ES2588383T3 - Composiciones que tienen contenidos plaquetarios - Google Patents

Abstract

Una composición de lisado plaquetario que comprende un filtrado a partir de una preparación plaquetaria lisada pasada a través de un filtro de 0.45 mm o menos, en donde dicho filtrado comprende más de 200 pg de polipéptido VEGF por mL.

Description

DESCRIPCION

Composiciones que tienen contenidos plaquetarios Antecedentes

1. Campo tecnico

5 Este documento se refiere a metodos y materiales implicados en la fabricacion y el uso de factores de crecimiento, quimiocinas y moleculas responsables de crecimiento, diferenciacion, o mantenimiento de celulas sin diferencias a partir de plaquetas humanas normales (por ejemplo, lisados plaquetarios). Por ejemplo, este documento se refiere a metodos y materiales para la fabricacion de plaquetas o preparaciones plaquetarias (por ejemplo, preparaciones plaquetarias de aferesis) los factores utilizados para cultivar celulas madre rapidamente (por ejemplo, celulas madre 10 adultas), para su mantenimiento en una forma sin diferencias, como un aditivo a medios para diferenciar las celulas madre (por ejemplo, celulas madre adultas) en combinacion con otros factores, para desarrollar cultivos de celulas primarias (por ejemplo, celulas tumorales y llneas de celulas tumorales), y para desarrollar celulas tumorales con propiedades de celulas madre. Este documento tambien se refiere a metodos y materiales que se pueden utilizar para identificar, aislar, enriquecer, u optimizar combinaciones de factores de crecimiento eficaces utilizando 15 plaquetas como material de partida. Ademas, el documento se refiere a suplementos de cultivo de plasma de plaquetas y composiciones que tienen contenidos plaquetarios.

2. Informacion de antecedentes

El cultivo celular esta implicado en gran parte de la biologla moderna, descubrimiento de farmacos y terapia. Por ejemplo, las celulas tumorales primarias pueden ser cultivadas para obtener una fuente de antlgenos que se puede 20 utilizar en las vacunas anti-tumorales. Dos metodos generales se utilizan para cultivar celulas tumorales del cerebro primario. Tradicionalmente, las celulas se cultivan en medio mlnimo suplementado con suero fetal bovino. Las celulas cultivadas de esta manera pueden exhibir aplicabilidad limitada como una fuente de antlgeno eficaces, ya que a menudo presentan caracterlsticas de los subtipos de celulas gliales diferenciadas con una capacidad reducida para recapitular el tumor original in vivo. Alternativamente, las celulas pueden ser cultivadas en un medio 25 enriquecido suplementado con factores de crecimiento, EGF y FGF. Las celulas cultivadas en este medio pueden formar neuroesferas y pueden contener poblaciones de celulas madre tumorales, que recapitulan mas de cerca las caracterlsticas fenotlpicas del tumor primario. Aunque estas celulas pueden tener las capacidades proliferativas reducidas, por lo general son menos diferenciadas, mas tumorigenicas y mas antigenico que las celulas cultivadas en suero fetal bovino (Lee et al., Cancer Cell., 9:391-403 (2006)). Estos enfoques no aparecen generar cultivos de 30 tumor primario con altas eficiencias y no aparecen permitir el crecimiento de cultivos lo suficientemente rapido para muchas aplicaciones. Si bien estos metodos pueden ser usados para generar cultivos de celulas a partir de gliomas malignos, estos protocolos incluyen por lo general materiales y metodos no apropiados para el uso cllnico.

La preparacion de lisados plaquetarios y su uso como un suplemento en cultivos de celulas diferenciadas se ha descrito en Lucarelli et al, Biomateriales, 24 (18): 3.095 hasta 3.100 (2003); WO 89/10398; Bernardo et al, J. Cell 35 Physiol, 211 (1): 121-130 (2007); Capelli et al, Bone Marrow Transplant., 40 (8): 785-791 (2007); Doucet et al., J. Cell. Physiol., 205: 228-236 (2005); Martineau et al, Biomateriales, 25 (18): desde 4489 hasta 4502 (2004).

Resumen

La invencion puede ser definida por las reivindicaciones adjuntas.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la invencion proporciona una composicion de lisado plaquetario que 40 comprende un filtrado a partir de una preparacion plaquetaria lisada pasada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos, en donde dicha composicion de lisado plaquetario comprende mas de 200 pg de polipeptido VEGF por mL.

Este documento proporciona metodos y materiales relacionados con la obtencion y utilizacion de moleculas y factores de crecimiento encontrados en las plaquetas (por ejemplo, lisados plaquetarios o "PL") o medios que contienen las plaquetas (por ejemplo, un sobrenadante o filtrado a partir de una preparacion plaquetaria tales como 45 una preparacion plaquetaria de aferesis). Por ejemplo, este documento se refiere a metodos y materiales para la fabricacion y uso de composiciones que tienen contenidos plaquetarios (por ejemplo, lisados y/o sobrenadantes plaquetarios o filtrados de medios que contienen plaquetas). Las composiciones que tienen contenidos plaquetarios proporcionadas en este documento pueden ser utilizadas para promover un mayor crecimiento de las celulas (por ejemplo, celulas progenitoras adultas normales, celulas madre, y celulas precursoras). Ejemplos de tales celulas 50 incluyen, sin limitacion, celulas mesenquimales del estroma, celulas precursoras endoteliales, fibroblastos y celulas epiteliales. Las composiciones que tienen contenidos plaquetarios proporcionadas en este documento tambien se pueden utilizar para mejorar la diferenciacion de las celulas progenitoras, celulas madre, y celulas precursoras en subtipos funcionales de manera eficiente. Ademas, las composiciones que tienen contenidos plaquetarios proporcionadas en este documento pueden ser utilizados para promover un mayor crecimiento de las celulas madre 55 no diferenciadas tales celulas madre del tipo tumoral y las celulas estromales mesenquimales adultas o para

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mantener las celulas como una mezcla de celulas madre y celulas diferenciadas, tales como la encontrada en cultivos de tumores primarios y llneas de celulas tumorales. En algunos casos, las composiciones que tienen contenidos plaquetarios proporcionadas en este documento se pueden utilizar para generar de manera eficiente cultivos de celulas primarias (por ejemplo, llneas de celulas tumorales). Como se describe en este documento, las composiciones que tienen contenidos plaquetarios proporcionadas en este documento (por ejemplo, lisados plaquetarios, sobrenadantes a partir de medios que contienen plaquetas, y filtrados de medios que contienen plaquetas) se pueden utilizar para obtener la cinetica de crecimiento superiores cuando el cultivo celular (por ejemplo, celulas progenitoras y celulas madre del tipo tumoral) en comparacion con los cultivos utilizando la administracion de suplementos de suero humano, suero fetal bovino, o medio libre de suero con administracion de suplementos del factor de crecimiento recombinante. Las composiciones que tienen contenidos plaquetarios proporcionadas en este documento tambien se pueden fabricar de una manera que sea aceptable para uso cllnico (por ejemplo, cumple con las regulaciones actuales de buenas practicas de fabricacion).

Este documento tambien proporciona suplementos de cultivo de plaquetas en plasma y metodos de cultivo celular y materiales para el uso de suplementos de cultivo de plasma de plaquetas. El termino "suplemento de cultivo de plasma de plaquetas" como se utiliza en este documento, se refiere a una composicion que contiene (a) plasma (por ejemplo, plasma humano) y (b) contenido plaquetario que esta en la forma de un lisado plaquetario que contenla mas de 3 x 108 plaquetas por mL (por ejemplo, mas de 4 x 108 plaquetas por mL, mas de 5 x 108 plaquetas por mL, mas de 6 x 108 plaquetas por mL, mas de 7 x 108 plaquetas por mL, mas de 8 x 108 plaquetas por mL, mas de 9 x 108 plaquetas por mL, o mas de 1 x 109 plaquetas por mL) antes de lisis o un medio que contenla mas de 3 x 108 plaquetas por mL (por ejemplo, mas de 4 x 108 plaquetas por mL, mas de 5 x 108 plaquetas por mL, mas de 6 x 108 plaquetas por mL, mas de 7 x 108 plaquetas por mL, mas de 8 x 108 plaquetas por mL, mas de 9 x 108 plaquetas por mL, o mas de 1 x 109 plaquetas por mL) antes de que se eliminen las plaquetas. Dicho medio puede ser un sobrenadante o filtrado obtenido a partir de una preparacion plaquetaria tal como una preparacion plaquetaria de aferesis o una preparacion plaquetaria de aislamiento a gran escala. En algunos casos, tales sobrenadantes filtrados o se pueden obtener de las preparaciones plaquetarias vencidas (por ejemplo, preparaciones plaquetarias de aferesis vencidas). Las preparaciones plaquetarias que han sido superados pueden ser preparaciones plaquetarias (por ejemplo, las preparaciones plaquetarias de aferesis) que se han obtenido de un ser humano vivo y almacenados entre 20°C y 24°C, durante mas de cuatro dlas (por ejemplo, mas de cinco, mas de seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 15 o mas dlas). Normalmente, se tomas 1-2 litros de sangre que tiene un recuento de plaquetas de 150,000/mm3 para producir una unidad de plaquetas que tienen aproximadamente 3 x 1011 plaquetas. Cualquier volumen de una preparacion que contiene las plaquetas en las concentraciones anteriores se puede utilizar. Por ejemplo, 30 mL (por ejemplo, dos tubos de 15 mL) 50 mL, 100 mL, 500 mL, o una unidad completa de las plaquetas se puede utilizar para obtener un lisado plaquetario o un medio (por ejemplo, plasma) que contenla mas de 3 x 108 plaquetas por mL.

Un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas proporcionado en este documento puede tener la capacidad de establecer cultivos de glioma. Por ejemplo, medio esencial mlnimo con 5 por ciento de un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas proporcionado en este documento puede ser capaz de establecer, a partir de tejido de la biopsia de glioblastoma humano multiforme recien diagnosticado, cultivos de glioma humano que tienen mas de 3 x 107 celulas dentro de 60 dlas a 37°C ( en un incubador humidificado con 5% de CO2) con una tasa de exito que es mas de 30 por ciento (por ejemplo, mas de 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o mas por ciento). Esta tasa de exito se basa en el numero de diferentes muestras de tejido de biopsia multiforme de glioblastoma humano recien diagnosticados (es decir, muestras para los diferentes seres humanos) que se pueden utilizar para establecer un cultivo de glioma, en comparacion con el numero de intentos utilizando una sola muestra de tejido de biopsia multiforme de glioblastoma de humano varias veces.

Los metodos y materiales proporcionados en este documento se pueden utilizar para desarrollar celulas madre adultas rapidamente, para diferenciar celulas madre (por ejemplo, celulas madre adultas), para desarrollar cultivos de celulas primarias (por ejemplo, llneas de celulas de tumor), para desarrollar celulas madre del tipo tumoral, e identificar los factores de crecimiento efectivos. Por ejemplo, los metodos y materiales proporcionados en este documento pueden permitir a los medicos o el personal medico desarrollar vacunas contra el cancer autologas especlficas del paciente, mientras que se siguen las directrices de la FDA. Las celulas tumorales tales como las celulas de glioma maligno cultivadas utilizando los metodos y los materiales proporcionados en este documento puede mantener muchos aspectos de fenotipos de celulas madre tumorales neural y puede ser enriquecido en antlgenos especlficos de tumores deseados para el reconocimiento de las respuestas inmunes del huesped. La cinetica de crecimiento de las celulas cultivadas utilizando los metodos y materiales proporcionados en este documento pueden permitir a los medicos para fabricar suficiente material celular para multiples vacunas en un corto perlodo de tiempo dictado por los reglmenes terapeuticos estandares actuales. Por lo tanto, los metodos y materiales proporcionados en este documento pueden proporcionar opciones adicionales para la expansion y el uso de material tumoral especlfico del paciente para la terapia celular.

Otra importancia del cultivo celular es el creciente uso de celulas como farmacos. En particular, celulas madre (tanto de adultos como fetales) se pueden utilizar en medicina regenerativa. En tales casos, la velocidad del crecimiento celular, la fidelidad de la genetica de cultivo, y la aplicabilidad cllnica puede estar involucrada en el exito de las terapias basadas en celulas.

