KR102161946B1

KR102161946B1 - 측분비인자 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102161946B1
Application number: KR1020200011827A
Authority: KR
Inventors: 김상재; 김필호
Original assignee: 주식회사 한국줄기세포뱅크; 김상재; 김필호
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2020-10-06

Abstract

본 발명은 측분비인자의 제조방법 및 이에 따라 제조된 측분비인자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 측분비인자는 세포 배양을 위한 조성물의 유효성분으로서 사용가능하다.

Description

측분비인자 및 이의 제조방법{Paracrine factor and preparation thereof}

본 발명은 측분비인자의 제조방법 및 이에 따라 제조된 측분비인자에 관한 것이다.

측분비 신호전달(paracrine signaling)은 세포 신호전달(cell signaling) 또는 세포간통신(cell-to-cell communication)의 한 형태로, 어떤 세포가 신호를 생성하여 근처 세포의 변화를 유도하는 것을 말한다. 이 때 특정 세포가 분비하는 신호물질을 측분비인자(paracrine factor)라고 한다. 순환계를 통해 상당히 먼 거리를 이동하는 내분비인자, 즉 호르몬에 의한 세포 신호전달과는 달리, 측분비인자는 비교적 짧은 거리에 걸쳐 확산된다.

측분비인자의 대표적인 예로는 세포증식인자(cell growth factor), 사이토카인, 케모카인 등과 같은 것을 포함한다. 더 나아가, 최근 세포밖소포체(extracellular vesicles)를 측분비인자의 하나로 이해하고, 세포로부터 세포밖소포체를 분리하여 측분비 신호전달에 사용하고자 하는 시도들이 이루어지고 있다.

특히, 암세포를 대상으로 한 연구들에서 정상세포로의 전이, 혈관형성 등에 세포밖소포체가 매개체 역할을 하는 것이 밝혀짐으로써 암을 포함한 다양한 질병의 스크리닝을 위한 생물학적 표지자로서 진단 등 바이오 전분야에 이용하고자 하는 노력들이 시도되고 있다.

이러한 노력들의 근본적인 문제는, 체액 또는 세포 배양액으로부터 세포밖소포체,즉 측분비인자를 분리해 내는 단계에서부터 발생하는데, 상대적으로 제한된 양과 높은 복잡성을 나타내는 시료에서 측분비인자를 통상의 방법으로 정제하는 것이 거의 불가능하기 때문이다.

또한, 측분비인자는 나노 미터 수준으로 그 크기가 작으며, 체액 및 세포 배양액 등에는 이외에도 다양한 물질들이 존재하기 때문에, 체액 및 세포 배양액 등의 시료로부터 측분비인자를 분리하는 것이 중요하며, 이를 활용하는 모든 분야에서 가장 핵심적인 기술이다.

측분비인자는 측분비인자를 분비한 원래 세포(모세포)의 단백질, 지질, 아미노산, RNA 등을 그대로 포함하고 있으며, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA 등의 세포 내 물질을 전달하는 운송체 역할을 하기 때문에, 모세포의 생리적·병리적 특성을 알 수 있는 중요한 근거가 된다.

또한 측분비인자에 포함되어 있는 핵산, 성장호르몬, 단백질 등은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 현재 사용되고 있는 가용성 형태의 성장인자 및 사이토카인보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다는 점이 알려지면서, 측분비인자의 중요성이 점차 증대되고 있으며, 측분비인자에 포함된 물질을 분석하여 질병의 진단, 치료를 포함한 다양한 용도로의 활용 가능성이 기대되고 있다.

따라서, 점차 증가하고 있는 측분비인자의 활용분야에 있어, 통상의 측분비인자 분리법과는 차별되는 효율적인 새로운 분리법이 시급히 요구되는 실정이다.

기존의 측분비인자 분리 기술로는 초고속원심분리(ultra-centrifugation), 크기별 제외법(size exclusion), 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation), 미세유체칩(microfluidics chip), 또는 폴리머(Polymer)를 이용한 침전법 등이 있으며, 이중 초원심분리법이 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 초원심분리법은 측분비인자 분리에 다양한 조건의 원심력을 이용하기 때문에 노동력과 시간이 많이 소요되며, 고가의 장비를 필요로 할 뿐만 아니라 수율이 낮은 한계가 있어, 소량의 시료만 이용하여 신속하게 결과를 얻어야 하는 진단, 치료제 등 측분비인자의 활용을 위한 정제 방법으로 적용하는 데는 매우 제한적이다.

또한, 현재까지 가장 효율적인 방법으로 사용되는 키트를 사용한 방법은 선택적 결합을 이용하여 복잡성을 가지는 환경으로부터 측분비인자만을 보존하고 오염체를 순차적으로 제거하는 방법이나, 측분비인자의 경우, 이러한 선택적 결합 성질을 가지는 물질이 일부에 국한되어 있고, 비효율적일뿐만 아니라, 고효율의 선택적 결합력을 갖는 항체 및 리간드 등의 개발이 어렵고, 고비용이 소요되어 범용적 사용이 매우 제한적이다.

따라서, 측분비인자의 구조와 기능을 온전히 유지하고, 선택적이면서 높은 수율로 분리, 정제하는 기술이 시급히 요구되는 실정이다.

본 발명은 생체에서 일어나는 측분비 기능을 모사하여 수행할 수 있는 측분비인자의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법을 통해 제조된 측분비인자를 유효성분으로 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 구체예는

혈액으로부터 분리한 단핵세포를 포함하는 세포 집단을 별도의 배양 과정 없이,

상기 세포 집단을 세포 용해하는 단계, 및

상기 세포 용해 공정을 수행하여 얻은 세포 용해물로부터 세포 찌꺼기(debris)를 제거하고, 여과하여 측분비인자(paracrine factor)를 얻는 단계를 포함하는,

측분비인자의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는,

상기 혈액으로부터 분리한 단핵세포를 포함하는 세포 집단으로부터 얻은 측분비인자에,

혈소판 풍부 혈장, 조혈모세포, 줄기세포 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 세포집단을 별도의 배양 과정 없이, 상기 세포 집단을 세포용해하는 단계, 및 상기 세포용해 공정을 수행하여 얻은 세포용해물로부터 세포 찌꺼기(debris)를 제거하고, 여과하여 얻은 측분비인자(paracrine factor)를 혼합하는 것을 포함하는 측분비인자의 제조방법을 제공한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서 "측분비인자(paracrine factor)"는 세포밖소포체(extracellular vesicle) 라고도 불리며, 일반적으로 세포에서 분비되거나 세포의 표면에 존재하는 분자의 집합이다. 측분비인자는 사이토카인, 케모카인 및 성장인자와 같은 생물활성 펩티드(bioactive peptide)를 포함할 수 있으며, 배양액에 포함되어 autocrine, paracrine 등의 기능을 통해 세포에 영향을 줄 수 있다. 본 발명에 따른 측분비인자는 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicles), 세포자멸체(apototic bodies), 세포괴사체(necroptotic bodies)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포밖소포체(extracellular vesicles)를 포함한다.

