CN111690603B - 一种促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂 - Google Patents

一种促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂，属于干细胞技术领域。本发明通过CCK‑8、荧光定量PCR、Transwell实验，Western Blot实验证明刺山柑多糖可以有效的促进牙髓干细胞的增殖和细胞迁移，为进一步开发牙髓干细胞在牙齿修复方面的应用提供了可能。

Description

一种促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂
技术领域
本发明属于牙髓干细胞技术领域，尤其涉及一种促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂。
背景技术
龋病俗称为虫牙，蛀牙是一种常见的口腔细菌性疾病。当龋齿发展至牙本质时，细菌及其分泌的毒性产物会通过牙本质小管侵入牙髓组织，导致牙本质出现不同程度的损伤。龋齿可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。如果不及时对其进行治疗，会导致牙齿出现龋洞，最终导致牙冠被完全破坏。
牙髓干细胞是一类存在于牙髓组织中的具有自我更新和多向分化的间充质干细胞。在不同的诱导剂作用条件下，牙髓细胞可以分化为不同的细胞类型。在牙髓组织损伤时，牙髓组织中的牙髓干细胞会发生增殖、迁移并黏附于牙齿的损伤部位分化为牙本质细胞，修复牙本质，保护牙髓。故，牙髓干细胞的研究对修复和再生牙齿带来了可行性。因此，寻找能够有效促进促进牙髓干细胞增殖，迁移的物质，对于进一步开发牙髓干细胞在牙齿修复方面的应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了刺山柑多糖在制备牙髓干细胞增殖和迁移促进剂中的用途。
其次，本发明提供了刺山柑多糖在制备促进牙髓干细胞增殖和迁移培养基中的用途。
优选地，所述刺山柑多糖为刺山柑果实多糖。
优选地，所述刺山柑多糖的制备方法包括如下步骤：
(1)将干燥的刺山柑用清水清洗干净，烘干；
(2)将烘干的刺山柑粉碎成粉末，加入5倍体积的95％乙醇浸泡24小时，过滤干燥；
(3)在干燥的刺山柑粉末中加入10倍体积的去离子水，90℃浸提3小时，离心得到粗刺山柑多糖提取液A；
(4)将粗刺山柑多糖提取液A减压浓缩至原体积的1/5；
(5)使用Sevage法去除蛋白，得到粗刺山柑多糖提取液B，重复Sevage法去除蛋白2次，得到粗刺山柑多糖提取液C；
(6)在粗刺山柑多糖提取液C中加入1倍体积的85％乙醇醇沉12小时，得到刺山柑多糖提取液；
(7)刺山柑多糖提取液冷冻干燥，得到刺山柑多糖。
此外，本发明提供了一种促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂，所述生物制剂为刺山柑多糖。
优选地，所述刺山柑多糖的制备方法如下：
(1)将干燥的刺山柑用清水清洗干净，烘干；
(2)将烘干的刺山柑粉碎成粉末，加入5倍体积的95％乙醇浸泡24小时，过滤干燥；
(3)在干燥的刺山柑粉末中加入10倍体积的去离子水，90℃浸提3小时，离心得到粗刺山柑多糖提取液A；
(4)将粗刺山柑多糖提取液A减压浓缩至原体积的1/5；
(5)使用Sevage法去除蛋白，得到粗刺山柑多糖提取液B，重复Sevage法去除蛋白2次，得到粗刺山柑多糖提取液C；
(6)在粗刺山柑多糖提取液C中加入1倍体积的85％乙醇醇沉12小时，得到刺山柑多糖提取液；
(7)刺山柑多糖提取液冷冻干燥，得到刺山柑多糖。
优选地，所述生物制剂用于制备促进牙髓干细胞增殖和迁移的促进剂。
优选地，所述生物制剂用于制备促进牙髓干细胞增殖和迁移的培养基。