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En general, un aspecto de este documento presenta una composicion de lisado plaquetario que comprende, o consiste esencialmente en, un filtrado a partir de una preparacion plaquetaria lisada pasada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos. La preparacion plaquetaria lisada puede ser una preparacion plaquetaria de aferesis lisada. El filtro puede ser un filtro de 0.45 pm. El filtro puede ser un filtro de 0.2 pm. El filtrado puede ser de la preparacion plaquetaria lisada que se pasada a traves de un filtro de 0.45 pm y un filtro de 0.2 pm. La preparacion plaquetaria lisada puede comprender sobrenadante de la centrifugacion de las plaquetas lisadas. Las plaquetas lisadas pueden ser plaquetas lisadas mediante un ciclo de congelacion/descongelacion. Las plaquetas lisadas pueden ser plaquetas lisadas a traves de al menos dos ciclos de congelacion/descongelacion. La centrifugacion puede comprender una fuerza entre 2000 x g y 4000 x g durante entre 15 y 45 minutos. La centrifugacion puede comprender una fuerza de aproximadamente 3000 x g durante aproximadamente 30 minutos. La composicion de lisado plaquetario puede comprender mas de 200 pg de polipeptido VEGF por mL. El cultivo de 1.4 x 106 celulas madre mesenquimales con un medio que contiene aproximadamente cinco por ciento de la composicion de lisado plaquetario puede resultar en mas de 1.4 x 107 celulas despues de tres dlas. Las celulas madre mesenquimales pueden ser celulas derivadas de tejido adiposo.

En otro aspecto, este documento presenta una composicion de lisado plaquetario producido mediante la filtracion de una preparacion plaquetaria lisada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos. La preparacion plaquetaria lisada puede ser una preparacion plaquetaria de aferesis lisadas. El filtro puede ser un filtro de 0.45 pm. El filtro puede ser un filtro de 0.2 pm. La composicion de lisado plaquetario puede ser producida mediante la filtracion de la preparacion plaquetaria lisada a traves de un filtro de 0.45 pm y un filtro de 0.2 pm. La preparacion plaquetaria lisada puede comprender sobrenadante de la centrifugacion de plaquetas lisadas. Las plaquetas lisadas pueden ser plaquetas lisadas mediante un ciclo de congelacion/descongelacion. Las plaquetas lisadas pueden ser plaquetas lisadas a traves de al menos dos ciclos de congelacion/descongelacion. La centrifugacion puede comprender una fuerza entre 2000 x g y 4000 x g durante entre 15 y 45 minutos. La centrifugacion puede comprender una fuerza de aproximadamente 3000 x g, durante aproximadamente 30 minutos.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la fabrication de una composicion de lisado plaquetario. El metodo comprende, o consiste esencialmente en, filtracion de una preparacion plaquetaria lisada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos. La preparacion plaquetaria lisada puede ser una preparacion plaquetaria de aferesis lisadas. El filtro puede ser un filtro de 0.45 pm. El filtro puede ser un filtro de 0.2 pm. El metodo puede comprender la filtracion de la preparacion plaquetaria lisada a traves de un filtro de 0.45 pm y un filtro de 0.2 pm. La preparacion plaquetaria lisada puede comprender sobrenadante de la centrifugacion de las plaquetas lisadas. Las plaquetas lisadas pueden ser plaquetas lisadas mediante un ciclo de congelacion/descongelacion. Las plaquetas lisadas pueden ser plaquetas lisadas a traves de al menos dos ciclos de congelacion/descongelacion. La centrifugacion puede comprender una fuerza entre 2000 x g y 4000 x g durante entre 15 y 45 minutos. La centrifugacion puede comprender una fuerza de aproximadamente 3000 x g durante aproximadamente 30 minutos.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la fabricacion de una composicion de lisado plaquetario. El metodo comprende, o consiste esencialmente en: (a) lisado de plaquetas a traves de uno o mas ciclos de congelacion/descongelacion para obtener plaquetas lisadas, (b) centrifugacion de las plaquetas lisadas para obtener un sobrenadante, y (c) filtrar el sobrenadante a traves de un filtro de 0.45 pm o menos para obtener un filtrado, en donde el filtrado es la composicion lisado plaquetario. La etapa de lisis puede comprender al menos dos ciclos de congelacion/descongelacion. La etapa de centrifugacion puede comprender el uso de una fuerza entre 2000 x g y 4000 x g durante entre 15 y 45 minutos. La etapa de centrifugacion puede comprender una fuerza de aproximadamente 3000 x g durante aproximadamente 30 minutos. El filtro puede ser un filtro de 0.45 pm. El filtro puede ser un filtro de 0.2 pm. La etapa de filtracion puede comprender filtrar el sobrenadante a traves de un filtro de 0.45 pm y un filtro de 0.2 pm. Las plaquetas pueden ser plaquetas de aferesis.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la expansion de una poblacion de celulas que comprende, o consiste esencialmente en, cultivo de una primera poblacion de celulas en presencia de medio que comprende una composicion de lisado plaquetario bajo condiciones en donde la primera poblacion de celulas se expande a una segunda poblacion de celulas que tienen mas celulas que la primera poblacion, en donde la composicion de lisado plaquetario comprende un filtrado a partir de una preparacion plaquetaria lisada pasada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos. Las celulas pueden ser celulas madre adultas, celulas de tumor primario, o celulas madre tumorales.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la diferenciacion de celulas madre. El metodo comprende, o consiste esencialmente en, cultivo de las celulas madre en presencia de medio de diferenciacion que comprende una composicion de lisado plaquetario bajo condiciones en donde las celulas madre se diferencian, en donde la composicion de lisado plaquetario comprende un filtrado a partir de una preparacion plaquetaria lisada pasada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la curacion de una herida. El metodo comprende, o consiste esencialmente en, poner en contacto la herida con una composicion de lisado plaquetario, en donde la composicion de lisado plaquetario comprende un filtrado a partir de una preparacion plaquetaria lisada pasada a

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traves de un filtro de 0.45 mm o menos. La herida puede ser un corte, fistula o ulcera diabetica. La etapa de contacto puede comprender el uso de una puntada o adhesivo que comprende la composicion lisado plaquetario en contacto con la herida. La etapa de contacto puede comprender la pulverizacion de la composicion de lisado plaquetario sobre la herida.

En otro aspecto, este documento presenta una composicion que contiene el contenido de plasma y plaquetas a partir de una preparacion plaquetaria pasada a traves de un filtro de 0.45 mm o menos. El plasma puede ser plasma humano. El contenido plaquetario puede ser contenido plaquetario humano.

En otro aspecto, este documento presenta un medio de composicion que comprende (por ejemplo, un medio esencial mlnimo) y un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas. El suplemento de cultivo de plasma de plaquetas puede ser un lisado plaquetario que comprende plasma. El suplemento de cultivo de plasma de plaquetas puede ser un filtrado obtenido mediante filtracion una preparacion plaquetaria de aferesis que comprende plasma. La preparacion plaquetaria de aferesis puede ser una preparacion plaquetaria de aferesis recolectada de un ser humano de mas de tres dlas antes. La preparacion plaquetaria de aferesis puede ser una preparacion plaquetaria de aferesis recolectada de un ser humano de mas de cinco dlas antes. La preparacion plaquetaria de aferesis puede ser una preparacion plaquetaria de aferesis recolectada de un ser humano de mas de seis dlas antes. El suplemento de cultivo de plasma de plaquetas puede ser un sobrenadante obtenido a partir de girar una preparacion plaquetaria de aferesis que comprende plasma. La preparacion plaquetaria de aferesis puede ser una preparacion plaquetaria de aferesis recolectada de un ser humano de mas de diez dias antes.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la obtencion de un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas que comprende la eliminacion de plaquetas o residuos de plaquetas de una preparacion plaquetaria de aferesis de tal manera que al menos algunos del plasma dentro de la preparacion plaquetaria de aferesis se retiene, obteniendo de esta manera el suplemento de cultivo de plasma de plaquetas, en donde el suplemento de cultivo de plasma de plaquetas comprende la capacidad de inducir la diferenciacion de celulas madre adultas 1x106 en al menos 1x103 celulas progenitoras de cardiomiocitos, adipocitos, osteoblastos, condrocitos, miocitos, o celulas nerviosas dentro de los 60 dias cuando se anade a medio a una concentracion de 5 por ciento, como medios de base con la administracion de suplementos dirigida al tipo de celula deseado.

En otro aspecto, este documento presenta de un cultivo celular aislado que comprende celulas MCGBM103 cultivadas en medio que comprende un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas.

En otro aspecto, este documento presenta de un cultivo celular aislado que comprende celulas MCGBM106 cultivadas en medio que comprende un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas.

En otro aspecto, este documento presenta un cultivo celular aislado que comprende celulas cultivadas en medio que comprende un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas, en donde las celulas crecen en el medio a una velocidad que es mas rapida que la velocidad de celulas control cultivadas en medio de control que comprende 10 por ciento de suero fetal bovino. Las celulas y las celulas de control pueden ser celulas del tumor primario. Las celulas y las celulas de control pueden ser celulas de glioma humanas primarias. Las celulas y las celulas de control pueden ser celulas madre. Las celulas y las celulas de control pueden ser celulas de fibroblastos. El medio y el medio de control pueden ser medio neurobasal o medio DMEM/F12. 1 x 105 de las celulas pueden crecer en el medio a mas de 1 x 106 de las celulas mas rapido que 1 x 105 de las celulas control cultivadas en el medio de control crecen a 1 x 106 de las celulas control. 1 x 105 de las celulas pueden crecer en el medio a mas de 3 x 107 de las celulas mas rapido que 1 x 105 de las celulas control cultivadas en el medio de control crecen a 3 x 107 de las celulas control. Las celulas pueden ser celulas de glioma primarias y 5 x 105 de las celulas pueden crecer en el medio a mas de 1 x 107 de las celulas dentro de los 30 dias. Las celulas pueden ser celulas de glioma primarias y 5 x 105 de las celulas pueden crecer en el medio a mas de 1 x 107 de las celulas dentro de los 60 dlas. Las celulas pueden ser celulas madre, y 1 x 105 de las celulas pueden crecer en el medio a mas de 1 x 107 de las celulas dentro de los 14 dlas. Las celulas pueden ser celulas madre, y 1 x 105 de las celulas pueden crecer en el medio a mas de 1 x 107 de las celulas dentro de los 20 dias. Las celulas madre pueden ser celulas madre mesenquimales. Las celulas madre pueden ser, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. Las celulas pueden crecer en el medio a una tasa que es 1.5 veces mas rapido que la velocidad de las celulas de control cultivadas en el medio de control.

En otro aspecto, este documento presenta un cultivo celular aislado que comprende celulas tumorales cultivadas en medio que comprende un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas, en donde las celulas crecen en el medio de una manera que es geneticamente mas estables que cuando las celulas de control se cultivan en el medio de control comprendiendo 10 por ciento de suero fetal bovino. Las celulas tumorales y las celulas de control pueden ser celulas del tumor primario. Las celulas tumorales y las celulas de control pueden ser celulas de glioma humanas primarias. El medio y el medio de control pueden ser medio neurobasal o medio DMEM/F12. Las celulas tumorales cultivadas en el medio para cuatro duplicaciones pueden exhibir menos que un cambio de cinco por ciento en cariotipo en comparacion a las celulas tumorales cultivadas en el medio para una duplicacion. Las celulas tumorales cultivadas en el medio para cuatro duplicaciones pueden exhibir menos que un cambio de tres por ciento en cariotipo en comparacion a las celulas tumorales cultivadas en el medio para una duplicacion. Las celulas tumorales

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cultivadas en el medio durante diez duplicaciones pueden exhibir menos que un cambio de cinco por ciento en cariotipo en comparacion a las celulas tumorales cultivadas en el medio para una duplicacion.

