CN117736975A - 一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法 - Google Patents
一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117736975A CN117736975A CN202311759901.4A CN202311759901A CN117736975A CN 117736975 A CN117736975 A CN 117736975A CN 202311759901 A CN202311759901 A CN 202311759901A CN 117736975 A CN117736975 A CN 117736975A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cells
- culture
- solution
- endometrial stem
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 67
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 72
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 40
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 27
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 24
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 22
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 12
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 11
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 11
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 6
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 6
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 6
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 claims description 6
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 5
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 208000033830 Hot Flashes Diseases 0.000 description 1
- 206010060800 Hot flush Diseases 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101100338009 Mus musculus Gsta1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 206010046798 Uterine leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002782 epithelial mesenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000001703 glandular epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009804 total hysterectomy Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括步骤：对获得的子宫内膜组织材料进行预处理；然后加入含有多肽的消化液，消化获得单细胞悬液；并对其进行原代培养和传代培养；即获得所述子宫内膜干细胞。本发明提供方法操作简单，获得的子宫内膜干细胞存活率高、传代效率高而且在培养过程中具有较高的增殖能力，干细胞表面标志物表达良好，能够对子宫内膜干细胞进行规模化的制备，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用的开展奠定良好基础。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法。
背景技术
干细胞(Stemcell，SC)是一种未分化细胞，这些细胞保持着高度增殖、自我更新和分化潜能的特性。干细胞可以定向分化为血液、骨骼、大脑及皮肤等其他组织。可能作为修复系统修复受损细胞。干细胞又可分为胚胎干细胞，脐血干细胞，成体干细胞及生殖干细胞等类型。干细胞在成体组织中调控成体细胞增殖、分化、凋亡及保持细胞数目的平衡中起到十分重要的作用。
细胞疗法的兴起激发了对各种干细胞的研究热潮，骨髓、脐带、脐带血、脂肪、经血等多种成体组织中的成体干细胞(Adult Stem Cells，ASCs)，不仅克服了胚胎干细胞取材难、分化不确定及伦理问题等限制，同时能保持高效增殖能力和多向分化潜能，为细胞治疗提供了良好的种子细胞。人子宫内膜由腺上皮细胞、间质细胞和血管组成，近年越来越多的研究表明，子宫内膜组织中存在一小群具有强大增殖和多向分化潜能的干细胞，可不断分裂增殖，及时补充脱落的终末分化细胞，使子宫内膜始终保持自我更新和再生能力。
子宫内膜干细胞的来源丰富，同时也具有较强的增殖活性。作为ASCs家族的重要成员，子宫内膜干细胞除表达CD29(>99％)、CD44(>99％)、CD73(>99％)、CD90(>95％)及CD105(>99％)等ASCs表面标志物，具有较高分化潜能。此外，相较于骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脐带血来源的ASCs等，子宫内膜干细胞不仅具有更佳的增殖活性，同时亦具有较强的遗传稳定性。在临床应用子宫内膜干细胞的安全性获得保障的前提下，其已在成骨、心肌、肝脏、子宫内膜及中风等疾病的治疗过程中展示了令人满意的效果。
由于子宫内膜组织中干细胞存量较少，因此，本领域技术人员致力于开发高效地子宫内膜干细胞提取方法，提供一种能提供更高纯度、更好增殖活性的子宫内膜干细胞的制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法。
为实现以上目的，本申请提供以下技术方案：
本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括以下步骤：
(1)无菌条件下取出子宫内膜组织并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液进行浸泡，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
(2)清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
(3)取步骤(2)离心后的组织破碎，并加入质量/体积比为0.1％的消化液50mL，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
(4)利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000r/min离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
(5)利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，并将接种瓶移植到CO2孵箱内培养；
