекулы или вызывать изменение биологической системы или пути, либо действовать в качестве биоматериала, либо действовать в качестве системы доставки лекарственного средства в биологической системе.

Широко распространенные оксиданты включают молекулярный кислород, озон, перекись водорода (Н₂O₂) и другие неорганические пероксиды, фтор (F₂), хлор (Cl₂), и другие галогены, азотную кислоту (HNO₃) и нитратные соединения, серную кислоту (H₂SO₄), пероксидисерную кислоту (H₂S₂O₈), пероксимоносерную кислоту (H₂SO₅), хлорит, хлорат, перхлорат и другие аналогичные галогенные соединения, гипохлорит и другие гипогалогенитные соединения, включая хозяйственный отбеливатель (NaClO), соединения шестивалентного хрома, такие как хромовые и дихромовые кислоты и трехокись хрома, пиридинийхлорхромат (РСС) и соединения хромата/дихромата, соединения перманганата, такие как KMnO₄, перборат натрия, оксид азота (N₂O), оскид серебра (Ag₂O), осмий тетраоксид (OsO₄), реактив Толленса, и 2,2'-дипиридилдисульфид (DPS).

В одном примере осуществления настоящего изобретения оксидантом является оксидант на основе кислорода, такой как пероксид, озон или молекулярный кислород. В одном примере осуществления настоящего изобретения оксидантом является перекись водорода. С целью потенциирования окислительной реакции катализатор, такой как ион трехвалентного железа, может быть включен в реакционную окислительную смесь. Преимущество использования пероксидов заключается в том, что окрашенные пигментные комплексы, зачастую обнаруживаемые в морских водорослях, отбеливаются, тем самым обеспечивая получение в основном получение осветленного раствора.

Количество пероксида может зависеть от вида и чистоты экстракта, тем не менее, было обнаружено, что диапазоны от приблизительно 10% до приблизительно 100% (в весовом отношении; по массе пероксида к массе полисахарида) явились эффективными. Экспериментальная работа, раскрытая в настоящем описании, позволила продемонстрировать, что приемлемый уровень снижения содержания пирогена может быть достигнут с помощью приблизительно 30% гидроксида (в весовом отношении фукоидана) в присутствии 1% лимоннокислого железа в качестве катализатора. Таким образом, в одном примере осуществления способа настоящего изобретения количество пероксида превышает приблизительно 30% (в весовом отношении).

Заявитель также продемонстрировал эффективность обработки экстрактов из морских водорослей поверхностно-активными веществами. Ни коим образом не ограничиваясь теорией, предлагается, чтобы пирогенные вещества были солюбилизированы поверхностно-активными веществами, при этом солюбилизированные вещества в большей степени поддаются инактивированию (например, оксидантом) или удалению (например, фильтрованием). Поверхностно-активное вещество может являться биологическим поверхностно-активным веществом и представлять собой тип, который зачастую используется в биохимии для солюбилизации клеточных компонентов и иных молекул природного происхождения. Поверхностно-активное вещество может быть веществом, используемом в тканевой культуре, таким как цвиттерионный детергент 3-(А,А/-диметилмиристиламмонио)пропансульфонат, 3-(децилдиметиламмонио)пропансульфонат внутренней соли, ASB-14, Brij® 58 average M_n - 1124, L-a-лизофосфатидилхолин из соевых бобов (Glycine max) ≥99%, лиофилизированный порошок, основной компонент Brij® 58: гексадециловый эфир эйкозаэтиленгликоля, 30% раствор Brij® L23 (в отношении веса к объему), основной компонент Brij® L23: додециловый эфир трикозаэтиленгликоля, C7BzO, CHAPS, CHAPSO, холевая кислота, дезоксихолевая кислота, дигитонин гликохолевая кислота, гексадецилтриметиламмоний бромид ≥98%, монододециловый эфир гексаэтиленгликоля, IGEPAL СА-630, лития додецилсульфат, А-деканоил-А-метилглюкамин, А/-додецил-А/,/V-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат, /V-нонаоил-/V-метилглюкамин, Нонидет Р-40, октил D-глюкопиранозид, октил a-D-глюкопиранозид, октил β-D-I-тиоглюкопиранозид, Плюроник F-68, Полиоксиэтилен (20), Полисорбат 20, Полисорбат 80, Сапонин, натрия холат гидрат, натрия дезоксихолат, натрия додецил сульфат, натрия гликохолат гидрат, натрия тауродезоксихолат гидрат, Tween 20, Tween 40, Tween 80, таурохолевая кислота гидрат солей натрия, Triton Х-100, Triton Х-114, урсодезоксихолевая кислота, n-додецил β-D-мальтозид, n-додецил β-D-мальтозид.

Поверхностно-активное вещество может быть веществом, используемым при солюбилизации мембран и белков, таких как, 2-циклогексилэтил β-D-мальтозид, 3-(4-терф-бутил-1-пиридинио)-1-пропансульфонат, 3-{N,N-диметилмиристиламмонио)пропансульфонат, 3-(1-пиридинио)-1-пропансульфонат, 3-(бензилдиметиламмонио)пропансульфонат, 3-(децилдиметиламмонио)пропансульфонат, 3-[/V,А-диметил(3-пальмитоиламинопропил)аммонио]-пропансульфонат, 5-циклогексилпентил β-D-мальтозид, ASB-14, ASB-C80, циклогексилметил β-D-мальтозид, децил β-D-глюкопиранозид, децил β-D-мальтопиранозид, децил^-D-1-тиомальтопиранозид, децил^-D-мальтозид, диметилдецилфосфин оксид, диметилэтиламмонийпропан сульфонат, додецилтриметиламмоний хлорид, детергент EMPIGEN® ВВ, гексадецилпиридиний хлорид моногидрат, гексаэтиленгликоль монодецил эфир, изопропил β-D-I-тиогалактопиранозид, изопропил β-D-тиогалактопиранозид, Lutro OP 2000, MEGA-8, N,N-бис[3-(D-глюконамидо)пропил]дезоксихлорамид, A/-деканоил-А-метилглюкамин, /V-додецил-А,А/-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат, N-лауроилсаркозин, А/-нонаоил-/V-метилглюкамин, нонаэтиленгликоль монододециловый эфир, октаэтиленгликоль монодециловый эфир, пентаэтиленгликоль монододециловый эфир, поли(малеиновый ангидрид-а/М-децен), производное 3-(диметил)-1-пропиламина, полиоксиэтилен (20) сорбитанмонолаурат, натрия тауродезоксихолат гидрат ≥95%, монодеканоат сахарозы, n-гептил β-D-тиоглюкопиранозид.

Поверхностно-активное вещество может быть неионным поверхностно-активным веществом. В одном примере осуществления настоящего изобретения неионное поверхностно-активное вещество представляет собой спирт С12-15, этоксилированный n молями этиленоксида (n может составлять приблизительно 12), неионное поверхностно-активное вещество G12 А12 полиэтоксилата алкилового спирта, неионный детергент додеканол этоксилата, додециловый спирт, этоксилированный прямоцепочечный спирт, полиэтилен-гликолевый эфир лаурилового спирта, полиэтилен-гликолевый монододециловый эфир, этоксилат лаурилового спирта, при этом иллюстративной формой является Teric G12A12 (ICI Chemicals) или эквивалент.

В одном примере осуществления настоящего изобретения неионным поверхностно-активным веществом является полисорбат, производное полиоксиэтилена сорбитанмонолаурата. В одном примере осуществления настоящего изобретения поверхностно-активным веществом является одно ПАВ из серии Tween (или эквивалент), и в одном примере осуществления настоящего изобретения - Tween 80 (Sigma Aldrich), или эквивалент.

В одном примере осуществления настоящего изобретения неионное поверхностно-активное вещество представляет собой вещество, имеющее гидрофильную полиэтиленоксидную цепь (опционально имеющую приблизительно 9,5 этиленоксидных единиц) и группу ароматических липофильных или гидрофобных углеводородов. Группа углеводородов может быть 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-фенильной группой. Поверхностно-активное вещество может быть одним ПАВ из серии Triton (Supelco) или эквивалентом, например, из серии Плюроник (BASF), и, в частности, Triton Х-100.