En otro aspecto, este documento presenta un cultivo celular aislado que comprende celulas madre cultivadas en medio que comprende un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas, en donde las celulas madre crecen en el medio de una manera que es geneticamente mas estables que cuando las celulas madre de control se cultivan en medio de control que comprende 10 por ciento de suero fetal bovino. Las celulas madre y las celulas madre de control pueden ser celulas madre mesenquimales. Las celulas madre y las celulas madre de control pueden ser, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. El medio y el medio de control pueden ser medio neurobasal o medio DMEM/F12. Las celulas madre cultivadas en el medio para cuatro duplicaciones pueden exhibir menos que un cambio de cinco por ciento en cariotipo en comparacion con las celulas madre cultivadas en el medio para una duplicacion. Las celulas madre cultivadas en el medio para cuatro duplicaciones pueden exhibir menos que un cambio tres por ciento en cariotipo en comparacion con las celulas madre cultivadas en el medio para una duplicacion. Las celulas madre cultivadas en el medio durante diez duplicaciones pueden exhibir menos que un cambio de cinco por ciento en cariotipo en comparacion con las celulas madre cultivadas en el medio para una duplicacion.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la obtencion de un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas. El metodo comprende, o consiste esencialmente en, elimination de plaquetas o residuos de plaquetas de una preparation plaquetaria de aferesis de tal manera que al menos algunos del plasma dentro de la preparation plaquetaria de aferesis se retiene, obteniendo con ello el suplemento de cultivo de plasma de plaquetas, en donde el suplemento de cultivo de plasma de plaquetas comprende la capacidad de inducir la proliferation de menos de 1x106, celulas madre mesenquimales, derivadas de tejido adiposo en el paso cinco en al menos 1x108 celulas dentro de 20 dlas cuando se anade a un medio esencial mlnimo a una concentration de 5 por ciento. El suplemento de cultivo de plasma de plaquetas puede comprender la capacidad de inducir la proliferacion de menos de 1x106, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo en el paso cinco en al menos 1x108 celulas dentro de los 15 dlas cuando se anade a un medio esencial mlnimo a una concentracion de 5 por ciento.

En otro aspecto, este documento presenta un metodo para la obtencion de un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas. El metodo comprende, o consiste esencialmente en, la eliminacion de plaquetas o los residuos de plaquetas de una preparacion plaquetaria de aferesis de tal manera que al menos algunos de los plasma dentro de la preparacion plaquetaria de aferesis se retiene, obteniendo de este modo el suplemento de cultivo de plasma de plaquetas, en medio esencial mlnimo con 5 por ciento del suplemento de cultivo de plasma de plaquetas es capaz de establecer, a partir de tejido de la biopsia multiforme glioblastoma humano recien diagnosticado, los cultivos de glioma humano que tienen mas de 3 x 107 celulas dentro de 60 dlas a 37°C con una tasa de exito que es mas de 30 por ciento. La tasa de exito, puede ser mas de 40 por ciento.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto ordinario en el arte al que pertenece esta invention. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden usar para practicar la invencion, se describen a continuation metodos y materiales adecuados.

En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, controlaran. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se exponen en los dibujos adjuntos y la siguiente description. Otras caracterlsticas, objetos y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la description y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Descripcion de los dibujos

La figura 1. Neuroesferas primarias autologas exhibieron cinetica de crecimiento mejorada y caracterlsticas de las celulas madre tumorales. A. Morfologla de una escision del tumor GBM y cultivada de forma independiente medio de celulas madre neurales (NSC) (neuroesferas), HCTL # 3 (principalmente celulas adherentes en este cultivo celular particular; cultivada utilizando 5% de lisado plaquetario) y DMEM + 10% de FBS (monocapa que forma celulas adherentes). Microfotograflas de fase de luz, 10X. B. Cinetica de crecimiento de los tumores GBM cultivada utilizando los tres metodos diferentes. C. Una tabla con la lista de resultados de la tincion de celulas madre neurales y otros marcadores de la superficie celular. Las celulas se cultivaron en cubreobjetos, y la expresion de nestina y SOX2 se analizo mediante inmunofluorescencia indirecta. Todos los otros marcadores fueron medidos por tincion de las celulas para cada uno y analizarlos utilizando citometrla de flujo. +++ Indica >90% de celulas positivas, ++ >50%, + >10%, y - indica <1% de celulas positivas. D. Analisis citogenetico de GBM083007 cultivado en tres cultivos diferentes. 20 celulas en metafase se contaron en cada analisis.

La figura 2. Identification y seguimiento de antlgenos asociados a tumores en cultivos tumorales cerebrales primarios autologos. Se utilizo el analisis de chips de genes para determinar la expresion relativa del antlgeno en tumores primarios (barras negras), cultivos de celulas madre tumorales obtenidos utilizando el protocolo Fine (Lee et

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La figura 3 es un grafico que representa el numero total de celulas GBM viables despues de uno, dos, tres, cuatro, o cinco dlas de ser cultivadas con medios que contienen los componentes indicados.

La figura 4 es un grafico que representa el numero total de celulas GBM viables despues de cinco dlas de ser cultivadas con medios indicados.

La figura 5 es un grafico que representa el numero total de MSC despues de tres, cuatro, o cinco dlas de ser cultivadas con medios que contienen los componentes indicados.

La figura 6 es un grafico que representa el numero de celulas GBM despues de tres, seis, y nueve dlas de ser cultivadas con el Medio Neurobasal (Invitrogen, Grand Island, NY) que contiene los componentes indicados.

La figura 7 es un grafico que representa el porcentaje de celulas GBM CD 133, CD 105, y CD90 positivas despues de ser cultivadas con el medio base neural que contiene los componentes indicados.

La figura 8 es un grafico que representa la cantidad de VEGF (pg/mL) presente en las preparaciones indicadas. MM = plaquetas de aferesis mlnimamente manipuladas de donaciones vencidos que no fueron congeladas (3 bolsas se combinaron). PPP = plasma pobre en plaquetas, que es una fraccion de plaquetas de aferesis mlnimamente manipuladas que se centrifugaron a 3000 g durante cinco minutos y luego se centrifugaron a 10,000 g durante un minuto. FT = fraccion congelacion/descongelacion, que plaquetas de aferesis manipuladas mlnimamente que fueron sometidos a dos ciclos de congelacion/descongelacion. PL = lisado plaquetario preparado como se describe en el Ejemplo 2. MM, PPP, FT, y PL se obtuvieron a partir del mismo material de partida y se almacenaron durante mas de dos meses a 4°C.

La figura 9 demuestra que los niveles de factores de crecimiento (VEGF y PDGF) son consistentes a traves de diferentes lotes de lisados plaquetarios manufacturados. Los niveles de estos factores de crecimiento son significativamente mas altos en las preparaciones de productos finales en comparacion con otros suplementos de factores de crecimiento como suero fetal bovino, suero fetal de ternera, suero AB humano, y otra preparacion de lisado plaquetario disponible comercialmente.

La figura 10 es un grafico que representa las cantidades tlpicas de los factores de crecimiento indicados encontrados en los lisados plaquetarios manufacturados. Once productos de lisado plaquetario manufacturados (Produccion PL) se realizaron mediciones de los factores de crecimiento indicados mediante ELISA. El factor de crecimiento y el eje que utiliza se indican a continuacion las columnas. Tambien se midio la cantidad de los factores de crecimiento indicados presentes dentro de suero fetal bovino (FBS).

La figura 11 es un grafico que representa la cantidad de FGF (pg/mL) medida en los lisados plaquetarios producidos como se describe en este documento (n = 11) y en los lisados plaquetarios disponibles comercialmente (Cryocheck; n = 4).

La figura 12 es un grafico que representa la cantidad de PDGF-BB (ng/mL) medida en los lisados plaquetarios producidos como se describe en este documento (n = 11), suero AB humano (HABS; n = 4), suero fetal bovino (FBS; n = 4), lisados plaquetarios disponibles comercialmente (Cryocheck; n = 4), y plasma fresco sin plaquetas (n = 4).

La figura 13 es un grafico que representa la cantidad de IGF-1 (ng/mL) medida en los lisados plaquetarios producidos como se describe en este documento (n = 11), suero AB humano (HABS; n = 4), suero fetal bovino (FBS; n = 4), lisados plaquetarios disponibles comercialmente (Cryocheck; n = 3), y plasma fresco sin plaquetas (n = 4).

La figura 14 es un grafico que representa la cantidad de TGF-p (ng/mL) medida en los lisados plaquetarios producidos como se describe en este documento (n = 11), suero AB humano (HABS; n = 4), suero fetal bovino (FBS; n = 4), lisados plaquetarios disponibles comercialmente (Cryocheck; n = 4), y plasma fresco sin plaquetas (n = 4).

La figura 15 es un grafico que representa la cantidad de protelna total (mg/mL) medida en lisados plaquetarios producidos como se describe en este documento (n = 11), suero AB humano (HABS; n = 4), suero fetal bovino (FBS; n = 4), lisados plaquetarios disponibles comercialmente (Cryocheck PL; n = 3), y plasma fresco sin plaquetas (n = 3).

La figura 16 contiene un grafico que representa el potencial de proliferacion de las celulas y presencia de PDGF en PL fraccionada utilizando filtros de corte de peso molecular. La proliferacion celular calculo el numero de celulas despues de 800 celulas/pozo se sembraron y se cultivaron durante cuatro dlas que contienen el componente indicado y un grafico que representa la cantidad de PDGF-BB (ng/mL) medida mediante ELISA en el componente indicado. HCTL PL = 5% de Pl utilizando MEM avanzado como medio base.

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La figura 17 contiene un grafico (arriba) que representa la A280 para las fracciones indicadas de PL aisladas por fraccionamiento tamano y una fotografla (abajo) de un gel reductor tenido con plata que contiene las fracciones indicadas.

La figura 18 es una fotografla electronica de barrido de los complejos presentes con un lisado plaquetario producido como se describe en el Ejemplo 2.

La figura 19 es un grafico que representa la cantidad de la citoquina o factor de crecimiento indicado presente dentro de lisados plaquetarios.

La figura 20 contiene cuatro graficos que comparan los niveles de PDGF-BB, FGF, TGF-p1, e IGF-1 presente con lisados plaquetarios producidos como se describe en el Ejemplo 2 (produccion HCTL) a los niveles de PDGF-BB, FGF, TGF-P1 e IGF-1 se informo en las referencias indicadas o de suero bovino. Lange et al. es la referencia Lange et al. (Cellular Therapy and Transplantation, 1(2) December (2008)); Weibrich et al. es la referencia Weibrich et al. (Craniomaxillofac Surg., 30: 97-102 (2002)); y Doucet et al. es la Doucet et al. referencia (Fisiologla Celular J., 205: 228-236 (2005)).

La figura 21 es un grafico que representa la proliferacion relativa (absorbancia) para las MSC cultivadas como se indica.

La figura 22 es un grafico que representa el recuento de celulas para las celulas madre adultas cultivadas para el numero indicado de dlas en un medio (medio esencial alfa mlnimo (a-MEM)) suplementado con 5 por ciento de un lisado plaquetario producido como se describe en el Ejemplo 2 o medio suplementado con 10 por ciento de suero fetal de ternera.

La figura 23 es un grafico que representa las duplicaciones de la poblacion para las MSC cultivadas en el medio indicado.

Figuras 24A es una tabla con los resultados del cultivo celular tumorales primarias con medios indicados, y las figuras 24B, 24C, 24D, 24E y contienen datos relativos a los cultivos celulares GBM103, GBM106, GBM110, y GBM111, respectivamente.

La figura 25 contiene cuatro graficos que representan el numero de celulas en el dla indicado para las celulas tumorales primarias cultivadas en PL (medio AlM-V suplementado con 5% de lisado plaquetario como por ejemplo 2), medio NSC (medio Neurobasal-A con los suplementos de N2 y B27 y EGF y FGF), o dMeM 10% de FbS.

La figura 26 es un grafico que representa el porcentaje positivo de celulas dendrlticas para el marcador indicado de monocitos CD14+ cultivados ex-vivo con 1% de HABS en medio X-Vivo 15 (XV-HABS), 1% de medio X-Vivo 15 que contiene lisado plaquetario (XV-PL), o medio libre de suero CellGro (sin suplementos). Todas las indicaciones contenlan 2800 Ul de GM-CSF y 1000 Ul de IL-4 para todo el curso del cultivo (seis dlas). Todas las condiciones tenlan TNF-a y se adiciona PGE2 en el tercer dla, y las celulas fueron fenotipadas en el dla seis. Para XV-PL (3-6), el cultivo se incubo en HABS para los tres primeros dlas y PL para los dos ultimos.

