KR102223725B1

KR102223725B1 - 처리 방법

Info

Publication number: KR102223725B1
Application number: KR1020157022816A
Authority: KR
Inventors: 찰스 드래가; 쟈넷 헬렌 휘튼; 비키-앤 가디너; 대미언 스트린저; 새뮤얼 카피닉
Original assignee: 마리노바 피티와이 엘티디
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2021-03-08
Also published as: CA2898515A1; KR20150108919A; US10149874B2; HK1215164A1; JP6336487B2; NZ710602A; EP2948158A4; CN105101982A; EP2948158B1; AU2013375786B2; US20150359828A1; DK2948158T3; RU2015135635A; JP2016505083A; EP2948158A1; AU2013375786A1; RU2686088C2; WO2014113836A1; CA2898515C

Abstract

본 발명은 발열물질을 비활성화 및/또는 발열물질을 제거하는 단계를 포함하여, 추출물의 발열성을 감소시키는 결과를 가져오는 것인, 표적 분자(target molecule) 및 발열물질을 포함하는 해조류를 처리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 발열인자의 제거가 중요한 의약 조성물 및 바이오 재료를 제조하는데 유용하다.

Description

처리 방법{TREATMENT METHODS}

본 발명은 2013년 1월 25일자 출원된 미국 가특허출원 제61/756,570에 기초한 우선권출원으로서, 상기 가출원의 전체 내용은 여기에 참조 통합된다.

본 발명은 해조류와 같은 해양 유기체의 추출물을 처리하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 상처 관리 및 수술용 비경구 약학 조성물의 제조에 유용한, 실질적으로 발열인자(pyrogen)가 없는 추출물의 제조에 관한 것이다.

푸코이단(fucoidan) 및 울반(ulvan)과 같은 다당류를 포함하는 다양한 해조류 성분의 생물학적 활성을 입증하는데 있어 상당히 많은 연구가 이루어져 왔다. 푸코이단은 갈조류(brown seaweed) 중 많은 종의 세포벽에서 발견되는 황산화 다당류(sulfated polysaccharide)이다. 생체외 실험은 푸코이단이 항암, 항혈관신생(antiangiogenic) (Maruyama H, Tamauchi H, Hashimoto M, Nakano T. Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll of Undaria pinnatifida. In Vivo 2003; 17(3):245-249; Haneji K, Matsuda T, Tomita M et al. Fucoidan extracted from cladosiphon okamuranus tokida induces apoptosis of human T-cell leukemia virus type 1-infected T-cell lines and primary adult T-cell leukemia cells. Nutr. Cancer 2005; 52(2):189-201 ; Liu JM, Bignon J, Haroun-Bouhedja F et al. Inhibitory effect of fucoidan on the adhesion of adenocarcinoma cells to fibronectin. Anticancer Res. 2005; 25(3B):2129-2133; Koyanagi S, Tanigawa N, Nakagawa H, Soeda S, Shimeno H. Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities. Biochem. Pharmacol. 2003; 65(2):173-179; Alekseyenko TV, Zhanayeva SY, Venediktova AA, et al. Antitumor and antimetastatic activity of fucoidan, a sulfated polysaccharide isolated from the Okhotsk Sea Fucus evanescens brown alga. Bull. Exp. Biol. Med. 2007 Jun;143(6):730-2; Nagamine T, Hayakawa K, Kusakabe T, et al. Inhibitory effect of fucoidan on Huh7 hepatoma cells through downregulation of CXCL12. Nutr. Cancer 2009;61(3):340-7), 항바이러스 (Lee JB, Hayashi K, Hashimoto M, Nakano T, Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu). Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 2004 Sep;52(9):1091-4; Hayashi K, Nakano T, Hashimoto M, Kanekiyo K, Hayashi T. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection. Int. Immunopharmacol. 2008 Jan;8(1):109-16.), 및 면역조절 효과 (Raghavendran HR, Srinivasan P, Rekha S. Immunomodulatory activity of fucoidan against aspirin-induced gastric mucosal damage in rats. Int. Immunopharmacol. 2011 Feb;11(2):157-63)를 가진다고 하였다. 이러한 효과는 자연살생세포를 자극하고, 세포 번식에 관여하는 AP-I을 하향 조절함으로써 발생한다. 또한, 푸코이단은 신경보호 (Do H, Pyo S, Sohn EH. Suppression of iNOS expression by fucoidan is mediated by regulation of p38 MAPK, JAK/STAT, AP-1 and IRF-1, and depends on up-regulation of scavenger receptor B1 expression in TNF-alpha- and IFN-gamma-stimulated C6 glioma cells. J. Nutr. Biochem. 2009 Jul 1 ; Luo D, Zhang Q, Wang H, et al. Fucoidan protects against dopaminergic neuron death in vivo and in vitro. Eur. J. Pharmacol. 2009 Sep 1 ;617(1 -3):33-40.), 방사선보호 (Byon YY, Kim MH, Yoo ES, et al. Radioprotective effects of fucoidan on bone marrow cells: improvement of the cell survival and immunoreactivity. J. Vet. Sci. 2008 Dec;9(4):359-65), 및 항궤양 (Choi Jl, Raghavendran HR, Sung NY, et al. Effect of fucoidan on aspirin-induced stomach ulceration in rats. Chem Biol Interact. 2010 Jan 5;183(1 ):249-54) 특성을 나타낸다.

다른 연구에서, 푸코이단은 항응고(Colliec S, Fischer AM, Tapon-Bretaudiere J, et al. Anticoagulant properties of a fucoidan fraction. Thromb. Res. 1991 Oct 15;64(2):143-54; Irhimeh MR, Fitton JH, Lowenthal RM. Pilot clinical study to evaluate the anticoagulant activity of fucoidan. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2009 Aug 18) 및 항혈전 (Church FC, Meade JB, Treanor RE, Whinna HC. Antithrombin activity of fucoidan. The interaction of fucoidan with heparin cofactor II, antithrombin III, and thrombin. J. Biol. Chem. 1989 Feb 25;264(6):3618-23) 활성을 나타내었고, 항응고제와 함께 투여하면 부가 효과를 얻을 수 있다.

또한, 푸코이단은 수술 후 유착을 예방하는 특별한 가능성을 나타내왔다. Cashman 등의 연구(Cashman JD, Kennah E, Shuto A, Winternitz, Springate CMK, Fucoidan Film Safely Inhibits Surgical Adhesions in a Rat Model, J. Surg. Res. 201 1 Dec 171 (2):495-503)는 여러 가지의 화합물을 시험하였지만, 푸코이단이 가장 안전하고 효율적이라는 것을 알아냈다. 푸코이단이 부가된 필름은 대조군 필름에 비하여 유착 수치를 약 90%까지 감소시켰다. 모든 대조군 필름에서 동물이 유착을 보인 것과 비교하여, 총 50% 내지 100%의 동물은 0.33 w/w% 내지 33 w/w%의 푸코이단 필름에서 유착이 일어나지 않았다. 약 30 mg 푸코이단/kg 체중에 해당되는 33 w/w% 푸코이단 필름에서 유해작용(adverse effects)이 전혀 일어나지 않았다.

또한, 푸코이단은 상처 관리, 특히 화상 치유에 유용하다고 제안되었다. Sezer 등의 연구를 인용한다(Sezer AD, Hatipoglu F, Cevher E, Ogurtan Z, Bas AL, and Akbuga J, Chitosan film containing fucoidan as a wound dressing for dermal burn healing: Preparation and in vitro/in vivo evaluation, AAPS Pharm. Sci. Tech. 75 2007 June; 8(2): E94-E101). 이들 저자는 래빗 화상 모형에서 최고의 진피 유두부 형성의 재생, 재상피화(epithelization) 및 가장 빠른 상처 폐쇄가 푸코이단-키토산 필름 치료군에서 발견되었음을 보여주었다.

울반(푸코이단과 유사함)은 녹조류(green seaweed)에서 추출되며, 임상 적용의 가능성을 지닌다. 예를 들어, 울반은 바이오 재료의 제조에 있어서 스캐폴드로서, 약물 전달 비히클로서, 및 면역조절제로서 유의한 가능성을 보유한다.

상술한 바에 의해, 해양 유기체로부터 추출된 다당류는 다양하고 임상적으로 중요한 용도에 사용될 수 있는 가능성이 있음이 명백할 것이다. 이들 분자의 유익을 훼손하는 심각한 문제는 상기 추출물에 발열인자가 존재한다는 것이다. 질환 적응증이 상처 또는 수술 부위에 비경구 투여 및 직접 적용하거나, 또는 몸 내에 이식을 필요로 할 경우, 이들 다당류 추출물의 사용은 이와 관련된 발열인자-유도 발열, 독성 쇼크 및 사망의 위험 때문에 금기시된다.

"그람 음성 박테리아 내독소"와 반대되는 것으로 "미생물 발열인자"는 많은 다른 물질을 설명하는 일반적인 용어가 되었다. 그러나, 발열성 물질은 몇가지 그람 양성 박테리아, 마이코박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 의해서도 생성될 수 있지만, 그람 음성 박테리아에 의해 생성된 발열인자, 즉, 내독소는 약학적 및 의학적 이식 산업에 있어 중요하다.

선행기술은 의약용 용액에서 발열성 물질을 제거하는 다양한 방법을 개시한다. 이들 중 다수는 발열물질의 파괴에 기반한 것이다. 그러나, 이러한 방법은 종종 용액 내 원하는 분자에 해를 입히거나 파괴하는 결과를 낳는다. 원하는 분자가 자연 유래일 경우에 특히 그러하다.

그밖의 발열성 물질 제거 방법은 예컨대 크로마토그래피 및 여과의 방법에 의해 발열물질을 물리적으로 제거하는 것이다. 이들 방법은 불안정한 분자를 포함하는 용액의 처리에 명백히 더 적합하지만, 이들 방법을 상업적 처리 양으로 스케일을 늘리면 중대한 문제가 발생한다. 종종, 산업적 스케일의 분리 방법은 매질의 비용, 및 매질을 지속적으로 교체하거나 재생하여야 하는 필요 때문에 경제적으로 실현가능성이 없다. 해조류 추출물은 특히, 분리 매질의 막힘 또는 오염을 야기하는 잔여물 및 침전을 포함하는 것으로 알려져 있다.

해조류 추출물의 또다른 문제중 하나는 공정 중에 자주 일어나는 바람직하지 않은 갈변(brown discolouration)이다. 이러한 변색은 알칼리 조건의 이용하기 때문에 일어나며, 주로 최종 산물에 일어나는 것으로 생각된다. 이 추출물이 사람에게 주사가능한 조성물로 조성될 경우, 투여 전 주사제의 시각적인 검사를 용이하게 하도록 무색 용액이 훨씬 바람직하다.