본 발명에 있어서, 측분비인자의 제조에 사용되는 원천(source)은 혈액으로부터 분리한 단핵세포를 포함하는 세포집단이다.

단핵세포를 포함하는 세포 집단을 얻는데 바람직한 것은 개체, 예컨대, 인간의 혈액이다.

본 발명의 한 구체예에서, 혈액은 말초혈액 또는 제대혈일 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 측분비인자의 제조에 대한 개략도를 보여준다.

도 1에서 세포 집단을 얻기 위한 원천(source)으로 말초혈액을 예시적으로 사용하였으며, 원심분리에 의해 말초혈액을 적혈구층, PBMC층, 혈장층 등으로 분리하여 이 중 단핵세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 과정을 보여주고 있다.

단핵세포를 포함하는 세포 집단을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 단순 원심분리법을 통해 혈액을 여러 층으로 구분하거나, Lymphoprep™ 혹은 Ficoll-Paque™과 같은 시약을 이용한 밀도구배 원심분리법을 통해 혈액을 여러 층으로 구분한 후, 원하는 층만을 취하여 그 안에 포함되어 있는 세포들을 얻을 수 있다.

도 1에서도 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명은 상기 세포 집단을 특별한 자극제를 처리하는 과정이나 별도의 배양 과정 없이 측분비인자의 제조에 곧바로 사용하는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 종래 기술에서 세포밖소포체, 즉 측분비인자를 분리하고자 할 때, 세포를 배양하여 배양액 중에 분비된 측분비인자를 초고속원심분리(ultra-centrifugation), 크기별 제외법(size exclusion), 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation), 미세유체칩(microfluidics chip), 또는 폴리머(Polymer)를 이용한 침전법 등이 있으며, 이중 초원심분리법이 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 초원심분리법은 측분비인자 분리에 다양한 조건의 원심력을 이용하기 때문에 노동력과 시간이 많이 소요되며, 고가의 장비를 필요로 할 뿐만 아니라 수율이 낮은 한계가 있어, 소량의 시료만 이용하여 신속하게 결과를 얻어야 하는 진단, 치료제 등 측분비인자의 활용을 위한 정제 방법으로 적용하는 데는 매우 제한적이다.

그러나, 본 발명은 종래의 기술과는 대조적으로 별도 배양 공정 없이 측분비인자를 제조할 수 있으며, 비용이나 공정의 단순화를 도모할 수 있을 뿐만 아니라, 성장인자 등의 시약 등을 사용하지 않기 때문에 최종적으로 얻어진 측분비인자에 포함되는 성분에 면역원성 등에 영향을 미치는 어떠한 위험요소도 존재하지 않게 된다.

일 구체예에서, 측분비인자의 제조방법은 단핵세포를 포함하는 세포 집단을 원심분리; 반복적인 냉해동; 삼투압 충격; 단백질 분해효소 처리; 엑스선, 전자선 또는 감마선의 방사선 조사; 자외선 조사; 초음파 조사;로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 공정을 사용하여 상기 세포 집단을 세포용해하는 단계(이하, "세포용해 공정"이라 함)를 포함한다.

이에 제한되는 것은 아니나, 반복적인 냉해동; 삼투압 충격; 단백질 분해효소 처리는 세포막을 손상시키거나 세포막을 파쇄할 수 있다. 이러한 공정을 수행하기 위한 구체적인 수단은 당업계에 잘 알려져 있다. 반복적인 냉해동은 세포 집단을 예컨대 액체질소에서 5 내지 20분 냉동 후 실온에서 해동하는 과정을 반복하는 것으로 수행될 수 있다. 삼투압 충격은 D형 포도당이나 만니톨(mannitol) 등의 첨가제를 다양한 삼투 농도(250-930 mOsm/kg H₂O)가 되도록 첨가하여 세포에 삼투충격(osmotic shock)을 유도하는 것으로 수행될 수 있다. 또한, 단백질 분해효소 처리는 당업계에서 일반적으로 사용되는 단백질 분해효소를 사용할 수 있다.

또한, 엑스선, 전자선 또는 감마선의 방사선 조사; 자외선 조사; 초음파 조사는 세포에 스트레스를 유도하고 항상성을 변화시키며, 세포막을 연화시킬 수 있다. 상기 공정을 통해 엑소좀, 미세소포체, 세포자멸체, 세포괴사체 및 세포밖소포체를 포함하는 측분비인자를 제조할 수 있다. 아울러, 방사선 조사를 통해 바이러스, 세균 등의 병원체를 불활성화할 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 고준위 또는 저준위 엑스선, 전자선, 감마선으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 방사선 조사는 세포 집단에 1 Gy 내지 100 kGy의 선량을 조사하여 수행할 수 있고, 자외선 조사는 320 내지 400 nm의 UVA 또는 270 내지 320 nm의 UVB를 조사하여 수행할 수 있다. 또한, 초음파 조사는 16 kHz 이상의 초음파를 조사하여 수행할 수 있다.

본 발명에서는 반복적인 냉해동; 삼투압 충격; 및 단백질 분해효소 처리; 중 하나 이상을 수행하여 측분비인자를 제조할 수 있으며, 또는 방사선 조사; 자외선 조사; 및 초음파 조사 중 하나 이상을 수행하여 측분비인자를 제조할 수 있다. 또한, 냉해동; 투압 충격; 및 단백질 분해효소 처리; 중 하나 이상 및 방사선 조사; 자외선 조사; 및 초음파 조사 중 하나 이상을 함께 사용하여 측분비인자를 제조할 수 있다. 이때 공정 순서는 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 측분비인자의 제조방법은, 전술한 세포용해 공정을 수행하여 얻은 세포용해물로부터 세포 찌꺼기(debris)를 제거하고, 여과하여 측분비인자를 얻는 단계를 포함한다.

전술한 세포용해 공정 후 얻어진 세포용해물은 측분비인자 외에도 세포막 등의 세포 찌꺼기, 즉, 불순물을 포함한다. 따라서, 측분비인자 외의 세포 찌꺼기와 원치 않는 성분들을 분리하는 과정을 거치게 된다.