La figura 27 es un grafico que representa las MSC totales despues de cinco dlas de cultivo con las composiciones indicadas.

La figura 28. Efecto de las condiciones de cultivo en la adhesion celular. Tumores (en filas) eran flsica y enzimaticamente digeridas y se incubaron en tres condiciones de cultivo (NSC, celulas madre neural; PL, lisado plaquetario, o FBS, suero fetal bovino). Las celulas fueron fotografiadas y descripciones de la morfologla enumeradas.

La figura 29. PL promueve un rapido crecimiento de cultivos primarios de GBM. Ejemplo de cinetica de crecimiento de un tumor primario cultivado en cada suplemento del medio (panel izquierdo), y el total de celulas obtenidas despues de 20-30 dlas de cultivo para multiples aislados tumorales (panel derecho). Pl fue superior en el numero de celulas cultivadas independientes del tumor individual (p = 0.05; n = 8).

La figura 30 es un grafico que representa el crecimiento celular observado con la cantidad indicada de lisado plaquetario (PL).

Figura 31. Presencia de PDGF y FGF en PL despues de 48 dlas de incubacion a diferentes temperaturas. Muestras de PL se incubaron a las temperaturas identificadas para cuatro lotes distintos de PL. Los factores de crecimiento se midieron por ELISA. Cada punto representa la media de tres muestras de ese lote incubadas a esa temperatura. Los datos representados son las medias de cada uno de estos lotes. Las barras son la media de cuatro lotes, con los cambios representados por asterisco (p<0.05 para muestras de pares).

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La figura 32 es un grafico que representa la cantidad de PDFG y FGF en muestras de PL incubadas a las temperaturas indicadas.

La figura 33 es un grafico que representa la cantidad de PDFG en las muestras de PL incubadas a las temperaturas indicadas.

La figura 34 es un grafico que representa la velocidad de desintegracion de PDFG.

La figura 35 contiene los datos cariotipo para dos aislados de celulas estromales mesenquimales cultivadas en ya sea 10% de FBS o 5% de PL.

Description detallada

La invention se define por las reivindicaciones adjuntas.

Este documento proporciona metodos y materiales relacionados con las composiciones que contienen los contenidos plaquetarios (por ejemplo, lisados plaquetarios y/o sobrenadantes filtrados o desde un medio que contiene plaquetas). Por ejemplo, este documento se refiere a metodos y materiales para la fabrication y uso de composiciones que tienen contenidos plaquetarios. Cualquier fuente apropiada de plaquetas se puede utilizar para hacer una composition que tiene contenidos plaquetarios. Por ejemplo, plaquetas de aferesis y plaquetas derivadas de la donation de sangre normal se pueden utilizar como una fuente de plaquetas para la fabricacion de una composicion de lisado plaquetario, un sobrenadante o filtrado de un medio que contiene plaquetas, o un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas.

En una realization, una composicion que tiene contenidos plaquetarios (por ejemplo, un lisado plaquetario) se puede obtener de la siguiente manera. Una vez obtenido, los contenidos plaquetarios pueden ser liberados utilizando cualquier metodo apropiado, incluyendo, sin limitation, un unico ciclo de congelacion/descongelacion, ciclos repetidos de congelacion/descongelacion (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o mas), lisis con detergente, activation con trombina, colageno, tromboxano A2, ADP u otros factores, y manipulation de fuerza ionica. En algunos casos, dos ciclos de congelacion/descongelacion se pueden utilizar para obtener las plaquetas lisadas. Una vez lisadas, la preparation plaquetaria lisada se puede centrifugar para obtener un sobrenadante. En general, la fuerza de centrifugation puede ser entre 2000 x g y 5000 x g, y la duration puede ser entre 10 minutos y 60 minutos. Por ejemplo, una preparacion plaquetaria lisada se puede centrifugar a aproximadamente 3000 x g durante aproximadamente 30 minutos. Una vez que se recogio el sobrenadante, este se puede filtrar. Por ejemplo, el sobrenadante se puede filtrar a traves de un filtro de 0.45 pm, un filtro de 0.2 pm, o un filtro de 0.45 pm, seguido de un filtro de 0.2 pm. El filtrado resultante se puede utilizar como una composicion de lisado plaquetario sin procesamiento adicional o se puede combinar con heparina para formar una composicion de lisado plaquetario.

Un lisado plaquetario proporcionado en este documento se puede preparar sin el lavado de las plaquetas antes de la lisis de estas. En tales casos, el lisado plaquetario puede incluir plasma y componentes de plasma. Por ejemplo, un lisado plaquetario proporcionado en este documento puede incluir albumina y/o trombina a aproximadamente concentraciones fisiologicas. En algunos casos, un lisado plaquetario proporcionado en este documento puede incluir contenidos plaquetarios preparados a partir de las plaquetas lisadas en presencia de plasma o de una composicion similar al plasma.

En otra realizacion, una composicion que tiene contenidos plaquetarios (por ejemplo, un sobrenadante o filtrado de medio que contiene plaquetas) se puede obtener de la siguiente manera. Las plaquetas se pueden mantener entre 2°C y 42°C (por ejemplo, entre 2°C y 40°C, entre 2°C y 38°C, entre 2°C y 36°C, entre 2°C y 30°C, entre 5°C y 36°C, entre 10°C y 36°C, entre 15°C y 36°C, entre 20°C y 30°C) durante un perlodo de tiempo (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, o mas dlas) en presencia de plasma sin realizar un paso activo disenado para lisar las plaquetas. Por ejemplo, una preparacion plaquetaria (por ejemplo, preparacion plaquetaria vencida) obtenida a partir de una tecnica de aferesis se puede utilizar sin necesidad de retirar el plasma. Una vez obtenida, la preparacion plaquetaria se puede tratar para eliminar plaquetas, residuos de plaquetas, o fantasmas de plaquetas, mientras que la obtencion del medio resultante que incluye contenidos plaquetarios y componentes del plasma. Por ejemplo, este medio resultante puede obtenerse por centrifugacion y/o filtration. Una vez obtenido, el medio resultante se puede almacenar o utilizar como una composicion que tiene contenidos plaquetarios o un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas como se describe en este documento.

Las composiciones que tienen contenidos plaquetarios (por ejemplo, composiciones de lisado plaquetario) proporcionadas en este documento se pueden formular con cualquier medio apropiado para producir un medio de cultivo que tiene propiedades mejoradas. Ejemplos de medio que puede ser suplementado con una composicion proporcionada en este documento incluyen, sin limitacion, DMEM, RPMI, AIMV, X-VIVO15, y otros medios libres de suero o suero que requiere definidos. Cualquier cantidad apropiada de una composicion que tiene contenidos plaquetarios proporcionadas en este documento se puede adicionar a un medio. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas por ciento (por ejemplo, vol/vol) de un medio puede ser una composicion de lisado plaquetario o un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas proporcionada en este documento. Tales medios suplementados se

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pueden utilizar para promover un mayor crecimiento de celulas (por ejemplo, celulas progenitoras adultas normales, celulas madre, celulas precursoras, celulas de fibroblastos, y celulas mesenquimales del estroma, para diferenciar celulas progenitoras, celulas madre, y celulas precursoras en subtipos funcionales de manera eficiente, para promover un mayor crecimiento de las celulas madre tumorales en cultivos de tumor primario, para establecer llneas de celulas tumorales, o para generar cultivos de celulas primarias (por ejemplo, llneas de celulas de tumor) de manera eficiente. Como se describe en este documento, las composiciones que contienen los contenidos plaquetarios (por ejemplo, composiciones de lisado plaquetario) proporcionados en este documento se pueden utilizar para obtener la cinetica de crecimiento superior cuando el cultivo celular (por ejemplo, celulas progenitoras y celulas madre tumorales) en comparacion con los cultivos utilizando la administracion de suplementos de suero humano, suero fetal bovino, o medio libre de suero con suplementos de factores de crecimiento recombinante.

Las composiciones que tienen contenidos plaquetarios (por ejemplo, composiciones de lisado plaquetario) proporcionados en este documento pueden ser utilizados para suplementar los medios utilizados para cultivar celulas de cualquier especie, incluyendo, sin limitacion, seres humanos, monos, caballos, perros, gatos, ratas o ratones.

Cualquier metodo apropiado se puede utilizar para obtener celulas diferenciadas a partir de celulas madre (por ejemplo, celulas madre mesenquimales). Por ejemplo, las celulas diferenciadas se pueden derivar de las celulas madre mesenquimales mediante la incubacion de las celulas madre mesenquimales con una composicion (por ejemplo, medios de cultivo) que contienen uno o mas factores, junto con una composicion que tiene contenidos plaquetarios (por ejemplo, una composicion de lisado plaquetario) proporcionada en este documento. Los factores pueden ser cualquier tipo de factores, tales como polipeptidos, esteroides, hormonas, y moleculas pequenas. Ejemplos de tales factores pueden incluir, sin limitacion, dexametasona, EGF, FGF y BMP4. Las celulas madre se pueden incubar con tales composiciones durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 dlas. En algunos casos, una composicion proporcionada en este documento y se utiliza para promover el crecimiento o diferenciacion celular puede ser sustituidos cada dla o cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas dlas.

Una vez que las celulas madre (por ejemplo, celulas madre mesenquimales) han sido incubada con una composicion proporcionada en este documento o de otra manera tratadas con factores de diferenciacion, el estado de diferenciacion se puede supervisar para determinar si las celulas madre diferenciadas en celulas diferenciadas que tienen un deseado fenotipo. Por ejemplo, una muestra de celulas se puede recolectar y evaluar mediante tecnicas tales como transferencia Western, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), inmunotincion, microscopla confocal laser, y reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion (RT-PCR) (por ejemplo, RT-PCR cuantitativa).

Este documento tambien proporciona cultivos de celulas aisladas. Por ejemplo, este documento proporciona cultivos de celulas del tumor primario aislados, tales como un cultivo celular GBM106 o cualquier otro cultivo de celulas tumorales identificado en la Figura 24A. Se observa que los aislados de cultivos de celulas de tumores primarios identificados en la Figura 24A se pueden designar con un prefijo "MC" cuando se ha establecido el uso de una composicion que tiene contenidos plaquetarios proporcionada en este documento. Por ejemplo, el cultivo celular GBM106 obtenido utilizando un lisado plaquetario proporcionado en este documento puede ser designado como MCGBM106. Del mismo modo, el cultivo celular GBM110 obtenido utilizando un lisado plaquetario proporcionado en este documento puede ser designado como MCGBM110, y as! sucesivamente. Un cultivo de celulas tumorales primario aislado proporcionado en este documento se puede obtener de un paciente humano y se cultiva en presencia de medio suplementado con una composicion que tiene contenidos plaquetarios. Por ejemplo, un medio que contiene entre 1 por ciento y 50 por ciento (por ejemplo, entre 1 por ciento y 45 por ciento, entre 1 por ciento y 35 por ciento, entre 1 por ciento y 25 por ciento, entre 1 por ciento y 15 por ciento, entre 1 por ciento y 10 por ciento, entre 1 por ciento y 5 por ciento, entre 5 por ciento y 50 por ciento, entre 10 por ciento y 50 por ciento, entre 20 por ciento y 50 por ciento, entre 3 por ciento y 10 por ciento, o entre 3 por ciento y 7 por ciento) de un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas proporcionado en este documento se puede utilizar para cultivar celulas de glioma primarias humanas.

Las celulas (por ejemplo, celulas tumorales primarias) cultivadas como se describe en este documento pueden exhibir una cinetica de crecimiento rapido (Figuras 1 y 29), una frecuencia mas alta de establecimiento de llnea celular (Figuras 24A-E), y genetica estable (Figura 1). Con referencia a la figura 1, se observa que el cariotipo de las celulas cultivadas con el HCTL # 3 y el medio NSC pueden ser muy similares, mientras que el cariotipo de las celulas cultivadas con FBS puede ser diferente. Esto se hizo a partir de una sola muestra de tumor. Por lo tanto, las celulas cultivadas de FBS evolucionaron lejos de las otras dos llneas celulares. Las otras dos llneas celulares son muy similares lo que sugiere que estas dos reflejan el tumor progenitor.