除此之外，本发明提供了一种刺山柑多糖的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将干燥的刺山柑用清水清洗干净，烘干；
(2)将烘干的刺山柑粉碎成粉末，加入5倍体积的95％乙醇浸泡24小时，过滤干燥；
(3)在干燥的刺山柑粉末中加入10倍体积的去离子水，90℃浸提3小时，离心得到粗刺山柑多糖提取液A；
(4)将粗刺山柑多糖提取液A减压浓缩至原体积的1/5；
(5)使用Sevage法去除蛋白，得到粗刺山柑多糖提取液B，重复Sevage法去除蛋白2次，得到粗刺山柑多糖提取液C；
(6)在粗刺山柑多糖提取液中加入1倍体积的85％乙醇醇沉12小时，得到刺山柑多糖提取液；
(7)刺山柑多糖提取液冷冻干燥，得到刺山柑多糖。
本发明的有益效果在于：
本发明首次发现刺山柑多糖能够显著的促进牙髓干细胞增殖和迁移，从而可以进一步利用刺山柑多糖开发促进牙髓干细胞增殖和迁移的促进剂或培养基，为牙髓干细胞在牙齿修复方面的应用提供了新的可能。
附图说明
图1刺山柑多糖对于牙髓干细胞增殖相关蛋白cyclin-D1和P21 mRNA表达水平的影响
图2刺山柑多糖对于牙髓干细胞细胞迁移的影响
图3刺山柑多糖对于牙髓干细胞趋化因子SDF-1和FGF-2的影响
具体实施方式
实施例1
(1)将200g干燥的刺山柑用清水清洗干净，烘干；
(2)将烘干的刺山柑粉碎成粉末，加入1L的95％乙醇浸泡24小时，过滤干燥；
(3)在干燥的刺山柑粉末中加入2L的去离子水，90℃浸提3小时，离心得到粗刺山柑多糖提取液A；
(4)将粗刺山柑多糖提取液A减压浓缩至400ml；
(5)使用Sevage法去除蛋白，得到粗刺山柑多糖提取液B，重复Sevage法去除蛋白2次，得到粗刺山柑多糖提取液C；
(6)在粗刺山柑多糖提取液C中加入400ml的85％乙醇醇沉12小时，得到刺山柑多糖提取液；
(7)刺山柑多糖提取液冷冻干燥，得到刺山柑多糖。
实施例2
人牙髓干细胞原代培养
(1)将本院收集的牙面形态完整且无龋的牙齿浸入到加有双抗的无菌PBS中，反复清洗，并将牙根部和颈部所附着的牙周膜等软组织去除；
(2)用牙凿沿着牙齿长轴将牙齿纵行劈开，使用无菌镊子将牙髓组织取出，并且剪除掉尖端的2mm部分，置于无菌EP管中；
(3)使用PBS漂洗3次后加入500μl PBS并用剪刀将牙髓组织剪碎，将EP管放入离心机中，1000rpm/min离心5分钟，保留沉淀，去除上清；
(4)加入I型胶原酶，置于细胞恒温培养箱中，37℃消化45min；
(5)加入适量的含10％FBS的α-MEM培养基终止消化，1000rpm/min离心5min，弃去上清，将组织块均匀铺在25cm2的培养瓶底部，加入含有10％FBS的α-MEM完全培养基，放于细胞恒温培养箱中，每2-3天更换一次培养基；
(6)将1代的人牙髓干细胞使用有效稀释法将细胞浓度调整为10-20个/mL，之后将细胞接种于96孔板中，每孔100μl；
(7)培养至出现细胞克隆后，使用胰酶将细胞消化下来进行传代，即可得到人牙髓干细胞，检测确认后用于后续实验。
实施例3
刺山柑多糖对于牙髓干细胞增殖的影响
(1)将100μl对数生长期的3代牙髓干细胞接种于96孔板中，每孔2000个细胞；
(2)贴壁后，弃去培养基，分别加入0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml的刺山柑多糖，每孔100μl，每组设置3个重复,实验重复3次；
(3)分别于24h，48h和72h时，使用CCK-8检测450nm波长下的吸光度。
表1牙髓干细胞被不同浓度刺山柑多糖后的吸光度
24h 48h 72h
0μg/ml 0.23±0.03 0.31±0.02 0.43±0.03
50μg/ml 0.27±0.03 0.40±0.02 0.51±0.02
100μg/ml 0.30±0.03 0.46±0.04 0.67±0.06
200μg/ml 0.38±0.04 0.64±0.03 0.92±0.03