예를 들어, 세포용해 공정 후 얻어진 세포용해물에 포함된 세포 찌꺼기(debris)는 예를 들어, 원심분리를 통해 제거할 수 있다.

본 발명에서 사용한 세포집단은 혈액에서 유래한 세포와 혈장 또는 혈청 등을 포함하는 것이므로 상기 세포용해물은 피브리노겐(fibrinogen) 등의 혈액응고인자를 포함할 수 있다. 이러한 혈액응고인자는 측분비인자로서 작용하지는 않으므로 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 혈액응고인자의 제거를 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포용해 공정을 거치기 전의 세포집단 또는 세포용해 공정을 거쳐 얻은 세포용해물에 칼슘 이온 등의 이온을 첨가하여 혈액응고인자를 응집시키고, 응집된 혈액응고인자를 원심분리 등에 의해 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 측분비인자 제조방법은 세포 찌꺼기나 혈액응고인자의 제거 외에도, 세포용해물을 여과하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 세포용해물을 여과하는 단계를 5㎛ 이하의 기공 크기를 갖는 여과막을 사용하여 수행될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 5㎛ 이하의 기공 크기를 갖는 셀룰로오스 막을 사용하여 본 발명에 따른 측분비인자를 수득할 수 있다.

상기 방법에 따라 얻어진 측분비인자는 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicles), 세포자멸체(apototic bodies), 세포괴사체(necroptotic bodies) 및 세포밖소포체(extracellular vesicles)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포밖소포체를 포함한다.

본 발명에서 “세포밖소포체(extracellular vesicle)”는 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 세포 바깥에 존재하는 다양한 크기의 소포체를 의미한다.

본 발명에서 "엑소좀(exosome)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 소포체를 의미한다. 상기 엑소좀의 직경은 150 nm 이하일 수 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포밖으로 방출, 분비된다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소포들은 세포 밖 환경으로 방출되는데 이를 엑소좀이라 한다.

본 발명에서 “미세소포체(microvesicle)”은 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소포를 의미한다. 상기 미세소포체의 직경은 150 내지 1,000 nm 일 수 있다.

본 발명에서 “세포자멸체(apoptotic bodies)”와 “세포괴사체(necroptotic bodies)”는 세포사멸 단계에서 유래되는 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 의미한다. 세포자멸체와 세포괴사체 이중인지질막 내에는 이중인지질막에 포함되어 있는 것은 DNA류, RNA류, 단백질류 등 세포 내 구성 성분들이 전부 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 상기 세포자멸체 및 세포괴사체의 직경은 1,000 nm 내지 5000 nm일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 측분비인자의 제조방법에서 상기 세포 집단은 혈소판 풍부 혈장, 조혈모세포, 줄기세포 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

혈소판 풍부 혈장은 측분비인자의 추가적 공급원이 될 수 있으며, 이를 추가하게 되면 측분비인자의 수득량을 증가시킬 수 있으며, 이로부터 얻어진 측분비인자의 생리활성 또한 우수하다.

조혈모세포(Hematopoietic stem cell)와 줄기세포(stem cells)는 본 발명에 따른 측분비인자의 제조에 필수적인 세포는 아니지만, 이들을 추가하게 되면 이후 설명하는 측분비인자를 이용한 세포배양 방법에서 보다 유리한 효과를 이끌어낼 수 있다.

상기 조혈모세포나 줄기세포의 기원은 특별히 제한되지 않으나, 이미 채취된 말초혈액 내에 포함되어 있는 조혈모세포를 이용하거나, 소변이나 타액과 같은 비침습적인 방법으로 얻을 수 있는 줄기세포를 이용하는 것이 바람직할 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 줄기세포는 성체줄기세포일 수 있고, 예컨대, 소변 유래의 줄기세포일 수 있다.

또한, 면역세포 또한 측분비인자의 제조에 있어서 추가로 세포 집단에 포함될 수 있으며, 이는 측분비인자를 포함하는 배양용 조성물로 배양되는 타겟세포에 측분비인자 유래 개체의 면역계를 접하게 함으로써 타겟세포를 측분비인자 유래 개체의 생체 환경을 모사하게 하는 역할을 하게 할 때 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는,

즉, 측분비인자의 공급원을 혈액으로부터 분리한 단핵세포를 포함하는 세포 집단으로 하거나, 여기에 혈소판 풍부 혈장, 조혈모세포, 줄기세포 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 세포집단을 추가하여 측분비인자를 제조할 수도 있고, 다르게는, 혈액으로부터 분리한 단핵세포를 포함하는 세포 집단으로부터 측분비인자를 제조하고, 이와는 별도의 공정으로 혈소판 풍부 혈장, 조혈모세포, 줄기세포 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 세포집단으로부터 측분비인자를 제조하여, 2종 이상의 세포집단으로부터 제조된 측분비인자를 혼합하여 본 발명에 따른 측분비인자를 제조할 수도 있다. 이 중 어떠한 방법을 취하더라도 본 발명에 따른 효과를 지니는 측분비인자를 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의해 얻어진 측분비인자를 제공한다.

본 발명에 따른 측분비인자는 앞서 설명한 바와 같이, 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicles), 세포자멸체(apototic bodies) 및 세포괴사체(necroptotic bodies) 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 세포밖소포체(extracellular vesicles)를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 측분비인자는 그 크기가 5000 nm 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 측분비인자는 하기 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이 생체에서 일어나는 측분비 기능을 모사하여 수행할 수 있다.

뿐만 아니라, 하기 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 측분비인자는 이종 유래의 혈청이나 상용화 배지를 대체하여 세포 배양을 위한 유효성분으로 사용될 수 있다.

이는 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicles), 세포자멸체(apototic bodies), 세포괴사체(necroptotic bodies) 등의 세포밖소포체(extracellular vesicles)에 포함되어 있는 각종 성분들이 세포의 성장과 분화 등을 위한 것들이기 때문이라고 생각된다.

따라서, 본 발명은 또한 상기 측분비인자를 유효성분으로 포함하며, 이종 유래 혈청을 포함하지 않는 세포 배양용 조성물을 제공한다.

이 때 세포 배양용 조성물에 포함되는 측분비인자의 함량은 세포 배양용 조성물 전체 100 중량부에 대하여 1 내지 100 중량부일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 세포 배양용 조성물은 오로지 본 발명에 따른 측분비인자만으로 이루어져 있을 수도 있고, 혹은 본 발명에 따른 측분비인자를 일부 포함할 수도 있다.