En algunos casos, las celulas tumorales primarias cultivadas como se describe en este documento pueden presentar un tiempo de duplicacion constante (Figura 29). Un tiempo de duplicacion constante puede indicar que no hay tiempo de retraso importante en el establecimiento del cultivo. Por lo tanto, no hay otros factores necesarios que requieren reordenamientos geneticos/o aditivos para hacer que los cultivos se desarrollen.

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Las celulas tumorales primarias cultivadas como se describe en este documento tambien pueden exhibir la presencia de celulas con fenotipos progenitores. Un ejemplo de expresion de SOX2 y CD 133 en un cultivo de tumor primario se proporciona en la Figura 1. SOX2 y CD 133 son marcadores de celulas progenitoras asociadas con celulas progenitoras tumorales (celulas madre tumorales). Las celulas tumorales primarias cultivadas como se describe en este documento pueden ser GMP compatible desde el suplemento (por ejemplo, una composicion que tiene contenidos plaquetarios, tales como un suplemento de cultivo de plasma de plaquetas) pueden ser compatibles con GMP.

En algunos casos, las celulas tumorales primarias cultivadas como se describe en este documento pueden ser biologicamente relevantes en que muchos tumores se asocian con la formacion de coagulos de sangre. Aunque no se esta limitado a ningun modo de accion particular, un coagulo de sangre puede actuar como una matriz in vivo para la recoleccion de los sobrenadantes de plaquetas. Por lo tanto, una composicion que tiene contenidos plaquetarios proporcionada en este documento puede imitar la biologla normal del tumor.

La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Fuente de plaquetas

Los ejemplos no pertenecientes a la invencion reivindicada son solo para fines ilustrativos.

Todos los donantes que donan plaquetas de aferesis cumplieron con los criterios de elegibilidad segun lo definido por AABB Standards for Blood Banks and Transfusion Service and the Food and Drug Administration. Los donantes fueron seleccionados utilizando el Uniform Donor History Questionnaire (UDQ) y los materiales educativos que se acompanan. Este cuestionario es un documento de seleccion creado por una coalicion de reglamentacion, acreditacion y las instituciones de recoleccion de sangre que consisten en the Food and Drug Administration, Centers for Disease Control and Prevention, Armed Services Blood Program, National Heart Lung and Blood Institute, American Blood Resources Association, AABB, American Red Cross, and America's Blood Centers. Information relativa al UDQ se puede encontrar en la World Wide Web en "fda.gov/cber/dhq/dhq.htm."

Todas las donaciones de plaquetas aferesis fueron probadas con las siguientes pruebas de enfermedades infecciosas: (1) prueba serologica para la slfilis; (2) prueba de anticuerpos contra el virus HCV ElA-hepatitis C, (3) prueba de acido nucleico del virus HCV NAT-hepatitis C, (4) prueba de antlgeno de superficie HBsAg-hepatitis B, (6) anticuerpo del nucleo Anti-HBc-hepatitis B, (7) prueba de anticuerpos Virus ^ de Inmunodeficiencia humana-EIA VIH-1^ - con capacidad para detectar VIH 1 subgrupo O; (8) prueba de acido nucleico Virus de Inmunodeficiencia NAT- VIH Humano, (9) Tipos I/II virus T linfotropico HTLV I/II EIA-humano, (10) prueba de acido nucleico Virus del Nilo Occidental WNV NAT, y (8) Anti - T. cruzi, (prueba serologica para enfermedad de Chagas) utilizando procedimientos autorizados por la FDA.

Ademas de las pruebas anteriores, todos los productos de aferesis de plaquetas tambien fueron analizados para contamination bacteriana. Veinticuatro horas despues de la recoleccion, se volvio a suspender el producto, y se recolectaron 8 mL de la muestra. Cuatro mL de esta muestra se inocularon en una botella de cultivo anaerobico, y 4 mL se inocularon en una botella aerobica. Estas botellas se colocaron despues en un sistema BacT/ALERT (bioMerieux, Durham, NC, Estados Unidos) en un plazo de tres horas de la inoculation y se monitorearon para la generation de CO2 durante 24 horas. Si no se detecto despues de 24 horas la production de CO2, los productos de plaquetas fueron liberados y puestos a disposition para la transfusion. Se continua motorizando las botellas de cultivo durante el tiempo de conservation restante del producto de plaquetas (un total de cinco dlas, tres dlas adicionales despues de la liberacion).

Los productos de plaquetas que se liberan para la fabrication de medios de cultivo se recolectaron a partir de donantes que cumplan los criterios de donation, eran pruebas negativas para las enfermedades infecciosas mencionadas anteriormente, y no mostraban evidencia de crecimiento bacteriano por su fecha de caducidad. Productos procedentes de donantes que no cumpllan criterios de los donantes, que mostraron pruebas de enfermedades infecciosas positivas, o que los cultivos producidos positivos para las bacterias fueron considerados residuos biologicos peligrosos. Estos productos fueron puestos en cuarentena y destruidos. Estos no fueron puestos en libertad para la fabricacion de un medio de cultivo de lisado plaquetario. Las pruebas y directrices de FDA para la liberation pueden cambiar. Sin embargo, las plaquetas utilizadas para estos fines cumplieron las pruebas y directrices de FDA actuales en el momento de la produccion.

Ejemplo 2 - Preparacion de lisado plaquetario a partir de plaquetas de aferesis

Se obtuvieron plaquetas de aferesis como se describe en el Ejemplo 1. Las plaquetas de aferesis utilizadas fueron de no mas de cuatro dlas de caducidad. Un solo lote de lisado plaquetario consistio en diez unidades de aferesis de plaquetas individuales, y un lote fue utilizado a la vez para crear un producto de lisado plaquetario. El procesamiento

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de los reactivos de grado cllnico se puede llevar a cabo en un alojamiento de sala limpia. Diez unidades de plaquetas de aferesis individuales fueron congeladas a -70°C o menos. Despues de haber sido congeladas durante al menos 24 horas, las unidades se retiraron del congelador y se dejan descongelar. Las unidades se descongelaron a temperatura ambiente o a temperaturas de refrigeracion. Despues de que la descongelacion se habla completado, cada unidad se mezclo masajeando la bolsa. Cada bolsa de plaquetas descongeladas se coloca plana (para minimizar la rotura de la tuberla) en un congelador superfrlo (-70°C o menos) para una segunda congelacion. Despues de que las unidades de plaquetas de aferesis se congelaron durante al menos 24 horas para una segunda congelacion, se retiraron del congelador y se dejan descongelar. Despues de la segunda descongelacion, el producto de plaquetas se transfirio asepticamente a tubos conicos de centrlfuga de 250 mL. Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 3000 xg durante 30 minutos a temperatura ambiente utilizando un Centrlfuga Benchtop Centrifuge Sorvall Legend T. Los sobrenadantes resultantes fueron transferidos a unidades de filtro de 0.45 micras (Pall Stericup, Catalog Number SCHV U05 RE; East Hills, NY o Nalgene Filter System, Catalog Number 167-0045; Rochester, nY) que fueron pre-equipado con uno o mas pre-filtros (filtros de microfibra de vidrio GF/B o GF/D utilizados de manera intercambiable; Whatman ®, Florham Park, NJ). La unidad de filtro se conecto a una fuente de vaclo y se dejo filtrar el producto. Si el producto no filtra por completo, el producto no filtrado se transfirio a otra unidad de filtro con un pre-filtro. Los filtrados de todas las unidades de filtro de 0.45 micras se agruparon y se filtraron a traves de una unidad de filtro de 0.2 micras (Pall Stericup, Catalog Number SCHV U05 RE; East Hills, NY o Nalgene Filter System, Catalog Number 567-0020; Rochester, nY) que fue pre-equipada con uno o mas pre-filtros (filtros de microfibra de vidrio GF/B o GF/D utilizados de manera intercambiable; Whatman®, Florham Park, NJ). La unidad de filtro se conecto a una fuente de vaclo y se dejo filtrar el producto. Si el producto no filtra por completo, el producto no filtrado se transfirio a una segunda unidad de filtro, y se repitio el proceso segun sea necesario. Los filtrados de 0.2 micras se combinaron en botellas receptoras.

Un conjunto de transferencia de plasma se encuentra conectado a una jeringa de 60 mL, y el conjunto de transferencia, se agrega en una bolsa de sangre de 2L. Utilizando la jeringa como un embudo, los lisados filtrados de las unidades de plaquetas de aferesis se combinaron en la bolsa de 2L. Los contenidos se mezclaron bien. Se adiciono heparina (1000 U/mL) a los lisados plaquetarios filtrados para obtener una concentracion final de dos U/mL.

Los lisados se dividieron en partes allcuotas. Los lisados se almacenaron congelados a < 20°C o inferior.

Una de las allcuotas que contiene el lisado plaquetario se utilizo para llevar a cabo las siguientes pruebas, para determinar si liberar o no la preparacion de lisado plaquetario para su uso:

Cultivo aerobio. Un mL de lisado plaquetario se transfirio a una botella de cultivo de sangre Peds Bactec (Becton, Dickinson and Company; Sparks, MD) que se utilizo para probar la esterilidad.

Cultivo anaerobico. Ocho mL de lisado plaquetario se transfirieron a una botella Bactec Lytic/10 Anaerobic/F (Becton, Dickinson and Company; Sparks, MD). En pocas palabras, botellas tanto aerobicas como anaerobicas son cargados en el instrumento BACTEC 9240 (Becton, Dickinson and Company; Sparks, MD) y controlados cada cuatro horas durante 14 dlas. Despues de 14 dlas, se informan a cabo cultivos negativos como "No hay crecimiento a los 14 dlas", los cultivos positivos se subcultivan y se identifican los aislados.

Ensayo de endotoxina. Un mL de lisado plaquetario se transfirio a un tubo esteril libre de endotoxina que se utilizo para llevar a cabo un ensayo de endotoxina. En resumen, una dilucion 1:50 de lisado plaquetario con lisado de Limulus Amebocyte (LAL). Reactivo de agua se analizo en el sistema Endosafe Portable Test (PTS; Charles River, Wilmington, MA). El PTS Endosafe utiliza metodologla cinetica cromogenica LAL para medir la intensidad del color directamente relacionada con la concentracion de endotoxina en una muestra. Cada cartucho desechable contiene cantidades precisas de reactivo LAL con licencia, sustrato cromogenico, y endotoxina estandar control. El resultado obtenido de cada lote de lisado plaquetario debe ser <0.500 unidades de endotoxina (EU)/mL.

Cinetica de celulas. Se preparo un lote (>150 mL) de medio de lisado plaquetario al 5% (PL al 5%) que contienen- Advanced MEM (120 mL), GlutaMAX (1.2 mL), heparina (~0.24mL), y 5% de lisado plaquetario (6.4 mL). Un vial de celulas madre mesenquimales previamente congeladas (celulas de referencia) se descongelaron en un bano de agua a 37°C. Una vez descongelado, las celulas se colocaron en un tubo esteril de 50 mL con aproximadamente 5 mL del medio de PL al 5 %. El tubo se centrifugo a 240 x g durante 5 minutos. Se retiro el sobrenadante del tubo, y se adiciono un mL del medio de PL al 5 % al pellet celular. Se realizo un recuento de celulas. Las celulas descongeladas se colocaron en una a dos matraces de 175 cm2 con 50 mL de PL5% de manera que cada matraz contenla 1.75x105-4.38 x105 de las celulas descongeladas. Los matraces se incubaron a 37°C en una incubadora de CO2 al 5 por ciento. Las celulas se pasaron utilizando TrypLE™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) despues de los matraces fueron confluentes. Se combinaron las celulas, y se realiza un recuento de celulas. Se realizo un calculo de duplicacion de la poblacion.

