ES2890126T3

ES2890126T3 - Métodos y composiciones para la obtención clínica de una célula alogénica y usos terapéuticos

Info

Publication number: ES2890126T3
Application number: ES17191442T
Authority: ES
Inventors: Amit Patel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2022-01-17
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: DK3321355T3; US20220251515A1; EP3321355A1; US20220251514A1; CA2862661C; US9803176B2; HRP20211373T1; JP6548897B2; EP2798058A1; CA2862661A1; ES2656614T3; SI3321355T1; EP2798058B1; CA3113484A1; JP2015503918A; US20220041992A1; US20130216505A1; EP3321355B1; WO2013102219A1; PL3321355T3

Abstract

Exosomas aislados extraídos de células obtenidas de una capa subepitelial de un tejido de cordón umbilical de mamífero y que pueden autorrenovarse y expandirse en cultivo, expresando las células CD90, CD44, CD146 o SOX2 y OCT4, y en donde las células no expresan NANOG, y en donde los exosomas expresan CD63.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para la obtención clínica de una célula alogénica y usos terapéuticos

Datos de prioridad

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° de serie.

61/582.070, presentada el 30 de diciembre de 2011, y de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° de serie 6l/591.21 1, presentada el 26 de enero de 2012.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a células madre y a diversos aspectos relacionados con las mismas. Por consiguiente, la presente invención implica los campos de la química, las ciencias de la vida y la medicina.

Antecedentes

Se ha demostrado que diversas poblaciones de células y de células madre son de valor en aplicaciones de investigación. Sin embargo, la traducción clínica de estos tipos celulares para su uso en seres humanos y animales en aplicaciones terapéuticas es limitada por varias razones, entre ellas cuestiones alogénicas.

Sumario

La invención se define en las reivindicaciones. En un primer aspecto de la presente invención se proporcionan exosomas aislados extraídos de células obtenidas a partir de una capa subepitelial de un tejido de cordón umbilical de mamífero y que pueden autorrenovarse y expandirse en cultivo, expresando las células CD90, CD44, CD146 o SOCX2 y OCT4, y en donde las células no expresan NANOG, y en donde los exosomas expresan CD63.

En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método de purificación de exosomas, que comprende:

cultivar células madre a partir de una capa subepitelial de un cordón umbilical de mamífero en un entorno de cultivo normóxico o hipóxico;

recoger sobrenadante de las células madre en cultivo;

purificar los exosomas del sobrenadante, en donde los exosomas expresan CD63.

En un aspecto adicional, la célula aislada puede producir exosomas que expresan tanto CD63 como CD9. Se comprende que el alcance de la presente incluye cultivos de células aisladas.

Las células de acuerdo con aspectos de la presente divulgación tienen la capacidad para diferenciarse en una diversidad de tipos celulares, y se considera que cualquiera de dichos tipos celulares se encuentra dentro del alcance de la presente. Los ejemplos no limitantes de dichos tipos celulares pueden incluir adipocitos, condrocitos, osteocitos, cardiomiocitos, células endoteliales, miocitos y similares, incluyendo combinaciones de los mismos. Se puede obtener una diversidad de células y productos celulares de las células aisladas descritas en el presente documento, y se considera que cualquiera de dichas células y productos celulares se encuentra dentro del alcance de la presente. En un aspecto, por ejemplo, la presente divulgación proporciona un exosoma aislado obtenido de las células aisladas descritas, donde el exosoma expresa CD63, CD9 o ambos. En otro aspecto, se proporciona un adipocito que se ha diferenciado de las células aisladas descritas. En aún otro aspecto, se proporciona un condrocito que se ha diferenciado de las células aisladas descritas. En un aspecto adicional, se proporciona un osteocito que se ha diferenciado de las células aisladas descritas. En aún otro aspecto adicional, se proporciona un cardiomiocito que se ha diferenciado de las células aisladas descritas. Adicionalmente, se proporciona un cultivo de células diferenciadas obtenidas de las células aisladas descritas incluyendo al menos un tipo celular seleccionado de un adipocito, un condrocito, un osteocito o un cardiomiocito.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para cultivar células madre a partir de una capa subepitelial de un cordón umbilical de mamífero. Dicho método puede incluir disecar la capa subepitelial del cordón umbilical, colocar la capa subepitelial disecada con el lado interno hacia abajo sobre un sustrato de manera tal que el lado interno de la capa subepitelial está en contacto con el sustrato y cultivar la capa subepitelial sobre el sustrato. El método puede incluir adicionalmente retirar explantes para la expansión de células primarias. En un aspecto, la disección de la capa subepitelial incluye además retirar la gelatina de Wharton del cordón umbilical.

La capa subepitelial puede cultivarse en cualquier medio en el que se puedan producir explantes a partir de la misma, y cualquier medio de este tipo se considera que está dentro del alcance de la presente. Sin embargo, en un aspecto específico, tal medio de cultivo puede incluir un lisado de plaquetas. En otro aspecto, los medios de cultivo pueden incluir un lisado de plaquetas humano o animal. En aún otro aspecto, los medios de cultivo pueden obtenerse libres de ingredientes humanos y animales.

El sustrato utilizado para cultivar la capa subepitelial puede ser cualquier sustrato en el que se puedan obtener explantes a partir del mismo. En un aspecto, el sustrato puede ser una matriz polimérica. Un ejemplo de una matriz polimérica tal es una placa de cultivo. En un aspecto específico, la placa de cultivo puede ser un plástico tratado para cultivo celular, y la capa subepitelial se puede colocar sobre la misma sin ningún pretratamiento adicional del plástico tratado para cultivo celular. En otro aspecto, el sustrato puede ser un sustrato para cultivo celular semisólido. Cualquier tipo de sustrato semisólido que ofrezca soporte a la capa subepitelial durante el procedimiento de cultivo se considera dentro del alcance de la presente.

Se contemplan diversas condiciones de cultivo, y se comprende que dichas condiciones pueden variar dependiendo del protocolo experimental y los diversos resultados deseados. En un aspecto, por ejemplo, la capa subepitelial se puede cultivar en un entorno normóxico. En otro aspecto, la capa subepitelial se puede cultivar en un entorno hipóxico. Adicionalmente, en algunos aspectos, el cultivo de la capa subepitelial y la retirada de los explantes pueden realizarse sin utilizar ninguna enzima. Además, en algunos aspectos, el subcultivo de los explantes y/o las células resultantes de los explantes se puede realizar sin utilizar ninguna enzima.