일 구체예에서, 세포 배양용 조성물에서 측분비인자의 함량은 세포 배양용 조성물 전체 중량(100 중량부)에 대하여 1 내지 100 중량부일 수 있다. 예컨대, 5 내지 100 중량부, 1 내지 10 중량부, 5 내지 20 중량부, 10 내지 50 중량부, 30 내지 100 중량부, 70 내지 100 중량부, 20 내지 70 중량부, 30 내지 60 중량부, 40 내지 80 중량부 또는 50 내지 100 중량부일 수 있다.

본 발명에 따른 측분비인자 외에 다른 배지 성물을 포함하는 경우, 본 발명에 따른 세포 배양용 조성물은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), RPMI 1640, F-10, F-12, a-MEM(a-Mineral Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Mineral Essential Medium), 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 배지를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 배양용 조성물을 이용하여 배양할 수 있는 세포의 종류는 전혀 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 세포 배양용 조성물은 측분비인자를 얻은 세포 집단의 원천이 된 개체와 동종인 또는 이종인 개체 유래의 세포를 배양하기 위한 것일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 세포 배양용 조성물은 측분비인자를 얻은 세포 집단의 원천이 된 개체와 동종인 개체의 세포를 배양하기 위한 것일 수 있다. 이 경우, 동종 유래의 세포는 자가세포 또는 타가세포일 수 있다.

예를 들어, 측분비인자를 얻은 세포 집단을 특정 개체로부터 얻고, 이 개체로부터 얻은 또다른 세포를 배양하기 위해 상기 측분비인자를 세포 배양용 조성물의 유효성분으로 포함할 수 있다. 이 경우, 이종 유래 혈청이나 상용화배지의 사용 없이 개체 유래의 세포를 동일 개체 유래의 측분비인자를 이용하여 배양할 수 있기 때문에 면역원성으로 인한 부작용이나 예기치 못한 병원체에 의한 감염 등을 막을 수 있다.

하기 실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 측분비인자를 타겟세포의 배양에 사용하는 예를 보여준다.

본 발명에서 "타겟 세포"는 측분비인자 도입 세포의 제조를 위해 사용된 세포를 의미한다. 상기 타겟 세포는 개체의 세포이거나 또는 일반 대중이 상업적으로 이용할 수 있도록 인체유래물로부터 분리ㆍ가공된 세포주일 수 있다. 상기 타겟 세포를 측분비인자를 포함하는 세포 배양용 조성물에서 배양하면, 측분비인자 도입 타겟 세포는 놀랍게도 측분비인자 유래 개체의 생체환경을 모사할 수 있다.

본 발명에서 "측분비인자 도입 세포"는 측분비인자가 도입된 타겟 세포를 의미한다. 측분비인자를 유효성분으로 포함하는 세포 배양용 조성물, 즉 배지에 타겟 세포를 배양하면, 상기 타겟 세포 내에 측분비인자가 도입되는데 이를 측분비인자 도입 세포라 표현할 수 있다. 상기 측분비인자 도입 세포는 측분비인자가 유래한 개체의 생체 내 환경을 모사하게 된다. 측분비인자가 유래한 개체의 생체 내 환경을 모사한다는 것은 예를 들어, 측분비인자가 유래한 생체가 개체 A이고, 타겟 세포가 개체 B로부터 유래한 세포이거나 또는 상용화된 세포주일 경우, 타겟 세포가 본래의 기능과 역할을 수행하면서도 개체 A의 생체 내 환경을 받아들여 개체 A 내에 존재하는 타겟 세포와 동일한 종류의 세포를 모사한다는 의미일 수 있다. 여기에서, "모사"는 모사의 대상과 완전히 동일하지는 않지만 유사하게 됨을 의미한다.

이렇게 얻어진 측분비인자 도입세포는 화장품 원료, 건강기능식품 원료 또는 약물에 대한 유효성, 적합성 및/또는 안전성을 평가하는데 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 타겟 세포는 인간유래 타겟 세포일 수 있다. 상기 인간유래 타겟 세포는 피부세포, 모유두세포, 대식세포, 지방세포, 신경세포, 혈관내피세포, 암세포, 간세포, 치아세포, 피지선 세포, 비장세포, 근육세포, 췌장세포 및 심장세포로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 측분비인자는 이종 유래 혈청이나 상용화 배지를 대체하여 세포 배양에 사용될 수 있다.

도 1은 측분비인자의 획득 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자의 세포수 측정 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자 도입 피부세포의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 5은 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자 도입 피부세포의 세포 특이적 분자마커 확인 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자 도입 피부세포의 세포 면역원성 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자 도입 피부세포의 화합물 원료 반응 변화 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자 도입 피부세포의 대사(단백질 생성량) 변화 측정 결과를 나타낸다.
도 9 내지 11은 본 발명의 실시예에서 제조된 측분비인자를 포함하는 세포 배양용 조성물을 사용하여 배양한 타겟세포의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.

실시예

[참고]

모든 실험예에 대해 Microsoft excel과 SigmaPlot을 이용하여 각 값에 대하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복한 결과이고, Mean ± standard error 값으로 하였으며, control media에 대한 P value 값은 *P < 0.05, **P < 0.01, 양성대조군에 대한 P value 값은 #P < 0.05, ##P < 0.01 로 하였다.

실시예 1. 측분비인자 제조

개체의 말초혈액 및 소변 유래 줄기세포를 분리한 후, 0.1 Gy~30 kGy의 방사선을 조사해 측분비인자를 획득하였다.

구체적인 제조 방법은 하기와 같다.

1) 말초혈액 및 소변 유래 자가세포 분리

단핵세포(Mononuclear cells), 면역세포(Immune cells), 혈소판(Platelet), 혈장(Plasma), 혈청(Serum), 조혈모세포(Hematopoietic stem cell), 성체 줄기세포(Adult stem cells)는 전남대학교병원 인체유래물 연구 심의위원회의 승인(CNUH-EXP-2019-189) 후, 전혈 10 ml 또는 소변 200 ml로부터 추출하였다(n=8).

시약 Lymphoprep ™ 혹은 Ficoll-Paque ™ 를 이용한 밀도구배 원심분리법 또는 단순 원심분리법을 통해 상기의 말초혈액 유래 세포를 분리하고, 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 2회 세척하였다.

구체적으로, 도 1에 나타난 바와 같이, 전혈을 원심분리하여, 혈장(Plasma)층으로부터 혈소판 풍부 혈장을 얻고, PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)층으로부터 말초혈액 단핵세포를 얻었다.

또한, 공지의 방법을 통해 소변으로부터 소변 유래 줄기세포를 얻었다.

이렇게 얻어진 세포들과 혈장 또는 혈청 등을 혼합하여 본 발명에 따른 세포 집단을 얻었다.