Citometrla de flujo. Las celulas del ensayo de cinetica celular se evaluaron utilizando el siguiente panel de citometrla de flujo:

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Tubo #

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IgG1 IGg1

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IgG2 IgG2

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CD90 CD73

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CD105 HLA-DR

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CD44 HLA-ABC

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CD45 CD14

Lisados plaquetarios que eran esteriles, libres de endotoxinas, crecieron MSC con el perfil de expresion de CD105, CD90, CD73, HLA-ABC positivo y negativo para CD14, CD45 y HLA-DR fueron liberados para uso cllnico y se les asigno una fecha de caducidad de dos anos a partir de la produccion.

Ejemplo 3 - Cultivo celular con lisados plaquetarios

Las caracterlsticas fenotlpicas de las celulas GBM cultivadas con medios que contenlan lisados plaquetarios se compararon con los de las celulas GBM cultivadas utilizando medios NSC (medios Neurobasal (Invitrogen, Grand Island NY); EGF recombinante y FGF (R & D Systems, Minneapolis, MN), suplementos de N2 y B27 (Invitrogen, Grand Island NY), glutamina y penicilina/estreptomicina) o DMEM que contenla FBS al 10%. El medio que contiene lisado plaquetario (HCTL#3) consistla de medio Neurobasal suplementado con 5% de lisado plaquetario, glutamina y penicilina/estreptomicina. Las celulas cultivadas en medios NSC forman neuroesferas clasicos enriquecidas en celulas madre tumorales (Figura 1A). Las celulas cultivadas en DMEM 10% de FBS se convirtieron en adherentes y por lo general se diferenciaron (Figura 1A). Las celulas cultivadas en HCTL# 3 resulto en una poblacion mixta de neuroesferas flotantes libres y neuroesferas adherentes con cinetica de crecimiento superior (Figura 1A y 1B). Las celulas cultivadas en HCTL#3 tambien mostraron muchos aspectos de las celulas madre tumorales neuronales y fueron positivos para CD133, nestina, y SOX2 (Figura 1C). Ademas, las celulas cultivadas en HCTL#3 fueron citogeneticamente anormales como ve a menudo en los tumores de GBM primarios (Figura 1D; Kitange et al., Curr. Opin. Oncol., 15(3):197-203 (2003)).

Resultados adicionales del cultivo de celulas tumorales primarias se presentan en las Figuras 24A-E y 25. Estos resultados ademas demuestran que los lisados plaquetarios proporcionados en este documento pueden realizar mejor que de suero fetal de ternera y un medio suplementado definido (NSC) para el cultivo de celulas tumorales primario (por ejemplo, gliomas) (Figuras 24A-E). Estos resultados tambien demuestran que medios que contiene lisados plaquetarios pueden desarrollar tumores en menos tiempo (Figura 25).

Las celulas tumorales cultivadas en medios suplementados con lisado plaquetario fabricado se enriquecieron para antlgenos tumorales primarios asociados a GBM que eran similares, si no superiores, a las celulas cultivadas en medios NSC (Figura 2). Como tal, medios suplementados con PL aceptan la generation de cultivos de celulas primarias de pacientes de GBM que mostraron una cinetica de crecimiento superior, reordenamientos geneticos tumorales caracterlsticos, poblaciones de celulas madre tumorales neurales, y enriquecimiento en ciertos antlgenos tumorales. El uso de lisados de cultivos tumorales autologos como antlgeno para la inmunoterapia DC ofrece la ventaja de apuntar los antlgenos tumorales multiples reflectantes de perfil antlgeno del paciente, eliminando las celulas contaminantes, y disponibilidad de antlgeno suficiente para multiples inmunizaciones. Las investigaciones preliminares en pacientes con GBM demostro la capacidad constante para generar cultivos primarios de tumores de pequenas porciones de tumor resecado.

Las celulas cultivadas a partir de un tumor cerebral primario se descongelaron y se sembraron (3.5 x 104 celulas/pozo) en uno de los siguientes medios de cultivo: medios Neurobasal (Invitrogen, Grand Island, NY), mas el 5% lisado plaquetario totalmente fabricado (lisado plaquetario), medio neurobasal al 5 por ciento de lisado plaquetario de un solo ciclo de congelacion/descongelacion sin transformar (Min. manipulado), medio neurobasal 5 por ciento de suero humano AB (HABS, Sigma, St. Louis, MO), medios Neurobasal solos, Neurobasal medio que contiene 5 por ciento plasma rico en plaquetas (PRP), medio Neurobasal que contiene 5 por ciento de plasma rico en plaquetas que se sometio a ultrasonidos (PRP-sonicada), y medio Neurobasal que contiene 5 por ciento de un lisado plaquetario disponible comercialmente (Cat. No. PNP-10, Lot No. PL14, Precision Biologic, Dartmouth, Nova Scotia). Igual numero de celulas se sembraron por duplicado para cada condition. Las celulas se cultivaron durante cinco dlas, y el numero total de celulas viables se conto cada dla (Figura 3). Los resultados de dla 5 se presentan en la Figura 4. Estos resultados demuestran que, en este experimento, las celulas tumorales crecieron mejor en lisado plaquetario totalmente fabricado.

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MSC se descongelaron y cultivaron en Advanced MEM (Invitrogen, Grand Island, NY) mas 5% de HCTL lisado plaquetario fabricado hasta confluencia. A continuacion, las celulas se pasaron y se dividieron en Avanced MEM con los siguientes suplementos: 5 por ciento (vol/vol) de un lisado plaquetario preparado como se describe en el Ejemplo 2, plasma pobre en plaquetas (plasma pobre en Plt), plaquetas enteras (plts enteros) o plaquetas expuestas a dos ciclos de congelacion/descongelacion sin procedimiento adicional (congelacion/descongelacion plts.). El lisado plaquetario al 5 por ciento fue utilizado como llnea de base con los otros que se ajustan para proporcionar una concentracion de protelna equivalente como el 5 por ciento de lisado plaquetario. Las celulas se dejaron equilibrar en sus medios especlficos durante unos dlas antes de comenzar el experimento. Una vez preparado, las MSC se sembraron a 2.5 x 104 celulas/placa en matraces T25 con su medio apropiado. El numero total de celulas en cada uno de tres matraces para cada condicion se conto en los dlas tres, cuatro y cinco (Figura 5). Estos resultados demuestran que las MSC crecieron mejor en HCTL lisado completamente fabricado.

Una llnea de celulas de un tumor primario se descongelo y se sembro en placas de manera similar al experimento de crecimiento de MSC. Las celulas acondicionadas se sembraron a 8 x 104 celulas/placa en Medio Neurobasal (Grand Island, NY) suplementado con 5 por ciento (vol/vol) de un lisado plaquetario (PL) preparado como se describe en el Ejemplo 2, plasma pobre en plaquetas (plasma pobre plt o PpP), plaquetas enteras (plts enteras o WP) o plaquetas expuestas a dos ciclos de congelacion/descongelacion sin procedimiento adicional (congelacion/descongelacion plts o FT). El lisado plaquetario al 5 por ciento fue utilizado como llnea de base con los otros que se ajustan para proporcionar una concentracion de protelna equivalente como el lisado plaquetario al 5 por ciento. Las celulas se dejaron equilibrar en sus medios especlficos durante unos dlas antes de comenzar el experimento. El numero total de celulas en cada uno de tres matraces para cada condicion se conto en los dlas tres, seis y nueve (Figura 6). Estos resultados demuestran que las celulas crecieron mejor en lisado plaquetario totalmente fabricado mas de 6 dlas.

En el dla 5, las celulas de cada matraz para cada tipo de condicion particular se agruparon y se analizaron por FACS para CD133 (se evaluaron dos tubos), CD105 (un tubo), y CD90 (un tubo). Se determino el porcentaje de celulas positivas para cada marcador (Figura 7). Estos resultados demuestran que las celulas cultivadas en lisado plaquetario totalmente fabricado fueron enriquecidas para celulas CD133+. La expresion CD133 se ha documentado como un marcador para las celulas madre iniciadoras de glioma (Singh et al., Cancer Res., Sept 15;63(18):5821-8 (2003)).

En otro experimento, se determino la cantidad de VEGF (pg/mL) presente en diversas preparaciones plaquetarias (Figura 8). Las preparaciones plaquetarias incluyen (1) plaquetas de aferesis mlnimamente manipuladas (MM) de donaciones caducadas que no fueron congeladas (3 bolsas se combinaron), (2) plasma pobre en plaquetas (PPP), que fue una fraccion de plaquetas de aferesis mlnimamente manipuladas que se centrifugaron a 3000 g durante cinco minutos y luego se centrifuga a 10,000 g durante un minuto, (3) una fraccion congelacion/descongelacion (FT), que contenla las plaquetas de aferesis mlnimamente manipuladas que fueron sometidas a dos ciclos de congelacion/descongelacion, (4) lisado plaquetario ( PL) preparado como se describe en el Ejemplo 2. Se obtuvieron las preparaciones de MM, PPP, FT, y PL del mismo material de partida y se almacenaron durante mas de dos meses a 4°C. La preparation de PL exhibio el mayor nivel de VEGF (Figura 8). Estos resultados demuestran que nuestro proceso de fabrication aumenta la concentracion de este factor de crecimiento y es mas alta en la etapa final de fabricacion.

Los experimentos posteriores demuestran que los niveles de VEGF y PDGF son consistentes a traves de varios lotes diferentes de lisado plaquetarios fabricados en el HCTL (14244, 14453, 14569, y 14593) (Figura 9). Ademas, estos factores de crecimiento son significativamente mayores en una base por volumen que el de otros suplementos de cultivo, incluyendo suero fetal bovino, suero fetal de ternera, suero AB humano, y otra preparacion de lisado plaquetario disponible comercialmente (Cat. No. PNP-10, Lot No. PL14, Precision Biologic, Dartmouth, Nova Scotia).

En otro experimento, seis aislados de celulas estromales mesenquimales se dividieron y se cultivaron utilizando medio suplementado con 10% de FBS o 5% de PL. Despues de 12 pasajes, las celulas se sometieron al analisis de cariotipo. Dos de los seis cultivos desarrollados en FBS tenlan cariotipo anormal, mientras que ninguna de las llneas cultivadas en PL fueron anormales. Los cariotipos de las dos llneas anormales y sus analogos cultivados en PL se muestran en la Figura 35.

Ademas de la initiation de los cultivos tumorales primarios derivados de pacientes con glioblastoma utilizando PL, se utilizaron PL para iniciar los cultivos de tumores primarios derivados a partir de muestras quirurgicas obtenidas de pacientes con carcinoma de celulas renales.

Ejemplo 4 - Analisis de lisados plaquetarios

Se analizaron once lotes de lisados plaquetarios fabricados como se describe en el Ejemplo 2 (Production PL) para determinar la cantidad de EGF, FGF, IgF-1, PDGF-BB, TGF-p, y VEGF presente, medido por ELISA. Las cantidades medidas se compararon con las medidas en uno o mas de los siguientes: suero fetal bovino (FBS), suero AB humano (HABS), un lisado plaquetario disponible comercialmente (Cryocheck; numero de catalogo PNP-10; Precision BioLogic, Inc., Nova Scotia, Canada) y plasma fresco sin plaquetas. Las cantidades tlpicas de EGF, FGF,

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PDGF-BB, TGF-p, y VEGF dentro de los lotes fabricados de plaquetas en comparacion con FBS se presentan en la Figura 10. La cantidad media de FGF dentro de los lotes fabricados de plaquetas fue de aproximadamente 180 pg/mL, mientras que la cantidad promedio presente en un lisado plaquetario disponibles en el mercado fue de 80 pg/mL (Figura 11). La cantidad promedio de PDGF-BB dentro de los lotes de plaquetas manufacturados fue alrededor de 8.5 ng/mL, mientras que la cantidad promedio presente en un lisado plaquetario disponibles en el mercado fue de 2.9 ng/mL (Figura 12). La cantidad promedio de IGF-1 dentro de los lotes fabricados de plaquetas fue aproximadamente 132 ng/mL, mientras que la cantidad media presente en un lisado plaquetario disponible en el mercado fue de 7.7 ng/mL (Figura 13). La cantidad media de TGF-p dentro de los lotes de plaquetas fabricados fue aproximadamente 54 ng/mL, mientras que la cantidad promedio presente en un lisado plaquetario disponible en el mercado fue 37 ng/mL (Figura 14). Los niveles de PDGF-BB, FGF, TGF-p, e IGF-1 presente en los lisados plaquetarios producidos como se describe en el Ejemplo 2 se compararon con los niveles de PDGF-BB, FGF, TGF- p, e IGF-1 reportados en la literatura o de suero bovino (Figura 20).