400μg/ml 0.33±0.03 0.59±0.06 0.82±0.03
实验结果如表1所示，从表中可以看出刺山柑多糖可以有效的促进牙髓干细胞的增殖，其中200μg/ml的刺山柑多糖对牙髓干细胞增殖的促进作用最好，差异具有统计学意义。
实施例4
刺山柑多糖对于牙髓干细胞增殖相关基因Cyclin-D1和P21的影响1.细胞处理
(1)将2×105处于生长期的第三代人牙髓干细胞接种于6孔板中，培养过夜；
(2)弃去培养基，更换为无血清培养基，饥饿培养24h；
(3)弃去培养基加入0μg/ml和200μg/ml的刺山柑多糖，培养48h后提取RNA，进行逆转录和荧光定量PCR。
2.RNA提取
(1)弃去培养基，使用PBS洗涤细胞，加入1ml Trizol，使用移液器轻轻吹打细胞直至细胞完全裂解，将混合液转移至新的无RNA酶EP管中；
(2)加入200μl氯仿，剧烈震荡EP管混匀，冰上放置5min；
(3)4℃，12000g，离心15min，小心将上层水相吸出转移至新的无RNA酶EP管中；
(4)加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，4℃，12000g离心10min，去除上清，保留白色沉淀；
(5)500μl DEPC水配置的75％乙醇，混匀，4℃，7500g，离心5min；
(6)去除乙醇，干燥后，加入50μl DEPC水溶解沉淀。
3.逆转录反应
(1)去除基因组DNA
试剂 用量
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
Total RNA 1μg
RNase Free dH2O up to 10μl
反应条件：42℃2min；4℃
(2)逆转录反应
试剂 用量
步骤(1)反应液 10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl
RT Primer Mix 1μl
RNase Free dH2O 4μl
5×PrimeScript Buffer 2 4μl
反应条件：37℃15min；85℃5s；4℃
4.PCR扩增反应
(1)引物序列
Figure GDA0003094466760000071
Figure GDA0003094466760000081
反应条件：95℃5min；95℃10s，60℃40s，72℃25s,35个循环；数据使用2-△△Ct方法处理。
实验结果如图1所示，从图中可以看出，刺山柑多糖能够促进牙髓干细胞中Cyclin-D1基因的表达(2.19±0.07)，并且能够抑制P21基因的表达(0.42±0.02)，且差异均具有统计学意义,进一步说明刺山柑多糖能够通过调控增殖相关蛋白促进牙髓干细胞的增殖。
实施例5
Transwell检测刺山柑多糖对于牙髓干细胞细胞迁移的影响
(1)将生长状态良好的处于生长期3代的牙髓干细胞消化，用不含血清的α-MEM培养液制备细胞悬液，计数，调整细胞密度；
(2)在Transwell小室的下层分别加入0μg/ml和200μg/ml的刺山柑多糖，每组设置3个重复；
(3)在Transwell小室的上层接种150μl 5×104个细胞，将Transwell小室放入细胞恒温培养箱中，孵育24h；
(4)孵育结束后，用无菌镊子将Transwell小室取出，洗净上层的培养液，用PBS轻轻的清洗2遍，将小室放入4％多聚甲醛固定液中，固定30分钟；
(5)PBS清洗2遍，用棉签轻轻的擦去Transwell小室上层的细胞，之后将小室置于结晶紫染色液中，染色20分钟，蒸馏水清洗；
(6)将小室置于显微镜下，拍照记录。
实验结果如图2所示，可以看出，刺山柑多糖可以显著的促进牙髓间充质干细胞的迁移。
实施例6
刺山柑多糖对于牙髓干细胞趋化因子SDF-1和FGF2的影响
(1)细胞处理方法同实施例4，处理完成后，弃去培养基，使用PBS清洗细胞，加入100μl细胞裂解液；
(2)使用细胞刮刀将细胞刮下，转移至EP管中，冰上放置30min；