2) 세포수 측정

1)에서 제조된 세포 현탁액에서 20 ㎕의 검체를 채취하여 준비된 네 개의 트리판 블루 시약 각 20 ㎕에 계단 희석하였다.

염색된 세포 현탁액 10 ㎕를 커버 슬라이드가 덮여 있는 혈구 계산판의 한쪽에 주입하고 현미경 상에서 혈구 계산판 가장자리 눈금 4 군데에서 살아있는 세포만을 톨리 계수기를 이용하여 계수하였다. 같은 방법으로 반복 측정하여 평균값을 계산하여 세포수를 산출하였다.

3) 측분비인자 획득

(1) 공정 A(Freezing & thawing)

세포를 일정 수준의 농도 및 세포수로 조정하였다. 구체적으로, 혈장층에서 얻어진 혈소판 풍부 혈장 및 말초혈액 단핵세포를 포함하는 세포 집단 1(1 내지 10 х 10⁶ cells/mL)을 제조하였다. 또한, 혈소판 풍부 혈장, PBMC층에서 얻어진 말초혈액 단핵세포 및 소변 유래 줄기세포를 포함하는 세포 집단 2(1 내지 10 х 10⁶ cells/mL)를 제조하였다.

상기 세포 집단 1 및 세포 집단 2를 액체질소에 급속냉동하고 실온에 꺼내어 해동하는 과정을 10회 반복하였다. 원심분리하여 불순물을 제거하고 상등액을 회수하였다.

(2) 공정 B(Irradiation)

공정 A에서 회수한 세포 집단 1 및 세포 집단 2의 측분비인자를 0.1 Gy 내지 30 kGy의 방사선을 사용하여, 상기 측분비인자에 잔존하는 바이러스, 세균 등의 병원체에 대한 불활성화 공정을 진행하였다. 그 후, 다공성 셀룰로오스 막을 이용하여 유효성분인 성장인자, 사이토카인 및 단백질류를 채집하였다. 채집한 측분비인자에서 불순물을 제거하였다.

비교-실시예 1. 측분비인자 제조

단계 3) 측분비인자 획득에서 (2) 공정 B를 수행하지 않을 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 측분비인자를 제조하였다.

실험예 1. 측분비인자 내 생존 세포수의 변화 및 측분비인자의 정량

1) 방법

공정 A 및 공정 B 처리 전후의 측분비인자 내 생존 세포수를 측정하였다. 공정 A 및 공정 B 처리 전후의 샘플을 PBS로 세척하고, 각 웰에 25 uL의 MTT 용액(5 mg/mL)을 처치한 후 4시간 동안 37℃ 배양기에서 암상태로 반응시켰다. 상등액을 제거하고 100 uL의 DMSO를 처리하여 570 nm에서 OD 값을 측정하여 세포수를 측정하였다.

또한, 0.1 nm 내지 5,000 nm 크기의 측분비인자를 측정하기 위해 nanoparticle tracking analysis(NTANS300, Malvern)를 사용하였다. 베시클(Vesicle)을 PBS에 희석한 현탁액을 챔버(chamber)에 넣고 카메라 버전 9로 측정하였고 3.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

2) 결과

하기 표 1 및 도 2는 공정 A 및 공정 B 처리 전후의 생존 세포수 변화를 나타낸다.

구분	처리 전	처리 후
구분	처리 전	공정 A (Freezing & thawing)	공정 B (Irradiation)
세포 집단 1	1.85 ± 0.56	0.21 ± 0.24	0.00 ± 0.00
세포 집단 2	73.50 ± 12.58	2.31 ± 1.59	0.00 ± 0.00

상기 표 1에서 단위는 1 × 10⁶ cells/ml이다.

상기 표 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 공정 A 만을 진행할 경우(비교-실시예 1) 생존 세포가 일부 확인되나, 방사선 조사를 수행하는 공정 B를 진행할 경우 생존 세포가 발견되지 않은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 세포 자체가 가진 측분비인자를 획득하기 위한 선행조건인 외인성 자극을 유도 시, 공정 A와 공정 B 모두 약 80% 이상의 세포 사멸율을 유도할 수 있는 것을 확인할 수 있다.

또한, 하기 표 2 및 도 3은 공정 A 및 공정 B 처리 전후의 측분비인자량의 변화를 나타낸다.

구분	처리 전	처리 후
구분	처리 전	공정 A (Freezing & thawing)	공정 B (Irradiation)
측분비인자 타입 1	0.09 ± 0.02	0.60 ± 0.16	1.04 ± 0.28
측분비인자 타입 2	1.23 ± 0.37	22.88 ± 3.60	39.53 ± 6.79

표 2에서 단위는 1 × 10¹² particles/ml이다.

상기 표 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 당 업계에서 일반적으로 사용되고 있는 측분비인자 획득 방법인 초고속원심분리(ultracentrigufation) 또는 키트를 사용한 배양액 내 측분비인자의 분리, 정제 공정 없이도, 세포에서 직접적으로 측분비인자를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 세포 사멸율이 높을수록 회수되는 측분비인자의 양이 증가함을 확인할 수 있다.

실시예 2. 측분비인자 도입 세포 제조

1) 타겟 세포 배양

(1) 타겟 피부세포 배양

피부 세포주(human fibroblast(ATCC PCS-201-012), human melanocyte(ATCC PCS-200-013), human keratinocyte(ATCC PCS-200-011))를 구매 및 분양 받았다.

상기 세포주를 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone)이 포함된 배지(DMEM, ATCC)를 이용하여 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 세포는 이틀마다 PBS washing 후 배지를 교환해 주면서 80~90% confluence를 보일 때까지 배양한 후, 0.05% Trypsin-EDTA를 이용하여 계대 배양 및 실험에 사용하였다.

(2) 타겟 모유두세포 배양

모유두 세포주(human dermal papilla cells(Merck 602-05A))를 구매 및 분양 받았다.

(3) 타겟 대식세포 배양(아토피, 여드름, 면역, 항산화 관련)

단구 세포주(human THP-1(한국세포주은행 40202)를 구매 및 분양 받았다.

상기 세포주를 배양을 위해 RPMI1640(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 10% FBS, 1%의 penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO₂가 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. THP-1 세포를 0.5~1 × 10⁶ cells/mL의 농도로 뿌리고 24시간 배양한 후, 대식세포로 분화시키기 위해 200 ng/mL phorbol myristate acetate(PMA, Abcam, Cambridge, MA, USA)를 처리한 후 24시간 배양하였다.

(4) 타겟 지방세포 배양(면역, 대사성 질환 관련)

지방 세포주(mouse fibroblast 3T3-L1 preadipocyte(한국세포주은행 10092.1))를 구매 및 분양 받았다.