La cantidad total de protelna dentro de once lotes de lisados plaquetarios fabricados como se describe en el Ejemplo 2 se midio utilizando un ensayo de Bradford modificado. La cantidad promedio de protelna total dentro de los lotes de plaquetas fabricados fue aproximadamente 49 mg/mL, mientras que la cantidad media presente en los lisados plaquetarios disponibles en el mercado fue 0.03 mg/mL (Figura 15). La cantidad total de protelna dentro de los lotes de plaquetas fabricados fue similar a las cantidades medidas en el plasma fresco sin plaquetas, el suero fetal bovino, y el suero AB humano (Figura 15).

Estos resultados sugieren que la concentration del factor de crecimiento por si solo no es responsable de las propiedades estimulantes de crecimiento efectivo de los lisados plaquetarios proporcionados en este documento. La media de los niveles de los factores de crecimiento presentes con los lisados de plaquetas proporcionados en este documento fue aproximadamente 2 a 3 veces la del lisado plaquetario disponibles comercialmente. Sin embargo, el lisado plaquetario disponibles en el mercado no fue diferente de suero fetal bovino. Ademas, los lisados plaquetarios proporcionados en este documento tenlan aproximadamente 3000 veces la cantidad de protelna que la de los lisados plaquetarios disponibles en el mercado, sin embargo, la protelna sola no puede dar cuenta de la actividad como los lisados plaquetarios proporcionados en este documento, ya que exhibieron niveles similares de protelna total como la que se encuentra en el suero AB humano.

Se realizaron los siguientes experimentos para evaluar el tamano del material dentro del lisado plaquetario proporcionado en este documento que contiene PDGF-BB y la capacidad para estimular la proliferation celular. En resumen, los lisados plaquetarios se producen a partir de un concentrado de plaquetas vencido de un solo donante. El numero de plaquetas para cada condition de lisis fue igual, y el volumen utilizado para lisar fue igual para todas las modificaciones e igual al volumen del concentrado de plaquetas utilizado para la condicion no modificada. Los lisados plaquetarios se filtraron sobre filtros de selection de tamano con puntos de corte especlficos de peso molecular. El filtrado (menor que el tamano indicado) y el retenido (mayor que el tamano indicado) se analizaron para la presencia de PDGF-BB por ELISA y la capacidad de estimular la proliferacion celular. Para evaluar la proliferacion celular, placas de cultivo de tejidos de 96 pozos sembrados con 800 celulas MSC derivadas de tejido adiposo de adulto se utilizaron con Advanced MEM (Gibco) suplementado con 2 unidades/mL de heparina y una preparation de lisado plaquetario (5%; v/v). PDGF-BB tiene un peso molecular de aproximadamente 30 KDa (protelna de 30,000 MW).

PDGF-BB se observo solo en los materiales retenidos incluyendo las preparaciones >100,000 que sugieren que la totalidad de la PDGF-BB esta obligado a complejos mayores de este tamano. Tambien, la proliferacion se produjo en cultivos que contienen estos complejos mas grandes (>100,000 Da). Estos resultados indican que hay complejos de alto peso molecular que contienen factores de crecimiento que pueden ser responsables de la actividad de los lisados plaquetarios proporcionados en este documento.

Los factores de crecimiento y otras protelnas pequenas se encuentran en complejos grandes en los lisados plaquetarios proporcionados en este documento. Un lisado plaquetario (0.5 mL), que se descongelo, se centrifugo a 3,000 x g, y se filtro a traves de un filtro de 0.2 mm, se aplico a una columna de 1.5 cm x 27 cm empaquetada con Sephadex G-150-120 (Pharmacia Fine Chemical Company) y equilibrada con fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, solution reguladora pH 7.4. La cromatografla se desarrolla a una velocidad de flujo de 25 mL/hora, y se midio la A280 de cada fraction. Las fracciones de columna se analizaron por SDS-PAGE utilizando un gel de 4-15% Criterion (Bio-Rad Laboratories) y tincion con plata. Este fue un analisis de exclusion por tamano que dio lugar a los complejos mas grandes que estan en las primeras fracciones y los complejos/moleculas individuales mas pequenas que estan en las fracciones posteriores.

Una fraccion grande del lisado plaquetario fluyo de la columna de inmediato (Figura 17, parte superior). Para ver el tamano de estos complejos, estas fracciones se corrieron en un gel reductor (Figura 17, parte inferior). Las primeras fracciones contenlan protelnas con un peso molecular de menos de 25,000 Da, lo que sugiere que las protelnas pequenas se unen a estos grandes complejos.

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Una muestra de lisado plaquetario fabricada como se describe en el Ejemplo 2 se examino utilizando un microscopio electronico de barrido. Como se muestra en la Figura 18, varios complejos grandes son facilmente observables. Se observaron muchas partlculas de hasta 0.2 pm de tamano.

En otro experimento, se evaluaron 1-4 lotes de lisados plaquetarios fabricados como se describe en el Ejemplo 2 para determinar la cantidad de 21 citocinas y factores de crecimiento presentes en los lisados plaquetarios, utilizando un ensayo BioPlex 26-plex (Biorad, Hercules, CA) segun las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Figura 19.

Ejemplo 5 - Uso de cultivo celular de lisados plaquetarios

MSC se descongelaron y se cultivaron en a-MEM con PL al 5% hasta confluencia. Las celulas despues se pasaron y se dividieron en medio a-MEM solamente o medio a-MEM con los siguientes suplementos: 5 por ciento (vol/vol) de Cryocheck, 10 por ciento (vol/vol) de FBS, 5 por ciento (vol/vol) de HABS, o 5 por ciento (vol/vol) de un lisado plaquetario preparado como se describe en el Ejemplo 2. La proliferacion relativa se evaluo mediante mediciones de absorbancia. Se observo la mayor cantidad de proliferacion con MSC cultivadas en presencia del lisado plaquetario preparado como se describe en el Ejemplo 2 (Figura 21).

En otros experimentos, se observe que las MSC de tejido adiposo se desarrollan mas rapido en presencia de 5 por ciento de un lisado plaquetario producido como se describe en el Ejemplo 2 que en el 10 por ciento de suero fetal de ternera (Figuras 22 y 23).

Para determinar el efecto modulador inmune de PL, se utilizo PL como un suplemento en lugar de suero AB humano en el cultivo propicio para la diferenciacion de CD14+ monocitos en las celulas inmunes estimulantes de las celulas dendrlticas (descrito en Dietz et al., Transfusion, 46(12):2083-9 (2006)). PL se incubaron durante la condition de cultivo total o para la etapa final (dla 3-6) de cultivo de celulas dendrlticas caracterlstico de generation de dendrltica madura activa. Los cambios asociados en el cultivo se midieron con especial enfasis en la expresion de CD80 y CD83; dos marcadores caracterlsticos del cultivo de celulas dendrlticas. No se observo efecto de la PL como un suplemento en estas condiciones. Por lo tanto, PL parece tener un efecto benigno en la respuesta inmune.

En otro experimento, las MSC se sembraron en medio, y el crecimiento celular se determino por recuento. Los suplementos de medios fueron las siguientes: (a) ninguno (medios solamente), (b) PL # 1 (lisado plaquetario fabricado en presencia de plasma), (c) lavado PL #1 + plasma (lisado plaquetario fabricado despues de la elimination de plasma seguido de la adicion de plasma de nuevo), (d) PL # 1 lavado (lisado plaquetario fabricado despues de la eliminacion de plasma), (e) PL2 + benzamidina (lisado plaquetario fabricado en presencia de plasma, mas el inhibidor de la coagulation benzamidina), y (f) plaquetas lavadas (PC2) en solution reguladora (plaquetas fabricadas en ausencia de plasma). Se observo proliferacion celular en celulas cultivadas con PL#1 y celulas cultivadas con PL#1+ plasma lavado (Figura 27). Poca o ninguna proliferacion se observo con las celulas cultivadas en las otras condiciones (Figura 27). Estos resultados sugieren que tanto plasma como factores de coagulacion pueden ser requeridos para producir una composition eficaz que contiene contenidos plaquetarios.

Ejemplo 6 - Establecimiento de alta eficiencia de cultivos primarios de glioblastoma para el descubrimiento de farmacos, optimizacion de farmacos y vacunas antitumorales

Se producen cultivos de celulas primarios glioblastoma multiforme (GBM) derivados del paciente aplicables para la traduction cllnica. El medio de cultivo descrito en este documento que contiene contenidos plaquetarios se utiliza para un establecimiento altamente eficiente de cultivos de celulas tumorales. El medio es probablemente mas relevante para el crecimiento del tumor que otros metodos y puede ser optimizado para la production a gran escala cllnica compatible con los requisitos de Buenas Practicas de Fabrication (GMP).

El efecto de los medios suplementados con contenidos plaquetarios sobre el cultivo tumoral se ensayo mediante el fraccionamiento de los tumores primarios y la incubation de ellos en uno de los tres metodos de cultivo. El primer cultivo incluye 10% de suero fetal de ternera (FCS o FBS) en medios de cultivo. El segundo cultivo contenla medio de cultivo utilizado para cultivar celulas madre tumorales (Medio de celula madre neural, NSC; Piccirillo y Vescovi, Expert Opinion on Biological Therapy, 7 (8):. 1129 (2007); Fan et al, Seminars in Cancer Biology, 17 (3): 214 (2007)). El tercer medio de cultivo contenla medio suplementado con 5% de suplemento de medio derivado de plaquetas humanas (lisado plaquetario, PL).

El efecto de los medios suplementados fue claro (Figura 28). En respuesta a las condiciones de cultivo, las celulas autoadherentes que forman esferas, preferencialmente adheridas al plastico que forma monocapas, o cultivos con la adherencia mixto. Cultivos de FBS fueron monocapas uniformemente adherentes, con medios de NSC en su mayorla que tiene esferas o las celulas no adherentes. Cultivos PL existlan dentro del espectro completo de la morfologla celular. Las celulas continuaron en cultivo y se contaron en cada pase. PL fue superior a otros metodos en la capacidad de grandes numeros de celulas generados (Figura 29). Es importante destacar que las celulas cultivadas en PL demostraron una tasa de crecimiento constante durante mas de 10 duplicaciones en ausencia de una fase inicial de retardo, lo que sugiere una respuesta de proliferacion de inmediato sobre placas (Figura 29, panel

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izquierdo). Por lo tanto, PL induce la proliferacion inmediata y profunda en muchos cultivos del tumor primario. De los dieciseis tumores cultivados hasta el momento, se obtuvo una tasa de exito del 56% de establecer el crecimiento celular primario, y se obtuvo una tasa de 44% de la generation de mas de 30 millones de celulas en 60 dlas. Ni un solo cultivo desarrollado en FBS podrla cumplir este ultimo requisito. El trece por ciento de los tumores que crecen en condiciones NSC cumplio con estos criterios. Curiosamente, habla un cultivo celular que crecio igualmente bien en PL y NSC, y solo un cultivo celular que crecio de forma unica en NSC. En general, PL fueron mayores que 3 veces mejor en el establecimiento de cultivos primarios de tumores que el mejor metodo siguiente.

Una crltica de los cultivos celulares establecidos de FBS es que se considera que han perdido el caracter indiferenciado del tumor in vivo. Para determinar si las celulas cultivadas en PL tienen caracterlsticas de celulas madre tumorales, la expresion de nestina, Sox2, y CD133 se midio en celulas cultivadas PL. La mayorla de las celulas en todos los cultivos fueron nestina y Sox2 positivo. Cuatro de los siete cultivos ensayados para expresion CD133 tenlan niveles por encima del fondo con un cultivo que tiene mas de 30% de las celulas positivas para CD133. Estos resultados sugieren que de hecho los cultivos contienen celulas que tienen caracterlsticas de celulas madre tumorales.