Поверхностно-активное вещество может использоваться в количествах, по меньшей мере, приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% и 90% (в весовом отношении; по массе поверхностно-активного вещества к массе полисахарида). В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения поверхностно-активное вещество используется в количестве, по меньшей мере, приблизительно 50% в весовом отношении, что может привести к 10-кратному снижению пирогенной нагрузки.

В частности, Teric® G12A12, Tween® 20 и Triton® Х100, добавляемые в 75% весовом соотношении, позволяют требуемых уровней снижения содержания пирогена.

Дополнительное преимущество использования поверхностно-активных веществ заключается в том, что выход полисахарида в количестве до 100% может быть обеспечен в некоторых примерах осуществления настоящего изобретения.

Способ может включать контактирование экстракта с основанием. Ни коим образом не ограничиваясь теорией, предлагается, чтобы основание действовало для инактивации пирогенного вещества. Полезность щелочной среды (т.е., pH>7) была продемонстрирована при депирогенизации экстрактов из морских организмов. Подходящие основания могут включать окиси металлов, гидроксиды, алкоксиды и аммиак. Для обработки экстрактов в промышленном масштабе могут быть приемлемы легко доступные и недорогостоящие основания, такие как гидроксид калия, гидроксид натрия и гидроксид кальция. В одном примере осуществления настоящего изобретения значение pH регулируется до показателя от приблизительно 10,5 до приблизительно 11,0.

В одном примере осуществления настоящего изобретения основанием является гидроксид натрия предпочтительно в приблизительно 0,5 молярном растворе. В указанном примере осуществления изобретения объем 50 мл, который может быть использован в количестве, составляющем, по меньшей мере, приблизительно 50 мл раствора, добавляется на один грамм полисахарида. В том случае, когда использовали 50 мл, было отмечено снижение пирогенной нагрузки. Большие количества гидроксида (50 мл 0,1 М гидроксид натрия) приводили к 50% снижению.

Активированный уголь и цеолит добавляли к экстракту в количестве, достаточном для поглощения, по меньшей мере, части присутствующего пирогенного вещества. Могут быть использованы количества, по меньшей мере, приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, и 50% (в весовом отношении; масса адсорбента к массе полисахарида). Было продемонстрировано, что количества, по меньшей мере, приблизительно 10% в весовом отношении приводят к снижению пирогенной нагрузки.

Следует понимать, что оксидант, поверхностно-активное вещество, основание, активированный уголь и цеолит могут быть использованы по отдельности или в любой комбинации любых 5, или в любой комбинации любых 4, или в любой комбинации любых 3, или в любой комбинации любых двух веществ.

Предпочтительной комбинацией является комбинация оксиданта с основанием. При проведении экспериментов, включающих обработку с помощью МОН (где M=Na или K) в количестве в диапазоне 10%-200% (в весовом отношении MOH к полисахариду) от массы полисахарида и H₂O₂ (10%-100% в весовом отношении пероксид к полисахариду) при различных температурах для различных временных интервалов, было продемонстрировано синергетическое действие, обеспечивающее значительное снижение содержания пирогена.

В одном примере осуществления настоящего изобретения количество основания является достаточным для достижения значения pH от приблизительно 7,0 до приблизительно 12,5. Предпочтительной комбинацией является комбинация оксиданта, основания и поверхностно-активного вещества. Несмотря на то, что комбинация перекиси водорода с Teric-G12A12 не приводила к снижению пирогенной нагрузки по сравнению с непосредственной обработкой пероксидом, добавление основания (такого как гидроксид натрия или гидроксид калия) приводили к синергическому эффекту, снижающему содержание пирогена.

Другой предпочтительной комбинацией является комбинация активированного угля с основанием. Активированный уголь испытывали как в кислотной, так и щелочной среде, при этом значительное снижение пирогенной нагрузки наблюдалось для щелочной среды, но не для кислотной среды.

В тех случаях, когда способ включает этап удаления пирогенного вещества, способ включает этап(-ы) связывания экстракта с одним или несколькими из следующих веществ: активированным углем, цеолитом, лигандом, способным к значительному специфическому связыванию с пирогенным веществом и значительному отделению связанного пирогенного вещества от молекулы-мишени.

Специалисту в данной области техники известны многие способы, с помощью которых можно достичь отделения.

Например, может быть использован метод обработки партиями, при этом заданный объем экстракта обрабатывают в сосуде и связанное пирогенное вещество отделяют от молекулы-мишени путем осаждения или флокуляции комплексов. В альтернативном случае связанное пирогенное вещество может быть отделено методом центрифугирования или с помощью способа отделения на магнитных микроносителях.

В одном примере осуществления настоящего изобретения лигандом, способным к значительному специфическому связыванию с пирогенным веществом, является полимиксин В.

Специалистам в данной области техники известны стандартные методы препаративной хроматографии, что продемонстрировано в работе «Preparative Chromatography)) (Edited by H. Schmidt-Traub et al, Second Edition, 2012, Wiley-VCH Weinheim), содержание которой включено в данное описание путем отсылки.

Способы настоящего изобретения могут включать этап гидролиза, и опционально этап фракционирования для получения полисахаридных фрагментов для различных молекулярных весов. Были проведены исследования по биоактивности фракций различного молекулярного веса одного и того же полисахаридного источника, при этом были обнаружены существенные различия. Было обнаружено, что фракция фукоидана с более высоким молекулярным весом была более эффективна, чем нефракционированный сырой фукоидан при ингибировании фиброза печени (Nakazato et al; Attenuation of N- nitrosodiethylamine-induced liver fibrosis by high-molecular-weight fucoidan derived from Cladosiphon okamuranus. J. Gastroenterol. Hepatol. 2010; 25: 1692-1701). В другом исследовании было проведено сравнение трех различных фракций фукоидана у мышей (Shimizu et al; Proportion of murine cytotoxic T-cell is increased by high-molecular weight fucoidan extracted from Okinawa Mozuku (Cladosiphon okamuranus) J. Health Sci. 2005; 51: 394-397). Указанное исследование позволило продемонстрировать дифференцированные иммунные эффекты с более существенным повышением экспрессии CD8 в селезенке животных, которым вводили фракции фукоидана с высоким молекулярным весом по сравнению с животными, которым вводили фракции фукоидана с низким молекулярным весом.

Гидролиз может быть частичным или полным и может быть достигнут за счет создания кислой среды, ферментной обработки или любых иных способов, которые должны быть очевидны специалистам в данной области техники.

Фракционирование может быть достигнуто с помощью хорошо известных методов, таких как хроматографический метод (например, путем использования смол, таких как сефароза для гель-фильтрационной хроматографии) или, например, ультрафильтрация.

Как вариант, способы могут быть применены к уже гидролизированным и (или) фракционированным полисахаридным препаратам.

Предпочтительно, чтобы некоторые примеры осуществления способа настоящего изобретения обеспечивали коммерчески требуемый выход полисахарида, при этом обеспечивая создание эффективно депирогенизированного продукта. Выход может превышать приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. В одном примере осуществления настоящего изобретения, выход превышает приблизительно 30%. В другом примере осуществления настоящего изобретения выход превышает приблизительно 60%. Несмотря на то, что вышеуказанный выход выражен на основе веса полученного полисахарида, очевидно, что вместо этого показателя могут быть использованы биологическая активность или иные приемлемые параметры.

Заявитель указал на дополнительное преимущество масштабируемости способов настоящего изобретения, продемонстрировав имеющее коммерческое значение извлечения целевого фукоидана, используя килограммовые количества высушенного фукоидан, при этом снижая пирогенную нагрузку на 99%. В настоящем описании ссылка дается на Пример 20. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения способ позволяет использовать, по меньшей мере, приблизительно 0,1 кг, 0,5 кг, 1 кг, 2 кг, 3 кг, 4 кг, 5 кг, 6 кг, 7 кг, 8 кг, 9 кг, 10 кг, 20 кг, 30 кг, 40 кг, 50 кг, 60 кг, 70 кг, 80 кг, 90 кг или 100 кг высушенного полисахарида в качестве исходного материала.