지방세포로 분화시키기 위해 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone)이 포함된 배지(DMEM, ATCC)에 P/S, 10 μg/ml insulin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 1 μM dexamethasone(Dex)(Sigma), 0.5 mM isobuthylmethylxanthine(IBMX)(Sigma)으로 지방세포로 분화를 유도하였다. 분화 후에는 DMEM, 10% FBS, P/S, insulin을 넣은 배지로 분화를 유지시켰다

(5) 타겟 신경세포 배양(기억력, 뇌질환 관련)

신경세포주(human neuroblastoma cell(ATCC CRL-2266))를 구매 및 분양 받았다.

(6) 타겟 혈관내피세포 배양(혈행, 심혈관 질환 관련)

혈관내피세포주(primary human umbilical vein endothelial cell(ATCC))를 구매 및 분양 받았다.

상기 세포주를 20% fetal bovine serum(FBS, Hyclone), 25 ㎍/㎖ EGF(Sigma-Aldrich), 0.2923 g/l L-Glutamin(Gibco), 0.1 g/l Heparin(Gibco) 및 10 ml antibiotic/antimycotic(Gibco)이 포함된 M199를 이용하여, 1% gelatin (Sigma)이 코팅된 100 mm culture dish (Nunc, Rochester, USA)에 깔아주고 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 세포는 이틀마다 PBS washing 후 배지를 교환해 주면서 80~90% confluence를 보일 때까지 배양한 후, 0.05% Trypsin-EDTA를 이용하여 계대 배양 및 실험에 사용하였다.

(7) 타겟 암세포 배양(항산화, 항암 관련)

간암 세포주(human hepatocellular carcinoma cells(ATCC HB-8065))를 구매 및 분양 받았다.

(8) 타겟 간세포 배양(피로, 약물독성 관련)

간 세포주(human normal hepatocyte cells(ATCC CCL-13))를 구매 및 분양 받았다.

상기 세포주를 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone)이 포함된 배지(DMEM, ATCC)를 이용하여 sodium bicarbonate(3.7 g/l, Sigma)을 첨가한 후 collagen coated plate(Iwaki, Japan)에서 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 세포는 이틀마다 PBS washing 후 배지를 교환해 주면서 80~90% confluence를 보일 때까지 배양한 후, 0.05% Trypsin-EDTA를 이용하여 계대 배양 및 실험에 사용하였다.

(9) 타겟 치아세포 배양(구강 질환 관련)

치아 치수 세포주(dental pulp stem cell(LONZA PT-5025))를 구매 및 분양 받았다.

2) 측분비인자 도입 세포 제조

타겟 세포의 종류에 따라서 상기 세포를 5 х 10⁴ ~ 1 х 10⁵ cells/mL 로 각각 12-well plate에 시딩후 하루 동안 배양하고, PBS washing하였다. 그 후 대조군 또는 실험군의 조성물을 첨가하여 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건으로 하루 동안 배양하였다.

대조군: 10% FBS가 포함된 DMEM 배지

실험군: 측분비인자 타입 1을 1~100 v/v%, DMEM을 0~99 v/v% 포함하는 조성물

실험예 2. 측분비인자 도입 세포 특성 확인_세포 생존율 측정

1) 방법

측분비인자 도입 세포를 PBS washing 후, 각 well에 25 uL의 MTT solution(5 mg/mL)을 처치한 후 4시간 동안 37℃ 배양기에서 암상태로 반응시켰다. 상등액을 제거하고 100 uL의 DMSO를 처리하여 570 nm에서 OD 값을 측정하였다.

2) 결과

(1) 측분비인자 도입 피부세포

하기 표 3 및 도 4는 측분비인자 도입 피부세포, 즉, 사람 진피세포, 사람 색소세포 및 사람 표피세포에서의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다(단위: %).

구분	대조군	실험군
사람 진피세포	100.00 ± 9.13	94.62 ± 9.35
사람 색소세포	100.00 ± 4.56	106.77 ± 19.08
사람 표피세포	100.00 ± 4.48	103.94 ± 3.96

상기 표 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 실험군은 대조군에 비해 변화된 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 측분비인자가 타겟 세포에 전달(도입)되어 타겟 세포의 세포생존 주기에 영향을 주었음을 확인할 수 있다. 또한, 통상적인 세포 배양법과 비교해서도 배양된 측분비인자 도입 피부세포가 안정성을 유지하고 있음을 확인할 수 있다.

실험예 3. 측분비인자 도입 세포 특성 확인_세포 특이적 분자마커 확인

1) 방법

세포를 5 X 10⁴ cells/mL 로 준비하여 8-well Chamber slide (LAB-TEK, Rochester, NY)에 200 μL씩 seeding 후 하루 동안 배양하고, PBS washing 후 측분비인자를 첨가하여 24시간 배양 후, 면역 염색을 위해 준비하였다. cold-methanol을 이용하여 세포를 고정시킨 후, 0.5% Triton X-100/PBS로 membrane permeabilization을 시키고 10% normal goat serum으로 blocking 하였다. CD 90과 vimentin은 fibroblast, Mel-5와 S100은 melanocyte, cytokeratin 14는 keratinocyte의 1차 항체로 사용하였고, Alexa-488을 2차 항체로 하여 형광염색을 진행하였다. 이 때, 세포핵을 염색하기 위하여 DAPI를 사용하였고 형광현미경으로 관찰하였다.

2) 결과

(1) 측분비인자 도입 피부세포

도 5는 측분비인자 도입 피부세포, 즉, 사람 진피세포 및 사람 표피세포에서의 분자 마커 확인 결과를 나타낸다.

도 5에 나타난 바와 같이, 대조군과 실험군의 세포 사이의 형태적 변화를 확인할 수 있다. 이를 통해, 측분비인자가 타겟 세포에 전달(도입)되어 표현형을 변화시켰음을 확인할 수 있다. 이는 측분비인자에 포함된 다양한 생체활성인자가 세포 사이에 전달되며, 세포 내외의 신호전달 및 생합성 경로를 변화시킨다는 기존 과학적 근거들과 일치함을 확인할 수 있다.

실험예 4. 측분비인자 도입 세포 특성 확인_ 세포 면역원성 평가

1) 방법

측분비인자 도입 세포를 mitomycin C(10 ㎍/㎖)로 처리하여 증식을 억제시킨 후, phytohaemaggluinin(1 ㎍/㎖) 처리한 1 х10⁵ cells/mL인 피험자의 말초혈액 단핵구(PBMC)를 첨가하여 첨가하여 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건으로 6일 배양시킨 후, 세포 생존율로서 세포의 면역학적 안전성을 확인하였다.