Para determinar la estabilidad genetica de los cultivos desarrollados en PL, celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humanos de donantes no malignas fueron incubadas en medios suplementados con PL. No hay cariotipos anormales se encontraron en hasta doce pasajes de las celulas. Por lo tanto, PL mantiene la integridad genetica de las celulas normales en cultivo. Cultivos GBM fueron cariotipados y se encontro que mantienen un cariotipo estable a pesar de duplicaciones celulares masivas (vease, por ejemplo, GBM106; Figura 24C). En algunos casos, los cultivos consistlan de subclones estables. Los cultivos tumorales mostraron deleciones caracterlsticas (tales como pten) y expresan antlgenos tumorales tales como EGFr, survivina, e IL-13 r. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que PL es un suplemento de crecimiento muy eficaz para establecimiento y proliferacion de los cultivos de tumores primarios.

Un beneficio adicional de PL como un suplemento de crecimiento es su fuente. Las plaquetas humanas vencidas, aprobadas para uso humano, se utilizaron. Este material fue aprobado para uso terapeutico con todas las pruebas equivalente completadas.

Por lo tanto, los metodos y materiales proporcionados en este documento pueden permitir a la generacion de celulas tumorales autologas para su uso en vacunas especlficas del paciente, u otros protocolos de modulation inmune donde pueda requerirse material especlfico del paciente. La eficiencia en la generacion in vitro de decenas de millones de celulas de >40% de todos los tumores GBM puede permitir muchos nuevos enfoques para el tratamiento del cancer, incluyendo (a) la posibilidad de generar suficientes materiales especlficos del paciente para las vacunaciones repetidas para protocolos de terapia inmune, (b) el establecimiento de una biblioteca de celulas del tumor primario para la detection de farmacos en los cultivos de celulas que tienen sustancialmente menor numero de pasajes y material mas relevante, (c) el desarrollo de protocolos de selection de farmacos especlficos para la optimization especlfica del paciente de quimioterapia, y (d) la catalogacion de la perfil molecular de estos cultivos primarios de tumores y la asociacion de estos perfiles con quimio-sensibilidad.

Se realizo un ensayo cllnico para confirmar el uso de cultivos de celulas GBM autologas primarias, que se producen como se describe en este documento, como una fuente de antlgeno para estudios de vacunas. Los cultivos de celulas primarios se establecen a partir de material obtenido en la cirugla. Los pacientes se someten a la atencion estandar.

El paciente comienza la vacunacion utilizando los cultivos de celulas primarios combinados con adyuvantes estimulantes inmunes. Las posibles adyuvantes para una vacuna de tumor incluyen celulas dendrlticas, alumbre, GM-CSF, LPS, KLH etc., as! como otros adyuvantes prometedores.

En algunos casos, el material de cGMP generado se utiliza directamente como antlgeno tumoral para los donantes alogenicos. Los pacientes tienen sus tumores molecularmente coincidentes con la biblioteca correspondiente, se identifica un equivalente, y posteriormente se utiliza para el tratamiento.

Para identificar tratamientos contra el cancer adicionales, los cultivos celulares producidos como se describe en este documento se seleccionan para la supresion del crecimiento celular mediado por farmacos, utilizando los compuestos de la coleccion cllnica NIH. Esta coleccion representa farmacos utilizados en ensayos cllnicos de fase temprana con perfiles de seguridad apropiada descrita y disponibilidad comercial. Los farmacos identificados como candidatos para la supresion de celulas se prueban in vivo en los mismos tumores en crecimiento en modelos de raton deficientes inmunes. Del mismo modo, los farmacos identificados como candidatos son coincidentes con el perfil de transcription o si las celulas del paciente estan creciendo lo suficientemente rapido, los farmacos probados en el material del paciente y se utilizan en el paciente que permite la deteccion y el uso de farmacos especlficos del paciente.

Ejemplo 7 - Estabilidad de lisados plaquetarios

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Lisado plaquetario

El lisado plaquetario fue fabricado como se describe en el Ejemplo 2. Inmediatamente despues de la fabricacion, PL se divide en alicuotas en multiples viales y se transfieren a -70°C, 5°C, 25°C, o 37°C para el almacenamiento a largo plazo. Alicuotas suficientes fueron transferidas de tal manera que las muestras se mantuvieron a una sola temperatura hasta su analisis. Por lo tanto, los datos representan las muestras almacenadas a una temperatura constante durante el tiempo indicado. Tres lotes independientes de PL se analizaron para la presencia de factores de crecimiento y dos para la capacidad de proliferar MSC.

Metodos de analisis

Proliferacion MSC: se obtuvieron celulas adultas mesenquimales del estroma (MSC), derivadas de tejido adiposo, de la grasa recogida como residuos procedentes de la cirugia gastrica de derivacion. La grasa fue procesada, y MSC se expandieron y se congelaron hasta su uso en estos ensayos. Para estos ensayos, el MSC se descongelaron y se dejaron un solo pasaje antes de la siembra para el analisis. El crecimiento se determino utilizando el Kit BioVision Quick Cell Proliferation Assay II (Mountain View, CA). Este ensayo se basa en la escision de la sal de tetrazolio a formazina por deshidrogenasa mitocondrial celular. La cantidad de colorante escindido es proporcional a las celulas vivas. En resumen, MSC se sembraron a 1x104 celulas por pozo en RPMI1640 que contienen la cantidad designada de PL de las condiciones indicadas. Las celulas se incubaron durante 48 horas en incubadora humidificada a 37°C, 5% CO2. Se adiciono el reactivo de deteccion (10 mL de WST) a cada pozo. La placa se incubo durante una hora, y el O.D. se midio segun las instrucciones del fabricante.

Factores de crecimiento: Se utilizo una prueba de ELISA en PL que fue almacenado a las temperaturas indicadas para determinar la concentracion de los factores de crecimiento de interes. Todos los ELISA fueron de R&D Systems (Minneapolis, MN) y se utilizaron segun las instrucciones del fabricante.

Resultados

El crecimiento de MSC en PL siguio una curva de respuesta a la dosis tipica. Se observo setenta por ciento de la capacidad de crecimiento de MSC utilizando 20% de la cantidad tipica de PL como un suplemento. Por lo tanto, los medios suplementados con PL al 1% dieron lugar a aproximadamente 70% de la capacidad de crecimiento.

El almacenamiento a largo plazo del PL a 37°C redujo, pero no elimino, el crecimiento de MSC (Figura 30). MSC se cultivaron con diferentes concentraciones de PL que habian sido mantenidas a - 70°C o 37°C durante 48 dias. Habia una curva de respuesta a dosis tipica observada tanto para PL incubada a -70°C y 37°C. De modo interesante, el PL incubado durante tanto tiempo a la temperatura corporal mantiene su capacidad de estimular el 70% del crecimiento esperado de PL a una concentracion similar.

Para identificar los posibles cambios en las concentraciones de factores de crecimiento asociados con la reduction en el crecimiento de MSC, se midieron los niveles de FGF y PDGF en cuatro lotes de PL mantenidos a -70°C, 5°C, 25°C, y 37°C (Figuras 31 y 32). Estas concentraciones se midieron inmediatamente despues de la production, y en los dias 7, 14, 21 y 48.

Cuando PL se almaceno a 37°C, durante 48 dias, los niveles de FGF cayeron a 36.5 ± 5.8 pg/mL en comparacion con los niveles de referencia de 115 ± 29.5 y 111.3 ± 26.8 cuando PL se almaceno durante 48 dias a -70°C. Esta reduccion fue significativa (p<0.01 y una reduccion de aproximadamente 32%; los datos representan la media de N = 4 lotes de PL, donde cada lote se midio utilizando tres muestras almacenadas de forma independiente). No se observo ninguna reduccion en las concentraciones de FGF cuando se almaceno durante esta cantidad de tiempo a 5°C o 25°C.

De manera similar, cuando PL se almaceno a 37°C, durante 48 dias, los niveles de PDGF corresponden a 2.8 ± 0.4 ng/mL en comparacion con los niveles basales de 10.2 ± 1.8 o 10.1 ± 2.6 cuando PL se almaceno durante la misma cantidad de tiempo a -70°C. Esta reduccion fue significativa (p<0.01 y una reduccion de aproximadamente 27%). Ademas, una reduccion dependiente de la temperatura en la cantidad de PDGF medida cuando el PL se almaceno a 25°C (media = 6.0 ± 0.9 y p = 0.02) se observo. Por lo tanto, la perdida en los factores de crecimiento se aproxima a la perdida en la capacidad estimuladora del crecimiento de MSC. Para el calculo de la vida util, se utilizaron los cambios en los factores de crecimiento en el tiempo y la temperatura.

Estimation de la vida util.

PDGF fue el mas sensible a los efectos de envejecimiento acelerado. Por lo tanto, los resultados de vida util se derivaron de estos datos (Figura 33). El metodo de interception de la pendiente (ecuacion de Arrhenius), norma Q, y enfoques conservadores fueron utilizados para estimar la vida util de los lisados plaquetarios (Figura 34 y Tabla 1).

Tabla 1. Vida util estimada de los lisados plaquetarios.

Para el almacenamiento a -70°C Para el almacenamiento a -20°C

Vida util

24.1 anos Aproximadamente 1 ano (290.5 dlas)

En conjunto, estos resultados indican que las composiciones proporcionadas en este documento contienen contenidos plaquetarios tienen una vida util estimada de mas de cinco anos a -70°C y una vida util estimada de 5 aproximadamente un ano a -20°C.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Una composition de lisado plaquetario que comprende un filtrado a partir de una preparation plaquetaria lisada pasada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos, en donde dicho filtrado comprende mas de 200 pg de polipeptido VEGF por mL.
2. 2. La composition de lisado plaquetario de la revindication 1, en donde dicha preparation plaquetaria lisada es una preparation plaquetaria de aferesis lisadas.
3. 3. La composition de lisado plaquetario de acuerdo con la revindication 1 o la revindication 2, en donde dicha preparation plaquetaria lisada comprende plasma.
4. 4. La composition de lisado plaquetario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha composition de lisado plaquetario es una composition de lisado plaquetario humano.
5. 5. Una composition que comprende un medio y una composition de lisado plaquetario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. 6. La composition de lisado plaquetario de la revindication 2, en donde dicha preparation plaquetaria de aferesis es una preparation plaquetaria de aferesis recolectada de un ser humano de mas de cinco dlas antes.
7. 7. Un cultivo celular aislado que comprende celulas y un medio suplementado con una composition de lisado plaquetario que comprende un filtrado a partir de una preparation plaquetaria lisada pasada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos, en donde dicho filtrado comprende mas de 200 pg de polipeptido VEGF por mL y plasma.
8. 8. El cultivo celular aislado de la revindication 7, en donde dichas celulas son celulas de tumor primario.
9. 9. El cultivo celular aislado de la revindication 8, en donde dichas celulas son celulas de glioma humanas primarias.
10. 10. El cultivo celular aislado de la revindication 7, en donde dichas celulas son celulas madre.
11. 11. Un metodo que comprende el cultivo de celulas tumorales en medio suplementado con una composition de lisado plaquetario de acuerdo con la revindication 3.
12. 12. El metodo de la revindication 11, en donde dichas celulas tumorales son celulas tumorales primarias.
13. 13. El metodo de la revindication 12, en donde dichas celulas tumorales primarias son celulas de glioma primarias humanas.
14. 14. Un metodo que comprende el cultivo de celulas madre en medio suplementado con una composition de lisado plaquetario de acuerdo con la reivindicacion 3.
15. 15. El metodo de la revindication 14, en donde dichas celulas madre son celulas madre mesenquimales.
16. 16. El metodo de la revindication 15, en donde dichas celulas madre mesenquimales son celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo.
17. 17. Un metodo para obtener una composition de lisado plaquetario de acuerdo con la revindication 3, que comprende lisado de plaquetas en una preparation plaquetaria de aferesis que comprende plasma y elimination de plaquetas o residuos de plaquetas a partir de la preparation plaquetaria de aferesis lisada haciendo pasar la preparation plaquetaria de aferesis lisada a traves de un filtro de 0.45 pm o menos.