(6)每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％(V/V)胚牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；
(7)将步骤(6)的消化液5000r/min离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入20-40重量份的生长刺激液，P2代以后按1:10的比例传代，继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
进一步的，步骤(1)所述的样本浸泡液为含有20～200U/mL青霉素、0.2～2.0mg/mL链霉素和0.1～1.0mg/mL EDTA-Na2的PBS缓冲液。
进一步地，步骤(2)所述的消化温度为37℃，1-5h。
进一步地，步骤(3)所述消化液为I型胶原酶和多肽溶液。
进一步地，所述Ⅰ型胶原酶为质量百分含量为0.2％。
进一步地，所述Ⅰ型胶原酶和多肽溶液的体积比为5-20:1。
进一步地，多肽的氨基酸序列为MSGKPST或GSTYAA或SDAAPFN(由上海生工生物工程股份有限公司合成)。
进一步地，在步骤(1)中，样本与样本浸泡液的用量体积比为1:1-5。
进一步地，在步骤(5)中，所述细胞培养的接种密度为5～10×104cells/cm2；所述的细胞培养是在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养。
进一步地，在步骤(7)中所述生长刺激液由以下重量份的组分组成：5-10份的甘露醇、1-2份的PDGF、2-5份的维生素C、2-5份的HEPES和5-10份的氯化钠。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种含有多肽的消化液，分离提取方法操作简单，获得的子宫内膜干细胞存活率高、传代效率高而且在培养过程中具有较高的增殖能力，干细胞表面标志物表达良好，能够对子宫内膜干细胞进行规模化的制备，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用的开展奠定良好基础。
具体实施方式
基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者(手术前半年未服用激素类药物)，组织学诊断未发现子宫内膜有病理性改变。与患者签署知情同意书，并本着对患者尊重、保密及公正的原则进行取材，并保证患者的隐私不受伤害。
实施例1子宫内膜干细胞的获得
(1)在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，剪至1mm3大小并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液(20U/mL青霉素、2.0mg/mL链霉素和0.1mg/mL EDTA-Na2的PBS缓冲液)进行浸泡，其中，样本与样本浸泡液的体积比为1:1，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
(2)清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液，在37℃消化1h，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
(3)取步骤(2)离心后的组织破碎，并加入质量/体积比为0.1％的消化液50mL(质量百分含量为0.2％的Ⅰ型胶原酶和多肽MSGKPST的体积比为5:1)，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
(4)利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000r/min离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
(5)利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，接种密度为5×104cells/cm2，并将接种瓶移植到在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养；
(6)每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％(V/V)胚牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；
(7)将步骤(6)的消化液5000r/min离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入20重量份的生长刺激液(8份的甘露醇、1份的PDGF、4份的维生素C、4份的HEPES和5份的氯化钠)，P2代以后按1:10的比例传代，继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
实施例2子宫内膜干细胞的获得
(1)在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，剪至1mm3大小并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液(100U/mL青霉素、1mg/mL链霉素和0.5mg/mL EDTA-Na2的PBS缓冲液)进行浸泡，其中，样本与样本浸泡液的体积比为1:3，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
(2)清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液，在37℃消化3h，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
(3)取步骤(2)离心后的组织破碎，并加入质量/体积比为0.1％的消化液50mL(质量百分含量为0.2％的Ⅰ型胶原酶和多肽GSTYAA的体积比为10:1)，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
(4)利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000r/min离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
(5)利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，接种密度为10×104cells/cm2，并将接种瓶移植到在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养；
(6)每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％(V/V)胚牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；
(7)将步骤(6)的消化液5000r/min离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入30重量份的生长刺激液(8份的甘露醇、1份的PDGF、4份的维生素C、4份的HEPES和5份的氯化钠)，P2代以后按1:10的比例传代，继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
实施例3子宫内膜干细胞的获得
(1)在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，剪至1mm3大小并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液(200U/mL青霉素、2.0mg/mL链霉素和1.0mg/mL EDTA-Na2的PBS缓冲液)进行浸泡，其中，样本与样本浸泡液的体积比为1:1-5，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