2) 결과

(1) 측분비인자 도입 피부세포

하기 표 4 및 도 6은 측분비인자 도입 피부세포, 즉, 사람 진피세포, 사람 색소세포 및 사람 표피세포에서의 세포 면역원성 평가 결과를 나타낸다(단위: %).

구분	대조군	실험군
사람 진피세포	89.42 ± 17.26	102.53 ± 5.13
사람 색소세포	98.36 ± 18.99	112.78 ± 5.65
사람 표피세포	99.03 ± 0.82	101.93 ± 0.00

상기 표 4 및 도 6에 나타난 바와 같이, 측분비인자 도입 피부세포(실험군)는 대조군 대비 향상된 면역억제력을 가지는 것을 확인할 수 있다. 이는, 측분비인자가 가진 면역관련 인자들이 타겟 세포로 전달되어 측분비인자와 유사한 면역성을 표현하게 된 것으로 판단된다. 또한, 이는 측분비인자가 면역조절 작용 등을 통해 이식 거부반응 등을 완화할 수 있다는 과학적 근거들과 일치하는 결과임을 확인할 수 있다.

실험예 5. 측분비인자 도입 세포 특성 확인_원료에 대한 세포의 생존 및 증식 변화 확인

1) 방법

대조군과 측분비인자로 배양된 세포의 대사변화, 즉, 세포가 생존, 증식하는 과정에 원료(시험물질)를 소모하여 세포생존율에 변화를 미치는 경향성을 살펴보고자 다음과 같이 실험을 진행하였다.

측분비인자 도입 세포를 PBS로 세척한 후, 대조군 또는 실험군 조성물에 세포의 생존, 증식에 도움이 되는 성장인자류(EGF(진피세포), 알부틴(색소세포), 글리세릴 글루코시드 (표피세포))를 시험물질로서 적정 농도로 처리하여 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건으로 하루 동안 배양하였다. 세포 생존율 측정법에 따라 세포의 반응 변화를 측정하였다.

대조군: 10% FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지를 포함하는 조성물

실험군: 세포 종류(n=4) 별로 측분비인자 타입 1을 1~100 v/v%, DMEM을 0~99 v/v% 포함하는 조성물

2) 결과

(1) 측분비인자 도입 피부세포

하기 표 5 및 도 7은 원료에 대한 측분비인자 도입 피부세포의 생존 및 증식 변화 확인 결과를 나타낸다(단위: %).

구분	대조군	실험군
EGF(인간 진피세포(hDF))	135.69 ± 17.25	105.22 ± 19.28
알부틴 (인간 색소세포(hEM))	90.76 ± 1.06	70.63 ± 11.17
글리세릴 글루코시드 (인간 표피세포(hEK))	100.28 ± 1.75	113.79 ± 22.28

상기 표 5 및 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군과 실험군의 피부세포 사이의 반응성 변화를 확인할 수 있다. 이를 통해, 제조된 측분비인자 도입 피부세포는 측분비인자로 인한 표현형 변화 중 화학물질에 대한 반응차이를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 6. 측분비인자 도입 세포 특성 확인_세포의 대사(단백질 생성량) 변화 확인

1) 방법

실험예 5의 실험에서 얻은 배양액을 분석하여 세포의 대사 변화를 확인해 보고자 하였다. 단백질 생성량은 Takara Bio Inc.로부터 procollagen type I C-peptide EIA kit을 구입하여 제시된 manual에 따라 hFibroblast의 supernatant에서의 collagen을, MyBiosource Inc.로부터 5,6-dihydroxyinole-2-carboxylic acid oxidase ELISA kit을 구입하여 제시된 manual에 따라 hMelanocyte의 supernatant에서의 melanoma antige을, Echelon Bioscience로부터 Hyaluronan ELISA kit을 구입하여 제시된 manual에 따라 HaCaT 및 hKeratinocyte의 supernatant에서의 hyaluronan을 405 nm에서 OD 값으로 측정하였다. 실험 결과는 standard curve로부터 분석하였고, OD값으로부터 농도를 계산하였다.

2) 결과

(1) 측분비인자 도입 피부세포

하기 표 6 및 도 8은 원료에 대한 측분비인자 도입 피부세포의 대사(단백질 생성량) 변화 확인 결과를 나타낸다(단위: %).

구분	대조군	실험군
Procollagen type I(on hDF)	100.00 ± 3.12	107.26 ± 11.54
5,6-dihydroxyindole(on hEM)	100.00 ± 2.09	99.36 ± 3.13
Hyaluronic acid(on hEK)	100.00 ± 12.01	84.11 ± 8.48

상기 표 6 및 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군과 실험군의 피부세포 사이의 단백질 생성량 변화를 확인할 수 있다. 이를 통해, 제조된 측분비인자 도입 피부세포는 측분비인자로 인한 표현형 변화 중 생합성 경로 변화를 통한 단백질 생성량 변화를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다.

실시예 3. 측분비인자를 포함하는 배지 조성물의 제조

본 발명자들은 본 발명에 대한 연구 과정에서 본 발명에 따라 제조된 측분비인자를 배지에 포함시켜 세포 배양을 할 경우 이종 유래 혈청이나 상용화 배지를 대체할 수 있음을 확인하였다.

이에 아래와 같이 3가지 배양방법을 설계하고, 이러한 배양방법을 수행하기 위한 측분비인자를 포함하는 배지 조성물을 제조하여 하기 실험예들에서 세포 배양을 진행하였다.

(1) 배양방법 A(이종 유래 혈청 대체 배양)

이종 유래 혈청(Fetal bovine serum 등)을 대체하여 자가 또는 동종세포를 배양하는 방법을 수행하기 위해 아래와 같이 배지 조성을 설계하였다.

대조군: 10% FBS가 포함된 DMEM 배지

실험군 A1: 10% 측분비인자 타입 1 이 포함된 DMEM 배지

실험군 A2: 10% 측분비인자 타입 2가 포함된 DMEM 배지

(2) 배양방법 B(상용화 배지 일부 대체 배양)

상용화 배지(Culture medium)를 일부 대체하여 자가 또는 동종세포를 배양하는 방법을 수행하기 위해 아래와 같이 배지 조성을 설계하였다.