Измерение инактивации или удаления пирогенного вещества может быть проведено с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники. Одним приемлемым тестом является анализ на основе Лизата амебоцитов Limulus (LAL). Имеется ряд комплектов, таких как комплект "Chromo-LAL", реализуемый компанией «Associates of Cape Cod Incorporated» (MA). В указанном тесте солиофилизированный LAL и субстратный реактив смешивают с испытуемым образцом в микропланшете и инкубируют на ридере при температуре 37±1°C. Результаты измерений абсорбции собирали с течением времени после добавления Chromoc-LAL и проведения анализа с помощью соответствующей программы. Рассчитывается время (время начала), требуемое для того, чтобы образец достиг специфической абсорбции (onset OD); и строится стандартная кривая, показывающая линейную корреляцию между лог-временем начала и лог-концентрацией стандартного эндотоксина. Максимальный диапазон концентраций эндотоксина для стандартной кривой составляет 0,005 ЕЭ/мл-50 ЕЭ/мл. Чувствительность (λ) анализа определяется как минимальная концентрация, используемая на стандартной кривой. Максимальная чувствительность указанного теста составляет 0,005 ЕЭ/мл.

Концентрация эндотоксина для соответствующего времени начала рядовой пробы считывается со стандартной кривой, являющейся графиком в логарифмическом масштабе по обеим осям времен начала в зависимости от стандартных концентраций, или арифметическим графиком логарифмов времен начала в зависимости от логарифмов стандартных концентраций. Уравнение прямой повторного логарифма, генерируемое для иллюстративной стандартной кривой, имеет вид Y=-0.2Х+3,14, где Y=лог времени начала и X=лог-концентрация эндотоксина. Концентрация эндотоксина в рядовой пробе со средним временем начала, составляющим 1630 секунд, рассчитывается путем преобразования времени начала в его логарифмическое значение - 3,212, решения уравнения для X, и принятия антилогарифма X для получения концентрации:

X=(Y-3,14)/-0,2

Х=(3,212-3,14)/-0,2

X=-0,36

Антилогарифм (-0,36)=0,44 ЕЭ/мл (или ЕЭ/мг)

Обычно количества эндотоксина в экстракте из морских водорослей, определяемые тестом LAL, находятся в пределах от 5000 до 10000 ЕЭ/мг. Способы депирогенизации настоящего изобретения позволяют снизить количество эндотоксина до менее, чем приблизительно 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, или 1 ЕЭ/мг.

Другим тестом, который используется для демонстрации инактивации или удаления пирогенного вещества, является тест на кроличий пироген в Фармакопеи США (USP<151>). Тест на кроличий пироген представляет собой тест in vivo для качественного определения пирогенов. Кролики обладают аналогичной переносимостью пирогена, как и человек, таким образом, наблюдая за изменением температуры тела у кроликов, существует возможность определения присутствия пирогенов. С помощью этого метода можно обнаружить пирогены небактериальных эндотоксинов, а также бактериальные эндотоксины.

Если ни у одного из кроликов не наблюдается индивидуального повышения температуры на 0,5°C или выше их соответствующей контрольной температуры при введении дозы соответствующего количества вещества, вещество отвечает требованиям отсутствия пирогенов. Если у любого из кроликов наблюдается индивидуальное повышение температуры на 0,5°C или выше, продолжают проводить тест, используя пять других кроликов. Если не более чем у трех из восьми кроликов наблюдается индивидуальное повышение температуры на 0,5°C или выше, и если сумма повышения восьми индивидуальных максимальных температур не превышает 3,3°C, испытуемый материал отвечает требованиям отсутствия пирогенов.

В одном примере осуществления способа настоящего изобретения инъецирование обработанного экстракта приводит к тому, что ни у одного из кроликов не наблюдается индивидуального повышения температуры на 0,5°C или выше по сравнению с его соответствующей контрольной температурой. В том случае, когда тестирование продолжается с использованием дополнительных 5 кроликов, в одном примере осуществления настоящего изобретения инъецирование обработанного экстракта приводит к повышению индивидуальной температуры не более чем у трех из восьми кроликов на 0,5°C или выше, и сумма повышения восьми индивидуальных максимальных температур не превышает 3,3°C.

Как LAL-тест, так и тест на кроличий пироген в Фармакопеи США, признаются Управлением по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств США как приемлемые при оценке безопасности для применения парентеральных препаратов.

В некоторых примерах осуществления способа настоящего изобретения, по меньшей мере, приблизительно 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,9%, 99,99% или 99,999% пирогенного вещества удаляют и (или) инактивируют. В одном примере осуществления настоящего изобретения пирогенное вещество удаляют и (или) инактивируют до уровня, допустимого государственным контролирующим органом, таким как Управлением по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств США или Европейским агентством по лекарственным средствам, или Управлением по контролю за изделиями медицинского назначения Австралии, или Министерством здравоохранения Канады, поскольку требования указанных организаций определены на дату подачи настоящей заявки. Предпочтительно, чтобы способ предусматривал, по меньшей мере, приблизительно 50%, 90% или 99% удаление и (или) инактивацию. В одном примере осуществления настоящего изобретения композиция фукоидана, полученная с помощью указанного способа, позволяет создать композицию, способную пройти тест на кроличий пироген в Фармакопеи США и (или) тест LAL. В одном примере осуществления настоящего изобретения с применением способа возможно получить раствор, содержащий меньшее количество пирогена, чем приблизительно 100 ЕЭ/мл, как определено с помощью LAL-теста.

Экстракт из морского организма можно получить из морских бурых водорослей класса Phaeophyceae, отряда Laminariales (например, Kesiphycacease, Alariaceae, Chordaceae, Costariaceae, Laminariaceae, Lessoniaceae и Pseudochordaceae) или отряда Fucales (например, Bifurcariopsdaceae, Durvillaeaceae, Fucaceae, Himanthallaceae, Hormosiraceae, Notheiaceae, Sargassaceae и Seirococcaceae). Примеры отряда морских водорослей Laminariales включают виды Genus Undaria, такие как, но не ограниченные Undaria pinnatifida, или родственные виды, такие как Alaria esculenta, Saccorhiza polysaccharides, Undaria undarioides, Undaria peterseniana и Laminaria sp, такие как Laminaria digitata, Laminaria hyperborean, Laminaria ochroleuca, Laminaria saccharina, Laminaria agardhii, Laminaria angustata, Laminaria bongardina, Laminaria cuneifolia, Laminaria dentigera, Laminaria ephemera, Laminaria farlowii, Laminaria groenlandica, Laminaria japonica, Laminaria longicruris, Laminaria nigripes, Laminaria ontermedia, Laminaria pallida, Laminaria platymeris, Laminaria saccharina, Laminaria setchellii, Laminaria sinclairli, Laminaria solidungula и Laminaria stenophylla. Примеры морских водорослей отряда Fucales включают виды Genus Fucus, такие как, но не ограниченные Fucus vesicuiosus, Fucus ceranoides, Fucus chalonii, Fucus cottonii, Fucus distichus, Fucus evanescens, Fucus gardneri, Fucus nereideus, Fucus serratus, Fucus spermophorus, Fucus spiralis, Fucus tendo и Fucus virsoides.

Другие отряды морских бурых водорослей включают Ascoseirales, Cutleriales, Desmarestiales, Dictyotales, Discosporangiales, Extocarpales, Ishigeales, Nemodermatales, Onslowiales, 500 Ralfsiales, Scytosiphonales, Scytothaminales, Sphacelariales, Sporochnales, Syringodermatales, Tilopteridales и Incertaesedis.