본 발명의 한가지 측면은 발열성 및/또는 변색을 감소시키기 위하여 해조류 추출물을 처리하는 개선된 방법을 제공함으로써, 선행기술의 문제를 극복하거나 경감시키는데 있다. 또다른 측면은 기존의 처리 방법에 대안을 제공하는 것이다.

문헌, 활동, 재료, 장치, 물품 등의 논의는 단지 본 발명의 전후사정을 제공하기 위한 목적으로 본 명세서에 포함되는 것이다. 이들 내용이 본 출원의 우선일 이전에 존재하였다고 해서, 이들이 선행기술의 일부를 형성한다거나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통용되는 상식이라고 제안하거나 표시하는 것이 아니다.

첫번째 측면에서, 본 발명은 표적 분자 및 발열물질을 포함하는 해조류를 처리하는 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 발열물질을 비활성화 및/또는 발열물질을 제거하는 단계를 포함하며, 이 방법은 추출물의 발열성을 감소시키는 결과를 가져온다. 이 방법은 추출물을 다음 중 1종 이상의 유효량에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다: 산화제(예컨대, 과산화물), 계면활성제(예컨대 비이온성 계면활성제), 염기(예컨대 수산화물), 활성탄, 제올라이트.

상기 표적 분자는 다당류, 좋기로는 푸코이단 또는 울반과 같은 다당류일 수 있다.

본 방법에서 바람직한 조합은 (i) 산화제 및 염기, (ii) 산화제, 염기 및 계면활성제, (iii) 활성탄 및 염기를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 실질적으로 발열성 물질이 제거된 해양 유기체 추출물을 제공한다. 처리된 추출물은 LAL에 의해 결정되는 발열물질 농도가 약 100 EU/mg 미만일 수 있고, 및/또는 래빗 발열성 시험을 통과할 수 있는 것이다. 상기 추출물은 여기에 기재된 방법으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 여기에 기재된 실질적으로 발열성 물질이 제거된 해양 유기체 추출물을 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은, 필요로 하는 포유류에게 의약 조성물을 투여하거나, 또는 바이오 재료를 이식하는 것을 포함하는 어떤 질환의 치료 또는 예방 방법이다.

또다른 측면은 여기에 기재된 의약 조성물 또는 바이오 재료를 의약에 사용하는 용도를 제공한다. 또한, 여기에 기재된 실질적으로 발열 인자가 제거된 해양 유기체 추출물, 또는 의약 조성물을 어떤 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.

본 명세서를 고려해 보면, 본 발명이 어떻게 다양한 대안적 구현예 및 대안적 적용으로 실시되는지 이 기술분야의 숙련자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 다양한 구현예가 여기에 기술될 것이지만, 이들 구현예는 단지 예시적 수단으로 기재되는 것이지 제한을 두려는 것이 아니다. 따라서, 다양한 대안적 구현예의 기재가 본 발명의 범위나 의미를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 장점 또는 다른 측면의 기재는 특정 예시적 구현예에 적용되며, 청구범위 내의 모든 구현예에 반드시 적용되는 것은 아니다.

명세서 및 청구항 전반에서, "포함하다(comprise)" 및 그 변형어, 예컨대 "포함하는(comprising)" 및 "포함하다(comprises)"는 다른 첨가제, 성분, 정수, 또는 단계를 제외한다는 의미가 아니다.

명세서 전반에서, "일 구현예" 또는 "하나의 구현예"라 함은 그 구현예와 관련된 특정한 성질, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 명세서 전반의 여러 곳에서 "일 구현예에서" 또는 "하나의 구현예에서"라는 어구는 반드시 동일한 구현예를 지시하는 것이 아니며, 그럴 수는 있다.

제1 측면에서, 본 발명은 표적 분자 및 발열물질을 포함하는 해조류를 처리하는 방법을 제공하며, 이 방법은 발열물질을 비활성화 및/또는 발열물질을 제거하는 단계(들)를 포함하며, 이 방법은 추출물의 발열성을 감소시키는 결과를 가져온다.

본 출원인은 해조류 및 해양 동물의 추출물로부터 효과적으로 발열성 물질을 제거할 수 있어, 인간용으로 안전하게 만들 수 있음을 알게 되었다. 중요하게도 예상외로, 제거 및 비활성화의 결과 추출물에 존재하는 활성 표적 분자에 실질적인 유해작용을 일으키지 않음이 드러났다. 또한, 표적 분자의 회수는 상업적으로 허용가능한 것으로 나타났다.

일 구현예에서, 표적 분자는 다당류이고, 좋기로는 황산화 다당류이다. 일 구현예에서 다당류는 푸코이단 또는 울반이다.

전술한 배경기술로부터 알 수 있듯이, 본 발견은 이 기술분야에서 상당한 진보로서, 해양 유기체 중의 활성 분자, 예컨대 푸코이단 및 울반의 생체내 의료 적용의 보다 포괄적인 조사를 가능하게 하며, 의약 제제나 의료 임플란트의 제조에 이러한 활성물질을 일상적으로 이용하는 것을 가능하게 한다.

본 방법의 일 구현예에서, 발열물질을 비활성화시키는 단계는 추출물을 산화제, 계면활성제, 염기, 활성탄, 제올라이트 중에서 선택된 1종 이상의 유효량과 접촉시키는 것을 포함한다:

이론에 의해 제한되지 않기를 바라건대, 본 방법에서 산화제를 사용하는 경우, 산화제는 발열물질을 비활성화시키는 역할을 하는 것으로 제시된다. 그러나, 발열성을 감소시키는데에 유효한 산화제의 농도는 추출물의 다당류 분자에 실질적으로 유해한 변화를 유도하지 않았음을 알게 되었다. 몇가지 구현예에서, 푸코이단 분자 또는 울반 분자는 실질적으로 생물학적 활성을 보유한다. 여기에 쓰인 바와 같이, "생물학적 활성"이라 함은 어떤 생물학적 분자에 구조적 및/또는 기능적 변화를 가져오거나, 어떤 생물학적 시스템 또는 경로에 변화를 가져올 수 있는 표적 분자의 능력을 의미한다.

일반적인 산화제는 산소 분자, 오존, 과산화수소(H₂0₂) 및 기타 무기 과산화물, 불소(F₂), 염소(Cl₂), 기타 할로겐, 질산(HN0₃) 및 질산염 화합물, 황산(H₂S0₄), 과산화황산(H₂S₂0₈), 과산화모노황산(H₂S0₅), 아염소산염, 염소산염, 과염소산염, 및 기타 유사한 할로겐 화합물, 가정용 표백제(NaCIO)를 포함하는 차아염소산염 및 기타 하이포할라이트 화합물, 6가 크롬 화합물, 예컨대 크롬산, 디크롬산 및 삼산화크롬, 피리디늄클로로크롬산(PCC), 및 크롬산염/디크롬산염 화합물, KMn0₄과 같은 과망간산염 화합물, 과붕산나트륨, 아산화질소(N₂0), 산화은(Ag₂0), 사산화오스뮴(Os0₄), 톨렌스 시약, 및 2,2'-디피리딜디술파이드(DPS)를 포함한다.

일 구현예에서, 산화제는 산소계 산화제, 예컨대 과산화물, 오존, 또는 산소 분자이다. 일 구현예에서, 산화제는 과산화수소이다. 산화 반응을 강화하기 위하여, 철 이온과 같은 촉매를 산화 반응 혼합물에 포함시킬 수 있다. 과산화물을 사용시 장점은 해조류에서 자주 발견되는 유색 색소 복합체가 표백되어 실질적으로 투명한 용액이 얻어진다는 점이다.

과산화물의 양은 추출물의 종과 순도에 따라 달라질 수 있으나, 약 10 w/w% 내지 약 100 w/w%(다당류의 질량에 대한 과산화물의 질량)의 범위가 효과적인 것으로 밝혀졌다. 여기 개시한 실험 결과는 촉매로서 1%의 시트르산철의 존재 하에 30 w/w% 수산화물(푸코이단 대비)에 의하여 허용가능한 수준의 발열인자 감소가 이루어질 수 있었다. 따라서, 본 방법의 일 구현예에서, 과산화물의 양은 30 w/w%을 초과한다.

또한, 본 출원인은 해조류 추출물에 대한 계면활성제 처리의 유효성을 나타내었다. 어떻게든 이론에 의하여 제한되지 않기를 바라건대, 발열물질은 계면활성제에 의하여 가용화되고, 가용화된 발열물질은 보다 용이하게 비활성되거나(예컨대 산화제에 의하여) 제거된다(예컨대 여과에 의하여). 계면활성제는 세포 성분 및 기타 자연적으로 발생하는 분자를 가용화시키기 위하여 생화학에 종종 사용되는 유형의 생물학적 계면활성제일 수 있다. 계면활성제는 조직 배양에 유용한 것일 수 있는데, 예컨대, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판설포네이트, 3-(데실디메틸암모니오)프로판설포네이트 내부 염 양쪽이온성 세제, ASB-14, Brij^®58 에버리지 Mn-1124, 글리신 맥스 (소이빈)로부터의 L-a-리소포스파티딜콜린 =99% 동결건조분말, Brij^®58 주성분: 아이코사에틸렌 글리콜 헥사데실 에테르, Brij^®L23 용액 30 w/v%, Brij^®L23 주성분: 트리코사에틸렌 글리콜 도데실 에테르, C7BzO, CHAPS, CHAPSO. 콜산, 디옥시콜산, 디지토닌, 글리코콜산, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 =98%, 헥사에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, IGEPAL CA-630, 리튬 도데실 설페이트, N-데카노일-N-메틸글루카민, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet P-40, 옥틸 D-글루코피라노사이드, 옥틸 α-D-글루코피라노사이드, 옥틸 β-D-l-티오글루코피라노사이드, Pluronic F-68, 폴리옥시에틸렌(20), 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 사포닌, 콜산나트륨 수화물, 디옥시콜산나트륨, 소디움 도데실 설페이트, 글리코콜산나트륨 수화물, 타우로디옥시콜산나트륨 수화물, Tween 20, Tween 40, Tween 80, 타우로콜산 나트륨염 수화물, Triton X-100, Triton X-114, 우르소디옥시콜산, n-도데실 β-D-말토사이드, n-도데실 β-D-말토사이드를 들 수 있다.