대조군: 10% FBS가 포함된 DMEM 배지

실험군 B1: 측분비인자 타입 1 및 2의 혼합물 1~20 v/v%, FBS를 포함하지 않은 DMEM 80~99 v/v%를 포함하는 조성물

실험군 B2: 측분비인자 타입 1 및 2의 혼합물 21~40 v/v%, FBS를 포함하지 않은 DMEM 60~79 v/v%를 포함하는 조성물

실험군 B3: 측분비인자 타입 1 및 2의 혼합물 41~60 v/v%, FBS를 포함하지 않은 DMEM 40~59 v/v%를 포함하는 조성물

(3) 배양방법 C(상용화 배지 완전 대체 배양)

상용화 배지(Culture medium)를 완전 대체하여 자가 또는 동종세포를 배양하는 방법을 수행하기 위해 아래와 같이 배지 조성을 설계하였다.

대조군: 10% FBS가 포함된 DMEM 배지

실험군 C1: 측분비인자 타입 1 또는 2를 단독으로 100 v/v%, FBS를 포함하지 않은 DMEM 0 v/v%를 포함하는 조성물

실험군 C2: 측분비인자 타입 1 및 2의 혼합물 100 v/v%, FBS를 포함하지 않은 DMEM 0 v/v%를 포함하는 조성물

실험예 7: 측분비인자를 포함하는 세포 배양용 조성물을 이용한 세포 배양

피부 세포주(human fibroblast(ATCC PCS-201-012), human melanocyte(ATCC PCS-200-013), human keratinocyte(ATCC PCS-200-011))를 구매 및 분양 받은 후, 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone)이 포함된 배지(DMEM, ATCC)를 이용하여 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 세포는 이틀마다 PBS washing 후 배지를 교환해 주면서 80~90% confluence를 보일 때까지 배양한 후, 0.05% Trypsin-EDTA를 이용하여 계대 배양 및 실험에 사용하였다.

공여세포의 종류에 따라서 5 х 10⁴ ~ 1 х 10⁵ cells/mL를 각각 96-well plate에 시딩(seeding) 후 하루 동안 배양한 후, PBS washing하였다. 그 후, 대조군 및 실험군의 조성물을 첨가하여 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 조건으로 하루 동안 배양한 후 세포생존률을 측정하였다.

결과

(1) 배양방법 A(이종 유래 혈청 대체 배양)

하기 표 7 및 도 9는 이종 유래 혈청 대체 배양 후의 사람 진피세포, 사람 색소세포 및 사람 표피세포에서의 세포 생존률 측정 결과를 나타낸다(단위: %).

구분	대조군	실험군 A1	실험군 A2
사람 진피세포	100.00 ± 9.56	88.17 ± 9.20	116.91 ± 14.68
사람 색소세포	100.00 ± 3.88	98.00 ± 3.09	110.84 ± 5.40
사람 표피세포	100.00 ± 8.49	89.06 ± 17.71	100.17 ± 6.73

(2) 배양방법 B(상용화 배지 일부 대체 배양)

하기 표 8 및 도 10은 상용화 배지 일부 대체 배양 후의 사람 진피세포, 사람 색소세포 및 사람 표피세포에서의 세포 생존률 측정 결과를 나타낸다(단위: %).

구분	대조군	실험군 B1	실험군 B2	실험군 B3
사람 진피세포	100.00 ± 4.36	94.55 ± 10.29	117.28 ± 17.34	121.79 ± 29.61
사람 색소세포	100.00 ± 8.45	106.18 ± 16.40	122.79 ± 16.34	133.66 ± 24.16
사람 표피세포	100.00 ± 5.12	94.54 ± 3.42	97.70 ± 3.01	103.87 ± 4.68

(3) 배양방법 C(상용화 배지 완전 대체 배양)

하기 표 9 및 도 11은 상용화 배지 완전 대체 배양 후의 사람 진피세포, 사람 색소세포 및 사람 표피세포에서의 세포 생존률 측정 결과를 나타낸다(단위: %).

구분	대조군	실험군 C1	실험군 C2
사람 진피세포	100.00 ± 6.82	99.14 ± 5.32	104.45 ± 15.25
사람 색소세포	100.00 ± 9.36	101.66 ± 9.63	108.83 ± 9.46
사람 표피세포	100.00 ± 1.83	95.73 ± 17.19	129.38 ± 18.53

상기 표 7 내지 9 및 도 9 내지 11에 나타난 바와 같이, 측분비인자로 이종 유래 혈청을 대체하여 사용하는 경우, 이종 유래 혈청을 사용하는 것에 비해 우수한 배양 효과를 확인할 수 있으며, 더 나아가 상용화 배지를 일부 또는 전부 대체하여 배양하는 경우에도 우수한 배양 효과를 확인할 수 있다.

또한, 공여세포의 종류에 따라 우수한 배양 효과를 나타내는 배양방법이 각각 상이하게 나타났다. 구체적으로, 측분비인자 타입 1 및 2의 혼합물을 사용할 경우 진피세포 및 색소세포는 상용화 배지 일부 대체 배양에서 우수한 배양 효과를 나타냈으며, 표피세포는 상용화 배지 완전 대체 배양에서 우수한 배양 효과를 나타내었다.

이를 통해, 공여세포 각각에 따라 알맞은 배양 공정을 선별하여 사용할 수 있다.

Claims

혈액으로부터 분리한 단핵세포를 포함하는 세포 집단을 별도의 배양 과정 없이,
상기 세포 집단을 세포용해하는 단계, 및
상기 세포용해 공정을 수행하여 얻은 세포용해물로부터 세포 찌꺼기(debris)를 제거하고, 여과하여 측분비인자(paracrine factor)를 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 측분비인자에,
혈소판 풍부 혈장, 조혈모세포, 줄기세포 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 세포집단을 별도의 배양 과정 없이,
상기 세포 집단을 세포용해하는 단계, 및
상기 세포용해 공정을 수행하여 얻은 세포용해물로부터 세포 찌꺼기(debris)를 제거하고, 여과하여 측분비인자(paracrine factor)를 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 측분비인자를 혼합하는 단계를 포함하고,
상기 측분비인자는 엑소좀(exosome), 미세소포체(microvesicles), 세포자멸체(apototic bodies) 및 세포괴사체(necroptotic bodies)를 포함하는 세포밖소포체(extracellular vesicles)를 포함하는 것인
측분비인자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 세포용해는 원심분리; 반복적인 냉해동; 삼투압 충격; 단백질 분해효소 처리; 엑스선, 전자선 또는 감마선의 방사선 조사; 자외선 조사; 및 초음파 조사로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 공정을 사용하여 수행되는 것인
측분비인자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 세포 용해물을 여과하는 단계는 5㎛ 이하의 기공 크기를 갖는 여과막을 사용하여 수행되는 것인
측분비인자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 세포 집단은 혈소판 풍부 혈장, 조혈모세포, 줄기세포 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것인
측분비인자의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 줄기세포는 성체줄기세포인
측분비인자의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 측분비인자.
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