Определенные морские бурые водоросли включают виды Ascoseira, Cutleria, Microzonia, Zanardinia, Arthrocladia, Desmarestia, Himantothallus, Phaeurusm, Dictyopteris, Dictyota, Dilophus, Distromium, Glossophora, Homoeostrichus, Lobophora, Lobospira, Newhousia, Pachydictyon, Padina, Spatoglossum, Stypopodium, Taonia, Zonaria, Scoresbyella, Choristocarpus, Discosporangium, Acinetospora, Feldmannia, Geminocarpus, Hincksia, Pogotrichum, Pylaiella, Adenocystis, Caepidium, Utriculidium, Acrothrix, Ascoseirophila, Asperococcus, Austrofilum, Chordaria, Cladosiphon, Corycus, Delamarea, Dictyosiphon, Elachista, Eudesme, Giraudia, Gononema, Halothrix, Haplogloia, Hecatonema, Heterosaundersella, Hummia, Isthmoplea, Laminariocolax, Laminar ionema, Leathesia, Leptonematella, Litosiphon, Microspongium, Mikrosyphar, Myelophycus, Myriogloea, Myrionema, Myriotrichia, Papenfussiella, Petrospongium, Pleurocladia, Polytretus, Proselachista, Protectocarpus, Punctaria, Sauvageaugloia, Soranthera, Sorocarpus, Spermaiochnus, Sphaerotrichia, Stictyosiphon, Streblonema, Striaria, Stschapovia, Tinocladia, Chordariopsis, Asterocladon, Ectocarpus, Kuckuckia, Mesospora, Asterotrichia, Bachelotia, Bifurcariopsis, Durvillaea, Ascophyllum, Fucus, Hesperophycus, Pelvetia, Pelvetiopsis, Silvetia, Xiphophora, Himanthalia, Hormosira, Notheia, Anthophycus, Axillariella, Bifurcaria, Bifurcariopsis, Carpoglossum, Caulocystis, Coccophora, Cystophora, Cystoseira, Halidrys, Hizikia, Hormophysa, Myagropsis, Myogropsis, Myriodesma, Sargassum, Turbinaria, Cystophaera, Marginariella, Phyllospora, Seirococcus, Ishige, Akkesiphycus, Alaria, Aureophycus, Druehlia, Eualaria, Hirome, Lessoniopsis, Pleurophycus, Pterygophora, Undaria, Undariella, Undariopsis, Chorda, Agarum, Costaria, Dictyoneurum, Thalassiophyllum, Arthrothamnus, Costularia, Cymathere, Feditia, Gigantea, Laminaria, Macrocystis, Nereocystis, Pelagophycus, Pelagophycus x Macrocystis, PhycoCastanum, Phyllariella, Polyschidea, Postelsia, Pseudolessonia, Saccharina, Streptophyllopsis, Ecklonia, Eckloniopsis, Egregia, Eisenia, Lessonia, Pseudochorda, Nemoderma, Onslowia, Verosphacella, Neoralfsia, Basispora, Hapalospongidion, Jonssonia, Lithoderma, Myrionemopsis, Petroderma, Porterinema, Pseudolithoderma, Ralfsia, Chnoospora, Colpomenia, Hydroclathrus, Petalonia, Rosenvingea, Scytosiphon, Bodanella, Coelocladia, Heribaudiella, Phaeostroma, Asteronema, Scytothamnus, Stereocladon, Splachnidium, Cladostephus, Sphacelaria, Sphacella, Alethocladus, Halopteris, Stypocaulon, Austronereia, Bellotia, Carpomitra, Encyothalia, Nereia, Perisporochnus, Perithalia, Sporochnema, Sporochnus, Tomaculopsis, Syngoderma, Halosiphon, Masonophycus, Phyllariopsis, Saccorhiza, Stschapovia, Haplospora, Phaeosiphoniella, Tilopteris, Neolepioneuma, Analipus и Phaeostrophion.

Определенные морские бурые водоросли включают виды Adenocystis, Alaria, Ascophyllum, Chorda, Cladosiphon, Desmarestis, Dictyota, Durvillaea, Ecklonia, Ectocarpus, Egregia, Fucus, Halidrys, Himanthalia, Hormosina, Lethesia, Lessonia, Macrocystis, Nereocystis, Padina, Pelagophycus, Pelvatia, Pilaiella, Postelsia, Saccrhiza, Sargassum, Sphacelaria и Turbinaria.

Другие приемлемые морские организмы включают морские зеленые водоросли и иглокожие, например, морские ежи и морские огурцы. Примеры морских зеленых водорослей включают Ulva sp, Enteromorpha sp, Codium sp, Caulerpa sp и Halimala sp.

В одном примере осуществления настоящего изобретения экстракт получен из Undaria pinnatifida, Fucus vesiculosus или Ulva sp.

Фукоидан также может быть получен из Chorda filum, Cladosiphon okamuranus, Undaria pinnatifida, Leathesia difformis, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Pelvetiafastigiata, Saundersella simplex или Chordariaflagelliformis.

Следовательно, источником получения экстракта могут служить любые морские бурые или зеленые водоросли или любые иглокожие.

В том случае, когда морской организм является растением, экстракт может быть извлечен из целого растения или любой части растения, такой как листья, стебли, споры или их сочетания. Исходным материалом для получения экстракта может являться свежий, замороженный или высушенный материал.

Экстракт может быть получен с использованием таких способов, как мацерация, экссудация, вываривание, экстракция с обратным холодильником, экстракция с помощью ультразвука, экстракция с помощью разделения фаз растворителя и сверхкритическая экстракция с сорастворителями или без них. Также может быть использован способ обработки морских водорослей кислотами или основаниями для получения экстракта, применяемого в качестве исходного материала для способов настоящего изобретения.

В одном примере осуществления настоящего изобретения способ предназначен для отделения углевода и, в частности, для отделения полисахарида. Полисахарид может представлять собой алгинат или сульфатированный полисахарид.

В одном примере осуществления настоящего изобретения сульфатированный полисахарид является фукоиданом или производным фукоидана. В контексте настоящего изобретения, термин "фукоидан" означает сульфатированный альфа-L-фукан, представляющий собой тип, обнаруженный во многих морских растениях и животных.

В одном примере осуществления настоящего изобретения сульфатированный полисахарид является ульваном, или производным ульвана. В контексте настоящего изобретения, термин "ульван" означает сульфатированный компонент клеточной стенки из зеленых водорослей, состоящих из в различной степени сульфатированных рамнозы, ксилозы и остатков глюкуроновой и идуроновой кислот.

Кроме того, термины "фукоидан" и "ульван" дополнительно включают их биологически активные фрагменты, производные или аналоги. Также термин включает фрагменты фукоидана или ульвана, полученные путем расщепления (например, гидролиза) более крупных молекул. Расщепление может быть достигнуто путем обработки кислотой, основанием, нагревом или ферментами для получения расщепленного фукоидана или ульвана, которые могут быть или не могут быть выделены отдельно. Фукоидан и ульван также могут быть химически изменены и могут иметь модификации, включая без ограничения сульфатизацию, полисульфатизацию, ацетилирование, этерификацию и метилирование.

В одном примере осуществления настоящего изобретения способ не включает этап, в соответствии с которым требуется использование асбеста, детоксифицирующих липополисахарид ферментов, гуанидин гидрохлорида, сульфата аммония, хроматографической смолы, Acticlean endotox, иммобилизированного гистамина, или двуокиси кремния Triton, или иного депирогенизирующего фильтра, коммерчески доступного на дату подачи настоящей заявки.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение предусматривает создание в основном апирогенного экстракта из морского организма. Предпочтительно, чтобы содержание пирогенного вещества в экстракте составляло менее приблизительно 100 ЕЭ/мл, как определено с использованием LAL-теста, и (или) чтобы экстракт был способен пройти кроличий тест на пирогенность.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение предусматривает создание экстракта, приготовленного с помощью способа, описание которого представлено в настоящей заявке.

В одном примере осуществления настоящего изобретения, экстракт получен, по меньшей мере, частично, с помощью способа, описание которого приведено в настоящей заявке. При этом понимается, что в способ настоящего изобретения могут быть включены дополнительные этапы для снижения содержания и (или) удаления пирогенного вещества.