En aún otro aspecto de la presente divulgación, un método de tratamiento de una afección médica que responde al tratamiento con las células aisladas descritas en el presente documento puede incluir introducir dichas células en un individuo que tiene la afección médica. Estos tratamientos celulares se pueden utilizar para tratar cualquier afección a la cual pueden proporcionar un beneficio. Los ejemplos no limitantes de dichas afecciones médicas incluyen EPOC, diabetes, isquemia, artrosis, daño ortopédico, daño hepático, angina resistente crónica, disfunción eréctil, discos herniados, insuficiencia cardíaca congestiva, asma, enfisema, heridas, síndrome de radiación aguda, trastornos autoinmunitarios, lechos de órganos isquémicos, enfermedad de injerto contra hospedador y similares, incluyendo combinaciones de las mismas. Adicionalmente, en otro aspecto, un método de tratamiento de una afección médica que responde al tratamiento con las células diferenciadas descritas en el presente documento puede incluir introducir al menos un tipo celular de las células diferenciadas en un individuo que tiene la afección médica.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la EPOC. Un método tal puede incluir administrar un agente activo eficaz para la EPOC por vía intravenosa a un sujeto para suministrar el agente activo eficaz para la EPOC en la mitad inferior del pulmón del sujeto, y administrar el agente activo eficaz para la EPOC en una forma aerosolizada al sujeto por medio de ventilación para suministrar el agente activo eficaz para la EPOC en una mitad superior del pulmón del sujeto. En un aspecto, el agente activo eficaz para la EPOC incluye células madre. En aún otro aspecto, las células madre incluyen células obtenidas de la capa subepitelial del cordón umbilical de mamífero como se ha descrito en el presente documento. En un aspecto específico, las células madre se pueden aerosolizar con un aerosol a un tamaño de aproximadamente 6 a aproximadamente 200 micrómetros. Adicionalmente, los dos tipos de administración se pueden suministrar de manera sucesiva o conjunta.

En otro aspecto, el agente activo eficaz para la EPOC puede ser un agente activo distinto de células madre. Los ejemplos no limitantes de dichos agentes activos eficaces para la EPOC pueden incluir exosomas, lisados celulares, extractos de proteínas obtenidos de cultivo celular y similares, incluyendo combinaciones de los mismos.

Descripción breve de los dibujos

La FIG. 1 muestra una imagen de un corte histológico de cordón umbilical donde se identifica la capa subepitelial en conformidad con un aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 2A-C muestran explantes de células que migran de la capa subepitelial y la determinación del cariotipo de células en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

La FIG. 3 muestra el análisis FACS de marcadores determinantes de células expresados por células o células madre obtenidas de cordón umbilical en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 4A-D muestran imágenes de un análisis por RT-PCR del ARN extraído de las células o células madre obtenidas del cordón umbilical y la tinción inmunocitoquímica de las células en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

La FIG. 5 muestra imágenes del cultivo de células o células madre obtenidas de tejido de cordón umbilical en una matriz de PRP (forma siglada de platelet rich plasma, plasma rico en plaquetas) semisólida o un lisado PL (forma siglada de platelet lysate, lisado de plaquetas) en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 6A-B muestran un análisis de los tamaños de exosomas extracelulares y una MEB de los exosomas en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

La FIG. 6C muestra la expresión de CD63 por los exosomas producidos a partir de células o células madre obtenidas de cordón umbilical en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 7A-D muestran imágenes que demuestran la diferenciación de tejido de cordón umbilical en los linajes adipogénicos en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 8A-D muestran imágenes que demuestran la diferenciación de tejido de cordón umbilical en los linajes osteogénicos en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 9A-D muestran imágenes que demuestran la diferenciación de tejido de cordón umbilical en los linajes condrogénicos en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 10A-D muestran imágenes que demuestran la diferenciación de tejido de cordón umbilical en los linajes cardiogénicos en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 11A-B muestran datos relacionados con la isquemia crónica de miembros y la percepción del dolor en el tiempo en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

La FIG. 12 muestra una imagen de un angiograma que demuestra el suministro de células en el corazón en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

La FIG. 13 muestra una serie de imágenes de un angiograma que demuestra el suministro de células en el corazón en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 14A-D muestran imágenes de la rodilla de una mujer de 80 años antes y después del suministro de células madre en el espacio intrarticular en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Las FIG. 15A-B muestran datos relacionados con el síndrome de radiación aguda en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

La FIG. 16 muestra datos relacionados con el síndrome de radiación aguda en conformidad con otro aspecto de la presente divulgación.

Descripción detallada

Antes de describir la presente divulgación en el presente documento, se deberá comprender que esta divulgación no se limita a las estructuras, pasos de proceso o materiales particulares divulgados en el presente documento, sino que se extiende a las equivalencias de los mismos como podrán reconocer los especialistas en el arte relevante. También se comprenderá que la terminología utilizada en el presente documento tiene por objeto describir formas de realización particulares solamente, y no debe interpretarse como una limitación de la invención.

Definiciones

La siguiente terminología se utilizará en conformidad con las definiciones expuestas a continuación.

Se deberá tener en cuenta que, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/una" y "la/el" incluyen los referentes al plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una o más de dichas células y la referencia "al matraz" incluye la referencia a uno o más de dichos matraces.

Según se usa en el presente documento, la expresión "célula aislada" se refiere a una célula que se ha aislado a partir de la capa subepitelial de un cordón umbilical de mamífero.

Según se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere al alcance o grado completo o casi completo de una acción, característica, propiedad, estado, estructura, artículo o resultado. Por ejemplo, un objeto que está "sustancialmente" incluido significará que dicho objeto está completamente incluido o casi completamente incluido. El grado exacto de desviación permitido de la totalidad absoluta puede depender en algunos casos del contexto específico. Sin embargo, en términos generales, la proximidad a la totalidad será de modo que se obtenga el mismo resultado general que si se obtuviera la totalidad absoluta y total. El uso de "sustancialmente" es igualmente aplicable cuando se usa con una connotación negativa para hacer referencia a la falta completa o casi completa de una acción, característica, propiedad, estado, estructura, artículo o resultado. Por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre de" partículas, o carecería por completo de partículas, o carecería casi por completo de partículas, por lo que el efecto sería el mismo que si careciera por completo de partículas. En otras palabras, una composición que está "sustancialmente libre de" un ingrediente o elemento puede contener realmente dicho artículo siempre que no haya un efecto medible del mismo.

Según se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se usa para proporcionar flexibilidad a un valor extremo de un intervalo numérico al proporcionar que un valor dado se puede encontrar "un poco por encima" o "un poco por debajo" del valor extremo.

Según se usa en el presente documento, se puede presentar una pluralidad de artículos, elementos estructurales, elementos de composición y/o materiales en un listado común para mayor conveniencia. Sin embargo, estos listados deben considerarse como si cada miembro del listado se identificara individualmente como un miembro separado y único. Por tanto, ningún miembro individual de dicho listado debería considerarse como un equivalente de hecho de cualquier otro miembro del mismo listado basándose solamente en su presentación en un grupo común sin indicaciones de lo contrario.

Las concentraciones, cantidades y otros datos numéricos se pueden expresar o presentar como un formato de intervalos en el presente documento. Se comprenderá que dicho formato de intervalos se usa simplemente para mayor conveniencia y brevedad, y, por tanto, debería interpretarse de forma flexible, para incluir no solo los valores numéricos explícitamente recitados como límites del intervalo, sino también para incluir todos los valores numéricos individuales o subintervalos englobados dentro de ese intervalo como si se recitara explícitamente cada valor numérico y subintervalo. A modo ilustrativo, se interpretará que un intervalo numérico de "aproximadamente 1 a aproximadamente 5" no solo incluye los valores recitados explícitamente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, sino también que incluye los valores y subintervalos individuales dentro del intervalo indicado. Por tanto, este intervalo numérico incluye valores individuales tales como 2, 3 y 4 y subintervalos tales como de 1-3, de 2-4 y de 3 5, etc., así como 1,2, 3, 4 y 5, de manera individual.

Este mismo principio se aplica a intervalos que solamente recitan un valor numérico como un mínimo o un máximo. Adicionalmente, dicha interpretación debería aplicarse independientemente de la amplitud del intervalo o de las características que se describen.

