KR102019822B1 - 두켜부채 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물 - Google Patents
두켜부채 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 상기 두켜부채 추출물은 대식세포의 면역활성을 유도하여 면역체계를 조절하는 NO와 TNF-α의 발현을 증가시키는 반면, 염증활성을 유도하는 염증성 사이토카인의 발현을 억제시키는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 두켜부채 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 인체에 안전하고 효과적인 면역증강용 약학조성물 및 건강식품으로 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
면역계는 자연저항, 비특이성 면역체계 및 특이성 면역체계로 구분할 수 있다. 자연저항(1차 방어선)이란 미생물을 포함한 모든 침입자들을 그들의 종류에 관계없이 막아내는 해부생리학적 요소들을 말하며, 비특이적 면역(2차 방어선)은 자연저항을 돌파하여 체내로 들어온 침입자들을 제거하는 식세포로 구성된 방어체계를, 그리고 특이성 면역계(3차 방어선)는 림프구들로 구성된 면역체계를 말하는데, 이중 특이성 면역계는 기억능 그리고 자기와 비자기를 구분할 수 있는 능력을 지닌 고도로 발달한 면역체계이다.
백혈구는 2차 또는 3차 방어선을 구성하여 1차 방어선을 돌파하여 체내에 들어온 이물을 담당하게 되며, 세균, 바이러스 감염 또는 염증 반응 시, 대식세포 및 림프구 활성의 조절은 의약품의 치료 효과의 결정에 있어서 중추적인 역할을 한다.
대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 일산화산소(NO)를 생성하여 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산하여, NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O2-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성억제기작이다.
이에 따라, 대식세포에 의한 NO와 TNF-α과 같은 사이토카인의 적절한 생성은 면역 체계를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고됨에 따라, 대식세포에 의한 사이토카인 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 확인하기 위한 많은 연구들이 수행되어 왔다.
두켜부채(Distromium decumbens)는 바다에 나는 갈조류로 식물체는 암반에 착생한다. 점심대에 생육하며 주로 4월에서 10월에 우점하여 출현한다. 호주 남부 지역 해안에서 채집 보고되었으며 국내에서는 1종이 제주도, 울릉도 그리고 남해안에서 보고되었다. 또한, 우리나라 동·남해안의 조간대 및 조하대에 서식하며, 일본, 호주 남부 지역에 분포하는 것으로 알려져 있다. 몸은 포복하며 처음은 단일의 부채꼴 또는 콩팥 꼴인데 후에 더러 방사형으로 벌어져서 쐐기꼴의 열편으로 되며 이것을 펼치면 부채꼴로 되고 가장자리는 서로 겹쳐진다. 몸의 지름은 2 내지 4cm, 몸의 하부는 오래되면 두꺼워지고 때로는 줄기모양을 형성한다. 빛깔은 엷은 갈색 또는 짙은 갈색이며, 색소체를 지닌 두 세포층으로 구성되어 있다. 이러한 두켜부채의 면역증진 효과에 대해서는 현재까지 보고된 바 없다.
앞서 전술한 바와 같이 대식세포에 의해 발현이 유도되는 NO와 TNF-α과 같은 사이토카인의 적절한 생성이 면역 체계를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 확인됨에 따라, 본 발명은 인체에 안전한 천연물을 이용하여 대식세포의 면역활성을 향상시킬 수 있는 면역증강용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강제를 제공한다.
본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, 두켜부채 추출물은 대식세포의 면역활성을 유도하여 면역체계를 조절하는 NO와 TNF-α의 발현을 증가시키고, 대식세포 내 면역 매개자의 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 두켜부채 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 인체에 안전하고 효과적인 면역증강용 약학조성물 및 건강식품으로 제공될 수 있다.
도 1은 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 두켜부채 추출물이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2는 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 두켜부채 추출물이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 IL-6 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 두켜부채 추출물이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 두켜부채 추출물이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, iNO2 및 COX-2 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 2는 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 두켜부채 추출물이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 IL-6 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 두켜부채 추출물이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 두켜부채 추출물이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, iNO2 및 COX-2 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
대식세포에 의한 NO와 TNF-α과 같은 사이토카인의 적절한 생성은 면역 체계를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고됨에 따라, 본 발명자들은 대식세포에서 TNF-α 및 NO의 생성에 영향을 미치는 천연물을 연구하던 중, 두켜부채 추출물이 대식세포의 NO 및 TNF-α 생성을 향상시키고 면역 매개자 생성을 증가시키는 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강제를 제공할 수 있다.
상기 두켜부채 추출물은 대식세포의 질소(NO) 및 TNF-α의 생성을 활성화시킬 수 있으며, 대식세포의 IL-1β, IL-6, iNOS 및 COX-2 생성을 증가시킬 수 있다.
상기 두켜부채 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있으며, 보다 상세하게는 50 내지 70% 에탄올 수용액으로 추출된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역증강제는 면역증강제 총 100 중량부에 대하여, 두켜부채 추출물을 0.1 내지 99 중량부로 포함할 수 있다.
본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 두켜부채 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 두켜부채 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 두켜부채 추출물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강식품을 제공할 수 있다.
상기 건강식품은 상기 두켜부채 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<
실험예
1>
두켜부채
(
Distromium
decumbens
; DDE) 에탄올 추출물 준비
갈조류인 두켜부채를 제주 울릉군 근처에서 수집한 후 두켜부채 표면에 부착되어 있던 소금, 부착식물 및 모래를 세척하여 제거하고 -20℃에 저장하였다.