Обработанные экстракты могут быть проанализированы на чистоту и различные свойства содержащихся в них полисахаридов, такие как молекулярный вес, содержание углеводов, включающих фукозу, галактозу, рамнозы, ксилозы, уроновые кислоты, загрязнение тяжелыми металлами, сульфатизация, ацетилирование, противоионы и воду. Может быть использован ряд аналитических методов для охарактеризования пробы полисахарида, включая без ограничения, высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), анализ химического состава, рассеяние лазерного излучения (LLS), масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS), спектроскопию в ультрафиолетовой и видимой области (UV-Vis) и метод газовой хроматографии-массовой спектрометрии. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения, фукоидан в обработанном экстракте в основном обладает аналогичными вышеуказанными свойствами при сравнении с необработанным фукоиданом.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение предусматривает создание фармацевтической композиции, включающей полисахарид, полученный в соответствии со способами, описание которых приведено в настоящей заявке, в комбинации с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом. Иллюстративные вспомогательные вещества включают, без ограничения, углеводы, неорганические соли, противомикробные средства, антиоксиданты, поверхностно-активные вещества, буферные растворы, кислоты, основания и их сочетания. Вспомогательными веществами, подходящими для инъецируемых композиций, являются вода, спирты, полиолы, глицерин, растительные масла, фосфолипиды и поверхностно-активные вещества. Углевод, например, сахар, дериватизированный сахар, например, альдит, альдоновая кислота, этерифицированный сахар, и (или) сахарный полимер могут присутствовать в качестве вспомогательного вещества. Специфические углеводные вспомогательные вещества включают, например: моносахариды, например, фруктозу, мальтозу, галактозу, глюкозу, D-маннозу, сорбозу и аналогичные соединения; дисахариды, например, лактозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу и аналогичные соединения; полисахариды, например, раффинозу, мелезитозу, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и аналогичные соединения; и алдитолы, например, маннитол, ксилитол, мальтитол, лактитол, ксилитол, сорбитол (глюцитол), пиранозил сорбитол, миоинозитол и аналогичные соединения. Вспомогательные вещества также могут включать неорганическую соль или буфер, например, лимонную кислоту, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, нитрат калия, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия и их сочетания.

Композиция настоящего изобретения также может включать антимикробное средство для предотвращения или замедления микробного роста. Неограничивающие примеры антимикробных средств, приемлемых для настоящего изобретения, включают бензалкония хлорид, бензетония хлорид, бензиловый спирт, цетилпиридиний хлорид, хлорбутанол, фенол, фенилэтиловый спирт, нитрат фенилртути, тимерсол и их сочетания.

Композиция может содержать антиоксидант для ингибирования окисления, тем самым предотвращая ухудшение качества фукоидана или иных компонентов препарата. Приемлемые антиоксиданты для использования в настоящем изобретении включают, например, аскорбил пальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, гипофосфористая кислота, монотиоглицерол, пропил галлат, полифенолы, натрия бисульфит, натрия формальдегид сульфоксилат, натрия метабисульфит и их сочетания.

Поверхностно-активное вещество может присутствовать в качестве вспомогательного вещества. Иллюстративные поверхностно-активные вещества включают: полисорбаты, такие как "Tween 20" и "Tween 80," и плюроники, такие как F68 и F88 (BASF); сложные эфиры сорбитана; липиды, например, фосфолипиды, например, лецитин и другие фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, жирные кислоты и жирные эфиры; стероиды, например, холестерин; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); и цинк и иные такие приемлемые катионы.

Кислоты или основания могут присутствовать в качестве вспомогательного вещества в композиции. Неограничивающие примеры кислот, которые могут быть использованы, включают кислоты, выбранные из группы, включающей хлористоводородную кислоту, уксусную кислоту, фосфористую кислоту, лимонную кислоту, оксиянтарную кислоту, молочную кислоту, муравьиную кислоту, трихлоруксусную кислоту, азотную кислоту, перхлорную кислоту, фосфорную кислоту, серную кислоту, фумаровую кислоту и их сочетания. Примеры приемлемых оснований включают без ограничения основания, выбранные из группы, включающей гидроксид натрия, ацетат натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия, ацетат аммония, ацетат калия, фосфат натрия, фосфат калия, цитрат натрия, формат натрия, сульфат натрия, сульфат калия, фумарат калия и их сочетания.

В другом примере осуществления настоящее изобретение предусматривает создание биоматериала, включающего полисахарид, полученный по способу в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке. Ульван может быть использован в качестве биологического цемента (например, костного цемента) или он может образовывать трехмерный клеточный каркас для обеспечения роста новой ткани. Более того, ульван может быть использован в качестве биоразрушаемого гидрогеля, и он является потенциально эффективным в качестве системы доставки лекарственных средств. В данном контексте ульван может быть функционализирован, например, путем прививки радикальных полимеризуемых групп для получения биоразрушаемых гидрогелей.

Апирогенные фукоиданы настоящего изобретения могут найти применение в ряде областей медицинской практики или в стерильных лабораторных условиях (ex vivo), в частности, в качестве модулятора коагуляции, фибринолитика, в качестве противоопухолевого препарата, противовирусного препарата (см., в частности, опубликованную международную заявку на патент заявителя WO/2011100805, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки), либо в качестве гемопоэтической стволовой клетки или иного типа мобилизирующего агента стволовых клеток.

Другие клинические показания, для которых могут найти применение экстракты апирогенного фукоидана настоящего изобретения, включают воспаление. Фукоидан может действовать посредством активности блокады селектина, блокады фагоцитарных рецепторов и модуляции накопления воспалительных клеток. [Фукоидан может быть применим для лечения] острых и хронических воспалительных заболеваний, включающих астму, аллергический дерматит, сердечнососудистые заболевания, постишемическое воспаление и воспаление, вызванное другим типом инфекции или патологии.

Экстракт апирогенного фукоидана может действовать в качестве мобилизирующего агента стволовых клеток в контексте вспомогательного агента радиационной и химиотерапии для защиты стволовых клеток пациентов со злокачественными новообразованиями. Экстракты могут найти применение в качестве прямого противоопухолевого препарата или вспомогательного противоопухолевого препарата. Кроме того, предусматривается их применение в терапевтических целях для лечения кишечных заболеваний, в частности, желудочных заболеваний, вызванных этанолом или другими веществам, либо инфекционными бактериями, такими как Helicobacter pylori и Clostridium difficile.

Также предусматривается применение экстракта апирогенного фукоидана в качестве противовирусного средства, включая лечение герпесвирусных инфекций (в том числе HSV1, HSV2 и их штаммов, резистентных к лекарственным средствам), генерализованной цитомегалической болезни (HCMV), гриппозных инфекций и ВИЧ-инфекции. При указанных инфекциях типичным является топическая или пероральная доставка лекарственного средства, хотя при некоторых герпесвирусных инфекциях может потребоваться непосредственное применение лекарственного средства на пораженном участке путем инъецирования или с использованием других методов.

Лечению также потенциально подлежат заболевания с нарушением иммунитета путем иммуномодуляции за счет способности фукоидана повышать иммунитет, в том числе увеличивать количество и повышать активность клеток, входящих в состав иммунной системы организма, таких как моноциты, естественные клетки-киллеры и дендритные клетки. Известно, что фукоидан способен повышать активность указанных клеток для создания антипатогенного или противоракового эффекта.

Кроме того, предусматривается его применение в области практической хирургии при проведении противоспаечной терапии для предотвращения возникновения спаек.

Дополнительное предполагаемое использование заключается в модуляции ферментной активности, в том числе, такой как коагуляция, метаболизм глюкозы, модуляция обмена матриксного белка и иные ферментные процессы как ex vivo, так и in vivo. Экстракты фукоидана настоящего изобретения также могут найти применение для модуляции активности факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста (TGF) и их рецепторы.

Экстракты фукоидана настоящего изобретения могут быть использованы для лечения заболеваний нервной системы (в том числе заболеваний, обусловленных амилоидным накоплением), при нарушении свертывания крови (в том числе в качестве антитромботического, тромболитического, антикоагулянтного или прокоагулянтного средства), а также при гемофилии, в качестве компонента крема для топического применения, дентальных аппликаций, офтальмологических аппликаций и в качестве носителя радиоактивного маркера для визуализации Р-селектина. Кроме того, экстракты апирогенного фукоидана могут быть использованы в качестве регулятора высвобождения или носителя для антибиотиков и иных активных веществ.

Апирогенные фукоиданы могут быть доставлены в организм с помощью любого приемлемого метода и к любой части организма, как считает нужным врач-клиницист.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает создание способов лечения таких заболеваний человека и иных млекопитающих с использованием композиций в соответствии с описанием, представленным в настоящей заявке.

Ниже представлено более полное описание настоящего изобретения со ссылкой на нижеизложенные неограничивающие примеры.

ПРИМЕР 1: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida Исходный материал представлял собой продукт, подвергшийся сублимационной сушке и предварительно очищенный для фукоидана, до приблизительно 87%, включающий нейтральные углеводы (приблизительно 50%-27,5% фукозы, 22,5% галактозы), сульфат (26%), ацетильные компоненты (3%) и противоионы (8%).

Всю воду, используемую в данном способе, фильтровали через депирогенизирующий фильтр до использования. Все оборудование дезинфицировали и промывали апирогенной водой до использования.

2,86 кг фукоидана, подвергшегося сублимационной сушке, растворяли в 50-кратном (143 л) 0,05 М NaOH.

Растворение проводили сначала заполнив реакционный аппарат приблизительно 114,4 л дистиллированной воды (т.е., 80% от 143 л). 5,94 кг NaOH добавляли к дистиллированной воде, и затем добавляли остальное количество от 143 л дистиллированной воды. Далее в процессе перемешивания добавляли твердый фукоидан (2,86 кг). Раствор нагревали до 40°C в процессе перемешивания до полного растворения всех твердых веществ. Раствор далее выдерживали при 40°C в течение 10 минут.

3 кг вспомогательной фильтрующей присадки Speedplus (Dicalite, PA) добавляли к раствору, и фильтрование проводили с использованием напорного фильтра. 180 л фильтрата собирали и перемещали в чистый реакционный аппарат.

2,6 л H₂O₂ (50% в весовом отношении) добавляли к фильтрату, и раствор выдерживали при 60°C в течение 1 часа в процессе перемешивания. Раствор далее охлаждался до 45°C, и значение pH регулировали до 10,0-10,5 с использованием H₂SO₄ (36% в весовом отношении). Достигали окончательное значение pH, составляющее 10,44.

Проводили ультрафильтрацию раствора с отрегулированным значением pH с использованием мембраны площадью 77 футов², при номинальном отсечении по молекулярной массе 30 kDa (Synder Filtration, CA)

Ультрафильтрационное оборудование было собрано и дезинфицировано путем рециркуляции раствора 150 мл NaOCl на 100 л дистиллированной воды при 45-50°C, при значении pH 10-11 в течение 30 минут. Оборудование промывали, по меньшей мере, 200 л апирогенной дистиллированной воды. Раствор фукоидана добавляли в ретентатный реактор, и ультрафильтрацию проводили до тех пор, пока ретентат не концентрировали до приблизительно 20% от исходного объема. Давление подачи поддерживали на уровне 2,0 бар, и давление ретентата при 1,0 бар на протяжении всего этапа ультрафильтрации. Скорость процесса ультрафильтрации вначале составляла 12,5 л/мин и снижалась до 10,8 л/мин по завершении ультрафильтрации.

Концентрированный раствор фукоидана (40 л) далее подвергали диафильтрации с использованием апирогенной дистиллированной воды (160 л). Давление подачи поддерживали на уровне 2,0 бар, давление ретентата при 1,0 бар. Скорость процесса ультрафильтрации снизилась с 10,9 л/мин до 7,5 л/мин в течение 20 мин.

Значение pH далее регулировали до 8 с помощью H₂SO₄, и диафильтрацию продолжали с другими 4-я объемами (160 л) апирогенной дистиллированной воды. Давление подачи поддерживали на уровне 2,0 бар, давление ретентата при 1,0 бар. Скорость процесса ультрафильтрации снизилась с 7,5 л/минуту до 6,0 л/минуту в течение 27 минут диафильтрации.

Раствор далее концентрировали до объема 40 л.

Концентрат пропускали через новый Cuno 1 DEPL депирогенизирующий фильтр и затем подвергали сублимационной сушке. Получали в общей сложности 1820 г твердого вещества. Подвергшийся сублимационной сушке продукт измельчали через Comil 032 сито.

Был рассчитан технологический выход в размере 63%. Было отмечено 90% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

ПРИМЕР 2: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с цеолитом с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (15,00 г) растворяли в 300 мл дистиллированной воды и фильтровали через стекловолоконный фильтр. Объем фильтрата доводили до 300 г дистиллированной водой. 40 мл аликвота раствора фукоидана разводили до 100 мл дистиллированной водой и добавляли 0,2 г цеолита. Суспензию перемешивали в течение 14 часов до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и ретентат промывали 100 мл дистиллированной воды до концентрирования до конечного объема 40 мл и подвергали сублимационной сушке.

Было отмечено 1% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

При проведении аналогичного процесса, но не включающего этап контактирования с цеолитом, выход фукоидана составил 92,5% без снижения содержания пирогена.

ПРИМЕР 3: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с низкоконцентрированной щелочью и активированным углем, с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (15,00 г) растворяли в 300 мл дистиллированной воды и фильтровали через стекловолоконный фильтр. Фильтрат доводили до 300 г дистиллированной водой. 40 мл аликвота раствора фукоидана разводили до 100 мл 0,5% NaOH и добавляли 0,2 г активированного угля. Суспензию перемешивали в течение 14 часов до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon, и ретентат промывали 100 мл апирогенной дистиллированной водой до концентрирования до конечного объема 40 мл и подвергали сублимационной сушке. Было отмечено 66% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

ПРИМЕР 4: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с поверхностно-активным веществом с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (10,00 г) растворяли в 300 мл апирогенной воды. Раствор фильтровали через стекловолоконный фильтр и получали прозрачный раствор бурого цвета (- 280 мл).

75 г аликвота раствора фукоидана разводили до 150 мл дистиллированной водой и добавляли 1,8 г Teric® G12A12. Суспензию перемешивали в течение 1 часа до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon, и ретентат промывали 100 мл апирогенной дистиллированной водой до концентрирования до конечного объема 40 мл и подвергали сублимационной сушке. Было отмечено 93% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

75 г аликвота раствора фукоидана разводили до 150 мл дистиллированной водой и добавляли 1,8 г Tween® 20. Суспензию перемешивали в течение 1 часа до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon, и ретентат промывали 100 мл апирогенной дистиллированной водой до концентрирования до конечного объема 40 мл и подвергали сублимационной сушке.

75 г аликвота раствора фукоидана разводили до 150 мл дистиллированной водой и добавляли 1,8 г Triton® Х100. Суспензию перемешивали в течение 1 часа до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon, и ретентат промывали 100 мл апирогенной дистиллированной водой до концентрирования до конечного объема 40 мл и подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 5: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (6,00 г) растворяли в 250 мл дистиллированной воды. Значение pH выдерживали на уровне 7,00 с использованием автотитратора, дозирующего 0,5 М NaOH. Раствор нагревали при перемешивании до 90°C на плите, далее добавляли 3,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂. По истечению 1 часа в ходе реакции было поглощено 4,37 мл щелочи. Раствор выдерживали при комнатной температуре в течение ночи до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Фильтрат далее фильтровали через кювету с перемешиванием Amicon, и ретентат промывали 50 мл апирогенной дистиллированной водой до концентрирования до 50 мл и подвергали сублимационной сушке.

Было отмечено 83% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

ПРИМЕР 6: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с пероксидом в присутствии катализатора на основе оксида железа с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (10,00 г) растворяли в 250 мл дистиллированной воды. Значение pH выдерживали на уровне 7,00 с использованием автотитратора, дозирующего 0,5 M NaOH. Раствор нагревали при перемешивании до 60°C на плите, далее добавляли 10,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ и 0,1 г FeIII цитрата. По истечению 4 часов было поглощено 14,92 мл щелочи. Раствор выдерживали при комнатной температуре в течение ночи до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Фильтрат далее фильтровали через кювету с перемешиванием Amicon, и ретентат промывали 50 мл апирогенной дистиллированной водой до концентрирования до 50 мл и подвергали сублимационной сушке.

Было отмечено 94% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

ПРИМЕР 7: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом в присутствии катализатора на основе оксида железа, при второй обработке пероксидом с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (10,00 г) растворяли в 250 мл дистиллированной воды. Значение pH выдерживали на уровне 7,00 с использованием автотитратора, дозирующего 0,5 М NaOH. Раствор нагревали при перемешивании до 60°C на плите, далее добавляли 10,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ и 0,1 г FeIII цитрата. По истечению 2 часов было поглощено 12,10 мл щелочи. Далее добавляли 5,0 H₂O₂ мл 30% в весовом отношении. По истечению 10 часов в общей сложности было поглощено 15,23 мл щелочи. Раствор выдерживали при комнатной температуре в течение ночи до фильтрования через стекловолоконный фильтр. Фильтрат далее фильтровали через кювету с перемешиванием Amicon, и ретентат промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды до концентрирования до 50 мл и подвергали сублимационной сушке.

Было отмечено 99% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

ПРИМЕР 8: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом в присутствии катализатора на основе оксида железа и поверхностно-активным веществом с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (10,00 г) растворяли в 250 мл дистиллированной воды. Значение pH выдерживали на уровне 7,00 с использованием автотитратора, дозирующего 0,5 М NaOH. Раствор нагревали при перемешивании до 70°C на плите, далее добавляли 10,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ и 0,1 г FeIII цитрата. По истечению 1 часа было поглощено 12,22 мл щелочи. Раствор охлаждали и выдерживали при комнатной температуре в течение ночи до фильтрования через стекловолоконный фильтр. 125 мл аликвота фильтрата обрабатывали 2,0 г Teric® G12A12 в течение 1 часа до проведения ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon. Ретентат промывали 170 мл апирогенной дистиллированной воды до концентрирования до 30 мл и подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 9: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (2,00 г) растворяли в 100 мл 0,5 М NaOH не нагревая до 40°C. По истечению 10 минут, твердые частицы отделяли центрифугированием и удаляли. Надосадочную жидкость фильтровали через стекловолоконный фильтр и 50 мл аликвота нагревали до 60°C в течение 3 часов. Реакционную смесь далее разводили до 100 мл апирогенной дистиллированной водой и проводили ультрафильтрацию через кювету с перемешиванием Amicon до концентрации 5 мл. Ретентат далее промывали 75 мл апирогенной дистиллированной воды, концентрировали до 5 мл и подвергали сублимационной сушке.

Было отмечено >99% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

ПРИМЕР 10: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Undaria pinnatifida, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (2,00 г) растворяли в 100 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 40°C. По истечению 10 минут твердые частицы отделяли центрифугированием и удаляли. Надосадочную жидкость фильтровали через стекловолоконный фильтр и 50 мл аликвота обрабатывали 1,00 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ при 60°C в течение 3 часов. Реакционную смесь далее разводили до 100 мл апирогенной дистиллированной водой и проводили ультрафильтрацию через кювету с перемешиванием Amicon до концентрации 5 мл. Ретентат далее промывали 75 мл апирогенной дистиллированной воды, концентрировали до 5 мл и подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 11: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Ecklonia maxima, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (8,00 г) растворяли в 400 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 45°C. По истечению 10 минут раствор обрабатывали 4,00 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ при 65 ^SC в течение 1 часа. Реакционную смесь далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Значение pH фильтрата регулировали от 13,0 до 10,5 с помощью 50% H₂SO₄ и далее проводили ультрафильтрацию через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 20 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 20 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 12: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Fucus vesiculosus, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (6,3 г) растворяли в 300 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 45°C. Реакционную смесь нагревали до 65°C и обрабатывали 2,00 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ в течение 1 часа. Реакционную смесь далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Значение pH фильтрата регулировали от 11,7 до 11,0 с помощью 50% H₂SO₄ и далее проводили ультрафильтрацию через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 20 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 20 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 13: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Ascophyllum nodosum, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (15,0 г) растворяли в 735 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 40°C. Реакционную смесь центрифугировали и надосадочную жидкость фильтровали через вспомогательную фильтрующую присадку с декалитом. Фильтрат нагревали до 60°C и обрабатывали 30,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ в течение 1 часа. Реакционную смесь при значении pH 10,0 далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 30 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 30 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 14: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Alaria esculente, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (4,0 г) растворяли в 200 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 40°C. Реакционную смесь центрифугировали и надосадочную жидкость фильтровали через вспомогательную фильтрующую присадку с декалитом. Фильтрат нагревали до 60°C и обрабатывали 5,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ в течение 30 минут. Реакционную смесь при значении pH 10,7 далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 30 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 30 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный ретентат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 15: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Ecklonia radiate, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (4,0 г) растворяли в 200 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 40°C. Реакционную смесь центрифугировали и надосадочную жидкость фильтровали через вспомогательную фильтрующую присадку с декалитом. Фильтрат нагревали до 60°C и обрабатывали 2,0 мл 30% в весовом отношении Н₂O₂ в течение 30 минут. Реакционную смесь при значении pH 10,7 далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 30 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной водой и реконцентрировали до 30 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 16: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Sarqassum fusiforme, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (4,0 г) растворяли в 200 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 40°C. Реакционную смесь центрифугировали и надосадочную жидкость фильтровали через вспомогательную фильтрующую присадку с декалитом. Фильтрат нагревали до 70°C и обрабатывали 0,7 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ в течение 30 минут. Реакционную смесь далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 30 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 30 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 17: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Macrocystis pyrifera, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (2,0 г) растворяли в 200 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 40°C. Реакционную смесь далее нагревали до 65°C и обрабатывали 1,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ в течение 30 минут. Реакционную смесь далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 30 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 30 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 18: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Cladosiphon okamuranus, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Фукоидан (4,0 г) растворяли в 200 мл 0,5 М NaOH, не нагревая до 40°C. Реакционную смесь центрифугировали и надосадочную жидкость фильтровали через вспомогательную фильтрующую присадку с декалитом. Фильтрат нагревали до 65°C и обрабатывали 2,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ в течение 30 минут. Реакционную смесь далее фильтровали через стекловолоконный фильтр. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 30 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 30 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 2 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 19: Депирогенизация ульвана, очищенного от Ulva sp., при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Ульван (2,0 г) растворяли в 150 мл 0,5 М КОН, не нагревая до 55°C. Фильтрат нагревали до 65°C и обрабатывали 6,0 мл 30% в весовом отношении H₂O₂ в течение 60 минут. Реакционную смесь далее нейтрализовали со значения pH 12,1 до значения pH 7,8 с помощью 50% H₂SO₄. Далее фильтрат подвергали ультрафильтрации через кювету с перемешиванием Amicon и концентрировали до объема 30 мл. Ретентат далее промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды и реконцентрировали до 30 мл. Промывку апирогенной дистиллированной водой в количестве 50 мл и реконцентрацию повторяли еще 3 раза. Конечный сконцентрированный концентрат далее фильтровали через а 0,2 мкм фильтр и подвергали сублимационной сушке.

ПРИМЕР 20: Депирогенизация фукоидана, очищенного от Fucus vesiculosus.

Исходный материал представлял собой продукт, подвергшийся сублимационной сушке и предварительно очищенный для фукоидана, до приблизительно 95%, включающий нейтральные углеводы (приблизительно 60,1%-54,0% фукозы, 3,0% галактозы), сульфат (27,5%), и противоионы (7,5%).

Все количество воды в данном способе было очищено путем дистилляции до использования. Все оборудование дезинфицировали и промывали очищенной водой до использования.

1,99 кг подвергшегося сублимационной сушке фукоидана растворяли в 50-кратном (100 л) 0,04 М КОН.

Растворение проводили сначала заполнив реакционный аппарат 100 л очищенной водой. 4 л 50% КОН добавляли к очищенной водой и раствор нагревали до 60°C. Далее в процессе перемешивания добавляли твердый фукоидан (1,99 кг). Температуру раствора поддерживали на уровне 60°C в процессе перемешивания до полного растворения всех твердых веществ. Значение pH в растворе достигло 11,9.