La divulgación

La presente divulgación presenta un descubrimiento novedoso de una población de células alogénicas o células madre que se puede usar para el tratamiento de una amplia gama de afecciones. Además, la presente divulgación describe medios y un método novedosos para cultivar estas células, en algunos casos, sin el uso de enzimas o productos animales. Como tales, se proporcionan células, células madre, cultivos celulares y métodos asociados, incluyendo métodos para aislar, cultivar, desarrollar o producir de otra manera estas células. El alcance de la presente divulgación abarca adicionalmente la investigación y los usos terapéuticos de dichas células y cultivos celulares, incluyendo los compuestos derivados de los mismos.

A modo de ejemplo, las poblaciones de células y células madre y los compuestos obtenidos a partir de estas poblaciones se pueden usar en aplicaciones alogénicas para tratar una amplia gama de afecciones incluyendo, pero sin limitación, trastornos cardíacos, ortopédicos, autoinmunitarios, diabetes, cardiovasculares, neurológicos, disfunción eréctil, lesiones de la médula espinal, discos herniados, isquemia crítica de miembros, hipertensión, cicatrización de heridas, úlceras, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome de radiación agudo, enfermedad de injerto contra hospedador, lechos de órganos isquémicos y similares. También se describen métodos para producir poblaciones de células y células madre y compuestos que pueden utilizarse para el descubrimiento y desarrollo de fármacos, así como para pruebas de toxicología. Los ejemplos de compuestos obtenidos a partir de estas poblaciones de células y células madre son vesículas pequeñas que contienen proteínas, ARN, micro ARN y similares, que son específicos de las poblaciones de células y células madre.

En un aspecto, se proporciona una célula aislada obtenida a partir de una capa subepitelial de un tejido de cordón umbilical de mamífero que se puede autorrenovar y expandir en cultivo. Dicha célula tiene la capacidad para diferenciarse en un tipo celular tal como, en un aspecto, por ejemplo, adipocitos, condrocitos, osteocitos, cardiomiocitos y similares. En otro aspecto, los ejemplos no limitantes de dichos tipos celulares pueden incluir adipocitos blancos, pardos o beis, condrocitos, osteocitos, cardiomiocitos, células endoteliales, miocitos y similares, incluyendo combinaciones de los mismos. Otros ejemplos de dichos tipos celulares pueden incluir células progenitoras neurales, hepatocitos, células de islotes, células progenitoras renales y similares.

En la FIG. 1 se muestra un corte transversal de un cordón umbilical humano, que muestra la arteria umbilical (UA, forma siglada de umbilical artery), las venas umbilicales (UV, forma siglada de umbilical veins), la gelatina de Wharton (WJ, forma siglada de Wharton’s Jelly) y la capa subepitelial (SL, forma siglada de subepithelial layer). Las células aisladas de la SL pueden tener una diversidad de marcadores característicos que las distingue de la célula aislada previamente de muestras del cordón umbilical. Debe tenerse en cuenta que estas células aisladas no se obtienen de la gelatina de Wharton, sino más bien de la SL.

Se pueden utilizar diversos marcadores celulares que están presentes o ausentes en la identificación de estas células obtenidas de SL y, como tales, se pueden usar para mostrar la novedad de las células aisladas. Por ejemplo, en un aspecto, la célula aislada expresa al menos tres marcadores celulares seleccionados de CD29, CD73, CD90, CD146, CD166, SSEA4, CD9, CD44, CD 146 o CD105, y la célula aislada no expresa al menos tres marcadores celulares seleccionados de CD45, CD34, CD14, CD79, CD106, CD86, CD80, CD19, CD117, Stro-1 o HLA-DR. En otro aspecto, la célula aislada expresa al menos cinco marcadores celulares seleccionados de CD29, CD73, CD90, CD146, CD166, SSEA4, CD9, CD44, CD146 o CD105. En otro aspecto, la célula aislada expresa al menos ocho marcadores celulares seleccionados de CD29, CD73, CD90, CD146, CD166, SSEA4, CD9, CD44, CD146 o CD105. En aún otro aspecto, la célula aislada expresa al menos CD29, CD73, CD90, CD166, SSEA4, CD9, CD44, CD146 y CD105. En otro aspecto, la célula aislada no expresa al menos cinco marcadores celulares seleccionados de CD45, CD34, CD14, CD79, CD106, CD86, CD80, CD19, CD117, Stro-1 o HLA-DR. En otro aspecto, la célula aislada no expresa al menos ocho marcadores celulares seleccionados de CD45, CD34, CD14, c D79, CD106, CD86, CD80, ^cD19, CD117, Stro-1 o HLA-DR. En aún otro aspecto, la célula aislada no expresa al menos CD45, CD34, CD14, CD79, CD106, CD86, CD80, CD19, CD117, Stro-1 y HLA-DR. Adicionalmente, en algunos aspectos, la célula aislada puede ser positiva para SOX2, OCT4, o tanto para SOX2 como para OCT4. En un aspecto adicional, la célula aislada puede producir exosomas que expresan CD63, CD9 o tanto CD63 como CD9.

Se puede utilizar una diversidad de técnicas para extraer las células aisladas de la presente divulgación de la SL y se considera que cualquier técnica tal que permita dicha extracción sin ocasionar daños significativos a las células se encuentra dentro del alcance de la presente. En un aspecto, por ejemplo, un método para cultivar células madre a partir de la SL de un cordón umbilical de mamífero puede incluir disecar la capa subepitelial del cordón umbilical. En un aspecto, por ejemplo, se puede recoger tejido de cordón umbilical y lavarlo para eliminar sangre, gelatina de Wharton y cualquier otro material asociado con la SL. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, el tejido del cordón se puede lavar múltiples veces en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) tal como la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). En algunos aspectos, el PBS puede incluir un lisado de plaquetas (es decir, 10 % de lisado de PRP del lisado de plaquetas). Luego se puede eliminar y desechar toda la gelatina de Wharton o porción gelatinosa del cordón umbilical restante. El tejido de cordón umbilical restante (la SL) se puede colocar luego con el lado interior hacia abajo sobre un sustrato de manera tal que el lado interior de la SL esté en contacto con el sustrato. Se puede colocar un cordón umbilical entero disecado con la jalea de Wharton eliminada directamente sobre el sustrato, o el cordón umbilical disecado se puede cortar en cortes más pequeños (por ejemplo, 1-3 mm) y estos cortes se pueden colocar directamente sobre el sustrato.

Se contempla una diversidad de sustratos sobre los cuales se puede colocar la SL. En un aspecto, por ejemplo, el sustrato puede ser un material polimérico sólido. Un ejemplo de un material polimérico sólido puede incluir una placa de cultivo celular. La placa de cultivo celular puede ser de un plástico tratado para cultivo celular como se conoce en la técnica. En un aspecto específico, la SL se puede colocar sobre el sustrato de la placa de cultivo celular sin ningún pretratamiento adicional del plástico tratado para cultivo celular. En otro aspecto, el sustrato puede ser un sustrato de cultivo celular semisólido. Dicho sustrato puede incluir, por ejemplo, un medio de cultivo semisólido incluyendo un agar u otro material de base gelatinosa.