(2)清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液，在37℃消化5h，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
(3)取步骤(2)离心后的组织破碎，并加入质量/体积比为0.1％的消化液50mL(质量百分含量为0.2％的Ⅰ型胶原酶和多肽SDAAPFN的体积比为20:1)，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
(4)利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000r/min离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
(5)利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，接种密度为8×104cells/cm2，并将接种瓶移植到在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养；
(6)每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％(V/V)胚牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；
(7)将步骤(6)的消化液5000r/min离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入40重量份的生长刺激液(8份的甘露醇、1份的PDGF、4份的维生素C、4份的HEPES和5份的氯化钠)，P2代以后按1:10的比例传代，继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
对比例1子宫内膜干细胞的获得
(1)在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，剪至1mm3大小并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液(100U/mL青霉素、1.0mg/mL链霉素和0.5mg/mL EDTA-Na2的PBS缓冲液)进行浸泡，其中，样本与样本浸泡液的体积比为1:1-5，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
(2)清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液，在37℃消化3h，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
(3)取步骤(2)离心后的组织破碎，并加入质量/体积比为0.1％的消化液50mL(质量百分含量为0.2％的Ⅰ型胶原酶)，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
(4)利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000r/min离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
(5)利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，接种密度为5～10×104cells/cm2，并将接种瓶移植到在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养；
(6)每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％(V/V)胚牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；
(7)将步骤(6)的消化液5000r/min离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入30重量份的生长刺激液(8份的甘露醇、1份的PDGF、4份的维生素C、4份的HEPES和5份的氯化钠)，P2代以后按1:10的比例传代，继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
试验例1原代培养干细胞的数量
将实施例1-3及对比例1的P1代按照上述记载方法传代到P5代，显微观察并计数，结果见表1。
表1各实验组分离的干细胞活细胞数
I型胶原酶对子宫内膜组织有一定的消化能力，其在经过传代培养后也能获得一定数量的活细胞。然而，实施例1-3的多肽与I型胶原酶联合使用显示出明显的刺激细胞增殖的效果，相较于对比例1未添加多肽的消化液，检测到更多数量的活细胞数。
试验例2细胞表面免疫表型遗传试验
分别取实施例1-3、对比例1提供的子宫内膜干细胞培养方法培养得到的干细胞，调整细胞密度至1×106cells/ml，取细胞混悬液各100μl，分别加入单克隆流式抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC、HLA-ABC-FITC混匀后于4℃避光孵育30min，然后用PBS缓冲液洗涤2次，再加入培养基重悬，然后分别用流式细胞仪检测表面标志物的表达情况，结果见表2。
表2子宫内膜干细胞表面标志物检测结果
测定结果表明，采用本发明的分离提取方法所获得的细胞表面标志物的表达，均符合国内外对成体干细胞表面标志物表达的要求，且优于对比例1的表达量。经流式细胞术鉴定，扩增传代的各代细胞均具有预期的干细胞特性，说明各传代细胞仍然保持了干细胞特性。
试验例3子宫内膜干细胞增殖活性试验
分别以实施例1-3和对比例1的方法进行子宫内膜干细胞的分离培养，得到P1原代子宫内膜干细胞，分别将各组原代子宫内膜干细胞以1×106个接种，加入完全培养基培养，再以每孔5000个细胞接种于96孔板中，每孔接种200μL的14L-DMEM，于96孔板最外一圈孔加入200μLPBS，贴壁生长后，对照组继续用完全培养基培养，24h后进行检测，每孔分别加入5g/L的MTT溶液20μL，并于培养箱内37℃条件下避光培养4h后，去除上清，每孔加入二甲基亚砜溶液150μL，用微孔板检测仪测定各孔在570nm波长处的吸光度值，计算各组10孔吸光度值的平均值及其增殖活性，结果见表3。
表3子宫内膜干细胞的增殖活性检测结果
由表3可知，实施例1-3的方法分离培养得到的子宫内膜干细胞具有较高的增殖活性，显著高于对比例1，说明本发明提供的分离培养过程中，消化液中的多肽能够加强消化组织并且刺激子宫内膜干细胞的生长增殖，当消化液不含有多肽时，会导致子宫内膜干细胞增殖活性的降低。
基于上述描述，本领域技术人员将理解，在不改变其技术精神和必要特征的情况下，可以以不同的具体形式实施本公开。因此，应该理解上述实施方式在所有方面不是限制性的，而是说明性的。本公开的范围由所附权利要求限制，而不是由它们前面的说明限制，且因此所有改变和修改落入权利要求的边界和范围内，或这种边界和范围的等同物因此意在被权利要求涵盖。
Claims (10)
1.一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，剪至1mm3大小并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液进行浸泡，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；
(2)清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；
(3)取步骤(2)离心后的组织破碎，并按质量体积比加入0.1％的消化液50mL，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；
(4)利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000r/min离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF/12培养基内进行培养；
(5)利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，并将接种瓶移植到CO2孵箱内培养；