0,5 л H₂O₂ (50%) добавляли к фильтрату, и раствор выдерживали при 65°C в течение 1 часа в процессе перемешивания. Значение pH раствора далее регулировали с 11,9 до 9,5-10,0 с помощью H₂SO₄ (50% в весовом отношении, 3,35 л). Конечное значение pH составило 9,8. Раствор далее охлаждался до 45°C.

Раствор с отрегулированным значением pH подвергали ультрафильтрации с использованием трех мембран площадью 78 футов² каждая, при номинальном отсечении по молекулярной массе 5 kDa (Koch, MA).

Ультрафильтрационное оборудование было собрано и дезинфицировано путем рециркуляции 100 л раствора 0,05% в весовом отношении КОН, с последующим промыванием 100 л раствора 100 ppm NaOCl при 45-50°C, и наконец, 100 л раствора 0,1% в весовом отношении H₂O₂, при этом каждый раствор рециркулировали в течение 15 минут. Оборудование далее промывали, по меньшей мере, 200 л очищенной воды. Раствор фукоидана добавляли в ретентатный реактор, и ультрафильтрацию проводили до тех пор, пока концентрацию ретентата не доводили до приблизительно 30% от исходного объема. Давление ретентата поддерживали на уровне 50 фунт/кв. дюйм в ходе всего этапа ультрафильтрации. Процесс ультрафильтрации начинался при скорости 2,0 л/минуту, и составлял 1,6 л/минуту по завершению ультрафильтрации.

Концентрированный раствор фукоидана (30 л) далее подвергали диафильтрованию с использованием очищенной воды (120 л при 10 л порциях). Давление ретентата поддерживали на уровне 50 фунт/кв. дюйм. Процесс ультрафильтрации оставался на уровне 1,5 л/минуту в течение 7 минут.

Раствор далее концентрировали до конечного объема 22 л.

Концентрат далее подвергали сублимационной сушке. В общей сложности выход твердого вещества составил 820 г.

Был рассчитан технологический выход продукта на уровне 41%. Было отмечено 99% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста).

ПРИМЕР 21: Депирогенизация и фракционирование фукоидана, очищенного от Fucus vesiculosus, при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей двухступенчатой ультрафильтрацией.

Фукоидан (50 г) растворяли в 2 л 1% в весовом отношении H₂SO₄, не нагревая до 50°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при указанной температуре. Значение pH в растворе повышали с 1,2 до 4,0 путем добавления 50% в весовом отношении NaOH.

Добавляли еще 50 г твердого вещества NaOH, и реакционную смесь нагревали до 65°C в течение 10 минут. Добавляли H₂O₂ (26 мл, 30% в весовом отношении), и реакционную смесь перемешивали в течение еще одного часа.

Значение pH в растворе снижали с 12,0 до 10,5 путем добавления 50% в весовом отношении H₂SO₄, охлаждали в течение ночи и затем подвергали ультрафильтрации с помощью кюветы с перемешиванием Advantec AMI UHP.

Реакционную смесь сначала концентрировали до 500 мл, используя мембрану с размером пор 30 kDa, далее ретентат (фракция >30 kDa) промывали 500 мл дистиллированной воды и реконцентрировали до 500 мл. Промывку/реконцентрацию повторяли еще три раза. Пермеат (фракция <30 kDa) подвергали аналогичной процедуре концентрирования с дальнейшей промывкой и реконцентрированием четыре раза, используя в данном конкретном случае мембрану с размером пор 10 kDa. Конечные ретентат (как фракции размером 10-30 kDa, так и размером >30 kDa) собирали и подвергали сублимационной сушке.

Было отмечено 98% снижение содержания пирогена (по результатам измерений, полученным на основе LAL-теста) в отношении обеих фракций.

ПРИМЕР 22: In situ отделение, очистка и депирогенизация фукоидана от Undaria pinnatifida при контакте с низкоконцентрированным пероксидом и высококонцентрированной щелочью с последующей ультрафильтрацией.

Морские водоросли (5,0 г, Undaria pinnatifida) суспендировали в 100 г 0,5% в весовом отношении H₂SO₄, при этом кислоту предварительно нагревали до 55°C. Полученную суспензию при значении pH 1,8 перемешивали в течение 4 часов при 50°C и далее фильтровали через целлюлозный фильтр с покрытием из диатомита. Далее значение pH фильтрата повышали до 11,0 с помощью 10% в весовом отношении NaOH и раствор нагревали при перемешивании до 45°C. К указанному раствору добавляли 0,5 мл 30% в весовом отношении H₂O₂, и значение pH раствора поддерживали выше pH 10,9 путем добавления 10% в весовом отношении NaOH. По истечению 1 часа нагревание раствора прекращали, и значение pH снижали до 5,01 с помощью 10% в весовом отношении H₂SO₄. Охлажденный раствор далее фильтровали через кювету с перемешиванием Amicon и ретентат промывали 50 мл апирогенной дистиллированной воды три раза до концентрирования до 50 мл и подвергали сублимационной сушке. Практический выход очищенного фукоидана белого цвета составил 10,8%.

Следует понимать, что несмотря на то, что описание настоящего изобретения было приведено в плане ряда отдельных аспектов, при этом определенные примеры осуществления и (или) предпочтительные признаки были раскрыты в отношении каждого аспекта, предполагается, что любой из различных примеров осуществления или предпочтений могли бы быть реализованы в сочетании с любым аспектом. Кроме того, признаки любого данного аспекта могут быть реализованы с признаками любого иного аспекта.

В то время, как некоторые примеры осуществления настоящего изобретения, описание которых приведено в настоящей заявке, включают одни, но не другие признаки, включенные в другие примеры осуществления, комбинации признаков различных примеров осуществления не выходят за пределы объема настоящего изобретения и образуют различные примеры осуществления, как должно быть очевидно специалистам в данной области техники.

Claims

1. Способ снижения пирогенности экстракта сульфатированных полисахаридов, включающего в себя сульфатированный полисахарид и пирогенное вещество, при этом способ включает контактирование экстракта с эффективным количеством оксиданта.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий контактирование экстракта с эффективным количеством одного или нескольких следующих веществ: поверхностно-активного вещества, основания, активированного угля и цеолита.

3. Способ по п. 1, в котором оксидант является пероксидом.

4. Способ по п. 3, в котором пероксид используют в количестве по меньшей мере 30% в весовом отношении по массе пероксида к массе сульфатированного полисахарида.

5. Способ по п. 2, в котором поверхностно-активное вещество является биологическим поверхностно-активным веществом.

6. Способ по п. 2, в котором поверхностно-активное вещество является неионным поверхностно-активным веществом.

7. Способ по п. 2, в котором поверхностно-активное вещество используют в количестве по меньшей мере 50% в весовом отношении по массе поверхностно-активного вещества к массе полисахарида.

8. Способ по п. 2, в котором основание используют в количестве, достаточном для достижения значения рН более 7,0 и менее 12,5.

9. Способ по п. 2, в котором активированный уголь или цеолит используют в количестве по меньшей мере 10% в весовом отношении по массе адсорбента к массе полисахарида.

10. Способ по п. 1, включающий контактирование экстракта с эффективным количеством оксиданта и основания.

11. Способ по п. 1, включающий контактирование экстракта с эффективным количеством оксиданта, основания и поверхностно-активного вещества.

12. Способ по п. 1, включающий контактирование экстракта с эффективным количеством активированного угля и основания.

13. Способ по п. 1, в котором достигается по меньшей мере 50% снижение пирогенности.

14. Способ по п. 1, в котором достигается по меньшей мере 99% снижение пирогенности.

15. Способ по п. 1, в котором сульфатированный полисахарид является фукоиданом или ульваном.

16. Биологически активный экстракт из морских водорослей со сниженной пирогенностью, изготовленный способом по любому из пп. 1-15.

17. Экстракт по п. 16, содержание пирогенного вещества в котором меньше 100 ЕЭ/мг, что установлено с использованием LAL-теста.

18. Экстракт по п. 16, способный проходить тест на кроличий пироген.