계면활성제는 세포막과 단백질의 가용화에 유용한 것일 수 있는데, 예컨대, 2-시클로헥실에틸 β-D-말토사이드, 3-(4-terf-부틸-1-피리디니오)-1-프로판설포네이트, 3-{N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판설포네이트, 3-(1-피리디니오)-1- 프로판설포네이트, 3-(벤질디메틸암모니오)프로판설포네이트, 3-(데실디메틸암모니오)프로판설포네이트, 3-[N,N-디메틸(3-팔미토일아미노프로필)암모니오]-프로판설포네이트, 5-시클로헥실펜틸 β-D- 말토사이드, ASB-14, ASB-C80, 시클로헥실메틸 β-D-말토사이드, 데실-β-D-글루코피라노사이드, 데실-β-D-말토피라노사이드, 데실-β-D-1-티오말토피라노사이드, 데실-β-D-말토사이드, 디메틸데실포스핀 옥사이드, 디메틸에틸암모늄 프로판설포네이트, 도데실트리메틸암모늄 클로라이드, EMPIGEN^®BB 세제, 헥사데실피리디늄 클로라이드 일수화물, 헥사에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 이소프로필 β-D-l-티오갈락토피라노사이드, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드, Lutro OP 2000, MEGA-8, N,N-bis[3-(D-글루콘아미도)프로필]디옥시콜아미드, N-데카노일-N-메틸글루카민, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-라우로일사르코신, N-노나노일-N- 메틸글루카민, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 폴리(무수말레산-alt-1-데센), 3-(디메틸아미노-1-프로필아민 유도체, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노아우레이트, 타우로디옥시콜산나트륨 수화물 =95%, 수크로오스 모노데카노에이트, n-헵틸 β-D-티오글루코피라노사이드를 들 수 있다.

계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 일 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 n몰의 에틸렌 옥사이드(n은 약 12일 수 있음)로 에톡시화된 알코올 C12-15, 알킬 알코올 폴리에톡실레이트 비이온성 계면활성제 G12 A12, 도데카놀 에톡실레이트 비이온성 세제, 도데실 알코올, 에톡실레이트 곧은 사슬 알코올, 라우릴 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 라우릭 알코올 에톡실레이트, 예시적 형태 Teric G12A12 (ICI Chemicals), 또는 동등물이다.

일 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트, 소르비탄 모노라우레이트의 폴리옥시에틸렌 유도체이다. 일 구현예에서 계면활성제는 Tween 시리즈 (또는 동등물) 중의 하나이며, 일 구현예에서, Tween 80 (Sigma Aldrich), 또는 동등물이다.

일 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 친수성 폴리에틸렌 옥사이드 사슬(선택적으로 약 9.5 에틸렌 옥사이드 단위를 갖음) 및 방향족 탄화수소 친유성 또는 소수성 기를 갖는 것이다. 상기 탄화수소기는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐기일 수 있다. 계면활성제는 Triton 시리즈(Supelco) 중 하나, 또는 그 동등물, 예컨대 Pluronic 시리즈(BASF)일 수 있으며, 특히 Triton X-100일 수 있다.

계면활성제는 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 및 90% (w/w; 다당류의 질량에 대한 계면활성제의 질량)의 양으로 사용할 수 있다. 몇가지 구현예에서, 적어도 약 50 w/w%의 양으로 사용된 경우, 발열인자 양이 10배 감소될 수 있다.

특히, Teric^®G12A12, Tween^®20 및 Triton^®X100을 75 w/w% 비로 첨가하면 발열인자 감소에 유용하였다.

계면활성제 사용의 추가적 장점으로는 몇가지 구현예에서 다당류 수율을 100%까지 얻을 수 있다는 것이다.

본 방법은 상기 추출물을 염기와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 어떻게든 이론에 의해 제한되지 않기를 바라건대, 염기는 발열물질을 비활성화시키는 역할을 하는 것으로 제시한다. 알칼리 조건(즉, pH > 7)은 해양 유기체 추출물에서 발열성 물질을 제거하는데 사용되어 왔다. 적절한 염기는 금속 산화물, 수산화물, 알콕사이드, 및 암모니아를 포함할 수 있다. 추출물의 산업적 처리 규모에 있어, 쉽게 접근가능하고 비용 효율적인 염기, 예컨대 수산화칼륨, 수산화나트륨, 및 수산화칼슘이 적합할 수 있다. 일 구현예에서, pH는 약 10.5 내지 약 11.0의 범위로 조절된다.

일 구현예에서, 염기는 수산화나트륨이며, 좋기로는 약 0.5몰 용액이다. 같은 구현예에서, 적어도 약 50 ml의 용액의 양으로 사용될 수 있는 50 ml의 부피는 다당류 1 그램당 첨가된다. 50 ml가 첨가되었을 때, 발열인자 양의 허용가능한 감소가 관찰되었다. 더 높은 수산화물의 농도(0.1M 수산화나트륨 50 mL)는 50%의 감소를 가져왔다.

활성탄 및 제올라이트는 적어도 존재하는 발열물질의 양을 흡착하기에 충분할만큼 추출물에 첨가된다. 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 및 50% (w/w; 다당류의 질량에 대한 흡착제의 질량)의 양이 사용될 수 있다. 적어도 약 10 w/w%의 양이 발열인자 함량을 감소시키는 것으로 나타났다.

산화제, 계면활성제, 염기, 활성탄 및 제올라이트는 독립적으로, 또는 5종을 조합하여, 또는 어느 4종을 조합하여, 또는 어느 3종을 조합하여, 또는 어느 2종을 조합하여 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.

바람직한 일 조합으로는 산화제와 염기의 조합이 있다. MOH (여기서, M은 Na 또는 K임)을 다당류 질량의 10 내지 200 w/w% (다당류에 대한 MOH) 범위의 양 및 H₂0₂ (10 내지 100 w/w%, 다당류에 대한 과산화물)으로 다양한 온도 및 다양한 시간 동안 처리하여 실험한 결과, 유의한 발열인자 감소에 있어 시너지 작용을 나타내었다.

일 구현예에서, 상기 염기의 양은 pH가 약 7.0 내지 12.5가 되기에 충분하다. 바람직한 일 조합으로는 산화제, 염기 및 계면활성제의 조합이 있다. 과산화수소 및 Teric-G12A12의 조합이 과산화물 단독 처리와 비교하여 발열인자 양을 더 낮추지 못한 반면, 염기(수산화나트륨 또는 수산화칼륨)의 첨가는 발열인자 농도를 낮추는 시너지 효과를 가져왔다.

더욱 바람직한 일 조합으로는 활성탄과 염기의 조합이 있다. 활성탄을 산성 및 알칼리성 조건 모두에서 시험해 보았는데, 알칼리성 조건에서 발열인자의 양은 유의한 감소를 보였으나, 산성 조건에서는 그렇지 않았다.

본 발명의 방법이 발열물질을 제거하는 단계를 포함함에 있어서, 본 방법은 추출물을 다음 중 1종 이상에 결합시키는 단계(들)을 포함한다: 실질적으로 발열물질에 결합할 수 있는, 및 실질적으로 표적 분자로부터 결합된 발열물질을 분리시킬 수 있는 활성탄, 제올라이트, 리간드. 이 기술분야의 숙련자는 상기 분리가 이루어질 수 있는 여러가지 방법들에 익숙하다. 예를 들어, 1회분(a batch) 처리 방법을 이용할 수 있는데, 이 방법에서는 소정 용량의 추출물을 하나의 용기에서 처리하고, 결합된 발열물질은 이 착물을 침전 또는 응고시킴으로써 표적 분자로부터 분리된다. 대안적으로, 결합된 발열물질은 원심분리법 또는 자기 비드 분리법에 의해 분리될 수 있다.

일 구현예에서, 실질적으로 발열물질에 특이적으로 결합 가능한 리간드는 폴리믹신 B이다.

표준 제조용 크로마토그래피법은 교재인 "제조용 크로마토그래피"(Edited by H. Schmidt-Traub et al, Second Edition, 2012, Wiley-VCH Weinheim)에 개시된 바와 같이 이 기술분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조 통합된다.

본 발명의 방법은 가수분해 단계를 포함할 수 있고, 선택적으로, 다양한 분자량의 다당류 분획을 만드는 분획(fractionation) 단계를 포함할 수 있다. 상기와 동일한 다당류 원료의 다양한 분자량 분획의 생체활성에 대한 연구가 이루어져 왔으며, 유의한 차이가 발견되었다. 푸코이단의 고분자량 분획은 분획되지 않은 생푸코이단에 비해 간 섬유증을 억제하는데 더 효과적임이 밝혀졌다 (Nakazato et al; Attenuation of N- nitrosodiethylamine-induced liver fibrosis by high-molecular-weight fucoidan derived from Cladosiphon okamuranus. J. Gastroenterol. Hepatol. 2010;25:1692-1701). 다른 연구는 마우스에서 서로 상이한 3가지 푸코이단 분획을 비교하였다 (Shimizu et al; Proportion of murine cytotoxic T-cell is increased by high-molecular weight fucoidan extracted from Okinawa Mozuku (Cladosiphon okamuranus) J. Health Sci. 2005;51 :394-397). 이 연구는 저분자량 푸코이단 분획을 먹인 동물과 비교하여 고분자량 푸코이단 분획을 먹인 동물의 비장에서 CD8 발현이 더 증가함을 밝혀, 차별적 면역 효과를 입증하였다.

가수분해는 부분적 또는 전체일 수 있으며, 산성 조건, 효소 처리 또는 당업자에게 알려진 그밖의 방법으로 달성될 수 있다.

상기 분획은 잘 알려진 방법, 예컨대 크로마토그래피법(예컨대, 세파로오스와 같은 사이즈 배제 레진을 사용함으로써), 또는 한외여과(ultrafiltration)로 달성될 수 있다.

대안적으로, 이 방법들은 이미 가수분해되어 있는 및/또는 분획되어 있는 다당류 물질에 적용될 수 있다.

유리하게도, 본 방법의 몇가지 구현예는 효율적으로 발열인자가 제거된 제품을 여전히 제공하는 가운데, 다당류의 상업적으로 바람직한 수율을 제공한다. 수율은 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 초과하거나, 또는 100%일 수 있다. 일 구현예에서, 수율은 약 30%를 초과한다. 다른 일 구현예에서, 수율은 약 60%를 초과한다. 전술한 수율은 회수된 다당류의 중량을 기준으로 표시된 것으로, 생물학적 활성 또는 다른 적합한 변수가 그대신 사용될 수 있다고 생각된다.

출원인은 발열인자 양을 99%까지 감소시키면서도, 건조 푸코이단 제품을 킬로그램 단위로 사용하여 표적 푸코이단의 상업적으로 유용한 회수율을 얻음으로써, 본 방법에서 확장성(scalability)이라는 추가적 장점을 입증하였다. 이는 실시예 20을 참조한 것이다. 몇가지 구현예에서, 본 방법은 출발 물질로서 건조 다당류를 적어도 약 0.1 kg, 0.5 kg, 1 kg, 2 kg, 3 kg, 4 kg, 5 kg, 6 kg, 7 kg, 8 kg, 9 kg, 10 kg, 20 kg, 30 kg, 40 kg, 50 kg, 60 kg, 70 kg, 80 kg, 90 kg 또는 100 kg 사용할 수 있다.

발열물질의 비활성화 또는 제거는 이 기술분야의 숙련자에게 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 적합한 방법 중 하나는 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시험이 있다. 다수의 키트, 예컨대 "Chromo-LAL" 키트(판매자: 메사추세츠의 Associates of Cape Cod Incorporated)가 사용가능하다. 이 시험에서, 공동-동결건조된 LAL 및 기질제는 마이크로플레이트에서 시험 샘플과 혼합되고, 37±1℃의 리더(reader)에서 배양된다. Chromo-LAL 첨가 후 시간에 따른 흡광도 측정값이 수집되고, 적절한 소프트웨어에 의해 분석된다. 샘플이 특정 흡광도(개시 OD)에 도달할 때까지 걸리는 시간(개시시간)을 계산하고; 로그(log) 개시시간과 내독소의 로그 농도 사이의 선형 상관관계를 보여주는 표준 곡선을 생성한다. 이 표준 곡선에서 내독소 농도의 최대 범위는 0.005 EU/mL 내지 50 EU/mL이다. 검정 감도(λ)는 표준 곡선에서 사용된 최저 농도로 정의된다. 이 시험의 최대 감도는 0.005 EU/mL이다.

미지의 샘플의 해당 개시시간에 대한 내독소 농도는, 개시시간 대 표준 농도의 로그-로그 그래프, 또는 개시시간의 로그 대 표준 농도의 로그의 산술 그래프인 표준 곡선으로부터 읽는다. 일 예시적 표준 곡선에 대해 생성된 로그-로그 직선의 방정식은 Y= - 0.2X + 3.14 이며, 여기서 Y = 로그 개시시간이고, X = 로그 내독소 농도이다. 평균 개시시간이 1630초인 미지의 샘플 중의 내독소 농도는, 개시시간을 그 로그값, 3.212로 변환시키고, X에 대한 방정식을 푼 다음, X의 역로그를 취하여 농도를 구함으로써 계산될 수 있다:

X = (Y-3.14)/-0.2

X = (3.212 - 3.14)/-0.2

X = -0.36

역로그 (-0.36) = 0.44 EU/mL (or EU/mg)

통상, LAL에 의해 결정되는 해조류 추출물 중 내독소 농도는 5,000 내지 10,000 EU/mg이다. 본 발명의 발열인자 제거방법은 내독소 농도를 약 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 EU/mg 미만으로 감소시킬 수 있다.

발열물질의 비활성화 또는 제거를 증명하는데 유용한 또다른 시험으로는 미국약전 래빗 발열인자 시험(USP<151>)이 있다. 래빗 발열인자 시험은 생체내 시험으로서 발열인자를 정성적으로 감지한다. 래빗은 사람과 유사한 발열인자 내성을 갖기 때문에, 래빗의 체온 변화를 관찰하면 발열인자의 존재여부를 결정할 수 있다. 이 방법은 세균성 내독소 뿐만 아니라 비세균성 내독소 발열인자 역시 감지할 수 있다.

적절한 양의 제품을 투여할 경우, 래빗이 각 대조 온도보다 0.5℃ 이상의 개별적 체온 상승을 보이지 않으면, 그 제품은 발열인자가 존재하지 않는 조건을 만족하는 것이다. 만일 어떤 래빗이라도 0.5℃ 이상의 개별적 체온 상승을 나타내면, 이 시험은 또다른 다섯마리의 래빗에 대하여 계속 실시된다. 여덟마리의 래빗 중 0.5℃ 이상의 개별적 체온 상승을 나타내는 래빗이 세마리 이하이거나, 또는 여덟마리에 있어 개별적 최대 체온 상승의 합계가 3.3℃를 초과하지 않으면, 시험 대상 물질은 발열인자가 존재하지 않는 조건을 만족하는 것이다.

본 방법의 일 구현예에서, 처리된 추출물의 주사는 각 대조 온도보다 0.5℃ 이상의 개별적 체온 상승을 보이지 않았다. 추가적 다섯마리의 래빗을 이용하여 시험을 계속진행하는 일 구현예에서, 처리된 추출물의 주사는 여덟마리의 래빗 중 0.5℃ 이상의 개별적 체온 상승을 나타내는 래빗이 세마리 이하이고, 그 여덟마리의 개별적 최대 체온 상승의 합계는 3.3℃를 초과하지 않는다.

LAL 및 USP 래빗 발열인자 시험 모두는 미국 식약청(USP)에 의하여 비경구적 제제의 안전 검증에 있어 허용가능한 것으로 인정되었다.

본 방법의 몇가지 구현예에서, 적어도 약 1 %, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, 99.99%, 또는 99.999%의 발열물질이 제거 및/또는 비활성화된다. 일 구현예에서, 발열물질은 정부규제기관, 예컨대 미국 식약청 또는 유럽 의약품청, 또는 호주 의약품관리국, 또는 캐나다 보건부에 허용가능한 농도로 제거 및/또는 비활성화된다; 이들 기관의 규제요건은 본 출원의 출원일에 명시되어 있었다. 좋기로는, 본 방법은 적어도 약 50%, 90% 또는 99% 제거 및/또는 비활성화를 제공한다. 일 구현예에서, 본 방법에 의해 제조된 푸코이단 조성물은 USP 래빗 발열인자 시험 및/또는 LAL 시험을 통과할 수 있는 조성물을 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 본 방법은 LAL에 의해 결정되는 발열인자 농도가 약 100 EU/mL 미만인 용액을 제조할 수 있다.

해양 유기체 추출물은 갈조강(Class Phaeophyceae) 다시마목(Order Laminariales) (예컨대, 에이케시피케이시(Akkesiphycacease), 미역과(Alariaceae), 고루메과(Chordaceae), 쇠미역과(Costariaceae), 다시마과(Laminariaceae), 레소니에이시(Lessoniaceae), 수도고루메과(Pseudochordaceae)), 또는 모자반목(Order Fucales) (예컨대, 바이푸카리옵스데이시(Bifurcariopsdaceae), 더빌레에이시(Durvillaeaceae), 뜸부기과(Fucaceae), 하이만탈레이시(Himanthallaceae), 호르모시레이시(Hormosiraceae), 노티에이시(Notheiaceae), 모자반과(Sargassaceae) 및 세이로코케이시(Seirococcaceae))의 갈조류로부터 얻을 수 있다. 다시마목 해조류의 예로는 운다리아속(Genus Undaria)의 종들, 예컨대 운다리아 피나티피다(Undaria pinnatifida), 또는 관련종들, 예컨대 알라리아 에스큘렌타(Alaria esculenta), 사코리자 다당류(Saccorhiza polysaccharides), 운다리아 운다리오드(Undaria undarioides), 운다리아 피터세니아나(Undaria peterseniana) 및 라미나리아종, 예컨대 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata), 라미나리아 하이퍼보린(Laminaria hyperborean), 라미나리아 오크롤루카(Laminaria ochroleuca), 라미나리아 사카리나(Laminaria saccharina), 라미나리나 아가르드히(Laminaria agardhii), 라미나리아 앵거스타타(Laminaria angustata), 라미나리아 봉가르디나(Laminaria bongardina), 라미나리아 큐니폴리아(Laminaria cuneifolia), 라미나리아 덴티제라(Laminaria dentigera), 라미나리아 에피메라(Laminaria ephemera), 라미나리아 파를로위(Laminaria farlowii), 라미나리아 그로엔란디카(Laminaria groenlandica), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 라미나리아 롱기크루리스(Laminaria longicruris), 라미나리아 니그립스(Laminaria nigripes), 라미나리아 온테르미디아(Laminaria ontermedia), 라미나리아 팔리다(Laminaria pallida), 라미나리아 플레이티메리스(Laminaria platymeris), 라미나리아 사카리나(Laminaria saccharina), 라미나리아 세트첼리(Laminaria setchellii), 라미나리아 싱클레얼리(Laminaria sinclairli), 라미나리아 솔리던귤라(Laminaria solidungula) 및 라미나리아 스테노필라(Laminaria stenophylla)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 모자반목 조류의 예로는 푸커스속(Genus Fucus)의 종들, 예컨대 푸커스 베시큐이오서스(Fucus vesicuiosus), 푸커스 세라노이드(Fucus ceranoides), 푸커스 칼로니(Fucus chalonii), 푸커스 코트니(Fucus cottonii), 푸커스 디스티커스(Fucus distichus), 푸커스 에바니신(Fucus evanescens), 푸커스 가드네리(Fucus gardneri), 푸커스 네레이더스(Fucus nereideus), 푸커스 세라투스(Fucus serratus), 푸커스 스퍼모퍼스(Fucus spermophorus), 푸커스 스피랄리스(Fucus spiralis), 푸커스 텐도(Fucus tendo) 및 푸커스 비르소이드(Fucus virsoides)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

갈조류의 그외의 목(目)들로는, 타래가죽채찍말목(Ascoseirales), 말총말목(Cutleriales), 쐐기말목(Desmarestiales), 짝지발목(Dictyotales), 디스코스포란기움목(Discosporangiales), 익스토카르팔레스(Extocarpales), 패목(Ishigeales), 네모더마탈레스(Nemodermatales), 온슬로위알레스(Onslowiales), 랄프시알레스(Ralfsiales), 고리매목(Scytosiphonales), 사이토타미날레스(Scytothaminales), 갯쇠털목목(Sphacelariales), 털비말목(Sporochnales), 시링고더마탈레스(Syringodermatales), 틸로프터리달레스(Tilopteridales) 및 분류학상 소속불명인 것을 포함한다.