추출 전에 냉동된 시료를 감압하에서 동결 건조하고 분쇄기를 이용하여 균질화하였다. 건조된 분말을 70% EtOH (1:10 w/v)에서 1시간 동안 초음파처리하여 추출하였으며, 상기 추출과정을 5번 반복한 후, 진공하에서 추출물을 증발시켰으며, 실험에 사용하기 전에 시료를 DMSO에 용해시켜 사용하였다.
<
실험예
2> 세포배양
American Type Culture Collection (Manassas, VA, U.S.A.)에서 얻은 RAW 264.7 대식세포를 10% 태아소혈청(FBS), 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL 이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
<
실시예
1>
두켜부채
(DDE) 세포 독성 확인
두켜부채의 세포독성을 확인하기 위해, 세포 계수 키트-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 이용하여 세포 생존도를 확인하였다.
먼저, RAW 264.7 대식세포 3×105 cells/ml가 포함된 96-웰에 푸코잔틴(fucoxanthin) 50 내지 200 μg/mL을 처리하고 24시간 인큐베이트하였다.
그 후, 각 웰에 CCK-8을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 추가로 인큐베이트하고 microplate reader (SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 확인하였다.
그 결과, 도 1A와 같이 DDE 200 μg/mL 이하의 농도에서는 세포 생존도에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
2> RAW 264.7 대식세포에서 DDE에 의해 유도된 IL-6 발현 확인
RAW 264.7 세포에서 DDE가 IL-6 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해, DDE 에 의해 유도된 IL-6 발현 수준을 확인하였다.
먼저, RAW 264.7 세포에 DDE 50, 100 또는 200 μg/mL를 24시간 동안 처리한 후 ELISA kit (BioLegend, San Diego, CA, USA)를 이용하여 세포 배양 배지 내 IL-6 수준을 분석하고, microplate (SpectraMax M2e)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 확인하였다.
그 결과, 도 2와 같이 DDE에 24시간 동안 자극받은 RAW 264.7 세포의 배양 배지에서 IL-6가 생산된 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
3>
RAW 264.7 대식세포에서 DDE에 의해 유도된 질소(NO) 방출 효과 확인
RAW 264.7 세포에서 DDE가 NO 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해, 그리스(Griess) 시약을 이용하여 질산염 수준을 확인하였다.
24-웰 플레이트에서 RAW 264.7 세포를 3 × 105 cells/mL로 분주하고 50, 100, 또는 200 μg/mL DDE를 24시간 동안 처리한 후, 각 배양 배지 100 μL와 동량의 그리스(Griess) 시약을 혼합하였다.
그 후, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 플레이트 리더기(SpectraMax M2e)를 이용하여 540nm에서 아질산염 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 3과 같이 DDE가 처리된 세포에서 NO 방출이 유도된 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
4> RAW 264.7 대식세포에서 DDE에 의해 유도된 IL-
1β
, IL-6,
TNF
-α,
iNOS
및 COX-2 발현 수준 확인
DDE가 면역 매개자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, RT-PCR을 수행하였다.
먼저, DDE를 24시간 처리한 RAW 264.7 세포로부터 얻은 전체 RNA (1.0 μg)를 역-전사한 M-MLV 역 전사효소로 cDNA를 제작하였다.
표 1과 같은 선택적인 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 IL-1β, IL-6, TNF-α, iNOS, COX-2 및 GAPDH를 코딩하는 RT-generated cDNAs를 증폭시켰다.
그 결과, 도 4와 같이 DDE가 24시간 처리된 RAW 264.7 세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, iNOS 및 COX-2가 코딩된 mRNA 발현이 유도된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 DDE는 주로 전사 수준에서 면역 매개자의 축적을 유도하는 것이 확인되었다.
| 유전자 | 방향 | 서열 |
| iNOS |
Sense | ATGTCCGAAGCAAACATCAC |
| Antisense | TAATGTCCAGGAAGTAGGTG | |
| COX-2 |
Sense | CAGCAAATCCTTGCTGTTCC |
| Antisense | TGGGCAAAGAATGCAAACATC | |
| IL-1β |
Sense | CTCGTGCTGTCGGACCCATAT |
| Antisense | TTGAAGACAAACCGCTTTTCCA | |
| IL-6 |
Sense | CATGTTCTCTGGGAAATCGTGG |
| Antisense | AACGCACTAGGTTTGCCGAGTA | |
| TNF-α |
Sense | ATGAGCACAGAAAGCATGATC |
| Antisense | TACAGGCTTGTCACTCGAATT | |
| GAPDH |
Sense | TTTGTGATGGGTGTGAACCACGAG |
| Antisense | GGAGACAACCTGGTCCTCAGTGTA |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강제.
- 청구항 1에 있어서, 상기 두켜부채 추출물은 대식세포의 질소(NO) 및 TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α)의 생성을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
- 청구항 1에 있어서, 상기 두켜부채 추출물은 대식세포의 IL-1β (Interleukin 1 beta), IL-6 (Interleukin 6), iNOS (Inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2 (cyclooxygenase-2) 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
- 청구항 1에 있어서, 상기 두켜부채 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
- 청구항 1에 있어서, 상기 면역증강제는 면역증강제 총 100 중량부에 대하여, 두켜부채 추출물을 0.1 내지 99 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강제.
- 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학조성물.
- 두켜부채(Distromium decumbens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강식품.
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2018
- 2018-01-31 KR KR1020180012079A patent/KR102019822B1/ko active IP Right Grant
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