Después de colocar la SL sobre el sustrato, la SL se cultiva en un medio adecuado. En algunos aspectos, es preferible utilizar medios de cultivo libres de componentes o contaminantes animales y humanos. A modo de ejemplo, en la FIG. 2 se muestra el cultivo de células a partir de la SL. Como se puede observar en la FIG. 2A, a los tres días después de sembrar en placas la SL, las células habían comenzado a migrar. La FIG. 2B muestra las células después de 6 días de cultivo en medios libres de componentes animales. Adicionalmente, la FIG. 2C muestra el cariotipo de las células después del pasaje 12. Como ya se describió, las células obtenidas de la SL tienen un perfil de expresión de marcadores exclusivo. Los datos que muestran una parte de este perfil se muestran La FIG. 3.

El cultivo se puede cultivar luego ya sea en condiciones de cultivo normóxicas o hipóxicas durante un período de tiempo suficiente como para establecer cultivos de células primarias, (por ejemplo, de 3-7 días en algunos casos). Una vez establecidos los cultivos de células primarias, se retira el tejido de SL y se desecha. Las células o las células madre se cultivan adicionalmente y se expanden en matraces de cultivo más grandes, en condiciones de cultivo ya sea normóxicas o hipóxicas. Aunque se contempla una diversidad de medios de cultivo celular adecuados, en un ejemplo no limitante los medios pueden ser el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), glucosa (500-6000 mg/ml) sin rojo fenol, glutamina 1X, AANE 1X y 0,1-20 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas. Otro ejemplo de medios adecuados puede incluir un medio de base de DMEM con bajo contenido de glucosa sin rojo fenol, glutamina 1X, AANE 1X, 1000 unidades de heparina y 20 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas. En otro ejemplo, las células se pueden cultivar directamente sobre un sustrato semisólido de DMEM con bajo contenido de glucosa sin rojo fenol, glutamina 1X, AANE 1X y 20 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas. En un ejemplo adicional, el medio de cultivo puede incluir un medio con bajo contenido de glucosa (500-1000 mg/ml) que contiene glutamina 1X, AANE 1X, 1000 unidades de heparina. En algunos aspectos, la glucosa puede estar a 1000 4000 mg/ml, y en otros aspectos la glucosa puede ser glucosa alta a 4000-6000 mg/ml. Estos medios también pueden incluir 0,1 %-20 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas. En aún otro ejemplo, el medio de cultivo puede ser uno semisólido con la sustitución de ácido-citrato-dextrosa ACD en lugar de heparina, y conteniendo un medio con bajo contenido de glucosa (500-1000 mg/ml), un medio de contenido intermedio de glucosa (1000-4000 mg/ml) o un medio con alto contenido de glucosa (4000-6000 mg/ml), y conteniendo además glutamina 1X, AANE 1X y 0,1 %-20 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas. En algunos aspectos, las células se pueden obtener, subcultivar y/o someter a pasajes usando TrypLE. En otro aspecto, las células se pueden obtener, subcultivar y/o someter a pasajes sin el uso de TrypLE o cualquier otra enzima.

La FIG. 4 muestra los datos relacionados con diversas características genéticas de las células aisladas del tejido de SL. La FIG. 4A muestra que las células de SL aisladas (calle 1) son positivas para SOX2 y OCT4, y son negativas para NANOG en comparación con las células de control (Ctrl). La FIG. 4B muestra una imagen teñida con DAPI de células de SL cultivadas que demuestra que dichas células son positivas para CD44. La FIG. 4C muestra una imagen teñida con DAPI de células de SL cultivadas que demuestra que dichas células son positivas para CD90. La FIG. 4D muestra una imagen teñida con DAPI de células de SL cultivadas que demuestra que dichas células son positivas para CD146.

En un aspecto, las células de SL se pueden cultivar a partir de un cordón umbilical de mamífero sobre un sustrato semisólido de lisado de PRP o de lisado de plaquetas. Dichas células se pueden cultivar directamente sobre un matraz de cultivo tisular recubierto con plástico como se describió en otra parte en el presente documento. Después de un tiempo suficiente en cualquiera de los entornos de cultivo normóxicos o hipóxicos, se cambia el medio y se agrega el medio semisólido de lisado de PRP o lisado de plaquetas recién preparado al matraz de cultivo. El matraz se continúa cultivando en un entorno de cultivo ya sea normóxico o hipóxico. Al día siguiente los medios se vuelven una matriz semisólida de lisado de PRP o de lisado de plaquetas. Las células se pueden continuar cultivando en esta matriz hasta posterior uso. Las FIG. 5A y B muestran células de SL que crecen en un gel semisólido de PRPL o PL, a un aumento de 10X y 40X. En un aspecto específico, los ingredientes para un cultivo semisólido pueden incluir factores de crecimiento para un cultivo celular expandido de diferenciación. Los ejemplos no limitantes pueden incluir FGF, VEGF, FNDC5, 5-azacitidina, TGF-Beta1, TGF Beta2, insulina, ITS, IGF y similares, incluyendo combinaciones de los mismos.

En algunos casos, la confirmación alogénica de células de SL, ya sean diferenciadas o no diferenciadas, puede ser muy beneficiosa, en particular para los usos terapéuticos de las células. En estos casos, se pueden realizar reacciones mixtas de linfocitos sobre células para confirmar las propiedades alogénicas de las células. En determinados aspectos, una célula obtenida como se describe en el presente documento no provoca una respuesta mixta de linfocitos o proliferación de linfocitos T.

En determinados aspectos, una célula obtenida como se describe en el presente documento se puede modificar de manera recombinante para expresar uno o más genes y/o proteínas. En una técnica, se puede incorporar uno o más genes en un vector de expresión. Las estrategias para suministrar un gen en la célula pueden incluir, sin limitación, vectores virales, incluyendo retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adeno-asociados, lentivirus, poxivirus, alfavirus, virus del herpes simplex 1, plásmidos bacterianos, eucariotas recombinantes y similares, incluyendo combinaciones de los mismos. El ADN plasmídico se puede suministrar desnudo o con la ayuda de exosomas, liposomas catiónicos o derivatizados (conjugados con anticuerpos), conjugados de polilisina, gramicidina S, envolturas virales artificiales, otros vehículos intracelulares, así como la inyección directa de los genes. En algunos aspectos, se pueden usar métodos de suministro de genes no virales tales como, por ejemplo, un vector basado en una región unida a armazón/matriz (S/MAR, forma siglada de scaffold/matrix attached región).

Adicionalmente, en algunos aspectos, las células de SL aisladas se pueden usar para producir una población de exosomas. Estas poblaciones de exosomas se pueden utilizar en una diversidad de usos de investigación y terapéuticos. En un aspecto, por ejemplo, las células se cultivan como se describe en un entorno de cultivo ya sea normóxico o hipóxico y los sobrenadantes se recogen en cada cambio de medios. A continuación, los exosomas se pueden purificar a partir de los sobrenadantes usando un protocolo de purificación apropiado. Un ejemplo no limitante de un protocolo tal es el sistema de aislamiento ExoQuick de SYSTEMBIO. Los exosomas purificados se pueden utilizar para la manipulación, el direccionamiento y el uso terapéutico adicionales. Los exosomas específicos de las SL células son positivos para la expresión de CD63. La FIG. 6A muestra un análisis del tamaño de los exosomas obtenidos como ya se describe, y la FIG. 6B muestra una imagen por microscopio electrónico de un muestreo de exosomas. Adicionalmente, la FIG. 6C muestra la expresión de CD63 de exosomas producidos a partir de células o células madre obtenidas de cordón umbilical.

En algunos aspectos, las células aisladas y los cultivos celulares se pueden utilizar tal como están tras su aislamiento del tejido de SL. En otros aspectos, las células aisladas se pueden diferenciar en otros tipos celulares. Debe tenerse en cuenta que cualquier tipo celular útil que se puede obtener a partir de las células aisladas del tejido de SL se considera dentro del alcance de la presente. Los ejemplos no limitantes de dichos tipos celulares incluyen adipocitos, condrocitos, osteocitos, cardiomiocitos y similares. La diferenciación se puede inducir mediante la exposición de las células a sustancias químicas, factores de crecimiento, sobrenadantes, compuestos sintéticos o naturales, o cualquier otro agente capaz de transformar las células. En un aspecto, por ejemplo, las células aisladas se pueden diferenciar en adipocitos, según se muestra la FIG. 7.

Se considera que cualquier técnica de diferenciación de células de SL en adipocitos se encuentra dentro del alcance de la presente. Un ejemplo no limitante usado para la diferenciación adipogénica incluye células de SL cultivadas en presencia del medio de diferenciación adipogénica StemPro (Life Technologies). La FIG. 7A muestra células de SL diferenciadas que son positivas para los marcadores adipogénicos FABP4, LPL y PPARy (calle 1). Para la diferenciación adipogénica, la confirmación se determinó mediante tinción con Aceite Rojo O e inmunocitoquímica para FABP4. La FIG. 7B muestra una imagen de células teñidas con DAPI que muestran los marcadores FABP4. La FIG. 7C muestra células no teñidas y la FIG. 7D muestra la tinción con Aceite Rojo O que demuestra el almacenamiento de grasas en las células.

Para la diferenciación osteogénica de las células de SL, una técnica no limitante permite cultivar dichas células en presencia del medio de diferenciación osteogénica StemPro (Life Technologies). Según se muestra la FIG. 8A, por ejemplo, las células de SL diferenciadas son positivas para los marcadores osteogénicos OP, ON y AP (calle 1). Para la diferenciación osteogénica, la confirmación se determinó mediante tinción con rojo de alizarina e inmunocitoquímica de osteocalcina. La FIG. 8B muestra una imagen de células teñidas con DAPI que muestra la presencia de osteocalcina. La FIG. 8C muestra células no teñidas y la FIG. 8D muestra una imagen de células teñidas con rojo de alizarina que demuestra la presencia de deposiciones cálcicos en las células.

Para la diferenciación condrogénica de las células de SL, una técnica no limitante permite cultivar células de SL en presencia del medio de diferenciación condrogénica StemPro (Life Technologies). Según se muestra la FIG. 9A, las células de SL diferenciadas son positivas para los marcadores condrogénicos Colágeno 2A, A6 y BG (calle 1). Para la diferenciación condrogénica, la confirmación se determinó mediante la tinción de Von Kossa. La FIG. 9B muestra la tinción con azul de Alsacia de un sedimento de condrocitos.

Para la diferenciación cardiogénica de las células de SL, una técnica no limitante permite cultivar células en presencia de DMEM con bajo contenido de glucosa sin rojo fenol, glutamina 1X, AANE 1X y 10 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas con 5-AZA-2'-desoxicitidina 5-10 |jM. Según se muestra en la FIG. 10A, las células de SL diferenciadas son positivas para los marcadores cardiogénicos MYF5, CNX43 y ACTIN (calle 1). Para la diferenciación cardiogénica, la confirmación se determinó mediante tinción para ANP, tropomiosina y troponina 1. La FIG. 10B muestra una imagen de células teñidas con DAPI que demuestra la presencia de Troponina 1. La FIG. 10C muestra una imagen de células teñidas con DAPI que demuestra la presencia de tropomiosina. La FIG. 10D muestra una imagen fusionada de las imágenes de las FIG. 10B y 10C.

En aún otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento de una afección médica. En algunas realizaciones, dicho método puede incluir introducir las células descritas en el presente documento en un individuo que tiene la afección médica. Las células se pueden suministrar a diversas dosis tales como, sin limitación, de aproximadamente 500.000 a aproximadamente 1.000.000.000 de células por dosis. En algunos aspectos, el intervalo de dosificación de células se puede calcular basándose en el peso del sujeto. En determinados aspectos, el intervalo de células se calcula basándose en el uso terapéutico o el tejido diana o el método de suministro. Los ejemplos no limitantes de afecciones médicas pueden incluir EPOC, diabetes, isquemia, artrosis, daño ortopédico, daño hepático, angina resistente crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, asma, enfisema, heridas, disfunción eréctil, lesiones de la médula espinal, discos herniados, síndrome de radiación aguda, trastornos neurológicos, enfermedad de injerto contra hospedador, trastornos autoinmunitarios, insuficiencia renal, trastornos autoinmunitarios y similares, incluyendo combinaciones de los mismos. El tratamiento puede incluir introducir células en una región del sujeto donde la afección médica pueda tratarse. Las células se pueden suministrar por vía intramuscular, vía intravenosa, intrarterial, subcutánea, quirúrgica, intratecal, intraperitoneal, intranasal, oral, tópica, rectal, vaginal, por aspiración y similares, incluyendo combinaciones de los mismos. Adicionalmente, en un aspecto, las células de SL no diferenciadas se pueden suministrar al sujeto para tratar la afección médica. En otro aspecto, las células de SL diferenciadas se pueden suministrar al sujeto para tratar la afección médica.

Las células madre también se pueden suministrar en un individuo de acuerdo con un suministro retrógrado o anterógrado. A modo de ejemplo, las células se pueden introducir en un órgano de un individuo mediante un suministro retrógrado de las células en el órgano. Los ejemplos no limitantes de dichos órganos pueden incluir el corazón, el hígado, un riñón, el cerebro, páncreas y similares.

Adicionalmente, en algunos aspectos las células de SL se pueden lisar y el lisado se pueden usar para el tratamiento. En otros aspectos, se puede usar el sobrenadante del proceso de cultivo para el tratamiento. Un ejemplo de dicho tratamiento con un sobrenadante incluye el suministro de exosomas. Los exosomas se pueden suministrar al individuo por medio de un suministro aerosolizado, un suministro i.v. o cualquier otra técnica de suministro eficaz. Los exosomas también se pueden usar para tratar individuos con heridas abiertas, úlceras, quemaduras y similares.

En un aspecto adicional, se proporciona un método de tratamiento de la EPOC. Dicho método puede incluir administrar un agente activo eficaz para la EPOC por vía intravenosa a un paciente para suministrar el agente activo eficaz para la EPOC en una mitad inferior del pulmón del paciente, y además administrar el agente activo eficaz para la EPOC en una forma aerosolizada al paciente por medio de ventilación para suministrar el agente activo eficaz para la EPOC en una mitad superior del pulmón del paciente. En algunas realizaciones, la administración puede ser conjunta. En otros aspectos, la administración puede ser secuencial. En algunos aspectos, el agente eficaz para la EPOC suministrado por vía intravenosa puede ser distinto del agente eficaz para la EPOC suministrado en forma de aerosol, mientras que en otros aspectos el mismo agente eficaz para la EPOC se puede utilizar en ambas administraciones. En algunos casos puede ser beneficioso para el paciente estar en posición sentada durante el suministro del agente activo eficaz para la EPOC. En un aspecto, el agente activo eficaz para la EPOC incluye células madre. En otro aspecto, las células madre incluyen las células descritas en el presente documento. En otro aspecto, el agente activo puede ser un agente farmacéutico o un agente biológico. Otros ejemplos no limitantes de agentes activos eficaces para EPOC pueden incluir exosomas, lisados celulares, extractos de proteínas, extractos de proteínas obtenidos del cultivo celular y similares.

Se puede utilizar una diversidad de condiciones para aerosolizar células. En un aspecto, por ejemplo, las células se pueden suspender en 1-5 ml de solución salina y aerosolizarse a una presión de 20,68 kPa-689,48 kPa (3-100 psi) durante 1-15 minutos, o hasta que las células comienzan a romperse y/o morir.

Se puede utilizar cualquier forma de aerosol para suministrar las células madre en los pulmones siempre que las células madre se puedan suministrar sustancialmente sin daños. En algunos casos, puede ser beneficioso aerosolizar las células madre por medio de un aerosol capaz de aerosolizar partículas de tamaños mayores. Por ejemplo, en un aspecto, se puede usar un aerosol que aerosolice un tamaño de partícula de aproximadamente 2 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros. En otro aspecto, se puede usar un aerosol que aerosolice un tamaño de partícula de aproximadamente 4 micrómetros a aproximadamente 30 micrómetros. En aún otro aspecto, se puede usar un aerosol que aerosolice un tamaño de partícula de aproximadamente 6 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros. En aún otro aspecto, se puede usar un aerosol que aerosolice un tamaño de partícula de aproximadamente 6 micrómetros a aproximadamente 200 micrómetros.

En otro ejemplo, las técnicas de la presente se pueden utilizar en el tratamiento del síndrome de radiación aguda. El síndrome de radiación aguda puede ser difícil de tratar, ya que la supervivencia depende de la dosis de radiación y la posterior atención clínica para mediar infecciones letales, incluyendo proporcionar un soporte para la expansión de las células madre residentes. Las técnicas tradicionales emplean un tratamiento con factores de crecimiento o el trasplante de células madre hematopoyéticas. Las células madre de acuerdo con aspectos de la presente divulgación se pueden usar según modelos de trasplante alogénico sin necesidad de compatibilización de HLA entre el donante y el hospedador. Se ha demostrado que las células son hipoinmunogénicas y que el sistema inmunitario no las reconoce, aún después de múltiples inyecciones. Estas células madre secretan varias moléculas bioactivas, tales como factores de crecimiento hematopoyéticos que incluyen IL6, IL11, LIF SCF y el ligando Fly3 y moléculas inmunomoduladoras tales como TGFB1, prostaglandina E2, indolamina 2,3-dioxigenasa.

Dichas células cultivadas facilitan un mecanismo protector que combate la cascada inflamatoria además de brindar soporte a la destoxificación después de una exposición a la radiación. Además, estas células liberan factores tróficos y actividad moduladora del nicho de las HSC (forma siglada de hematopoietic stem cell, células madre hematopoyéticas) para rescatar la hematopoyesis y la actividad endógenas. Estos datos sugieren que estas células sirven como un tratamiento rápido y eficaz en la primera línea de defensa para combatir una insuficiencia hematopoyética inducida por radiación. Además, estas células se pueden usar para tratar una enfermedad de injerto contra hospedador grave o resistente a esteroides.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Composición para cultivar células o células madre procedentes de cordón umbilical para uso clínico.

Composición de medios 1

DMEM-con bajo contenido de glucosa-sin fenol

glutamina 1X

AANE 1X

10 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas

1000 unidades de heparina

Composición de medios 2

DMEM-con bajo contenido de glucosa-sin fenol

glutamina 1X

AANE 1X

10 % de lisado de PRP liofilizado o comprimido de lisado de plaquetas

1000 unidades de heparina

Composición de medios 3

DMEM-con bajo contenido de glucosa-sin fenol

glutamina 1X

AANE 1X

10 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas

ACD

Ejemplo 2 - Cultivo de células o células madre procedentes de cordón umbilical para uso clínico.

Se obtiene tejido de cordón umbilical y se efectúan pruebas de la sangre materna en cuanto a enfermedades infecciosas antes de obtener las poblaciones de células y células madre. Se lava 10 veces un trozo de 1 cm del cordón en una solución de DPBS que contiene 10 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas. Luego se abre el cordón umbilical longitudinalmente para exponer el interior del cordón umbilical. Se retira todo el tejido que pueda originar células endoteliales. El cordón umbilical se coloca luego directamente en una placa de cultivo celular que contiene la Composición de medios 1 con el interior del cordón umbilical en contacto con el plástico y se cultiva en entornos de cultivo ya sea normóxicos o hipóxicos.

El tercer día se reemplazan los medios por Composición de medios 1 recién preparada y se cultiva hasta el día siete, momento en el cual se retiran los explantes para la expansión de células primarias. Las células se alimentan en días alternos hasta que se pueden recoger aproximadamente 500.000-1.000.000 de células y expandirlas adicionalmente. Cabe señalar que los medios usados para los ejemplos posteriores es la Composición de medios 1 a menos que específicamente se indique de otra manera.

Ejemplo 3 - Pasaje enzimático de células o células madre de cordón umbilical para uso clínico.

Se puede utilizar TrypLE para subcultivar las células. Los medios se retiran del matraz del Ejemplo 2 y las células se lavan tres veces con DPBS. Luego se agrega TrypLE y las células se transfieren a una incubadora a 37 °C durante 3-5 minutos. La reacción enzimática se detiene con la adición de un volumen igual de medios de cultivo/expansión. A continuación, las células se centrifugan a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se retira el sobrenadante y las células se lavan 3 veces si se subcultivarán o 10 veces se utilizarán terapéuticamente.

Ejemplo 4 - Pasaje no enzimático de células o células madre de cordón umbilical para uso clínico.

Para una estrategia no enzimática, se puede usar un gel semisólido para retirar las células del matraz de cultivo tisular. Las células se cultivan en medios de cultivo/expansión normales. Un día antes del subcultivo, se agrega a las células medio semisólido DMEM-con bajo contenido de glucosa-sin fenol, glutamina 1X, AANE 1X, 10 % de lisado de PRP o lisado de plaquetas, ADC. Las células se cultivan durante la noche ya sea en un entorno normóxico o hipóxico. Al día siguiente se forma un gel semisólido sobre las células. Para retirar las células de la placa, se golpea un lado de la placa hasta que el gel semisólido se desprende del fondo. Luego se puede retirar la capa semisólida y las células se situarán dentro del gel semisólido. Si se precisa un subcultivo adicional, el gel semisólido se transfiere a matraces o bolsas de cultivo celular adicionales para expansión adicional. Si las células no se van a expandir adicionalmente, la capa semisólida que contiene las células se puede aplicar directamente de forma terapéutica. Ejemplo 5 - Uso terapéutico de células o células madre procedentes de cordón umbilical en el tratamiento de isquemia crítica de miembros

Los pacientes reunían los requisitos para su inclusión si tenían una isquemia crítica de miembros crónica, incluyendo dolor en reposo (clase de Rutherford 4) o pérdida de tejido leve a moderada (Rutherford 5) y si no eran candidatos para cirugía o una revascularización endovascular. Los parámetros hemodinámicos incluyeron uno de los siguientes: presión en tobillos < 50 mm de Hg o ABI < 0,4; presión en dedos del pie < 40 mm de Hg o TBI < 0,4; o TcPO2 < 20 mm de Hg en aire ambiente.

Los criterios de exclusión incluyeron necrosis generalizada del miembro de referencia haciendo que inevitable la amputación (clase de Rutherford 6); oclusión no corregida de la arteria ilíaca ipsilateral con respecto al miembro de referencia; ausencia de señal Doppler en el miembro de referencia (ABI = 0); creatinina sérica > 2,0 mg/dl; infección activa que precisa antibióticos; neoplasia maligna activa; o cualquier trastorno hemático que impidiera la recogida de médula ósea.

Todos los pacientes tenían > 18 años y pudieron proporcionar un consentimiento informado. Todos los pacientes incluidos en el estudio se sometieron a una selección para cáncer preoperatorio y a exámenes oftalmológicos por retinopatía proliferativa.

Las células se produjeron como se describe en los Ejemplos 1-4. El cirujano vascular aplicó 40 inyecciones intramusculares de partes alícuota de 1 ml de células o de células madre obtenidas de cordón umbilical en ubicaciones identificadas previamente a lo largo del miembro isquémico usando ecografía como guía. Los procedimientos se llevaron a cabo con anestesia local y sedación consciente.

Los pacientes se evaluaron a las 1, 4, 8, 12 y 26 semanas después del procedimiento. Los resultados clínicos incluyeron estado de amputación, clasificación de Rutherford de isquemia miembros y dolor, determinado mediante la escala analógica visual (VAS, forma siglada de Visual Analog Scale). Las amputaciones importantes se definieron como aquellas que se producen por encima del tobillo. Los resultados hemodinámicos se evaluaron mediante el índice de tobillo-brazo (ABI, forma siglada de Ankle Brachial Index). También se realizó un control de laboratorio de hematología y química de la sangre. Se realizó un examen oftalmológico de la retina al inicio y a las 12 semanas en pacientes diabéticos para evaluar retinopatía proliferativa. Los resultados se muestran en las FIG. 11A y 11B. La inyección solo representa el suministro de las células madre, en tanto que el control era una solución salina sin células madre.

Ejemplo 6 - Uso terapéutico de células o células madre procedentes de cordón umbilical para el tratamiento de la angina resistente crónica y/o la insuficiencia cardíaca congestiva.

Se incluyeron en el estudio pacientes con angina de clase III-IV de la Sociedad Cardiovascular Canadiense (CCS, forma siglada de Canadian Cardiovascular Society) a pesar de una terapia médica o quirúrgica máxima que no cumplían los requisitos para una revascularización percutánea o quirúrgica posterior (basándose en la anatomía coronaria) y que presentaban evidencia de isquemia reversible en una tomografía de emisión monofotónica (SPECT, forma siglada de single photon emission computed tomography) con ejercicio.

Las células se produjeron como se describe en los Ejemplos 1-4. Se canuló la vena femoral con un manguito French 7, se colocó un catéter French 6 en el seno coronario y se colocó un alambre de guía hidrófilo de 0,035 mm en la vena interventricular o lateral seguido por la colocación de un globo periférico en la porción media del seno coronario para permitir un suministro no selectivo de células. (Cook Medical, Indiana, EE.UU.). El globo se infló a una presión muy baja (1 a 2 atm) durante 10 minutos produciendo un estancamiento del flujo. Se inyectaron 50 ml de células (50.000.000-400.000.000) manualmente a través del globo a una velocidad de 10 ml por minuto. El tiempo promedio total del procedimiento para el suministro de células fue de 30 minutos. La FIG. 12 muestra un angiograma que demuestra el suministro de células en el corazón usando una técnica retrograda.

La evaluación de selección inicial de los pacientes incluyó una evaluación clínica, electrocardiograma (ECG), evaluación de laboratorio (hemograma completo, análisis bioquímico de la sangre, velocidad de sedimentación globular, niveles en suero de creatina cinasa y troponina T). Los pacientes mantuvieron un registro de la frecuencia diaria de angina durante tres semanas, y la gravedad de la angina se calificó de acuerdo con la clase de la CCS al inicio, a los 3, 12 y 24 meses. Dentro de las dos semanas antes de la terapia celular, se evaluó la capacidad de ejercicio usando ergometría en bicicleta junto con imágenes de SPECT para evaluar la isquemia del miocardio y la función ventricular izquierda (VI).

Ejemplo 7 - Estudio de seguridad de la insuficiencia cardíaca

Diez pacientes, 5 isquémicos y 5 no isquémicos, recibieron un suministro retrógrado de células en el corazón como se describe en el Ejemplo 6. La FIG. 13 muestra imágenes según intervalos de tiempo de dicho suministro retrógrado. La evaluación de selección inicial de los pacientes incluyó una evaluación clínica, electrocardiograma (ECG), evaluación de laboratorio (hemograma completo, análisis bioquímico de la sangre, velocidad de sedimentación globular, niveles en suero de creatina cinasa y troponina T). Los pacientes recibieron evaluaciones de seguimiento a los 1, 3, 6 y 12 meses. Las Tablas 1 y 2 muestran los resultados en el tiempo para pacientes isquémicos y no isquémicos.

Tabla 1

Tabla 2

Ejemplo 8 - Uso terapéutico de células o células madre de cordón umbilical para diabetes

Las células se producen como se describe en los Ejemplos 1-45. Las dosis terapéuticas pueden ser de 50.000.000 400.000.000. Las células se suministran por acceso arterial en la arteria celíaca y/o AMS, para así suministrar las células en la cabeza y/o la cola del páncreas mediante la técnica de infusión.

Ejemplo 9 - Uso terapéutico de células o células madre procedentes del cordón umbilical para el tratamiento de la EPOC/asma/enfisema.

En este estudio se utilizaron los siguientes criterios de inclusión para los sujetos. Se incluyeron individuos que tenían:

- EPOC moderada o grave con una relación VEMS/CVM posbroncodilatador < 0,7

- el sujeto debe tener un valor predicho de % de VEMS posbroncodilatador > 30 %

- fumador actual o ex fumador, con antecedentes de consumo de cigarrillos de > 20 años-cajetilla

Se excluyeron del estudio los sujetos que presentan uno o más de los siguientes:

- diagnóstico de asma u otra enfermedad pulmonar clínicamente importante distinta de EPOC (por ejemplo, enfermedades pulmonares restrictivas, sarcoidosis, tuberculosis, fibrosis pulmonar idiopática, bronquiectasia o cáncer de pulmón)

- diagnóstico de deficiencia de a-antitripsina

- masa corporal mayor que 150 kg o menos que 40 kg

- sujeto con una infección activa

- sujeto que tuvo un agravamiento significativo de la EPOC o que ha precisado ventilación mecánica dentro de las 4 semanas anteriores a la selección

- insuficiencia cardíaca no controlada, fibrilación auricular

- rehabilitación cardiopulmonar iniciada dentro de los 3 meses anteriores a la selección

- sujeto con evidencia de neoplasia maligna activa o antecedentes de neoplasia maligna activa que no ha estado en remisión durante al menos 5 años

- sujeto con una esperanza de vida < 6 meses

Las células se producen como se describe en los Ejemplos 1-4. Las dosis terapéuticas pueden ser de 50.000.000 400.000.000 de células. Las células se administran al sujeto sentado erguido, de manera simultánea por medio de un suministro aerosolizado que permanecerá en la mitad superior del pulmón debido a la perfusión por ventilación fisiológica y se administra por vía intravenosa en la mitad inferior del pulmón, debido a la perfusión por ventilación natural para una persona sentada erguida. Esta técnica combinada se utiliza debido a que cualquiera de las dos realizadas por separado no proporciona suficientes productos biológicos a todo el volumen pulmonar.

Se dividieron 20 sujetos de prueba en 4 grupos y recibieron lo siguiente:

5 sujetos en el Grupo 1 recibieron placebo - inyección de solución salina

5 sujetos en el Grupo 2 recibieron suministro i.v. - 200 M de células

5 sujetos en el Grupo 3 recibieron suministro inhalado - 200 M de células

5 sujetos en el Grupo 4 recibieron suministro i.v. e inhalado - 100 M/100 M de células

Los resultados obtenidos de estos grupos tratados sin células, con células i.v. solamente, con células inhaladas solamente y con células i.v. e inhaladas se muestran en la Tabla 3.

Con respecto a la aerosolización, las células se prepararon como se describe, suspendidas en 1-5 ml de solución salina y se aerosolizaron a una presión de 206,84 kPa (30 psi) durante 8-10 minutos

Tabla 3

continuación

Ejemplo 10 - Uso terapéutico de células o células madre procedentes de cordón umbilical para el tratamiento de la cicatrización de heridas

Las células se producen como se describe en los Ejemplos 1-4. En este ejemplo las dosis terapéuticas pueden ser de 50.000.000-400.000.000 de células. Las células se suministran en la herida mediante inyección y/o aerosolizadas en un vehículo de PL con adición de calcio y trombina líquidos.

Ejemplo 11 - Uso terapéutico de células o células madre procedentes de cordón umbilical para aplicaciones ortopédicas

Las células se producen como se describe en los Ejemplos 1-4. En este ejemplo las dosis terapéuticas pueden ser de 50.000.000-400.000.000 de células. Las células se inyectan directamente con ecografía como guía en el espacio intrarticular/articulación con o sin una técnica de microfractura. Estas células también se pueden suministrar con vehículo de PRPL o PL además de calcio/trombina líquida. A modo de ejemplo, las FIG. 14A y 14B muestran imágenes de la rodilla de una mujer de 80 años antes del procedimiento de suministro. Las FIG. 14C y 14D muestran imágenes de la misma rodilla de la misma mujer de 80 años a los 3 meses después del trasplante. Cabe señalar que se observa más espacio intrarticular en el paciente en las imágenes de postrasplante.

Ejemplo 12 - Uso terapéutico de células o células madre procedentes de cordón umbilical en aplicaciones para el síndrome de radiación aguda en ratones

Se usaron ratones C57BL/6J hembra como población receptora. Se aislaron células madre de cordón umbilical como se describió previamente, pero en este caso se aislaron de ratones. Los ratones C57BL/6J hembra recibieron TBI (forma siglada de total body irradiation, irradiación corporal total) usando una fuente de radiación de Cs-137. La irradiación letal se realizó usando 9,5 Gy. Los ratones recibieron los trasplantes por vía intravenosa dentro de las 8 horas posirradiación. La evaluación de los recuentos de sangre periférica de los animales tratados con células madre reveló una recuperación similar de leucocitos y trombocitos que lo observado en los receptores tratados con las HSC. (Véanse las FIG. 15A-B). A los siete meses después del trasplante los receptores estaban bien hematológicamente con una distribución normal de las poblaciones de células de sangre periférica. (Véase la Tabla 4).

Tabla 4: Población de células de sangre periférica en ratones trasplantados linfocitos neutrófilos monocitos eosinófilos

72 %+/- 3 21 % /- 3 5 % /- 2 2 % /- 1

Ejemplo 13 - Uso terapéutico de células o células madre procedentes de cordón umbilical en aplicaciones para el síndrome de radiación aguda en seres humanos

Para determinar si las células de cordón umbilical de la capa subepitelial obtenidas de seres humanos tenían el mismo efecto que en el Ejemplo 12, se repitió el mismo experimento usando células obtenidas de seres humanos como material donante y ratones nulos para nod/scid gamma(c) como receptores. Los animales se trataron como se describió previamente y se trasplantaron i.v. a las 6, 12 y 24 horas después de la irradiación corporal total (TBI). A los 6 meses postrasplante todos los ratones de control (n=30) que no habían recibido células después de la TBI habían muerto. La f Ig . 16 muestra la supervivencia de los ratones que recibieron las células humanas 6, 12 y 24 horas después de la TBI.

Por supuesto, debe entenderse que las disposiciones descritas anteriormente son solo ilustrativas de la aplicación de los principios de la presente divulgación. Los expertos en la materia pueden idear numerosas modificaciones y disposiciones alternativas. Por tanto, aunque la presente divulgación se ha descrito anteriormente con particularidad y detalle en relación con lo que actualmente se considera que son las realizaciones más prácticas de la divulgación, será evidente para los expertos en la materia que pueden realizarse numerosas modificaciones, incluyendo, pero sin limitación, variaciones en el tamaño, los materiales, la forma, la conformación, la función y la manera de funcionamiento, el ensamblaje y el uso, sin apartarse de los principios y conceptos expuestos en el presente documento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Exosomas aislados extraídos de células obtenidas de una capa subepitelial de un tejido de cordón umbilical de mamífero y que pueden autorrenovarse y expandirse en cultivo, expresando las células CD90, CD44, CD146 o SOX2 y OCT4, y en donde las células no expresan NANOG, y en donde los exosomas expresan CD63.

2. Los exosomas aislados de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los exosomas aislados expresan CD9.

3. Los exosomas aislados de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en terapia.

4. Un método de purificación de exosomas, que comprende:

recoger sobrenadante de las células madre cultivadas;

purificar los exosomas del sobrenadante, en donde los exosomas expresan CD63.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el cultivo de las células madre comprende además cultivar las células madre en un entorno de cultivo normóxico.

6. El método de la reivindicación 4, en donde el cultivo de las células madre comprende además cultivar las células madre en un entorno de cultivo hipóxico.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el cultivo de las células madre comprende además:

disecar la capa subepitelial del cordón umbilical;

colocar la capa subepitelial disecada con el lado interior hacia abajo sobre un sustrato de manera tal que el lado interior de la capa subepitelial esté en contacto con el sustrato;

cultivar la capa subepitelial sobre el sustrato; y

retirar explantes para la expansión de células primarias.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la disección de la capa subepitelial incluye además retirar la gelatina de Wharton del cordón umbilical.

9. El método de la reivindicación 7, en donde la capa subepitelial se cultiva en un medio de cultivo que comprende un lisado de plaquetas.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el sustrato es una placa de cultivo y en donde la placa de cultivo es un plástico tratado para cultivo celular, y la capa subepitelial se coloca sobre el mismo sin ningún pretratamiento adicional del plástico tratado para cultivo celular.

11. El método de la reivindicación 7, en donde el cultivo de la capa subepitelial y la retirada de los explantes se realizan sin el uso de ninguna enzima.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en donde el sobrenadante se recoge en cada cambio de medios.