특정 갈조류의 종으로는, 타래가죽채찍말(Ascoseira), 말총말(Cutleria), 마이크로조니아(Microzonia), 자나디니아(Zanardinia), 아쓰로크라디아(Arthrocladia), 데스마레스티아(Desmarestia), 히마토탈러스(Himantothallus), 패유러즘(Phaeurusm), 딕티옵터리스(Dictyopteris), 딕티오타(Dictyota), 딜로퍼스(Dilophus), 디스트로미움(Distromium), 글로소포라(Glossophora), 호모이오스트리쿠스(Homoeostrichus), 로보포라(Lobophora), 로보스피라(Lobospira), 뉴하우시아(Newhousia), 파키딕티온(Pachydictyon), 파디나(Padina), 스파토글로썸(Spatoglossum), 스티포포디움(Stypopodium), 타오니아(Taonia), 조나리아(Zonaria), 스코레스비엘라(Scoresbyella), 코리스토카퍼스(Choristocarpus), 디스코스포란기움(Discosporangium), 아시네토스포라(Acinetospora), 펠드마니아(Feldmannia), 게미노카퍼스(Geminocarpus), 힝크시아(Hincksia), 포고트리쿰(Pogotrichum), 필래일라(Pylaiella), 아데노시스티스(Adenocystis), 캐피디움(Caepidium), 우트리쿨리디움(Utriculidium), 아크로트릭스(Acrothrix), 아스코세이로필라(Ascoseirophila), 아스페로코쿠스(Asperococcus), 아우스트로필룸(Austrofilum), 코다리아(Chordaria), 클라도시폰(Cladosiphon), 코리쿠스(Corycus), 델라마리(Delamarea), 딕티오시폰(Dictyosiphon), 엘라치스타(Elachista), 유데슴(Eudesme), 기라우디아(Giraudia), 고노니마(Gononema), 할로트릭스(Halothrix), 하플로글로이아(Haplogloia), 헤카토니마(Hecatonema), 헤테로사우더셀라(Heterosaundersella), 휴미아(Hummia), 이스모플리(Isthmoplea), 라미나리오콜락스(Laminariocolax), 라미나 이오니마(Laminar ionema), 리테시아(Leathesia), 렙토니마텔라(Leptonematella), 리토시폰(Litosiphon), 마이크로스폰기움(Microspongium), 미크로시파르(Mikrosyphar), 미엘로피쿠스(Myelophycus), 미리오글로이(Myriogloea), 미리오니마(Myrionema), 미리오트리키아(Myriotrichia), 파펜푸실라(Papenfussiella), 페트로스폰기움(Petrospongium), 플루로클라디아(Pleurocladia), 폴리트리투스(Polytretus), 프로셀라키스타(Proselachista), 프로텍토카퍼스(Protectocarpus), 펑타리아(Punctaria), 소바조글로이아(Sauvageaugloia), 소란테라(Soranthera), 소로카퍼스(Sorocarpus), 스퍼마이오크너스(Spermaiochnus), 스패로트리키아(Sphaerotrichia), 스틱티오시폰(Stictyosiphon), 스트레블로니마(Streblonema), 스트리아리아(Striaria), 스트카포비아(Stschapovia), 티노클라디아(Tinocladia), 코다리옵시스(Chordariopsis), 아스테로클라돈(Asterocladon), 익토카퍼스(Ectocarpus), 쿠쿠키아(Kuckuckia), 메소스포라(Mesospora), 아스테로트리키아(Asterotrichia), 바첼로티아(Bachelotia), 비푸르카리옵시스(Bifurcariopsis), 더빌래(Durvillaea), 아스코필룸(Ascophyllum), 푸커스(Fucus), 히스페로피커스(Hesperophycus), 펠베티아(Pelvetia), 펠베티옵시스(Pelvetiopsis), 실베티아(Silvetia), 크시포포라(Xiphophora), 히만탈리아(Himanthalia), 호르모시라(Hormosira), 노티아(Notheia), 안토피커스(Anthophycus), 엑실라리엘라(Axillariella), 비푸르카리아(Bifurcaria), 비푸르카리옵시스(Bifurcariopsis), 카포글로썸(Carpoglossum), 카울로시스티스(Caulocystis), 코코포라(Coccophora), 시스토포라(Cystophora), 시스토세이라(Cystoseira), 할리드리스(Halidrys), 히지키아(Hizikia), 호르모피사(Hormophysa), 미야그롭시스(Myagropsis), 미요그롭시스(Myogropsis), 미리오데스마(Myriodesma), 사가썸(Sargassum), 터비나리아(Turbinaria), 시스토패라(Cystophaera), 마기나리엘라(Marginariella), 필로스포라(Phyllospora), 세이로코쿠스(Seirococcus), 이시게(Ishige), 아케시피커스(Akkesiphycus), 알라리아(Alaria), 아우레오피커스(Aureophycus), 드루엘리아(Druehlia), 유알라리아(Eualaria), 히롬(Hirome), 레소니옵시스(Lessoniopsis), 플루로피커스(Pleurophycus), 프테리고포라(Pterygophora), 운다리아(Undaria), 운다리엘라(Undariella), 운다리옵시스(Undariopsis), 코다(Chorda), 아가룸(Agarum), 코스타리아(Costaria), 딕티요뉴룸(Dictyoneurum), 탈라시오필룸(Thalassiophyllum), 아쓰로탐누스(Arthrothamnus), 코스튤라리아(Costularia), 사이마테레(Cymathere), 페디티아(Feditia), 기간티(Gigantea), 라미나리아(Laminaria), 마크로시스티스(Macrocystis), 네레오시스티스(Nereocystis), 펠라고피커스(Pelagophycus), 펠라고피커스 엑스 마크로시스티스(Pelagophycus x Macrocystis), 피코카스타눔(PhycoCastanum), 필라리엘라(Phyllariella), 폴리스키디(Polyschidea), 포스텔시아(Postelsia), 수도레소니아(Pseudolessonia), 사카리아(Saccharina), 스트렙토필롭시스(Streptophyllopsis), 에클로니아(Ecklonia), 에클로니옵시스(Eckloniopsis), 에그레지아(Egregia), 에이세니아(Eisenia), 레소니아(Lessonia), 수도코다(Pseudochorda), 네모더마(Nemoderma), 온슬로위아(Onslowia), 베로스파셀라(Verosphacella), 네오랄프시아(Neoralfsia), 바시스포라(Basispora), 하팔로스폰기디온(Hapalospongidion), 존소니아(Jonssonia), 리토더마(Lithoderma), 미리오네몹시스(Myrionemopsis), 페트로더마(Petroderma), 포르테리네마(Porterinema), 수도리토더마(Pseudolithoderma), 랄프시아(Ralfsia), 크누스포라(Chnoospora), 콜포메니아(Colpomenia), 하이드로클라트루스(Hydroclathrus), 페탈로니아(Petalonia), 로센빈지(Rosenvingea), 시스토시폰(Scytosiphon), 보다넬라(Bodanella), 코엘로클라디아(Coelocladia), 헤리바우디엘라(Heribaudiella), 패오스트로마(Phaeostroma), 아스테로네마(Asteronema), 시스토탐누스(Scytothamnus), 스테레오클라돈(Stereocladon), 스플라크니디움(Splachnidium), 클라도스테푸스(Cladostephus), 스파셀라리아(Sphacelaria), 스파셀라(Sphacella), 알레토클라두스(Alethocladus), 할로프테리스(Halopteris), 스티포콜론(Stypocaulon), 아우스트로네레이아(Austronereia), 벨로티아(Bellotia), 카포미트라(Carpomitra), 엔시오탈리아(Encyothalia), 네레이아(Nereia), 페리스포로크누스(Perisporochnus), 페리탈리아(Perithalia), 스포로크네마(Sporochnema), 스포로크누스(Sporochnus), 토마큘롭시스(Tomaculopsis), 신고더마(Syngoderma), 할로시폰(Halosiphon), 마소노피커스(Masonophycus), 필라리옵시스(Phyllariopsis), 사코리자(Saccorhiza), 스트카포비아(Stschapovia), 하플로스포라(Haplospora), 패오시포니엘라(Phaeosiphoniella), 틸롭테리스(Tilopteris), 네오레피오뉴마(Neolepioneuma), 아날리푸스(Analipus) 및 패오스트로피온(Phaeostrophion)을 포함한다.

특정 갈조류로는 다음의 종들을 포함한다: 아데노시스티스(Adenocystis), 알라리아(Alaria), 아스코필룸(Ascophyllum), 코다(Chorda), 클라도시폰(Cladosiphon), 데스마레스티스(Desmarestis), 딕티요타(Dictyota), 더빌래(Durvillaea), 에클로니아(Ecklonia), 엑토카퍼스(Ectocarpus), 에그레지아(Egregia), 푸커스(Fucus), 할리드리스(Halidrys), 히만탈리아(Himanthalia), 호르모시나(Hormosina), 레테시아(Lethesia), 레소니아(Lessonia), 마크로시스티스(Macrocystis), 네레오시스티스(Nereocystis), 파디나(Padina), 펠라코피커스(Pelagophycus), 펠바티아(Pelvatia), 필라이엘라(Pilaiella), 포스텔시아(Postelsia), 사크리자(Saccrhiza), 사가썸(Sargassum), 스파셀라리아(Sphacelaria) 및 터비나리아(Turbinaria).

그밖의 적합한 해양 유기체로는 녹조류 및 극피동물, 예컨대 성게 및 해삼을 포함한다. 녹조류의 예로는 울바(ulva sp), 파래(Enteromorpha sp), 코디움(Codium sp), 콜러파(Caulerpa sp) 및 할리말라(Halimala sp)를 포함한다.

일 구현예에서, 추출물은 운다리아 피나티피다(Undaria pinnatifida), 푸커스 베시큘로수스(Fucus vesiculosus) 또는 울바(Ulva sp)를 원료로 한다.

푸코이단은 코다 필룸(Chorda filum), 클라도시폰 오카무라누스(Cladosiphon okamuranus), 운다리라 피나티피다, 리테시아 디포미스(Leathesia difformis), 아스코필룸 노도숨(Ascophyllum nodosum), 에클로니아 쿠롬(Ecklonia kurome), 펠베티아페스티지아타(Pelvetiafastigiata), 사운더셀라 심플렉스(Saundersella simplex), 또는 코다리아플라겔리포미스(Chordariaflagelliformis)로부터 유래할 수도 있다.

따라서, 추출물은 갈조류 또는 녹조류 또는 극피동물을 원료로 할 수 있다.

해양 유기체가 식물일 경우, 추출물은 그 식물 전체 또는 그 식물의 일부, 예컨대, 잎사귀, 줄기, 포자, 또는 이들의 조합을 원료로 할 수 있다. 추출물 제조시 출발물질은 신선하거나, 냉동되거나, 또는 건조된 물질일 수 있다.

추출물은 방법들, 예컨대, 침용, 삼출, 탕제(decoction), 환류 추출, 초음파를 이용한 추출, 용매상들 사이의 분리를 이용한 추출, 공동-용매의 존재 또는 비존재하 초임계 추출을 이용하여 제조할 수 있다. 본 방법을 위한 출발물질로서 유용한 추출물을 형성하기 위하여, 해조류를 산 또는 염기로 처리하는 방법도 이용될 수 있다.

일 구현예에서, 이 방법은 탄수화물을 분리하기 위한 것으로, 구체적으로는 다당류를 분리하기 위한 것이다. 다당류는 알지네이트, 또는 황산화 다당류일 수 있다.

일 구현예에서, 황산화 다당류는 푸코이단, 또는 푸코이단의 유도체이다. 본 발명의 맥락에서, "푸코이단"이라 함은 여러가지 해양 식물 및 동물에서 발견되는 유형의 황산 알파-L-푸칸을 의미하는 것으로 의도된다.

일 구현예에서, 황산화 다당류는 울반, 또는 울반의 유도체이다. 본 발명의 맥락에서, "울반"이라 함은 다양한 정도의 황산화된 람노오스, 자일로오스, 글루쿠론산, 이두론산 잔기를 함유하는, 녹조류의 황산화된 세포벽 성분을 의미하는 것으로 의도된다.

또한, "푸코이단" 및 "울반"이라 함은 생물학적 활성 단편, 유도체, 또는 이들의 유사물질을 더 포함한다. 또한, 더 큰 분자의 분해(예컨대, 가수분해)에 의해 생성된 푸코이단 또는 울반의 단편이 포함된다. 분해는 산, 염기, 열, 또는 효소로 처리함으로써 달성되어, 분해된 푸코이단 또는 울반을 얻을 수 있으며, 이들은 따로 분리될 수 있거나, 또는 분리될 수 없다. 푸코이단 및 울반은 화학적으로 변환될 수 있으며, 개질이 가능하고, 황산화, 폴리황산화, 아세틸화, 에스테르화, 및 메틸화를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 본 방법은 석면, 지질다당류-해독 효소, 구아니딘 염산, 황산암모늄, 크로마토그래피 수지, 액티클린 엔도톡스(Acticlean endotox), 고정 히스타민, 또는 트리톤 실리카(Triton silica), 또는 본 출원의 출원일에 상업적으로 유통되는 그밖의 발열인자 제거 필터의 사용을 필요로 하는 과정을 포함하지 않는다.

일 측면에서, 본 발명은 실질적으로 발열인자가 제거된 해양 유기체 추출물을 제공한다. 좋기로는, 이 추출물은 LAL에 의해 결정되는 발열물질의 농도가 약 100 EU/mL 미만, 및/또는 래빗 발열성 시험을 통과할 수 있는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 추출물을 제공한다.

일 구현예에서, 추출물은 적어도 부분적으로 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된다. 본 방법은 발열물질의 감소 및/또는 제거을 위한 다른 단계들을 추가할 수 있음이 이해될 것이다.

처리된 추출물은 순도 및 함유된 다당류의 다양한 성질, 예컨대, 분자량, 푸코오스, 갈락토오스, 람노오스, 자일로오스, 우론산을 포함하는 탄수화물 함량, 중금속 오염, 황산화, 아세틸화, 반대이온 및 물에 대하여 분석될 수 있다. 다당류 샘플을 특징짓기 위하여 여러가지 분석기법이 이용될 수 있는데, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 원소조성분석법(elemental composition analysis), 레이저광산란법(LLS), 유도결합 플라즈마 질량분석기(ICP-MS), 가시광선 분광법(UV-Vis) 및 가스크로마토그래피 질량분석기(GC-MS)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇가지 구현예에서, 처리된 추출물 중의 푸코이단은, 비처리된 푸코이단과 비교할 때, 실질적으로 전술한 성질들 중 하나 이상에서 서로 유사하다.

또다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 다당류를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 부형제를 예로는, 탄수화물, 무기염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 버퍼, 산, 염기, 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 주사가능한 조성물에 적합한 부형제의 예로는 물, 알코올, 폴리올, 글리세린, 식물성 기름, 인지질, 및 계면활성제를 포함한다. 탄수화물, 예컨대, 설탕, 설탕 유도체, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 설탕, 및/또는 설탕 폴리머가 부형제로 존재할 수 있다. 특정 탄수화물 부형제의 예로는 다음을 포함한다: 단당류, 예컨대 프룩토오스, 말토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노오스, 소르보오스 등; 이당류, 예컨대, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 셀로비오스 등; 다당류, 예컨대, 라피노오스, 멜레치토오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 솔비톨(글루시톨), 피라노실 솔비톨, 미요이노시톨(myoinositol) 등. 부형제는 또한 무기염 또는 버퍼, 예컨대, 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 인산수소나트륨, 인산수소이나트륨, 및 이들의 조합도 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 미생물 성장을 예방 또는 억제하기 위하여 항미생물제도 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항미생물제의 비제한적 예로는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐릭 니트레이트, 티머솔(thimersol), 및 이들의 조합물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 산화를 억제하여 푸코이단 또는 그밖의 제제 성분의 변질을 방지하기 위하여, 항산화제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 항산화제로는, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 하이포포스포러스 애시드, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 폴리페놀, 소디움 바이설파이트, 소디움 포름알데히드 설폭실레이트, 소디움 메타바이설파이트, 및 이들의 조합물을 포함한다.

계면활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 계면활성제의 예로는: 폴리솔베이트, 예컨대 "Tween 20" 및 "Tween 80", 및 플루로닉(pluronic), 예컨대 F68 및 F88 (BASF); 솔비탄 에스테르; 지질, 예컨대 인지질, 예컨대 레시틴, 및 그밖의 포스파티딜콜린(phosphatidylcholines), 포스파티딜에탄올아민, 지방산 및 지방산 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 아연 또는 그밖의 적합한 양이온을 포함한다.

산 또는 염기가 부형제로서 조성물에 존재할 수 있다. 산의 비제한적 예로는, 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 삼염화아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 산들을 포함할 수 있다. 염기의 적합한 예로는, 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 염기를 제한없이 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 다당류를 포함하는 바이오 재료를 제공한다. 울반은 바이오 재료 시멘트(예를 들어, 골 시멘트)로 사용되거나, 3차원 스캐폴드를 형성하여 새로운 조직의 성장을 촉진하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 울반은 생분해성 하이드로겔로 사용될 수 있으며, 따라서 약물 전달 비히클로서 잠재적으로 유용하다. 이 맥락에서, 울반은 예를 들어, 생분해성 하이드로겔을 얻기 위해 라디칼 중합성(polymerizable) 관능기를 이식함으로써, 기능화될 수 있다.

본 발명의 발열인자가 제거된 푸코이단은, 하나 이상의 임상 분야 또는 무균 탈체(ex vivo) 분야, 더욱 구체적으로는, 응고 조절, 섬유소용해제로서, 항암제로서, 항바이러스제로서(출원인의 국제출원 공개공보 WO/2011/100805 참조, 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참조 통합된다.), 조혈 줄기세포 또는 다른 유형의 줄기세포 가동화제(mobilizing agent)로서 이용될 것이다.

본 발명의 발열인자가 제거된 푸코이단 추출물이 이용될 수 있는 기타 임상 적응증으로 염증을 포함한다. 푸코이단은 셀렉틴 억제 활성, 스캐빈저 수용체 억제, 및 염증 세포 축적의 조절을 통해 작용할 수 있다. 급성 및 만성 염증 질환은 천식, 알러지성 피부염, 심혈환 질환, 허혈후 염증, 및 다른 감염이나 병리 이후 염증을 포함한다.

발열인자가 제거된 푸코이단 추출물은, 암환자의 줄기세포를 보호하기 위한 방사선 및 화학요법 보조제의 맥락에서, 줄기세포 가동화제로서 작용할 수 있다. 이 추출물은 직접 항암제로서, 또는 보조 항암제로서 유용할 수 있다. 나아가, 장 질환에 대한 치료 분야가 고려된다. 구체적으로는, 에탄올이나 다른 제제에 의해 유발되거나, 감염, 예컨대 헬리코박터 파일로리 및 클로스트리듐 디피실균에 의한 위 질환을 들 수 있다.

또한, 항바이러스 분야가 고려되며, 이는 헤르페스 바이러스 감염(HSV1, HSV2, 및 이들의 약제 내성 균주를 포함), 거대세포바이러스(HCMV), 독감 바이러스, HIV의 치료 분야이다. 비록 몇가지 헤르페스 감염이 주사나 다른 방법을 통해 해당부위에 직접 투여를 필요로 할 수 있지만, 이들 조건에서는 국소 또는 경구 전달이 일반적일 것이다.

면역 세포, 예컨대 모노사이트, NK 세포, 및 수지상세포의 수와 활성에 있어서 면역 기능을 향상시키는 푸코이단의 능력을 고려하면, 면역 조절과 관련된 질환도 잘 받아들일 가능성이 있다. 푸코이단은 항병원균성 또는 항암 효과를 얻기 위하여 이들 세포의 활성을 향상시키는 것으로 알려져 있다.

또한, 수술에 있어 유착을 방지하는 유착방지 처치에 사용되는 것이 고려된다.

또한, 응고, 당 대사와 관계된 효소 기능의 조절, 매트릭스 단백질 전환율, 탈체 및 생체내 기타 효소 과정의 조절에 사용되는 것이 고려된다. 또한, 본 발명의 푸코이단 추출물은 성장 인자, 예컨대 TGFβ 및 그 수용체의 활성 조절에도 사용될 수 있다.

본 발명의 발열인자가 제거된 추출물은, 신경 질환(아밀로이드 축적과 관련된 것을 포함), 응고 장애(항혈전성, 혈전용해성, 또는 항응고, 또는 응혈촉진성 포함), 뿐만 아니라, 헤모필리아(haemophilia), 국소 미용크림, 치과 분야, 안구 분야, 및 P 셀렉틴 영상을 위한 방사성 마커의 담체에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 발열인자가 제거된 푸코이단 추출물은 방출제 또는 항생제나 다른 활성제제의 담체로 사용될 수 있다.

본 발명의 발열인자가 제거된 추출물은, 임상가가 필요하거나 적절하다고 여기는 바에 따라, 적합한 방법으로 신체 및 신체의 일부에 전달될 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 상기와 같은 건강상태에 있는 사람 및 다른 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 이하의 비제한적 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 묘사될 것이다.

실시예 1: 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

출발물질은 푸코이단에 대해 약87%까지 사전에 정제된 동결건조 제품으로, 이는 천연 탄수화물(대략 50% 내지 27.5% 푸코오스, 22.5% 갈락토오스), 황산염(26%), 아세틸 부분(3%) 및 반대이온(8%)을 포함하였다.

이 방법에서 사용된 물은 전부 사용전에 발열인자 필터를 통해 여과된 것이었다. 모든 장치는 사용전에 위생처리하고 발열인자가 제거된 물로 헹궈냈다.

동결건조된 푸코이단 제품 2.86 kg을 50배의 (143 L) 0.05M NaOH에 용해시켰다.

상기 용해는, 먼저 반응기에 약 114.4 L의 정제수(즉, 143 L의 80%)를 넣어 수행하였다. 상기 정제수에 5.94 kg의 NaOH을 첨가하였고, 143 L의 정제수 중 나머지를 첨가하였다. 교반하면서 고체 푸코이단(2.86 kg)을 첨가하였다. 교반하면서 모든 고체가 완전히 용해될 때까지 이 용액을 40℃까지 가열하였다. 40℃에서 10분동안 이 용액을 방치하였다.

3 kg의 스피드플러스 필터 에이드(Dicalite, PA)를 용액에 첨가하고, 가압여과기를 사용하여 여과를 수행하였다. 180 L의 여과액을 수집하고 이를 새로운 반응기에 옮겼다.

2.6 L의 H₂0₂ (50 w/w%)를 상기 여과액에 첨가하고, 이 용액을 교반하면서 60℃에서 1시간 동안 두었다. 그런 다음, 이 용액을 45℃까지 식히고, H₂S0₄ (36 w/w%)을 사용하여 pH를 10.0 내지 10.5으로 조정하였다.

30 kDa의 명목 컷-오프를 갖는 77 ft²막(Synder Filtration, CA)을 사용하여pH가 조정된 용액을 한외여과(ultrafilter)하였다.

UF 장치를 조립한 후, 45 내지 50℃, pH 10 내지 11인 정제수 100 L당 150 ml NaOCl의 용액을 30분동안 재순환시킴으로써 위생처리하였다. 상기 장치를 적어도 200 L의 발열인자가 제거된 정제수로 헹궜다. 푸코이단 용액을 농축 용기(retentate vessel)에 넣고, 농축물이 최초 부피의 약 20%로 농축될 때까지 한외여과를 수행하였다. 한외여과 과정 전반에 걸쳐, 피드 압력을 2.0 bar로 하고, 농축 압력을 1.0 bar로 유지하였다. 침투 플럭스(permeate flux)는 12.5 L/minute에서 시작하고, 한외여과의 종료 시점에는 10.8 L/minute으로 떨어졌다.

그런 다음, 농축된 푸코이단 용액(40 L)을 발열인자가 제거된 정제수(160 L)를 사용하여 정용여과하였다(diafilatration). 피드 압력을 2.0 bar로 하고, 농축 압력을 1.0 bar로 유지하였다. 20분에 걸쳐 침투 플럭스가 10.9 L/minute에서 7.5 L/minute으로 떨어졌다.

그 다음, H₂S0₄을 사용하여 pH를 8로 조정하고, 또다른 4 부피(160 L)의 발열인자가 제거된 정제수를 사용하여 정용여과를 계속하였다. 피드 압력을 2.0 bar로 하고, 농축 압력을 1.0 bar로 유지하였다. 정용여과 27분에 걸쳐 침투 플럭스가 7.5 L/minute에서 6.0 L/minute으로 떨어졌다.

그리고 나서, 이 용액을 40 L 부피로 더 농축시켰다.

농축물을 새로운 Cuno 1 DEPL 발열인자 제거 필터를 통과시킨 후, 동결건조하였다. 총 1820 g의 고형물을 회수하였다. 동결건조된 생성물을 Comil 032 스크린을 통과시켜 제분하였다.

처리 수율이 63%로 계산되었다. 90%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 2: 제올라이트와 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

푸코이단(15.00 g)을 300 mL의 증류수에 용해시키고, 유리섬유 필터로 여과하였다. 증류수를 사용하여 여과액을 300 g으로 만들었다. 상기 푸코이단 용액 중 40 mL의 분취량을 증류수를 사용하여 100 mL으로 희석하고, 0.2 g의 제올라이트를 첨가하였다. 현탁액을 14시간 동안 교반한 후, 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 100 mL의 증류수로 씻은 후, 최종 부피 40 mL로 농축하고 동결건조하였다.

1%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

제올라이트 접촉 없이 유사한 과정에서는 푸코이단 수율이 92.5%이었고, 발열인자의 감소는 없었다.

실시예 3: 저농도 알칼리 및 활성탄과 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

푸코이단(15.00 g)을 300 mL의 증류수에 용해시키고, 유리섬유 필터로 여과하였다. 증류수를 사용하여 여과액을 300 g으로 만들었다. 상기 푸코이단 용액 중 40 mL의 분취량을 0.5% NaOH를 사용하여 100 mL으로 희석하고, 0.2 g의 활성탄을 첨가하였다. 현탁액을 14시간 동안 교반한 후 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 100 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 40 mL로 농축하고 동결건조하였다.

66%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 4: 계면활성제와 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

푸코이단(10.00 g)을 300 mL의 발열인자가 제거된 물에 용해시켰다. 이 용액을 유리섬유 필터로 여과하여 투명한 갈색 용액을 얻었다(- 280 mL). 상기 푸코이단 용액 중 75 g의 분취량을 증류수를 사용하여 150 mL으로 희석하고, 1.8 g의 Teric^®G12A12을 첨가하였다. 현탁액을 1시간 동안 교반한 후 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 100 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 40 mL로 농축하고 동결건조하였다. 93%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

상기 푸코이단 용액 중 75 g의 분취량을 증류수를 사용하여 150 mL으로 희석하고, 1.8 g의 Tween^®20을 첨가하였다. 현탁액을 1시간 동안 교반한 후 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 100 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 40 mL로 농축하고 동결건조하였다.

상기 푸코이단 용액 중 75 g의 분취량을 증류수를 사용하여 150 mL으로 희석하고, 1.8 g의 Triton^®X100을 첨가하였다. 현탁액을 1시간 동안 교반한 후 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 100 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 40 mL로 농축하고 동결건조하였다.

실시예 5: 저농도 과산화물과 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

푸코이단(6.00 g)을 250 mL의 증류수에 용해시켰다. 0.5 M NaOH을 제공하는 자동 적정장치를 이용하여 pH를 7.00에 고정하였다. 핫플레이트에서 교반하면서 이 용액을 90℃로 가열한 후, 3.0 mL의 30 w/w% H₂0₂을 첨가하였다. 1시간 후, 4.37 mL의 알칼리가 반응에 소비되었다. 이 용액을 상온에 밤새 방치한 후, 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 50 mL로 농축하고 동결건조하였다. 83%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 6: 철계 촉매의 존재하에 과산화물과 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

푸코이단(10.00 g)을 250 mL의 증류수에 용해시켰다. 0.5 M NaOH을 제공하는 자동 적정장치를 이용하여 pH를 7.00에 고정하였다. 핫플레이트에서 교반하면서 이 용액을 60℃로 가열한 후, 10.0 mL의 30 w/w% H₂0₂ 및 0.1 g의 시트르산철(Ⅲ)을 첨가하였다. 4시간 후, 14.92 mL의 알칼리가 소비되었다. 이 용액을 상온에 밤새 방치한 후, 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 50 mL로 농축하고 동결건조하였다.

94%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 7: 철계 촉매의 존재하에 고농도 과산화물과 접촉 및 두번째 과산화물 처리 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

푸코이단(10.00 g)을 250 mL의 증류수에 용해시켰다. 0.5 M NaOH을 제공하는 자동 적정장치를 이용하여 pH를 7.00에 고정하였다. 핫플레이트에서 교반하면서 이 용액을 60℃로 가열한 후, 10.0 mL의 30 w/w% H₂0₂ 및 0.1 g의 시트르산철(Ⅲ)을 첨가하였다. 2시간 후, 12.10 mL의 알칼리가 소비되었다. 또다른 5.0 mL의 30 w/w% H₂0₂을 첨가하였다. 10시간 후, 총 15.23 mL의 알칼리가 소비되었다. 이 용액을 상온에 밤새 방치한 후, 유리섬유 필터로 여과하였다. 그런 다음, Amicon stirred cell을 통해 여과액을 한외여과하고, 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 50 mL로 농축하고 동결건조하였다.

99%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 8: 철계 촉매 및 계면활성제의 존재하에 고농도 과산화물과 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

푸코이단(10.00 g)을 250 mL의 증류수에 용해시켰다. 0.5 M NaOH을 제공하는 자동 적정장치를 이용하여 pH를 7.00에 고정하였다. 핫플레이트에서 교반하면서 이 용액을 70℃로 가열한 후, 10.0 mL의 30 w/w% H₂0₂ 및 0.1 g의 시트르산철(Ⅲ)을 첨가하였다. 1시간 후, 12.22 mL의 알칼리가 소비되었다. 이 용액을 상온에 밤새 방치한 후, 유리섬유 필터로 여과하였다. 이 여과액 중 125 g의 분취량을 2.0 g의 Teric^®G12A12으로 1시간 동안 처리한 후, Amicon stirred cell을 통해 한외여과하였다. 농축물을 170 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 최종 부피 30 mL로 농축하고 동결건조하였다.

99%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 9: 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(2.00 g)을 100 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 10분 후, 고체를 원심분리에 의해 분리하여 버렸다. 상층액을 유리섬유 필터로 여과하고, 50 mL의 분취량을 3시간 동안 60℃로 가열하였다. 그런 다음, 발열인자가 제거된 증류수를 사용하여 반응 혼합물을 100 mL로 희석하고, Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 5 mL의 농축물을 얻었다. 농축물을 75 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 5 mL로 농축하고 동결건조하였다.

99% 이상의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 10: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(2.00 g)을 100 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 10분 후, 고체를 원심분리에 의해 분리하여 버렸다. 상층액을 유리섬유 필터로 여과하고, 60℃에서 50 mL의 분취량을 1.00 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 3시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 발열인자가 제거된 증류수를 사용하여 반응 혼합물을 100 mL로 희석하고, Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 5 mL의 농축물을 얻었다. 농축물을 75 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 5 mL로 농축하고 동결건조하였다.

99% 이상의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 11: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 에클로니아 맥시마로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

45℃로 온도를 높이면서 푸코이단(8.00 g)을 400 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 10분 후, 이 용액을 65℃에서 4.00 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 1시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 50% H₂S0₄을 사용하여 여과액의 pH를 13.0로부터 10.5로 조정한 다음, Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 20 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 20 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

실시예 12: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 푸커스 베시큘로수스로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

45℃로 온도를 높이면서 푸코이단(6.3 g)을 300 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 반응 혼합물을 65℃로 가열하고, 2.00 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 1시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 50% H₂S0₄을 사용하여 여과액의 pH를 11.7로부터 11.0으로 조정한 다음, Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 20 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 20 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

99% 이상의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 13: 고농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 아스코필룸 노도숨으로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(15.0 g)을 735 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 Dicalite 필터-에이드를 통해 여과하였다. 여과액을 60℃로 가열하고, 30.0 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 1시간 동안 처리하였다. 그런 다음, pH 10.0의 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 30 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 30 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

실시예 14: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 알라리아 에스큘렌테(Alaria esculente)로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(4.0 g)을 200 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 Dicalite 필터-에이드를 통해 여과하였다. 여과액을 60℃로 가열하고, 30.0 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 30분 동안 처리하였다. 그런 다음, pH 10.7의 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 30 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 30 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

실시예 15: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 에클로니아 라디아타(Ecklonia radiata)로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(4.0 g)을 200 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 Dicalite 필터-에이드를 통해 여과하였다. 여과액을 60℃로 가열하고, 2.0 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 30분 동안 처리하였다. 그런 다음, pH 10.7의 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 30 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 30 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

실시예 16: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 사르가숨 푸시폼(Sargassum fusiforme)으로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(4.0 g)을 200 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 Dicalite 필터-에이드를 통해 여과하였다. 여과액을 70℃로 가열하고, 0.7 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 30분 동안 처리하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 30 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 30 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

실시예 17: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 마크로시스티스 피리페라(Macrocystis pyrifera)로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(2.0 g)을 200 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 반응 혼합물을 65℃로 가열하고, 1.0 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 30분 동안 처리하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 30 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 30 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

실시예 18: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 클라도시폰 오카무라누스( Cladosiphon okamuranus )로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

40℃로 온도를 높이면서 푸코이단(4.0 g)을 200 mL의 0.5 M NaOH에 용해시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 Dicalite 필터-에이드를 통해 여과하였다. 여과액을 65℃로 가열하고, 2.0 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 30분 동안 처리하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 30 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 30 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 2회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 동결건조하였다.

실시예 19: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 울바종( Ulva sp.)으로 부터 정제된 울반의 발열인자 제거

55℃로 온도를 높이면서 울반(2.0 g)을 150 mL의 0.5 M KOH에 용해시켰다. 여과액을 65℃로 가열하고, 6.0 mL의 30 w/w% H₂0₂으로 60분 동안 처리하였다. 그런 다음, 50% H₂S0₄을 사용하여 반응 혼합물을 pH 12.1에서 pH 7.8로 중화시켰다. 여과액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하여 30 mL의 부피로 농축하였다. 농축물을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 씻은 후, 30 mL로 재농축하였다. 50 mL의 수세 및 재농축을 추가적으로 3회 더 반복하였다. 최종 농축된 농축물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고 동결건조하였다.

99% 이상의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 20: 푸커스 베시큘로수스로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거

출발물질은 푸코이단에 대해 약95%까지 사전에 정제된 동결건조 제품으로, 이는 천연 탄수화물(대략 60.1% 내지 54.0% 푸코오스, 3.0% 갈락토오스), 황산염(27.5%), 및 반대이온(7.5%)을 포함하였다.

이 방법에서 사용된 물은 전부 사용전에 증류에 의해 정제된 것이었다. 모든 장치는 사용전에 위생처리하고 정제된 물로 헹궈냈다.

동결건조된 푸코이단 제품 1.99 kg을 50배의 (100 L) 0.04M KOH에 용해시켰다.

상기 용해는, 먼저 반응기에 약 100 L의 정제수를 넣어 수행하였다. 상기 정제수에 4 L의 50% KOH을 첨가하였고, 이 용액을 60℃로 가열하였다. 교반하면서 고체 푸코이단(1.99 kg)을 첨가하였다. 교반하면서 모든 고체가 완전히 용해될 때까지 이 용액을 60℃로 유지하였다. 이 용액은 pH가 11.9였다.

0.5 L의 H₂0₂ (50%)를 상기 여과액에 첨가하고, 이 용액을 교반하면서 65℃에서 1시간 동안 두었다. 그런 다음, H₂S0₄ (50 w/w%, 3.35 L)을 사용하여 용액의 pH를 11.9에서 9.5 내지 10.0으로 조정하였다. 최종 pH는 9.8이었다. 그리고 나서, 이 용액을 45℃까지 식혔다.

5 kDa의 근소 컷-오프를 갖는 각각 78 ft²의 3개의 막(Koch, MA)을 사용하여, 상기pH가 조정된 용액을 한외여과하였다.

UF 장치를 조립한 후, 45 내지 50℃에서, 순서대로 각각 15분씩, 0.05 w/w% KOH의 용액 100 L, 100 ppm NaOCI 용액 100 L, 0.1 w/w% H₂0₂ 용액 100 L을 재순환시킴으로써 위생처리하였다. 상기 장치를 적어도 200 L의 정제수로 헹궜다. 푸코이단 용액을 농축 용기에 넣고, 농축물이 최초 부피의 약 30%로 농축될 때까지 한외여과를 수행하였다. 한외여과 과정 전반에 걸쳐, 농축 압력을 50 psi로 유지하였다. 침투 플럭스는 2.0 L/minute에서 시작하고, 한외여과의 종료 시점에는 1.6 L/minute이었다.

그런 다음, 농축된 푸코이단 용액(30 L)을 정제수(10 L 분획으로 120 L)를 사용하여 정용여과하였다. 농축 압력을 50 psi로 유지하였다. 침투 플럭스가 7분 동안 1.5 L/minute에서 유지되었다.

그리고 나서, 이 용액을 최종 22 L의 부피로 더 농축시켰다.

농축물을 동결건조하였다. 총 820 g의 고형물을 회수하였다.

처리 수율이 41%로 계산되었다. 99%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 21: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 2단계 한외여과를 통한, 푸커스 베시큘로수스로부터 정제된 푸코이단의 발열인자 제거 및 분획

50℃로 온도를 높이면서 푸코이단(50 g)을 2 L의 1 w/w% H₂S0₄에 용해시켰다. 반응 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 50 w/w% NaOH을 첨가하여 용액의 pH를 1.2에서 4.0으로 올렸다. 여기에 50 g의 고체 NaOH을 더 첨가하고, 반응 혼합물을 10분에 걸쳐 65℃로 가열하였다. H₂0₂ (26 mL, 30 w/w%)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 더 교반하였다.

50 w/w% H₂S0₄을 첨가하여 용액 pH를 12.0에서 10.5로 낮추고, 밤새 방치하여 냉각시킨 후, Advantec AMI UHP stirred cell을 이용하여 한외여과하였다.

반응 혼합물을 처음에는 30 kDa 막을 사용하여 500 mL로 농축하고, 농축물(>30kDa 분획)을 500 mL의 증류수로 씻은 후, 500 mL로 재농축하였다. 수세 및 재농축을 추가적으로 3회 더 반복하였다. 침투물(<30 kDa 분획)에 대하여도 동일하게 농축하고, 수세 및 재농축으로 이어지는 과정을 4회 수행하였으며, 이때 10 kDa 막을 사용하였다. 최종 농축물(10-30 kDa 및 >30 kDa 분획들)을 수집하고 동결건조하였다.

양분획에서 모두 98%의 발열인자 감소를 보였다(LAL에 의해 결정됨).

실시예 22: 저농도 과산화물 및 고농도 알칼리와 접촉 후 한외여과를 통한, 운다리아 피나티피다로부터 정제된 푸코이단의 현장에서의 분리, 정제 및 발열인자 제거

55℃로 사전에 가열되어 있는 100 g의 0.5 w/w% H₂S0₄ 중에 해조류(5.0 g, 운다리아 피나티피다)를 현탁시켰다. pH 1.8의 얻어진 현탁액을 50℃에서 4시간 동안 교반한 후, 규조토로 코팅된 셀룰로오스 필터를 통해 여과하였다. 그런 다음, 10 w/w% NaOH을 사용하여 여과액의 pH를 11.0으로 올리고, 이 용액을 교반하면서 45℃로 가열하였다. 이 용액에 0.5 mL의 30 w/w% H₂0₂을 첨가하고, 10 w/w% NaOH을 첨가하여 용액 pH를 pH 10.9 보다 높게 유지하였다. 1시간 경과후 가열을 멈추고, 10 w/w% H₂S0₄을 사용하여 pH를 5.01로 낮추었다. 냉각된 용액을 Amicon stirred cell을 통해 한외여과하고, 농축액을 50 mL의 발열인자가 제거된 증류수로 3번 씻은 후, 50 mL로 농축하고 동결건조하였다. 정제된 백색 푸코이단의 분리 수율은 10.8%였다.

본 발명이 다수의 구분되는 측면에서 기술되고, 각 측면에 대한 특정 구현예 및/또는 바람직한 특징 개시되었지만, 이들 다양한 구현예 또는 응용들은 어떠한 측면과도 결합하여 실시될 수 있음이 고려된다. 또한, 어떤 주어진 측면의 특징은 다른 측면의 특징과 함께 실시될 수 있다.

본 명세서에 기재된 몇가지 구현예는 다른 구현예에 포함된 특징이 아닌 몇가지 특징을 포함하지만, 본 발명의 범위 내에서 서로 다른 구현예의 특징들을 조합하여 서로 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이 기술분야의 기술자에게 이해될 것이다.

Claims

표적 황산화 다당류 분자 및 발열물질(pyrogenic agent)을 포함하는 해조류 추출물의 발열성을 감소시키는 방법으로서,
상기 황산화 다당류 분자를 유효량의 산화제 및 염기의 조합과 접촉시킴으로써 상기 발열물질을 비활성화 및/또는 상기 발열물질을 제거하는 단계를 포함하여,
상기 추출물의 발열성을 감소시키는 결과를 가져오는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 추출물을 계면활성제, 활성탄 및 제올라이트 중 1종 이상의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 산화제는 과산화물인 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 과산화물은 적어도 약 30 w/w%(상기 황산화 다당류의 질량에 대한 과산화물의 질량)의 양으로 사용되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 계면활성제는 생물학적 계면활성제인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 계면활성제는 적어도 약 50 w/w%(상기 황산화 다당류의 질량에 대한 계면활성제의 질량)의 양으로 사용되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 염기는 pH가 약 7.0 초과, 약 12.5 미만이 되게 하는 양으로 사용되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 활성탄 또는 제올라이트는 적어도 약 10 w/w%(상기 황산화 다당류의 질량에 대한 흡착제의 질량)의 양으로 사용되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 황산화 다당류의 회수율은 적어도 약 30%인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 황산화 다당류의 회수율은 적어도 약 60%인 것인 방법.
제1항에 있어서, 적어도 약 50%의 발열물질이 제거 및/또는 비활성화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 적어도 약 99%의 발열물질이 제거 및/또는 비활성화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 황산화 다당류는 푸코이단(fucoidan) 또는 울반(ulvan)인 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 제조된 추출물.
제15항에 있어서, LAL에 의해 결정되는 발열물질의 농도가 약 100 EU/mg 미만인 것인 추출물.
제15항에 있어서, 래빗 발열성 시험(rabbit pyrogenicity test)을 통과할 수 있는 추출물.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 제조된 것인, 실질적으로 발열인자가 제거된(depyrogenated) 해양 유기체 추출물.
제15항에 기재된 추출물을 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, 혈액 응고 장애, 암, 바이러스 감염, 염증성 질환, 상처 치유 또는 수술적 유착 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제15항에 기재된 추출물을 포함하는 바이오 재료(biomaterial).
제18항에 기재된 추출물을 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, 혈액 응고 장애, 암, 바이러스 감염, 염증성 질환, 상처 치유 또는 수술적 유착 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제18항에 기재된 추출물을 포함하는 바이오 재료(biomaterial).
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