(3)4℃，12000g离心15min，吸去上清；
(4)通过BCA法测量蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液，配置蛋白浓度为2μg/μl，沸水煮5min；
(5)配置分离胶和浓缩胶，开始电泳，直至溴酚蓝跑出分离胶时，结束电泳；
(6)恒流200mA电转1.5h，取出置于5％脱脂奶粉中封闭1h；
(7)加入SDF-1、FGF2和GAPDH一抗，4℃孵育过夜；
(8)PBS清洗3遍，加入2抗，室温孵育1h；
(9)配置等体积的显影液A液与B液，混合后，滴加于膜上，进行显影曝光。
实验结果如图3所示，从图中可以看出，刺山柑多糖可以有效的促进细胞趋化因子SDF-1和FGF2的蛋白表达。
序列表
<110> 青岛思拓新源细胞医学有限公司
<120> 一种促进牙髓干细胞增殖和迁移的生物制剂
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ggcggaggag aacaaacaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcctcaggt tcaggccttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgactgtga tgcgctaatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtagag cttgggcagg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaggttact ggttcggtct g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accagaggca tacagggaca g 21

Claims (2)

1.刺山柑多糖在制备牙髓干细胞增殖和迁移促进剂中的用途，其特征在于，所述刺山柑多糖为刺山柑果实多糖；
所述刺山柑多糖的制备方法包括如下步骤：
（1）将干燥的刺山柑用清水清洗干净，烘干；
（2）将烘干的刺山柑粉碎成粉末，加入5倍体积的95%乙醇浸泡24小时，过滤干燥；
（3）在干燥的刺山柑粉末中加入10倍体积的去离子水，90℃浸提3小时，离心得到粗刺山柑多糖提取液A；
（4）将粗刺山柑多糖提取液A减压浓缩至原体积的1/5；
（5）使用Sevage法去除蛋白，得到粗刺山柑多糖提取液B，重复Sevage法去除蛋白2次，得到粗刺山柑多糖提取液C；
（6）在粗刺山柑多糖提取液C中加入1倍体积的85%乙醇醇沉12小时，得到刺山柑多糖提取液；
（7）刺山柑多糖提取液冷冻干燥，得到刺山柑多糖。
2.刺山柑多糖在制备促进牙髓干细胞增殖和迁移培养基中的用途，其特征在于，所述刺山柑多糖为刺山柑果实多糖；
所述刺山柑多糖的制备方法包括如下步骤：
（1）将干燥的刺山柑用清水清洗干净，烘干；
（2）将烘干的刺山柑粉碎成粉末，加入5倍体积的95%乙醇浸泡24小时，过滤干燥；
（3）在干燥的刺山柑粉末中加入10倍体积的去离子水，90℃浸提3小时，离心得到粗刺山柑多糖提取液A；
（4）将粗刺山柑多糖提取液A减压浓缩至原体积的1/5；
（5）使用Sevage法去除蛋白，得到粗刺山柑多糖提取液B，重复Sevage法去除蛋白2次，得到粗刺山柑多糖提取液C；
（6）在粗刺山柑多糖提取液C中加入1倍体积的85%乙醇醇沉12小时，得到刺山柑多糖提取液；
（7）刺山柑多糖提取液冷冻干燥，得到刺山柑多糖。
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刺山柑多糖提取及其抗炎镇痛作用研究;张瑜等;《石河子大学学报(自然科学版)》;20110415;第29卷(第2期);第205-209页 *

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