(6)每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％(V/V)胚牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；
(7)将步骤(6)的消化液5000r/min离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入20-40重量份的生长刺激液，P2代以后按1:10的比例传代，继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。
2.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：步骤(1)所述的样本浸泡液为含有20～200U/mL青霉素、0.2～2.0mg/mL链霉素和0.1～1.0mg/mLEDTA-Na2的PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：步骤(2)所述的消化温度为37℃，1-5h。
4.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：步骤(3)所述消化液为I型胶原酶和多肽溶液。
5.根据权利要求4所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：所述Ⅰ型胶原酶为质量百分含量为0.2％。
6.根据权利要求4所述子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：所述Ⅰ型胶原酶和多肽溶液的体积比为5-20:1。
7.根据权利要求6所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为MSGKPST或GSTYAA或SDAAPFN。
8.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：在步骤(1)中，样本与样本浸泡液的用量体积比为1:1-5。
9.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述细胞培养的接种密度为5～10×104cells/cm2；所述的细胞培养是在37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养。
10.根据权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，其特征在于：在步骤(7)中所述生长刺激液由以下重量份的组分组成：5-10份的甘露醇、1-2份的PDGF、2-5份的维生素C、2-5份的HEPES和5-10份的氯化钠。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311759901.4A CN117736975A (zh) | 2023-12-19 | 2023-12-19 | 一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311759901.4A CN117736975A (zh) | 2023-12-19 | 2023-12-19 | 一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117736975A true CN117736975A (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=90277072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311759901.4A Pending CN117736975A (zh) | 2023-12-19 | 2023-12-19 | 一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117736975A (zh) |
-
2023
- 2023-12-19 CN CN202311759901.4A patent/CN117736975A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754674B (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
| CN103352026B (zh) | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 | |
| CN107475190B (zh) | 一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途 | |
| CN105238751B (zh) | 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN107164319B (zh) | 一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法 | |
| WO2016049986A1 (zh) | 一种脐带间充质干细胞的分离方法 | |
| CN109234229B (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| CN110669729B (zh) | 一种制备间充质干细胞外泌体的方法 | |
| CN106801032B (zh) | 人羊膜上皮干细胞库的构建方法 | |
| CN107653225A (zh) | 一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法 | |
| US20190264179A1 (en) | Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof | |
| CN109943533B (zh) | 一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用 | |
| CN103223194A (zh) | 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法 | |
| CN101705209B (zh) | 一种从棕色脂肪分离心脏干细胞及其成心肌细胞分化的方法 | |
| CN108486039B (zh) | 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法 | |
| CN111961640B (zh) | 一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系 | |
| CN108034634B (zh) | 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN111849878A (zh) | 一种提高间充质干细胞成骨能力的方法 | |
| CN111849887A (zh) | 一种自体脂肪三维凝胶及其svf干细胞的制备方法及应用 | |
| CN104818243A (zh) | 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法 | |
| CN117736975A (zh) | 一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法 | |
| CN113633754B (zh) | 卵巢干细胞在制备卵巢抗衰的药物中的用途 | |
| CN115820540A (zh) | 一种间充质干细胞内皮分化诱导剂 | |
| CN114874979A (zh) | 一种驴骨骼肌卫星细胞的分离提纯方法 | |
| CN113322231A (zh) | 一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |